一、一个新的胎肝发育相关因子cDNA的克隆与序列分析（论文文献综述）
张美玲[1]（2018）在《水稻纹枯病菌中2个双分体病毒的基因组结构与功能研究》文中研究说明由水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn AG-1 IA）引起的水稻纹枯病（rice sheath blight）是水稻（Oryza sativa L.）最重要的病害之一。近年来随着真菌病毒研究的开展,水稻纹枯病菌中的真菌病毒也逐渐被发现和研究。已报道的水稻纹枯病菌中的真菌病毒主要为双链RNA（double-stranded RNA,ds RNA）病毒,包括双分体病毒、内源病毒和暂未分类的真菌病毒等。已有研究表明,有的真菌病毒对寄主真菌的生物学性状有一定的影响。而目前,关于水稻纹枯病菌中的真菌病毒对原始寄主真菌的影响的研究甚少。为发现更多的新的真菌病毒,并明确某些真菌病毒对寄主真菌的影响,本研究以实验室保存的13个已知含有真菌病毒的水稻纹枯病菌为研究对象,进行了新真菌病毒的筛选、真菌病毒的基因组结构与功能分析以及真菌病毒对寄主真菌的影响等一系列研究工作。现将主要研究结果报道如下:1.用反转录PCR（RT-PCR）的方法对本实验室前期初步筛选出的13个含有真菌病毒的水稻纹枯病菌株进行新真菌病毒的筛选,结果发现:B240和B261菌株中存在水稻纹枯病菌ds RNA病毒1（Rhizoctonia solani ds RNA virus 1,Rs V1）,菌株A111中只存在病毒Rs V1的片段1,说明了病毒Rs V1的片段1的单独侵染性。水稻纹枯病菌双分体病毒2（Rhizoctonia solani partitivirus 2,Rs PV2）存在于A5和B261菌株中。而A82、A102、A105、A106、A154、A182、D122、D168和Y1等9个菌株中含有与Rs V1和Rs PV2不同的真菌病毒。根据这9个菌株中病毒核酸的琼脂糖凝胶电泳条带,挑选A105和D122两个菌株为本研究的深入研究对象。2.从水稻纹枯病菌A105菌株中分离到一个新的真菌病毒,命名为水稻纹枯病菌ds RNA病毒3（Rhizoctonia solani ds RNA virus 3,RsRV3）。RsRV3基因组含有两个ds RNA片段（ds RNA1和ds RNA2）,大小分别为1890 bp和1811 bp,各含有一个开放阅读框（open reading frame,ORF）,分别编码病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）和外壳蛋白（coat protein,CP）。对病毒粒子进行负染观察,发现该病毒具有等轴的病毒粒子,直径约为20 nm。系统发育分析表明,RsRV3与双分体病毒科（Partitiviridae）的a-双分体病毒属（Alphapartitivirus）成员具有较高的相似性。因此确定真菌病毒RsRV3是隶属于双分体病毒科（Partitiviridae）、a-双分体病毒属（Alphapartitivirus）的一个新的ds RNA真菌病毒。3.从水稻纹枯病菌D122菌株中分离到另一个新的真菌病毒,命名为水稻纹枯病菌ds RNA病毒5（Rhizoctonia solani ds RNA virus 5,RsRV5）。RsRV5基因组含有两个ds RNA片段（ds RNA1和ds RNA2）,大小分别为1894 bp和1755 bp,各含有一个开放阅读框（open reading frame,ORF）,分别编码病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,Rd Rp）和外壳蛋白（coat protein,CP）。对病毒粒子进行负染观察,发现该病毒具有等轴的病毒粒子,直径约为20 nm。