一、基于二级结构的靶向蛋白激酶C-α mRNA的反义药物设计及构效关系分析(英文)（论文文献综述）
魏益娟[1]（2018）在《抗高血压1,4-二氢吡啶药物通过靶向核受体FXR保护肝脏的结构机理研究》文中提出法尼醇X受体（FXR）在调节胆汁酸合成和胆固醇稳态等方面具有重要作用。尽管FXR作为代谢疾病的药物靶点受到相当多的关注,但FXR选择特异性配体仍有很大的研究意义和治疗潜力。本论文就筛选发现的抗高血压药物靶向FXR调控肝脏代谢的分子机制及其构效关系进行详细的阐释。通过高通量筛选FDA库的一千多种化合物,我们揭示并鉴定了一系列抗高血压的1,4-二氢吡啶类药物（DHPs）作为配体能够特异性地与FXR结合并产生不同的构象变化,进而促进FXR募集不同辅调节因子,尤其是类固醇激素受体辅激活因子（SRC2-3）,并诱导FXR的转录活性。为了进一步研究不同DHPs结合并调控FXR的分子和结构机理,本论文首次成功获得并解析出了四种DHPs分别与FXR/SRC2-3的晶体结构。通过对比这四种复合物的晶体结构,显示出DHPs和FXR配体结合口袋（LBD）的特异性结合模式,其主要表现为由一种含三个叶片的螺旋桨形状嵌入到LBD空腔中。通过对比发现与人工合成配体GW4064和鹅去氧胆酸（CDCA）在FXRLBD中结合位置不同的是,DHPs三叶片螺旋桨结构的叶片Ⅱ主要位于FXR LBD α螺旋H7和H11之间来形成一个较小的空间结合腔从而调控DHPs的结合灵活性。同时定点突变实验进一步从构效关系上分析四种DHPs激活FXR转录的独特能力,并且重点突出FXR LBD 口袋结合配体的灵活性以及突变氨基酸残基在特异性识别不同DHPs中的差异作用,进而共同实现对FXR功能的不同调节。为了进一步研究FXR功能,通过使用对乙酰氨基酚（Acetaminophen,APAP）诱导野生型（WT）和FXR敲除小鼠（KO）的急性肝损伤模型,发现西尼地平（Cilnidipine）预处理能够显着降低WT小鼠中血清的丙氨酸氨基转移酶ALT、天冬氨酸转氨酶AST和乳酸脱氢酶LDH水平,同时还增加肝脏中的谷胱甘肽转移酶GSH水平;但对FXR敲除鼠却没有明显影响,这表明西尼地平对小鼠肝损伤生化指标的调节是直接靶向FXR的。此外通过H&E染色观察到APAP过量导致小鼠肝切片中明显的肝小叶呈点状坏死,有大面积的受损和坏死区域等肝损伤病理学特征。西尼地平预处理能够极大程度地减轻APAP造成的肝组织损伤,然而在FXR敲除小鼠中肝损伤特征并没有得到改善,因此通过组织形态学分析认为西尼地平通过FXR改善肝损伤。其次,我们用TUNEL染色发现在APAP24h造模组的小鼠肝脏切片中有明显的细胞凋亡特征,并且凋亡的阳性肝细胞达到很高的比例,同时西尼地平预处理的WT组小鼠显着降低肝细胞的凋亡程度,但仍然对FXRKO小鼠没有影响,因此认为西尼地平也通过靶向FXR减弱肝细胞的凋亡来发挥保肝作用。另外,通过RT-PCR分析小鼠肝脏组织的基因表达,我们发现DHPs预处理WT小鼠可以上调FXR相关靶基因成纤维细胞生长因子FGF15,回肠胆汁酸结合蛋白iBABP和氮酸输出蛋白BSEP的mRNA水平,但在FXR KO小鼠没有这种变化。这些结果进一步证明DHPs作为FXR的特异性配体,是通过激活FXR来实现对其生理功能的调节。同时RT-PCR分析证实FXR的激活诱导谷胱甘肽硫转移酶Gsta3和谷胱甘肽GSH代谢相关基因（谷氨酸半胱氨酸连接酶Gclm,谷胱甘肽过氧化物酶Gpx1）的mRNA水平在西尼地平预处理的WT小鼠肝脏组织中显着上调,同样对FXRKO小鼠没有影响。因此认为西尼地平很可能通过激活FXR并随后上调这些肝脏相关基因的mRNA水平来发挥其保肝功能,再次证实DHPs通过FXR依赖性的方式调节肝脏基因表达实现肝脏保护的作用。鉴于DHPs已经长期作为抗高血压药物并广泛应用于临床治疗,我们的发现不仅为设计和开发下一代具有更多有益保肝作用的抗高血压Ca2+阻滞剂药物提供有价值的见解,同时也为以FXR为药物靶标的潜在治疗性药物的优化设计提供安全有效的结构模板。此外,基于新建立的药物-靶标关系,DHPs可能潜在地用于治疗高血压以外的FXR介导的相关疾病,我们的研究也为“老药”新功能的开发提供更强有力的筛选策略。
付洁[2]（2008）在《靶向HBV的siRNA优化设计研究》文中进行了进一步梳理RNA干涉方法因能序列特异性抑制基因表达而深受基因功能研究者与新药开发者们的青睐。但是,有效siRNA序列的设计和获得仍然停留在低效和随机的水平。随着人类基因组学、转录组学和功能组学等学科的飞速发展,RNAi技术的应用愈加广泛和深入,针对具有高突变性、基因异质性以及重叠基因等多种影响因素存在的复杂基因组,siRNA的优化设计面临更大的挑战。HBV是目前已知的感染人类最小的双链DNA病毒基因组,具有4个重叠开放读码框,具有多基因型异质性和高突变性,是初步研究靶向复杂基因的siRNA优化设计的良好靶点。本研究以HBV基因组为靶点,基于目前相关研究基础,通过全面分析可能影响siRNA活性的一级、二级结构因素,采用定量评价方法对siRNA构效关系进行初步研究,发掘了siRNA设计的一些规律;并在此基础上,考察了不同检测终点与siRNA活性评价之间的相互关系;并对疗效突出的siRNA候选序列进行了可成药性的初步研究。论文主要分两大部分共四章:前言:简要介绍了siRNA优化设计的重要意义,构效关系对于siRNA分析的必要性,以及目前利用RNAi技术对于HBV应用的研究现状和存在问题,并在此基础上提出了论文的研究目的和研究内容。第一部分（第一、二、三章）靶向HBV的siRNA对于抑制S/P mRNA和HBsAg表达的构效关系分析基于HepG2.2.15细胞模型的U95551序列和部分中国患者感染HBV序列的一级结构比对结果,结合三家知名网站按照siRNA设计基本原则设计并提供的上百条siRNA,在低突变区域筛选出21条siRNA（包括文献阳性对照siRNA）。使用DNA一级序列比对程序和mRNA二级结构模拟程序对HBV基因组靶mRNA和多条siRNA进行了HBV基因型同源性分析、二级结构单元（膨胀环、内环、茎、发卡环、多分支环的碱基数）、二级结构热动力学参数等特点分析。体外HBV模型采用HepG2.2.15细胞,建立可以高通量筛选和评价siRNA活性的HBsAg定量方法和实时荧光PCR相对定量方法,对22条siRNA（包括阴性对照siRNA）在三个剂量1nM,10nM和100nM下对蛋白水平HBsAg和mRNA水平S/P基因表达进行确定,从而评价siRNA活性。在设计的21条siRNA中,有15条siRNA与对照组相比显示出有效性（P < 0.05）,其中数条siRNA（如537、672、1658等）活性优于阳性对照,可能作为后续研究的候选序列。统计学结果显示半数（13/21）siRNA在本研究的剂量范围内呈现剂量依赖性（P < 0.05）。以S/P mRNA表达水平为因变量进行一级结构多元线性（逐步）回归分析,结果显示:基因型同源性、靶向X区这两个因素对于siRNA活性有密切关系（P < 0.001;P < 0.05）。以HBsAg水平为因变量进行一级结构多元线性（逐步）回归分析结果显示:基因型同源性、靶向S/P区和X区对siRNA抑制HBsAg的表达有密切关系（P < 0.001;P < 0.01;P < 0.01）。