系统发育分析表明,RsRV5与双分体病毒科（Partitiviridae）的γ-双分体病毒属（Gamapartitivirus）成员具有较高的相似性。因此确定病毒RsRV3是隶属于双分体病毒科（Partitiviridae）、γ-双分体病毒属（Gamapartitivirus）的一个新的ds RNA真菌病毒。4.病毒脱除方法主要有菌丝尖端法、菌丝尖端与病毒抑制剂结合法、菌丝碎段法和原生质体再生法等。为了获得带毒和不带毒的等基因系菌株,以便建立真菌病毒与寄主真菌的互作体系,本研究利用原生质体再生法成功地把病毒RsRV5从寄主中脱除。对等基因系带毒菌株D122和脱毒菌株D122-P的生物学性状进行比较,病毒RsRV5对寄主的生长速率没有明显影响,但在7 d时间内能提高寄主真菌产色素能力,使寄主真菌产菌核量变少,致病力稍有降低。5.对等基因系的水稻纹枯病菌野生型带毒（RsRV5）菌株D122和不带毒菌株D122-P样本进行转录组测序和生物信息学分析,比较两种样本在转录水平上的差异,旨在了解真菌病毒对寄主真菌转录组的影响。结果表明:测序数据的有效比对序列数为127380018,能够比对到参考基因组的序列数为96371422,比对百分比都达到了70%以上。鉴定出可变剪接事件65535个,其中内含子滞留所占比例最大,外显子跳跃次之。差异基因表达分析表明,病毒RsRV5脱除后,基因rna6273和rna6673表达显着上调,基因rna9529表达显着下调,其中rna6273和rna9529编码未知功能的蛋白,rna6273编码蛋白激酶抑制剂（PKI）功能域蛋白（domain-containing protein）。综上所述,本研究阐明了2种新发现的双分体病毒（RsRV3和RsRV5）的基因组结构与功能的关系,并初步阐明了真菌病毒RsRV5对寄主真菌生物学性状和转录组的影响。
黄欣[2]（2018）在《凝集素、Dorsal及Ras在主要经济虾中的免疫功能研究》文中研究说明虾养殖业带来巨大的经济价值,在全世界范围内受到高度关注。随着环境生态的日益紧张,集约化养殖模式的发展壮大,营养供给的逐渐失衡以及包括细菌、病毒、真菌和寄生虫等在内的多种病原的侵袭,使得虾类病害频发,并给整个水产养殖业造成了一定的经济损失。鉴于此,研究虾类抵抗病原体感染的免疫应答机制对疾病防控具有深远意义。凝集素在病原识别和清除过程中发挥重要作用,但目前对C-型凝集素和L-型凝集素在先天免疫防御中的功能研究却依然有限。Toll信号通路在回应革兰氏阳性细菌和真菌感染,进而调节抗菌肽表达的体液免疫过程中发挥重要作用。作为Toll信号通路中的关键转录因子,Dorsal参与调控抗肽的表达。小G蛋白参与多种细胞生命活动,已有的研究表明在对虾感染病毒的过程中,小G蛋白具有调控血细胞吞噬的作用。为了阐明以上免疫相关基因在甲壳类动物先天免疫系统中的具体功能与作用机制,本研究选取沼虾和对虾作为实验动物,研究了一种含发夹结构域（Clip）的C-型凝集素（Mn-clip-Lec）、一种L-型凝集素（MrVIP36）、Toll信号通路关键转录因子Dorsal（MrDorsal）以及三种Ras小G蛋白（MjRap,MjRas和MjRal）在宿主抗细菌和（或）抗病毒先天免疫防御中的作用。本研究得到如下结果:1.日本沼虾含Cl ip结构的C-型凝集素在细菌感染过程中的功能研究我们在日本沼虾中发现了一种以前没有报道过的含Clip结构域的新的C-型凝集素,命名为Mn-clip-Lec。该凝集素的cDNA全长为1315 bp,含有一个1098 bp的开放阅读框,编码一个包含365个氨基酸残基的蛋白,该蛋白包含一个Clip结构域在N-端以及两个C型凝集素样结构域在C-端。Mn-clp-Lec在血细胞中表达相对较高。在受到金黄色葡萄球菌刺激后,Mn-clip-Lec、酚氧化酶原激活系统主要成员（MnPPAF,MnPPAE和MnPo）以及抗菌肽（MnALF和MnCRU）的表达量明显上调。利用RNA干扰敲低Mn-clip-Lec会减少金黄色葡萄球菌刺激后酚氧化酶原激活系统主要成员和抗菌肽的表达。此外,Mn-clip-Lec基因沉默会降低金黄色葡萄球菌刺激后总血淋巴PO活性。纯化的Mn-clip-Lec重组蛋白（rMn-clip-Lec）能够结合5种细菌且结合活性不同。rMn-clip-Lec能够凝集金黄色葡萄球菌且这种凝集活性依赖钙离子。rMn-clip-Lec可以结合病原菌表面的多糖,如脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）。在结合金黄色葡萄球菌后,rMn-clip-Lec可以在日本沼虾体内促进机体对该菌的清除作用。这些结果表明作为含Clip结构域的C-型凝集素,Mn-clip-Lec参与包括病原识别、诱导酚氧化酶原系统的活化以及调控抗菌肽的表达在内的先天免疫应答。在以上研究的基础上,我们进一步运用酵母双杂交技术从日本沼虾cDNA文库中筛选出了可能与Mn-clip-Lec存在相互作用的蛋白,但需要进一步的验证。这些筛选结果为进一步研究机体对抗病原体入侵的先天免疫应答机制奠定了基础。2.罗氏沼虾L-型凝集素对细菌和病毒感染的免疫应答研究我们从罗氏沼虾中克隆得到了一个L-型凝集素,命名为Mr VIP36。MrVIP36的cDNA全长为1687 bp,开放阅读框为972 bp,共编码323个氨基酸。预测的MrVIP36蛋白包含一个L-型凝集素样结构域（LTLD）和一个跨膜区。进化分析显示,与脊椎动物相比,MrVIP36与无脊椎动物L-型凝集素的进化距离更近。Mr VIP36广泛分布在健康的罗氏沼虾的不同组织,其中在肝胰腺和肠中尤为丰富。在金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌以及白斑综合征病毒（WSSV）刺激后,血细胞中MrVIP36的表达明显上调。MrVIP36的LTLD结构域重组蛋白（rMrLTLD）能够结合所有测试的细菌,并且以钙离子依赖的形式凝集金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌。rMrLTLD还可以结合脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）。此外,rMrLTLD能够在体外抑制细菌的生长,并且在体内促进机体对侵入的细菌的清除。rMrLTLD与WSSV共同孵育后能够抑制WSSV在罗氏沼虾体内的复制。同时,存活率分析也表明rMrLTLD能够减少WSSV感染罗氏沼虾后导致的死亡。这些结果表明MrVIP36可能作为模式识别受体,在罗氏沼虾的抗细菌和抗病毒免疫中发挥重要作用。3.罗氏沼虾Dorsal转录因子在WSSV感染过程中调控甲壳肽的表达我们在罗氏沼虾中鉴定了一个Dorsal同系物,命名为MrDorsal。它的全长cDNA为2533 bp,含有一个1986 bp的开放阅读框,可以编码661个氨基酸。氨基酸序列分析显示MrDorsal含有一个Rel同源结构域（RHD）和一个IPT/TIG结构域,并且包含Dorsal蛋白的特征序列FRYMCEG。MrDorsal在血细胞和鳃中的表达高于在其他组织中的表达。WSSV刺激引起了 MrDorsal与甲壳肽（MrCrustin2和MrCrustin4）的表达增加。沉默MrDorsal会抑制病毒感染后鳃组织中以上两种甲壳肽的转录。这些结果表明在病毒感染罗氏沼虾的过程中,MrDorsal参与调控甲壳肽的表达并发挥重要的免疫作用。4.日本囊对虾小G蛋白家族的3个成员在WSSV感染过程中的功能鉴定我们对日本囊对虾Ras小G蛋白家族的3个成员（分别命名为MjRap、MjRa和MjRal）进行了克隆和鉴定。MjRap、MjRas和MjRal的cDNA全长分别为1236、1330和2074 bp,分别拥有570、609和597 bp的开放阅读框,并分别编码189、202和198个氨基酸。