值得注意的是,在两者的QSAR分析中,靶向C基因的存在与siRNA抑制S/P mRNA和HBsAg的活性呈负相关（P < 0.05）。对mRNA结合靶部位二级结构单元（发卡、茎、多分支环、茎的碱基数目）与siRNA活性进行了QSAR分析。在数据满足SPSS分析的前提下,对S/P/Pregenome mRNA区域的siRNA靶点进行加权分析二级结构构效关系,结果显示:靶mRNA区域发卡环的存在与相应siRNA的活性呈正相关,即siRNA与该区域靶mRNA结合的发卡环越大,越有效（R = 0.994,P = 0.009）,并且预测值与实测值相符,而siRNA与靶mRNA结合区域多分支环和膨胀环的存在是降低siRNA活性的因素（R = 0.994,P = 0.02）。另一方面,在siRNA序列自身二级结构热动力学参数与活性的QSAR分析中,未得出有意义的结论。我们在系统的二级结构构效关系分析中发现,在HBV各基因重叠区域,局部靶mRNA的空间构象极度保守,即同一条siRNA与前基因组mRNA,聚合酶mRNA以及表面抗原mRNA模拟的二级结构结合的靶点空间结构完全相同,且出现频率高（共分析30条,重现率≥50%）。该现象提示同一条siRNA可能同时靶向体内的多条靶mRNA的相同空间区域。对于包括HBV基因组在内的复杂基因来说,这种局部空间结构的高度保守性也可能是siRNA潜在优选靶点的重要特点。第二部分（第四章）确定不同检测终点对于评价复杂基因中靶向不同区域的siRNA活性的影响HBV基因组含有多个重叠基因,同时表达若干产物。研究表明,靶向某特定基因的siRNA可能对与之重叠的其它基因表达产物有交互影响。如靶向C mRNA的siRNA亦可抑制S/P mRNA和S/P蛋白,尽管其活性弱于直接靶向S/P mRNA的siRNA。也就是说,靶向某基因的siRNA对于其它基因对应的检测终点也可能有效。那么,这种有效性是均一的,还是专一的?是否要针对不同的靶mRNA区域选择不同的检测终点来考察相应siRNA的活性,而非选择通用的检测终点来进行评价?对此,我们增加了靶向C/P/Pregenome区的siRNA的条数（源自文献报道的有效siRNA）,建立了评价HBV复制的多个检测指标的方法,包括HBeAg ELISA方法,针对C、X基因的mRNA表达水平的测定,HBV DNA病毒含量的测定以及细胞中cccDNA含量测定的定量方法。考察了10nM固定浓度下24条siRNA对各检测终点的抑制程度。分别以各考察指标为因变量进行多元线性回归逐步分析,结果表明,靶向S区和C区的siRNA与对应的检测终点有相关性。首先,以C/P mRNA和HBeAg为因变量进行方差分析,得到的siRNA的有效性排序与之前不同;其次,以C基因的对应检测终点（C mRNA和HBeAg）为因变量分析,靶向C区的siRNA较靶向S区的siRNA效果好（P < 0.05）,反之亦然（P < 0.05）。结果表明,对于复杂重叠基因,虽然根据各基因的功能和体内形成特点不同,存在着影响终产物的交错环节,但选择不同的检测终点对于siRNA活性进行个体化评价对于有效siRNA的筛选和潜在治疗药物候选序列的确定是有重要意义的。
徐萍[3]（2008）在《HIF-1α在肝细胞癌中的表达及反义HIF-1α寡核苷酸对HepG2细胞增殖的抑制作用》文中研究指明第一部分HIF-1α、VEGF及MvD在肝细胞癌中的表达及临床意义缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）作为一种重要的转录激活因子,能诱导多种缺氧反应性表达,可促进包括血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Fatcor,VEGF）在内的多种血管生长相关基因转录,促进肿瘤血管生成,并在促进肿瘤细胞增殖和转移、调节糖代谢、增加肿瘤耐药性等方面发挥重要作用,与肿瘤的发展与转移密切相关。其中,HIF-1α是HIF-1的活性亚基。为进一步探讨HIF-1α在肝细胞癌（HepatocellularCarcinoma,HCC）发生、发展和转移中的作用,本研究将在第一部分采用免疫组化方法观察人HCC及癌旁组织中HIF-1α、VEGF及微血管密度（microvesseldensity,MVD）的表达及其临床意义。材料和方法1、一般资料收集2005年12月—2006年12月浙江大学医学院附属第一医院手术切除肝脏标本55例,并经病理检查证实。其中HCC组织45例,并取距离肿瘤边缘1cm处组织为癌旁组织。正常肝脏组织10例。2、主要试剂HIF-1α鼠抗人多克隆抗体,购自Lab Vision公司:VEGF鼠抗人多克隆抗体,购自长岛生物技术公司;CD34鼠抗人多克隆抗体,购自长岛生物技术公司;PV9000试剂盒,购自北京中山生物技术公司。3、实验方法HIF-1α、VEGF、CD34采用免疫组化PV9000二步法,染色步骤按试剂盒说明书进行。4、结果判断HIF-1α染色综合染色强度和阳性细胞占总细胞数的百分比进行半定量评分。染色强度:1分,染色弱但明显强于阴性对照;2分,染色清晰,中等程度;3分,染色程度强。阳性细胞数:2分,阳性细胞占11-50%;3分,阳性细胞占51-80%;4分,阳性细胞＞81%。上述两项评分相加,不论染色强度,阳性细胞≤10%为（-）,3分为（+）,4-5分为（++）,6-7分为（+++）,其中以（++）和（+++）为强阳性。VEGF判别标准为:随机选择5个视野,计算100个细胞/视野,共计500个,阳性细胞≦10%为阴性,阳性细胞＞10%为阳性。微血管密度（MVD）计数方法:在200倍高倍镜下随机选择4个不同视野计数,计算每例标本的单位视野平均血管数。5、统计学处理数据统计在SPSS 13.0统计软件上进行。样本率的比较采用X2检验;计量资料两样本均数比较t检验:多个样本均数比较采用单因素方差分析;参数间相关性采用Spearman等级相关分析。以P＜0.05为差异有显着性。结果1、HIF-1α、VEGF与MVD在HCC、癌旁及正常组织中的表达HIF-1α在HCC组织中广泛表达,与正常及癌旁组织比较,HIF-1α表达显着增高,表达阳性率和强阳性率分别为91.1%和68.9%。在癌旁组织中,表达阳性率和强阳性率分别为20.0%和6.7%。10例正常组织中,仅1例阳性。癌旁组织与正常组织比较,差异无显着性。VEGF在HCC中表达阳性率为53.3%;在癌旁组织中,表达阳性率为13.3%。而正常组织中均为阴性表达。与正常及癌旁组织比较,HCC组织中VEGF表达显着增高。与正常组织比较,癌旁组织中VEGF表达差异无显着性。HCC组织MVD值较癌旁、正常组织明显增高,为52.2±18.3;癌旁组织与正常组织的MVD值分别为23.2±9.8和16.5±9.7,差异无显着性。2、HCC中HIF-1α、VEGF表达及MVD与临床病理的关系在HCC中,HIF-1α表达强阳性率在高分化、中分化和低分化HCC分别为16.7%、62.5%和100.0%,差异具显着性;在伴门脉癌栓形成和无癌栓形成HCC组织中,HIF-1α强阳性率分别为100.0%和60.0%;在瘤体直径＞5cm和≤5cm HCC组织中,HIF-1α强阳性率分别为86.3%和52.2%,组间差异均具统计学意义。