进化分析显示来自不同物种的Rap、Ras和Ral分别聚集在一起。MjRap、MjRas和MjRal广泛分布在健康对虾的血细胞、肝胰腺、鳃、胃和肌肉中。在受到WSSV刺激后的48和72 h,MjRal在鳃中的表达上调,而MjRap和MjRas的转录水平没有变化。进一步研究发现利用RNA干扰沉默MjRal基因后能够显着增加WSSV的拷贝数。此外,体外重组表达的MjRal蛋白（rMjRal）与WSSV共孵育后注入对虾体内,48 h之后检测鳃中VP28的表达和病毒拷贝数。结果显示VFP28的表达没有明显变化,然而病毒拷贝数却明显降低。这些结果表明只有MjRal能够抑制病毒在日本囊对虾体内的复制,并在抵御病毒感染的免疫反应中发挥重要作用。
魏敏[3]（2018）在《半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病相关QTL定位及免疫相关基因筛选和功能分析》文中认为鲆鲽鱼类在形态学分类上隶属鲽形目。其中,半滑舌鳎是我国特有的,温水性近海营底栖生活的海水鱼类,主要分布于我国渤海、黄海等沿海地区,在我国具有极高经济价值和较高的科学研究价值。为了更好的适应底栖生活方式,半滑舌鳎进化发展成为一种具有内脏小,运动少,生长快,占用较少的水体生活空间等生物学特性的鲆鲽鱼类,加之其肉味鲜美,口感爽滑,蛋白质含量高,营养丰富,市场价格高,经济效益好等特点,深受广大海水养殖者的喜爱,成为我国海水养殖的重要经济鱼类。哈维氏弧菌是半滑舌鳎养殖过程中细菌病的主要病原之一,严重影响了半滑舌鳎的经济价值并阻碍了半滑舌鳎养殖业的发展。本论文主要通过对半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病相关基因座进行定位,对免疫相关基因进行初步筛选及对免疫相关基因进行初步功能研究,以期为解析半滑舌鳎抗病机制提供研究基础。1.半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病QTL定位及抗病免疫相关基因筛选为了方便筛选到与抗病免疫相关的候选基因,在实验室之前的研究基础上,对17号染色体（LG18连锁群）已经定位到的抗哈维氏弧菌病相关区间qE进行加密,在半滑舌鳎加密后的整合（LG18）、雌性（LG18F）、雄性（LG18M）连锁群上定位到11个免疫相关基因座,使得抗病相关区间从原先的7.6 Mb缩小到5.6 Mb。将加密后的区间比对到基因组上,发现其中包含311个推定基因。在GO功能富集过程中共富集到13个相关GO term;在KEGG分析中发现5个与免疫相关通路;最终,结合基因功能分类筛选到12个抗病免疫候选基因,并在后续实验中将对其中2个基因（dctn5和stat5bl）进行了深入的研究。以上结果为半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病的深入研究提供了数据基础。2.半滑舌鳎dctn5基因的克隆和特征分析,及dctn5 tv1在免疫应答反应中的功能初步分析为了探索dctn5在半滑舌鳎免疫应答反应中的功能,本试验克隆和鉴定了半滑舌鳎两个cdtn5转录本（分别命名为dctn5tv1 and dctn5tv2）的全长cDNA。这两个变体是通过可变剪切第一和第二个外显子而产生的。不同组织的qRT-PCR检测结果显示dctn5tv1在免疫相关组织中广泛表达,而dctn5tv2主要在性腺中表达。基于这些,推测dctn5 tv1参与了半滑舌鳎免疫应答反应。因此,检测了在哈维氏弧菌感染后的dctn5tv1的mRNA表达水平,结果显示在半滑舌鳎鳃、肠、脾、肾、皮肤中dctn5tv1 mRNA表达水平显着上调,为dctn5 tv1参与半滑舌鳎免疫应答提供了证据。此外,成功重组表达了 Dctn5tv1蛋白并检测了其体外抗菌活性,结果表明Dctn5tv1对大肠杆菌、无乳链球菌、副溶血弧菌、希瓦氏菌和哈维氏弧菌具有不同的抑菌活性,而对革兰氏阳性菌（无乳链球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）具有较高的体外抑菌活性。重组蛋白Dctn5tv1在体外与细菌的结合试验结果显示Dctn5tv1能够在体外与细菌细胞结合,暗示Dctn5tv1的抗微生物活性可能在与细菌细胞结合后起作用。为探索dctn5在半滑舌鳎抗病中的机制提供了研究基础。3.半滑舌鳎stat5bl基因的克隆、鉴定及在免疫应答反应中的表达模式分析为了分析stat5bl在半滑舌鳎免疫应答反应中的作用,本试验克隆和鉴定了stat5bl全长cDNA。在氨基酸序列的多重比对中,硬骨鱼类中的stat5bl和stat5b基因的氨基酸序列相似性较高。此外,在进化分析中发现在硬骨鱼类中stat5bl和stat5b聚为同一个分支,因此推测在硬骨鱼类中stat5bl和stat5b是同一个基因。使用qRT-PCR检测了其在半滑舌鳎不同组织中的表达分布,结果显示stat5bl mRNA在免疫相关组织肝脏、鳃、皮肤高表达,因此推测stat5bl可能参与了半滑舌鳎抗病免疫反应。为了验证stat5bl在半滑舌鳎免疫应答反应中的作用,检测了哈维氏弧菌感染后stat5bl在免疫相关组织中的表达情况,结果显示stat5bl mRNA在肾脏、鳃、肠、皮肤中均出现上调表达,为stat5bl参与半滑舌鳎免疫应答反应中的推测提供了证据。stat5bl基因在肝细胞中敲降后,对Jak-STAT信号通路上的免疫相关基因的表达产生了相应调控作用。初步阐明了sta5bl基因在半滑舌鳎免疫应答反应中的作用。4.半滑舌鳎r-spondin家族新成员（rspo2l）的分子特征、表达及功能初步分析除了对通过QTL定位筛选的免疫相关基因进行功能研究外,还对本实验室通过转录组分析和文献查阅筛选到的R-spondins家族中rspo2l基因进行了相关的功能研究,我们克隆和鉴定了半滑舌鳎r-spondin家族新成员rspo2l全长cDNA。进化分析表明,rspo2l和rspo2分别各聚为一支,暗示raspo2l和rspo2具有不同的进化地位,进一步说明rspo2l和rspo2是两个独立的基因。在不同组织中rspo2l表达模式结果显示,rspo2l mRNA主要高表达于鳃、皮肤、肝脏中,在其它组织中表达较低。此外,还检测了哈维氏弧菌感染后半滑舌鳎免疫相关组织中rspo2l和其下游基因β-catenin的表达水平,结果显示,rspo2l mRNA在鳃,皮肤,脾脏,肾脏均是上调表达,而在肝脏中是下调表达。此外,下游基因β-catenin的表达趋势与rspo2l的相似,暗示rspo2l与Wnt/β-catenin信号通路可能存在一定关联。此外,成功重组表达了 Rspo21蛋白并检测了其体外的抗菌活性,结果表明Rspo21在体外对大肠杆菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌均没有明显的抑菌活性。基于以上结果,我们推测Rspo21不是直接参与了半滑舌鳎的抗病免疫反应而可能是通过调控Wnt/β-catenin信号通路参与了半滑舌鳎的免疫反应。这些初始结果推动了半滑舌鳎免疫应答反应中rspo2l的功能研究。
陈曦[4]（2017）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒上调猪树突细胞CD83的表达及其分子机制》文中指出猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是危害全球养猪业的一种重要病原,可引起母猪繁殖障碍和猪呼吸道疾病,并导致感染猪体免疫抑制,造成严重经济损失,但其致病机理尚不十分清楚。CD83作为树突细胞（DCs）的重要表面分子,它不仅仅是DCs成熟的标志,还是DCs发挥其激发免疫应答作用不可或缺的功能性分子。