而随远处转移的发生,HIF-1α表达阳性程度有增高趋势,但无统计学意义。VEGF表达随HCC组织分型减低呈增高趋势,但无统计学意义。在伴门脉癌栓形成和无癌栓形成HCC组织中,VEGF表达阳性率分别为90.0%和42.9%,差异具显着性。VEGF表达随远处转移发生、肿瘤体积增大而增高,但无统计学意义。在高分化HCC和低分化HCC组织中,MVD均值分别为40.5±14.8和61.0±17.2,差异具显着性。在伴发门脉癌栓形成、远处转移发生HCC组织中,MVD均值分别为71.3±12.7和64.1±12.2,与无门脉癌栓形成（46.8±16.0）和远处转移发生（49.7±18.5）HCC组织相比,组间差异具有统计学意义。MVD均值随肿瘤体积增大而增高,但无统计学意义。3、HCC癌旁HIF-1α、VEGF表达及MVD与临床病理的关系在伴门脉癌栓形成和无癌栓形成的癌旁组织中,HIF-1α表达阳性率分别为50.0%和11.4%,差异具显着性。随远处转移发生、伴发肝硬化、HCC组织分型减低,表达阳性程度有增高趋势,但无统计学意义。VEGF表达随门脉癌栓形成、远处转移发生、HCC组织分型减低、伴发肝硬化呈增高趋势,但无统计学意义。在低分化HCC癌旁组织,MVD均值为28.5±10.6,与高分化（16.6±7.1）和中分化（21.6±8.4）HCC癌旁组织相比,差异具有统计学意义。在伴发门脉癌栓形成、远处转移发生及肝硬化的癌旁组织中,MVD均值分别为33.7±5.6、31.5±9.5和26.2±10.8,与无门脉癌栓形成（20.2±8.6）、无远处转移发生（21.4±8.7）及不伴肝硬化（20.1±7.6）癌旁组织相比,组间差异具有统计学意义。4、HIF-1α与VEGF、MVD表达的关系在HCC中,HIF-1α阳性表达程度与VEGF表达、MVD均值有显着的正相关性（r=0.545,r=0.705）。HIF-1α表达（+）、（++）和（+++）癌组织中MVl)分别为36.5±7.9、53.8±14.3、75.3±9.1。VEGF阳性表达的HCC组织其MVD（64.1±15.9）明显高于VEGF阴性HCC组织（38.7±10.9）,VEGF阳性表达程度与MvD呈正相关（r=0.710）。在HCC癌旁组织中,HIF-1α表达与VEGF表达、MVD值同样具有相关性（r=0.784,r=0.608）。HIF-1α阴性与HIF-1α阳性表达癌旁组织的MVD值分别为20.0±7.6和36.0±6.2。VEGF阳性表达的癌旁组织MVD值为38.5±6.0,明显高于VEGF阴性癌旁组织（20.9±7.9）,VEGF阳性表达程度与MVD呈正相关（r=0.554）。本研究采用免疫组化PV9000二步法检测肝组织中HIF-1α,VEGF和MVD的表达,结果表明:1、HIF-1α,VEGF和MVD在HCC肿瘤组织中表达上调,与癌旁组织以及正常肝组织有显着性差异。提示上述各种因子可能在HCC发生发展过程中起重要作用。2、HIF-1α,VEGF和MVD表达上调与HCC临床病理特征有一定的相关性。其中,HIF-1α表达与肿瘤组织分型、肿瘤体积、门脉癌栓形成密切相关;VEGF表达与门脉癌栓形成密切相关;MVD与肿瘤组织分型、肿瘤远处转移、门脉癌栓形成密切相关。3、HIF-1α,VEGF和MVD在HCC肿瘤组织及癌旁组织中的表达具有相关性。第二部分HIF-1αAS-ODN对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用由于HIF-1α在肝癌发生、发展与转移中的关键作用,HIF-1α可能成为肝癌治疗的新靶向,在抑制肝癌血管生成、抑制肝癌细胞增殖和转移、降低肝癌细胞对缺氧的耐受性等环节中发挥作用。反义寡核苷酸（antisenseoligodeoxynucleotides,AS-ODN）是人工合成的单链小片段核苷酸,能在转录水平或翻译水平特异性地抑制靶基因的表达,以达到治疗效果。为进一步研究HIF-1αAS-ODN对肝癌细胞生长的抑制作用,本研究将在第二部分实验中设计和合成若干条HIF-1αAS-ODN,以脂质体介导转染HepG2细胞,观察AS-ODN对肝癌细胞增殖的抑制作用,选择出细胞生长抑制效应最强的AS-ODN,并进一步验证该AS-ODN对肝癌细胞靶基因HIF-1αmRNA转录和翻译的抑制作用。材料与方法1、实验材料HIF-1αAS-ODN1-6,由北京军事医学科学院放射研究所设计、合成、修饰和纯化。HIF-1αRT-PCR引物,北京军事医学科学院放射研究所合成。PCR反应试剂盒,购于美国Promega公司;Trizol RNA提取试剂盒、购于Gibco BRL公司;HIF-1α抗体（一抗和二抗）,购自stressgen公司;β-actin抗体（一抗和二抗）,购自Santa CruzBiotechnology公司。2、实验方法2.1脂质体寡核苷酸转染肝癌细胞HepG2培养至对数生长期后,将HepG2细胞接种到96孔板（4×103细胞/孔/100μL）。培养至细胞贴壁且丰度达到40%～60%时,吸弃各孔中的培养液。按脂质体说明书进行AS-ODN的转染。用无血清无抗生素DMEM细胞培养液分别配制各序列及浓度寡核苷酸和阳离子脂质体溶解液,室温静置40分钟。振荡并混和寡核苷酸液和阳离子脂质体液成转染液,使脂质体充分包裹寡核苷酸。转染液混匀后滴加至细胞上,置于培养箱转染6小时。每个浓度寡核苷酸设置4个平行孔。吸弃各孔转染液,加入100μl含血清的DMEM培养液。封闭缺氧的条件下置于37℃、5%CO2孵箱继续培养。2.2 MTS检测法脂质体寡核苷酸转染96孔板后继续培养72小时后,每孔加入20μl MTS（5mg/ml）,在微量振荡器上混匀后,置于37℃、5%CO2孵箱继续培养90分钟后,用多功能酶标仪（Wallac美国）在492nm测定吸光值,并计算细胞增殖抑制率（Ip）。2.3 RT-PCR法脂质体寡核苷酸转染后继续培养48小时,提取HepG2细胞RNA,取2μg RNA加入20μl逆转录体系中,42℃孵育1小时反转录合成cDNA,72℃,5分钟,灭活逆转录酶,中止反应。PCR反应体系:cDNA1μl,Taq酶0.5μl,PCR mix 15μl,20μmol/L内参照β-actin和HIF-1α上、下游引物各0.5μl,去离子水补充至20μl。PCR扩增条件:94℃预循环4分钟;94℃变性30秒,56℃退火30秒,72℃延伸30秒,30个循环;最后72℃延伸5分钟。产物进行2%琼脂糖电泳。利用ImageQuant5.2软件读取各条电泳带的信号值,计算抑制率Im。2.4 Western blot检测脂质体寡核苷酸转染后继续培养48小时,提取HepG2细胞蛋白,改良Lowry法进行蛋白定量后将各组蛋白提取物调至相同浓度。取60μg/10μl蛋白与等体积2×SDS上样缓冲液混合均匀,煮沸5分钟充分变性。用8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。凝胶行半干转移至PVDF膜。用含1%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭1小时。