CD83一方面活化DCs,另一方面为初始T细胞和记忆性T细胞提供共刺激信号,但可溶形式CD83分子（sCD83）具有强大的抑制混合淋巴细胞反应（MLR）和DCs介导的同种异体T细胞增殖反应作用。PRRSV与CD83的相互关系及其机制尚无报道。本研究主要内容如下:1.PRRSV诱导树突细胞CD83表达及其关键功能蛋白的探寻本研究采集PRRSV阴性猪外周血液淋巴细胞（PBMC）,采用GM-CSF和IL-4刺激,制备获得单核细胞衍生的树突细胞（MoDCs）,采用PRRSV 3个不同毒力毒株(高致病性毒株BB0907、经典毒株S1及致弱毒株NT0801,分别以不同剂量感染MoDCs,收集细胞和细胞培养液,分别通过流式细胞术检测MoDCs细胞膜CD83（mCD83）表达,夹心ELISA方法检测细胞培养液sCD83表达,qRT-PCR检测MoDCs CD83 mRNA水平,发现3种不同病毒株均可上调mCD83及其mRNA水平,并能够强烈诱导sCD83分泌。采用基因步移试剂盒扩增获得850 bp的CD83启动子基因,克隆至pGL3-Basic质粒,成功建立CD83双荧光报告基因检测系统。将PRRSV BB0907毒株编码蛋白基因克隆至pVAX1,构建成功PRRSV编码蛋白基因真核表达质粒。将不同真核表达质粒与CD83启动子报告基因共转染Marc-145和HEK293细胞,发现PRRSVN、nsp1及nsp10蛋白能够显着上调CD83启动子活性,表明PRRSVN、nsp1及nsp10蛋白在促进MoDCs表达sCD83方面发挥重要作用2.PRRSV N蛋白诱导树突细胞CD83表达及其分子机制本研究利用丙氨酸突变技术,构建PRRSV N蛋白基因的8个连续氨基酸（aa）残基突变体的基因重组质粒,转染Marc-145和HEK293细胞,采用CD83双荧光报告基因检测系统检测,结果显示:N蛋白第43和44aa残基能够上调CD83基因启动子活性。利用PRRSVBB0907毒株感染性cDNA克隆（pBB/wt）,通过融合PCR方法构建上述N蛋白基因突变重组质粒,构建感染性cDNA克隆,拯救获得N蛋白第43和44aa突变重组PRRSV[rK43A和rR44A]及其回复重组病毒[rK43A（R）和rR44A（R）]。该4种重组病毒空斑和生长特性与其野生重组病毒rBB/wt相似,但rK43A与rR44A上调CD83启动子活性明显低于rBB/wt（P<0.001）,rK43A（R）与rR44A（R）上调CD83活性与rBB/wt相似。将4种重组病毒及rBB/wt接种MoDCs后测定CD83表达水平,rK43A和rR44A组中的CD83 mRNA水平,mCD83表达水平及sCD83分泌量都明显低于rBB/wt、rK43A（R）和rR44A（R）组。根据CD83启动子基因序列含有的多个Sp1结合位点及NF-κB结合位点,利用Sp1 siRNA及NF-κB抑制剂研究Sp1及NF-κB在PRRSV N蛋白上调CD83中的作用。CD83双荧光报告基因检测系统检测结果显示,Sp1 siRNA及NF-κB抑制剂均能够阻断PRRSV及N蛋白质粒对CD83启动子的激活,但对rK43A和rR44A重组病毒激活CD83启动子活性无明显差异。rK43A和rR44A重组病毒感染MoDCs诱导的Sp1和NF-κB mRNA水平明显低于rBB/wt。上述结果表明,PRRSV N蛋白N端非共价键区域是PRRSV N蛋白上调CD83的关键区域,PRRSVN蛋白通过Sp1及NF-κB信号通路诱导CD83表达,从而丰富了 PRRSV免疫抑制理论基础。3.PRRSV nsp10蛋白诱导树突细胞CD83表达及其分子机制本研究采用截断体和丙氨酸基因突变技术,构建了 8个连读5aa突变体及多个点突变体重组质粒,与pCD83报告基因共转染Marc-145和HEK293细胞,采用CD83双荧光报告基因检测系统检测,结果显示:nsp10的第192至196aa和214-216aa残基,均能够上调CD83启动子活性。