室温结合β-actin和HIF-1α一抗1小时,浓度比例（1:400）,用TBST洗涤;室温结合β-actin和HIF-1α二抗1小时,浓度比例（1:2000）,用TBST洗涤后加ECL显色剂反应2分钟,X光胶片成像。3、统计学处理数据统计在SPSS 13.0统计软件上进行。计量资料多个样本均数比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异有显着性。结果1、HIF-1αAS-ODN细胞水平活性筛选脂质体法AS-ODN转染HepG2细胞72小时后,采用MTS检测法测定各序列对HepG2细胞增殖的抑制率。结果显示,与脂质体对照组相比,AS-ODN1-6各序列均可以显着抑制HepG2细胞的增殖（p＜0.01）,随剂量增大,抑制作用呈增强趋势,当浓度为0.8μmol/L时,AS-ODN1-6的细胞增殖抑制率分别达57.2±2.4%、61.8±1.9%、57.4±2.6%、49.1±3.4%、53.3±3.1%和53.7±2.7%。尤其是AS-ODN2当浓度为0.2μmol/L、0.4μmol/L和0.8μmol/L时,细胞增殖抑制率分别为37.8±2.0%、49.2±1.7%、61.8±1.9%;与其它反义链相比,AS-ODN2抑制HepG2细胞增殖作用更明显,具有显着性差异（p＜0.05）。因此我们筛选出AS-ODN2作为反义药物继续以下研究。2、HIF-1αAS-ODN2对HepG2细胞增殖的抑制作用在AS-ODN2对细胞增殖抑制作用的实验中,设置0.2、0.4、0.8、1.0μmol/L四个剂量,结果显示,与S-ODN相比,AS-ODN2可以显着抑制HepG2细胞的增殖（p＜0.01）;随剂量增大,抑制作用呈增强趋势,当浓度达到1.0μmol/L时,细胞增殖抑制率达89.7±3.8%。3、HIF-1αAS-ODN2对HepG2细胞HIF-1αmRNA表达的抑制作用脂质体法AS-ODN2转染HepG2细胞48小时后,采用RT-PCR法,对AS-ODN2抑制HepG2细胞HIF-1αmRNA表达进行检测。RT-PCR产物分析结果显示,与S-ODN相比,AS-ODN2可以明显抑制HIF-1αmRNA的表达,浓度为0.4μmol/L和0.8μmol/L时,抑制率分别为79.5%和78.2%。4、HIF-1αAS-ODN2对HepG2细胞HIF-1α蛋白表达的抑制作用脂质体法AS-ODN2转染HepG2细胞48小时后,采用Western blot印迹检测HIF-1αAS-ODN2对HIF-1α蛋白表达的抑制。免疫印迹结果显示,与S-ODN和细胞对照组相比,AS-ODN2可以显着抑制相应蛋白的表达。该抑制作用随浓度增加有增强趋势,当浓度为0.8μmol/L时,HIF-1α蛋白表达基本受到抑制。结论本研究合成6条HIF-1α硫代AS-ODN,阳离子脂质体法转染HepG2细胞,观察其对HepG2细胞增殖、HIF-1αmRNA转录及翻译的抑制作用,结果表明:1、HIF-1αAS-ODN1-6各序列均具有不同程度抑制HepG2细胞增殖的作用,当浓度为0.8μmol/L时,AS-ODN1-6的细胞增殖抑制率分别达57.2±2.4%、61.8±1.9%、57.4±2.6%、49.1±3.4%、53.3±3.1%和53.7±2.7%。2、与其它反义链相比,HIF-1αAS-ODN2抑制HepG2细胞增殖作用最明显,当浓度达到1.0μmol/L时,细胞增殖抑制率达89.7±3.8%。3、HIF-1αAS-ODN2可以明显抑制HepG2细胞HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白的表达,提示HIF-1αAS-ODN2对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用,由通过阻断HIF-1αmRNA的转录及翻译而实现。
刘静[4]（2005）在《灵芝多糖抗病毒和抗肿瘤作用机制研究》文中研究表明从发酵得到的灵芝菌丝体中分离得到一种多糖成分GLP,并对它的细胞毒作用、抗病毒活性及抗肿瘤作用进行了研究。采用热水抽提和乙醇沉淀的方法从灵芝菌丝体中得到灵芝多糖的粗制品,再用离子交换和分子筛的方法从多糖中分离得到5个不同的峰的灵芝多糖,经含量测定证明第二个峰所含有的灵芝多糖占总的多糖含量的42%,分子量测定表明该峰的多糖的分子量约为30～50Kda,硫酸—酚试验和Lowry-Folin试验分别检测多糖和蛋白质的含量分别为86.4%和8.3%,多糖与蛋白质的比例为10.4:1,命名该峰的多糖为GLP。 采用台盼兰和MTT法检测了GLP对体外培养的非洲绿猴肾细胞Vero细胞的毒性作用。结果表明,GLP对Vero细胞无毒,即使GLP浓度高达2000μg/mL,GLP对细胞也没有任何毒副影响,细胞的活力仍可达到98%以上。 GLP能够抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus type 1,HSV-1）和单纯疱疹病毒Ⅱ型（herpes simplex virus type 2,HSV-2）感染Vero细胞并抑制病毒感染引起的细胞病变。CCID50试验表明,GLP能强烈地抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型和单纯疱疹病毒Ⅱ型感染细胞。在病毒感染细胞前将GLP和疱疹病毒混合孵育1小时,然后再感染Vero细胞,GLP抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型和单纯疱疹病毒Ⅱ型的EC50(50%effective concentration,EC50)值分别为15.37和16.75μg/mL;如果GLP不预先与病毒孵育而和病毒同时加入到Vero细胞中,这时GLP抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型和单纯疱疹病毒Ⅱ型的EC50值分别为17.22和18.91μg/mL;但是在单纯疱疹病毒Ⅰ型和单纯疱疹病毒Ⅱ型感染Vero细胞2小时后再加入GLP,这时GLP抑制单纯疱疹
宋海峰[5]（2004）在《基于系统发育比较分析的反义药物优化设计及相关药理学研究》文中进行了进一步梳理本文基于系统发育比较分析方法,整合计算机模拟二级结构方法进行反义药物优化设计研究,分析构效关系与系统发育保守性在反义药物设计中的意义,进一步改善QSAR方程。筛选具有应用前景的活性先导序列,考察优选序列的体内外活性。 1.选取与乳腺癌发生密切相关的HER-2为靶点,通过Genbank共获取HER-2 mRNA（4530bp与1316bp）,分析HER-2 mRNA的系统发育保守性;同时利用计算机模拟靶mRNA的二级结构,将局部二级结构（局域,local motif,LMs）分为三种类型:1)完全保守局域（completely conservative LMs）,即一级序列完全保守、模拟mRNA最优及次优二级结构中全部具有的LMs;2)相对保守LMs（relatively conservative LMs）,即一级序列不完全保守、模拟的三个最优或次优mRNA二级结构中出现二次的LMs;3)变异LMs（variable LMs）,以及序列完全变异,模拟mRNA最优及次优二级结构中只出现一次的LMs。在分析二级结构特点、计算ΔG°R等参数的
孙正基[6]（2002）在《依据远程WEB生物信息平台靶向设计人端粒酶催化亚基反义寡核苷酸药物的研究》文中指出背景／目的 端粒酶活性在恶性肿瘤中的高表达，使之成为目前肿瘤治疗的重要靶点。选择性抑制端粒酶特别是TERT的表达可有效地抑制肿瘤细胞的生长。针对端粒酶的反义核苷酸技术是基因治疗药物设计的研究热点。然而，目前反义药物的设计仍停留在低效和随机的水平，影响了其治疗的应用效果，反义药物的优化设计已成为研究者们致力于解决的难题。本课题拟利用现有远程WEB网生物网络资源，以TERT mRNA为靶点，从靶mRNA的一／二级结构、反义药物与靶序列之间反应自由能变化（ΔG°）以及mRNA系统发育保守性几个方面综合考虑进行反义药物优化设计，以期提高设计的成功率，并发掘反义药物设计的一般规律。 方法 选取人端粒酶催化亚基（hTERT）mRNA作为靶标进行抗肿瘤反义寡核苷酸（antisense oligodeoxyonucleotide,ASODN）的靶向设计和药理学评价，利用自行设计的程序构建了基于远程WEB的生物信息分析平台，针对人mRNA的一级结构的mRNA 5’端，启动密码AUG周围和核糖体的装配部位、编码区和非编码区、进化保守区，以及二级结构单元中结构不稳定的区域重叠部分作为反义药物设计的靶位，筛选出若干个作用效果明显的ASODN。对疗效突出的寡核苷酸候选序列进行体内体外抗肿瘤活性评价，进一步分析其导致人肠癌Lovo细胞凋亡前后的基因表达谱的差异，探讨ASODN抑制人端粒酶催化亚基转录后至翻译前时期细胞调控网络的变化。 结果 1．构建了基于远程WEB的生物信息分析平台。使用基因功能区定位软件分析mRNA一级结构的编码区和非编码区、同时利用同源性比较软件进行物种序列分析以确定进化保守区。再进一步使用mRNA二级结构模拟程序预测人TERT mRNA的二级结构，针对二级结构中膨胀环、内环、发夹、多分支连接部等结构不稳定区域，设计合成靶向TERT mRNA的反义硫代寡核苷酸（ASODN）。以目前国际上已进入临床试验的靶向人类端粒酶RNA模板反义寡核苷酸TTAGGG为阳性对照，结果表明在所设计的29个反义药物中，3个ASODN IC50值(分别为48±7，50±4，64±2．7 nmol1.L-1)显着低于对照的TTAGGG(81±25nmol.L-1)。根据体外药效评价结果，使用统 — — — —计软件SPSS进行构效关系（QSAR）分析显示，构成靶H级结构单元膨胀环、内环、结点碱基数、药物结构自由能和反应自由能在QSAR方程中有统计意义。提示以模拟二级结构为基础的计算机辅助药物设计有助于提高反义药物设计的效率并获得体外药效优于TTAGGG的反义药物。 2．验证了QSAR方程对所设计反义药物药效预测的可靠性。本课题结合靶 mRNA系统发育比较分析和二级结构预测，针对系统发育保守性不同的区域再次设计了 10个 ASODN。结果表明，其中 8个 ASODN与 TTAGGG的实测 IC。。与上述 QSAR方程预测的 IC。值相符，线性回归分析显示 ASODN的实测与预测IQ。之间有较好的相关性，相关系数为0．76(P＜O．0引。提示上述QSAR方程一定程度上反映了ASODN活性与靶结构的关系，对预测反义药物的生物活性有所帮助。 3．体外和体内药效评价显示反义药物对肿瘤细胞有明显的抑制作用。体外试验中，观察了ASODN对人大肠癌LOVO细胞系和鼠源性黑色素瘤B16－BL6细胞系的增殖抑韦作用卜’。结果显示，其中有 3个ASODN：AT0155 （20），AT01S6（20）与AT1261（20）对LOVO细胞增殖抑策的IC朋值显着低于 TTAGGG（P＜0．05）。对于 B16－BL6细胞，其中 5个 ASODN：AT0155（20），AT0186（20），AT0478（20），AT1261（20）及 AT1999（20）的 IC；。值低于100nM，而 TTAGGG对该细胞株的增殖无抑制效应。在体内药效评价实验中，使用BALB八裸鼠荷人源性LOVO肠癌肿瘤模型进行评价。结果显示，对于LOVo肿瘤，AT1261（20）在 0．5，0．25，0．05，0．005mg／kg／day的剂量下对肿瘤生长的抑制率分别为 89．2％，79．3％，64．l％及 ZS．8％，而 TTAGGG在 0．5。g／kg／day的剂量下对 Lovo肿瘤生长的抑制率为 69．2％，显着低于同等剂量的 AT1261（20）(P（．05）。而 TTAGGG对鼠源性肿瘤的生长无抑制活性：｝个错序与随机对照吁mN无体内抑瘤活性。 4．揭示了“靶域”的特征。通过对上述ASODN，如AT1624（20），AT0022 （20），AT1261（20）和 AT0186（20）等进一步分析，发现有效的反义药物相对集中地分布于由若干二级结构单元组成的局部二级结构区域，且集中于同一局部二级结构区域的反义药物活性相似”’「”。我们将这种局部二级结构区域称为“二级结构靶域”（“靶域”）。“靶域”具有如下特点：①局部结构相对稳定（在计算机模拟的最优及次优结构中该结构维持不变）；②区域内包含不少于一个的不稳定二级结构单元（结构自由能＞o）；③具有高度的系统发育保守性。体外细胞MTT法与原位杂交方法证实针对不同
宋海峰,汤仲明,袁守军,朱宝珍[7]（2000）在《定量构效关系方程对靶向蛋白激酶 C-α m RNA的反义药物的活性预测（英文）》文中研究表明以往研究对 34个针对蛋白激酶 C- α m RNA二级结构设计的反义药物 （AS- ODNs）进行了定量构效关系 （QSAR）分析并得到 QSAR方程 .本研究再次设计 1 0个 AS- ODNs验证 QSAR方程对药物活性预测的可靠性 .结果显示其中 4个 AS- ODNsIC50 值明显低于阳性对照 ISIS352 1 （P<0 .0 5） . 8个AS- ODNs与 ISIS352 1的实测 IC50 与 QSAR方程预测相符 ,实测与预测 IC50 之间相关系数为 0 .76（P<0 .0 5） .两个 AS- ODNs,AP1 2 61 （2 0 ）和 AP0 1 86（2 0 ）的实测 IC50 与预测不符 .结果提示 QSAR方程一定程度上反映了 AS- ODNs活性与靶结构的关系 ,对预测反义药物生物活性有益 .但 QSAR方程难以解释的其他因素需进一步研究以优化反义药物设计
宋海峰,汤仲明,袁守军,朱宝珍[8]（2000）在《基于二级结构的靶向蛋白激酶C-α mRNA的反义药物设计及构效关系分析（英文）》文中研究表明目的:通过优化靶向蛋白激酶C-αmRNA的反义设计,获得优于阳性药ISIS3521的反义药物。方法:RNAstructure预测靶mRNA二级结构,针对二级结构单元设计。体外评价药物对A549细胞增殖的抑制效应。SPSS进行构效关系（QSAR）分析。结果:29个反义药物中3个IC50值显着低于ISIS3521。靶二级结构单元膨胀环、内环、结点的碱基数、药物结构自由能和反应自由能在QSAR方程中有统计意义。多元回归R=0.68,P=0.0193。2个S-ODN有良好的靶结构与自由能但药效差。结论:计算机辅助药物设计有助于获得体外药效优于ISIS3521的反义药物。靶二级结构单元的不稳定程度和自由能影响药效。影响药效的其它因素则有待进一步研究。