利用PRRSV BB0907毒株感染性cDNA克隆（pBB/wt）,通过PCR方法构建了 nsp10位点基因突变体,拯救获得nsp10蛋白第192-196和214-216aa 突变重组PRRSV[rP192-196A,rG214-216]及其回复病毒[rP192-196A（R）和rG214-216（R）]。Nsp10基因突变重组PRRSV空斑和生长特性与其野生重组病毒rBB/wt相似,但rP192-196A和rG214-216对CD83启动子调节活性明显低于rBB/wt、rP192-196A（R）和rG214-216（R）。将重组病毒接种MoDCs后测定CD83蛋白水平,rP192-196A 和 rG214-216 对 CD83 诱导能力也明显低于 rBB/wt、rP192-196A（R）和rG214-216（R）。此外,Sp1 siRNA及NF-κB抑制剂均能够阻断PRRSV及Nsp10重组质粒对CD83启动子的激活,但对rP192-196A和rG214-216激活CD83启动子活性无明显影响。rP192-196A和rG214-216感染MoDCs诱导的Sp1和NF-κB mRNA水平明显低于rBB/wt组。上述结果表明,PRRSV nsp10的P192-196aa及G214-216aa是PRRSV Nsp10上调CD83的关键区域,PRRSV Nsp10也通过Sp1及NF-κB信号通路诱导CD83表达。4.PRRSV通过sCD83介导抑制MoDCs免疫调节作用本研究利用大肠杆菌表达系统和重组蛋白纯化技术,制备sCD83重组蛋白。将sCD83重组蛋白预处理MoDCs并与PBMC分离的T细胞共培养,结果显示,随着sCD83剂量的增加,T细胞增殖明显减低。采用CD83抗体预先封闭MoDCs后,则其丧失对T细胞增殖的抑制能力。Western blot检测结果显示,sCD83蛋白以剂量依赖的方式抑制LPS刺激的MoDCs中TAP1和ERp57蛋白的表达,表明sCD83能够明显抑制T细胞的增殖,降低MoDCs细胞抗原提呈能力。将PRRSV感染的MoDCs与PBMC中T细胞共培养结果显示,PRRSV感染能够抑制MoDCs促进T细胞增殖,采用CD83抗体封闭MoDCs,PRRSV抑制作用明显降低。同时,PPPSV感染明显抑制MoDCs中TAP1和ERp57蛋白表达。上述结果表明,PRRSV通过诱导sCD83抑制MoDCs抗原提呈及MoDCs介导的T淋巴细胞增殖作用,丰富了 PRRSV免疫抑制机制理论基础。5.PRRSV nsp1通过sCD83介导抑制MoDCs免疫调节作用及其关键氨基酸位点本研究构建了 PRRSV BB0907毒株nsp 1、nsp 1 α及nsp 1 β真核表达质粒,发现仅nsp1α具有上调CD83启动子活性功能。根据nsp1α功能域构建nsp1α截断体,同时利用丙氨酸突变技术构建10个半胱氨酸位点突变的重组质粒,发现nsp1α上调CD83的功能区域位于锌指结构域,nsp1α的C8半胱氨酸对上调CD83也有重要作用。针对锌指结构域,构建12个连续4-6个氨基酸突变的重组质粒及多个点突变重组质粒,发现nsp1α调节CD83的功能位点位于第5aa、6aa、45aa、48aa及61-66aa。因此,构建了 PRRSV BB0907 毒株 nsp1α 第 5-2aa、45a/48a 及 61-6aa 单突变重组病毒[rL5-2A、rG45/G48A、rL61-6A]及双突变体病毒rNsp1α-2m和rNsp1α-3m,随后构建了回复病毒[rL5-2A（R）、rG45/G48A（R）、rL61-6A（R）、rNsp1α-2m（R）和 rNsp1α-3m（R）]。除了 rL5-2A和rNsp1α-3m,其他突变重组病毒空斑和生长特性与其野生重组病毒 rBB/wt 相似,rL5-2A、rG45A/G48A、rL61-6A、rNsp1α-2m 和 rNsp1α-3m 重组PRRSV上调CD83启动子活性明显下降,表明PRRSV nsp1α锌指结构域5-2aa、45a、48a及61-66aa与上调CD83作用密切相关。