二、基于二级结构的靶向蛋白激酶C-α mRNA的反义药物设计及构效关系分析(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基于二级结构的靶向蛋白激酶C-α mRNA的反义药物设计及构效关系分析(英文)（论文提纲范文）
（1）抗高血压1,4-二氢吡啶药物通过靶向核受体FXR保护肝脏的结构机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 核受体概述 |
| 1.1.1 核受体分类 |
| 1.1.2 核受体功能域 |
| 1.1.3 核受体LBD的结构和功能 |
| 1.1.4 药物靶点核受体 |
| 1.2 法尼醇X受体FXR |
| 1.2.1 FXR研究进展 |
| 1.2.2 FXR配体介绍 |
| 1.2.3 FXR与配体复合物的晶体结构 |
| 1.2.4 FXR调节肝脏代谢 |
| 1.2.5 FXR和其它代谢 |
| 1.3 抗高血压药物 |
| 1.3.1 钙通道阻滞剂介绍 |
| 1.3.2 钙通道阻滞剂的作用机制 |
| 1.3.3 钙通道阻滞剂研究进展 |
| 1.3.4 老药新功能的研究 |
| 1.4 结构生物学研究 |
| 1.4.1 蛋白质结晶学 |
| 1.4.2 蛋白质晶体结构解析 |
| 1.4.3 蛋白质结构和药物研发 |
| 1.5 本论文的研究依据和思路 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 常用试剂和耗材 |
| 2.1.3 常用溶液配制 |
| 2.1.4 本论文所用的菌株和细胞系 |
| 2.1.5 本论文所用的主要载体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 重组质粒构建 |
| 2.2.3 定点突变 |
| 2.2.4 靶标蛋白FXR LBD的表达 |
| 2.2.5 靶标蛋白FXR LBD的分离纯化 |
| 2.2.6 蛋白质和小分子复合物的晶体解析 |
| 2.2.7 Alpha辅因子结合实验 |
| 2.2.8 荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.9 小鼠实验 |
| 2.2.10 生化指标检测 |
| 2.2.11 组织的基因表达分析 |
| 2.2.12 组织学检测分析 |
| 2.2.13 数据统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 筛选鉴定一系列DHPs作为FXR的特异性配体 |
| 3.1.1 靶标蛋白FXR LBD的表达和纯化 |
| 3.1.2 靶向FXR蛋白高通量筛选配体化合物 |
| 3.1.3 DHPs对FXR LBD和不同辅因子结合能力的调节 |
| 3.1.4 DHPs对核受体FXR转录活性的影响 |
| 3.1.5 DHPs能够特异性地调节FXR转录活性 |
| 3.2 基于复合物晶体结构确定DHPs为FXR的激动剂 |
| 3.2.1 FXR/DHPs/SRC2-3蛋白复合物的制备 |
| 3.2.2 FXR/ DHPs /SRC2-3复合物结晶条件的筛选 |
| 3.2.3 FXR LBD/ DHPs /SRC2复合物晶体的结构解析 |
| 3.3 DHPs与FXR LBD复合物的构效分析 |
| 3.3.1 DHPs与FXR LBD结合模式的分析 |
| 3.3.2 DHPs与FXR LBD结合口袋和空腔的结构分析 |
| 3.3.3 DHPs与FXR LBD相互作用的分子机制 |
| 3.4 DHPs对急性肝损伤小鼠的调节作用 |
| 3.4.1 DHPs对肝损伤小鼠肝脏组织的病理变化影响 |
| 3.4.2 DHPs对肝损伤小鼠肝脏组织的生理指标分析 |
| 3.4.3 西尼地平以FXR依赖性方式调节肝损伤小鼠肝脏组织的病理变化 |
| 3.4.4 西尼地平以FXR依赖性方式调节小鼠肝损伤的生理指标 |
| 3.4.5 西尼地平以FXR依赖性方式调节APAP急性肝损伤小鼠肝脏细胞凋亡 |
| 3.4.6 西尼地平以FXR依赖性方式调节APAP肝损伤小鼠肝脏相关基因的表达 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 DHPs作为FXR的特异性配体 |
| 4.2 DHPs和FXR结合的构效关系 |
| 4.3 DHPs配体调节FXR功能 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩写对照表 |
| 在学期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（2）靶向HBV的siRNA优化设计研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 HBV 基因组全面分析与SIRNA 的设计合成 |
| 1. 引言部分 |
| 1.1 乙肝基因组的结构以及乙肝病毒致病基因的异质性 |
| 1.2 靶向HBV 的siRNA/shRNA 设计的研究现状 |
| 2. 实验部分 |
| 2.1 研究技术路线 |
| 2.2 实验方法与软件 |
| 2.2.1 HBV m RNA 序列的获得 |
| 2.2.2 序列同源性比对与siRNA 的基因型同源性分析 |
| 2.2.3 靶mRNA 二级结构的模拟 |
| 2.2.4 siRNA 二级结构热动力学参数分析 |
| 2.2.5 siRNAs 二级结构分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 基于部分中国HBV B、C 基因型和U9555 1 序列的siRNA 筛选 |
| 3.2 siRNA 的一级结构基因型同源性分析 |
| 3.3 靶mRNA 二级结构的模拟和分析 |
| 3.3.1 HBV 各转录本的核苷酸序列 |
| 3.3.2 RNAstructure4.4 对siRNA 二级结构热动力学参数的分析 |
| 3.4 siRNA 的设计与合成 |
| 第二章 评价SIRNA 抑制病毒活性的定量分析方法的建立 |
| 1. 引言部分 |
| 2. 实验部分 |
| 2.1 实验试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 细胞株 |
| 2.2 实验方法的建立 |
| 2.2.1 细胞培养与siRNA 转染条件优化 |
| 2.2.2 HBsAg 酶联免疫吸附的定量检测 |
| 2.2.3 实时定量RT-PCR 相对定量方法 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 转染条件的优化 |
| 3.2 HBsAg ELISA 定量方法学结果 |
| 3.3 实时荧光相对定量结果 |
| 第三章 SIRNA 体外抑制病毒表达活性与QSAR 分析 |
| 1. 实验方法 |
| 1.1 细胞转染、ELISA 定量检测、mRNA 荧光相对定量方法 |
| 1.2 siRNA 基因型同源性分析与评分系统 |
| 1.3 方差分析有效siRNA 验证与量效关系分析 |
| 1.4 siRNA 有效性结果中mRNA 和HBsAg 相关性分析 |
| 1.5 基于多元线性回归方程的构效关系分析 |
| 1.5.1 一级结构构效关系分析 |
| 1.5.2 二级结构构效关系分析 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 不同剂量下siRNA 对S/P mRNA 和HBsAg 的抑制情况 |
| 2.1.1 siRNA 在不同剂量下抑制S/P mRNA 表达结果 |
| 2.1.2 不同siRNA 在不同剂量下抑制HBsAg 表达结果 |
| 2.2 剂量依赖性分析和有效性排序 |
| 2.3 siRNA 抑制mRNA 和HBsAg 表达的相关性分析 |
| 2.4 一级结构构效关系的多元线性回归分析 |
| 2.5 二级结构构效关系的多元线性回归分析 |
| 2.5.1 二级结构热动力学参数与siRNA 构效关系分析 |
| 2.5.2 二级结构单元与siRNA 构效关系分析 |
| 第四章 SIRNA 活性评价与不同检测终点的关系初步研究 |
| 1 引言部分 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞转染和样品检测 |
| 2.2.2 实时定量RT-PCR 相对定量方法确定m RNA 水平 |
| 2.2.3 HBeAg ELISA 定量检测方法的建立和确证 |
| 2.2.4 细胞tDNA 和cccDNA 的获得 |
| 2.2.5 cccDNA 检测方法的建立和确证 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HBeAg ELISA 定量结果 |
| 3.2 cccDNA 检测的方法学确证结果 |
| 3.3 对细胞cccDNA 检测终点的抑制作用 |
| 3.4 多条siRNA 对各检测终点的抑制情况 |
| 3.5 多元线性回归结果 |
| 3.6 mRNA 水平与蛋白水平相关性分析 |
| 3.7 靶向S 区和C 区的siRNA 对不同检测终点的统计学差异 |
| 3.8 有效性排序 |
| 讨论 |
| 1. 基于复杂基因组设计siRNA 药物候选序列和QSAR 分析的前提 |
| 2. 靶向复杂基因组的siRNA 构效关系的初步研究与规律 |
| 2.1 一级结构构效关系 |
| 2.2 二级结构构效关系 |
| 2.3 该部分研究中的不足与问题 |
| 3. 复杂基因检测终点对于评判siRNA 活性的重要性 |
| 4. 可能有益于复杂基因优化设计的规律 |
| 5. 靶向HBV 的siRNA 的成药的研发前景 |
| 5.1 基因型同源保守性对RNAi 的抗药性的重要意义 |
| 5.2 有待深入研究的问题 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（3）HIF-1α在肝细胞癌中的表达及反义HIF-1α寡核苷酸对HepG2细胞增殖的抑制作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 HIF-1α、YEGF及MVD在肝细胞癌中的表达及临床意义 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HIF-1α AS-ODN对肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 缺氧诱导因子-1的研究进展及与肝癌的关系 |
| 正文 |
| 参考文献 |
| 综述二 肝癌反义寡核苷酸基因治疗的研究现状 |
| 正文 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）灵芝多糖抗病毒和抗肿瘤作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一章 前言 |
| 1 灵芝的有效成分 |
| 1.1 子实体多糖 |
| 1.2 菌丝体多糖 |
| 1.3 灵芝的其它活性成分 |
| 2 灵芝多糖的结构与生物活性之间的关系 |
| 3 灵芝多糖的分离纯化及分析方法 |
| 3.1 多糖的提取 |
| 3.2 多糖的分离纯化及鉴定 |
| 4 发酵培养灵芝菌丝体的研究现状 |
| 5 灵芝多糖的药理作用 |
| 5.1 抗病毒作用 |
| 5.2 免疫调节作用 |
| 5.3 抗肿瘤作用 |
| 5.4 其它药理作用 |
| 6 抗病毒药物的研究现状 |
| 6.1 病毒的致病机理 |
| 6.2 抗病毒药物的作用机理 |
| 7 抗肿瘤药物的研究现状 |
| 7.1 以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物 |
| 7.2 新生血管生成抑制剂 |
| 7.3 端粒酶抑制剂 |
| 7.4 反义药物 |
| 7.5 肿瘤耐药逆转剂 |
| 7.6 分化诱导剂 |
| 7.7 导向治疗剂 |
| 7.8 基因治疗 |
| 7.9 抗癌中草药 |
| 8 本研究的意义 |
| 8.1 灵芝多糖的抗病毒作用机制 |
| 8.2 灵芝多糖的抗肿瘤作用机制 |
| 第二章 研究方法 |
| 2.1 灵芝多糖粗制品的提取 |
| 2.2 灵芝多糖的纯化 |
| 2.3 GLP纯度的鉴定 |
| 2.4 苯酚-硫酸法测多糖含量 |
| 2.5 细胞的复苏 |
| 2.6 细胞的传代 |
| 2.7 MTT比色法 |
| 2.8 台盼兰染色法 |
| 2.9 病毒CCID_(50)测定 |
| 2.10 空斑实验方法 |
| 2.11 病毒毒力的确定 |
| 2.12 病毒基因组DNA的提取 |
| 2.13 实时定量PCR方法 |
| 2.14 从琼脂糖凝胶中回收DNA |
| 2.15 血凝试验及血凝抑制试验 |
| 2.16 流式细胞仪检测CD_4~+和CD_8~+细胞 |
| 2.17 细胞因子的放射免疫试剂盒检测 |
| 第三章 GLP抗病毒作用机制研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 定量PCR和空斑减少试验方法检测GLP的抗病毒作用机理 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 GLP抑制流感病毒的实验研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 GLP的抗肿瘤作用机制研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 读博士期间发表和待发表的研究论文 |
| 致谢 |
（5）基于系统发育比较分析的反义药物优化设计及相关药理学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 第一部分 实验材料 |
| 第二部分 实验方法 |
| 实验结果 |
| 第一章 基于靶mRNA二级结构模拟及其保守性分析的的反义药物优化设计与QSAR分析 |
| 一、靶mRNA同源性分析及二级结构的模拟 |
| 二、基于模拟靶mRNA二级结构的反义药物设计 |
| 三、S-ODNs体外对 SK-BR-3乳腺癌细胞株生长的抑制作用 |
| 四、QSAR分析与多元回归 |
| 第二章 反义药物对目的基因表达的特异性抑制作用 |
| 一、S-ODNs对 HER-2 mRNA表达的特异性抑制作用 |
| 二、HA2741对 HER-2 mRNA表达的特异性抑制作用 |
| 三、HA2741对 HER-2受体表达的影响 |
| 四、S-ODNs对细胞凋亡的影响 |
| 第三章 HA2741体内抗肿瘤活性初步研究 |
| 一、荷人乳腺癌移植瘤动物模型 |
| 二、HA2741对乳腺癌体内生长的影响 |
| 三、HA2741对体内肿瘤 HER-2受体蛋白表达的影响 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附录 |
（6）依据远程WEB生物信息平台靶向设计人端粒酶催化亚基反义寡核苷酸药物的研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 一、 实验材料 |
| 二、 实验方法 |
| （一） 依据远程WEB生物信息平台靶向设计AntihTERT的ASODN |
| （二） 反义药物体外药理学实验及QSAR方程预测评价 |
| （三） 反义药物体内药效的评价实验结果 |
| （四） mRNA差异显示技术分离抑制hTERTmRNA后诱导Lovo细胞凋亡调控基因片段 |
| 结果 |
| 一、 以hTERT为靶的生物信息学分析和ASODN的设计与评价 |
| （一） 靶mRNA的一级结构生物信息学分析 |
| （二） hTERTmRNA二级结构预测和分析 |
| （三） Lovo细胞体外评价所设计反义药物的药效 |
| （四） QSAR分析与多元回归 |
| 二、 QSAR方程预测反义药物的体外药效 |
| （一） 反义药物设计与体外药效预测 |
| （二） 反义药物药效实测 |
| （三） 药效预测值与实测值一致性分析 |
| 三、 靶向mRNA系统发育保守区域设计反义药物的体体外活性 |
| （一） 靶mRNA系统发育比较 |
| （二） 靶向系统发育保守序列的ASODN及其对Lovo细胞的体外药效 |
| （三） ASODN对鼠源性肿瘤细胞的体外抑瘤活性 |
| （四） ASODN对人、鼠源性肿瘤细胞的体内抑瘤活性 |
| 四、 反义药物研究中的“靶域”现象 |
| 五、 AT1261（20）体内外抗肿瘤活性的初步研究和评价 |
| （一） AT1261（20）对端粒酶表达的特异性抑制 |
| （二） ASODN对Lovo细胞的增殖抑制作用 |
| （三） 硫代反义寡核苷酸作用时间的持续性 |
| （四） 硫代反义寡核苷酸体内抗肿瘤活性评价 |
| 六、 端粒酶靶向反义药物诱导凋亡及mRNA差异显示技术分析正常与启动凋亡的Lovo细胞的基因表达差异 |
| （一） 以染色体DNA降解情况判定细胞凋亡方法的建立 |
| （二） ASODN诱导下Lovo细胞出现凋亡时相 |
| （三） 通过撤药实验确定ASODN诱导的Lovo细胞凋亡启动相关基因表达时相靶MRNA |
| （四） mRNA差异显示技术分析正常与启动凋亡的Lovo细胞的基因表达差异 |
| 讨论 |
| 一、 基于靶mRNA二级结构的反义药物设计 |
| 二、 反义药物设计中的“靶域”现象（靶序列的空间构象） |
| 三、 系统发育保守性在反义药物设计中的意义 |
| 四、 生物信息学在反义药物靶向设计中的实际操作和药物设计远程计算的实现 |
| 五、 TERT与细胞凋亡及AT1261（20）的可能应用前景 |
| 六、 TERT在增殖分化等生命调控网络活动的定位与意义 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述： 反义抗肿瘤药物研究进展 |
| 致谢 |
（7）定量构效关系方程对靶向蛋白激酶 C-α m RNA的反义药物的活性预测（英文）（论文提纲范文）
| 1 MATERIALS AND METHODS |
| 1.1 Prediction of secondary structure and the QSAR analysis |
| 1.2 Design and synthesis of the antisense AS-ODNs |
| 1.3 Predicted activities of AS-ODNs designed |
| 1.4 Evaluation of the inhibitory effect on A549 cell proliferation of AS-ODNs |
| 1.5 Data analysis and statistics |
| 2 RESULTS |
| 2.1 Prediction of drug activity and observed IC50 of designed AS-ODNs |
| 2.2 Accordance of observed IC50 and predicted IC50 |
（8）基于二级结构的靶向蛋白激酶C-α mRNA的反义药物设计及构效关系分析（英文）（论文提纲范文）
| INTRODUCTION |
| MATERIALS AND METHODS |
| RESULTS |
| DISCUSSION |
四、基于二级结构的靶向蛋白激酶C-α mRNA的反义药物设计及构效关系分析(英文)（论文参考文献）
- [1]抗高血压1,4-二氢吡啶药物通过靶向核受体FXR保护肝脏的结构机理研究[D]. 魏益娟. 厦门大学, 2018(12)
- [2]靶向HBV的siRNA优化设计研究[D]. 付洁. 中国人民解放军军事医学科学院, 2008(11)
- [3]HIF-1α在肝细胞癌中的表达及反义HIF-1α寡核苷酸对HepG2细胞增殖的抑制作用[D]. 徐萍. 浙江大学, 2008(09)
- [4]灵芝多糖抗病毒和抗肿瘤作用机制研究[D]. 刘静. 武汉大学, 2005(05)
- [5]基于系统发育比较分析的反义药物优化设计及相关药理学研究[D]. 宋海峰. 中国人民解放军军事医学科学院, 2004(11)
- [6]依据远程WEB生物信息平台靶向设计人端粒酶催化亚基反义寡核苷酸药物的研究[D]. 孙正基. 第一军医大学, 2002(01)
- [7]定量构效关系方程对靶向蛋白激酶 C-α m RNA的反义药物的活性预测（英文）[J]. 宋海峰,汤仲明,袁守军,朱宝珍. 中国药理学与毒理学杂志, 2000(06)
- [8]基于二级结构的靶向蛋白激酶C-α mRNA的反义药物设计及构效关系分析（英文）[J]. 宋海峰,汤仲明,袁守军,朱宝珍. Acta Pharmacologica Sinica, 2000(01)