为了进一步检测nsp1α的免疫抑制效应,将nsp1α突变重组PRRSV感染MoDCs,检测MoDCs抗原提呈相关蛋白TAP1和ERp57表达水平及PRRSV感染MoDCs对T细胞增殖能力,结果显示,与野生重组病毒相比,nsp1α 突变重组病毒 rL5-2A、rG45A/G48A、rL61-6A、rNsp1α-2m 和 rNsp1α-3m感染细胞TAP1和ERp57表达水平明显回升,且T细胞增殖能力也显着回升,表明突变体病的的抑制效应不同程度丧失。上述结果表明,PRRSV nsp1通过sCD83介导抑制MoDCs免疫调节作用,其关键氨基酸位点是第5-6aa、45aa、48aa及61-66aa,从而丰富了 PRRSV nsp1α能够引起机体的免疫抑制的理论基础。
周翠姬[5]（2017）在《BrYV与PEMV2协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱研究》文中研究说明病毒协生互作是指两种不相关的病毒复合侵染同一寄主植物,使寄主植物出现更加严重的症状或者其中一种或两种病毒的积累量增加。马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）是最具有经济重要性的植物病毒属之一,该属病毒常与幽影病毒属病毒（umbraviruses）复合侵染,引起严重的植物病害。然而,马铃薯卷叶病毒属病毒与幽影病毒属病毒协生互作的机制尚不十分清楚。本论文以马铃薯卷叶病毒属的芸薹黄化病毒（Brassica yellows virus,BrYV）以及幽影病毒属的豌豆耳突花叶病毒2号（Pea enation mosaic virus 2,PEMV 2）为主要研究材料,对BrYV与PEMV 2在本生烟（Nicotiana bentaamiana）协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱进行研究。与BrYV或PEMV 2单独侵染本生烟时相比,BrYV与PEMV 2复合侵染本生烟导致:（1）本生烟植株产生严重的症状;（2）BrYV的积累量明显升高;（3）BrYV能够进行摩擦接种;（4）BrYV突破韧皮部局限。BrYV P0突变体病毒BrYV-APO和BrYV-P0H10Q/T11P并不能与PEMV 2在本生烟上协生互作。而缺失了通读结构域（Read-through domain,RTD）的BrYV病毒突变体（BrARTD）能与PEMV 2在本生烟上协生互作。通过农杆菌介导的叶盘转化方法获得了能稳定表达BrYV P0-6×Myc或PEMV 2 ORF4-3×Flag的转基因本生烟植株,为后续研究提供重要的实验材料。以上结果表明BrYV与PEMV 2在本生烟上存在协生互作并引起一系列的协同效应。转录组高通量测序结果表明与BrYV或PEMV 2单独侵染本生烟时相比,BrYV与PEMV 2复合侵染本生烟引起更多的基因表达发生变化,有1778个基因的表达在病毒复合侵染时发生特异性的上调或下调,这些基因主要包括光合作用相关基因、乙烯相关基因、植物防御相关基因、RNA沉默相关基因、转录因子和蛋白翻译相关基因。推测在BrYV与PEMV 2协生互作时发生特异性变化的基因为潜在的与病毒协生互作相关的寄主因子。小RNA高通量测序结果说明BrYV与PEMV 2协生互作主要对来源于BrYV病毒的小干扰RNA（Virus-derived small interfering RNAs,vsiRNAs）产生影响,表现为:（1）显着提高了 BrYV vsiRNAs的积累量;（2）改变了 BrYV vsiRNAs的正负义链的比例;（3）明显地改变了 BrYV vsiRNAs在BrYV基因组上的分布以及相对积累量。BrYV与PEMV 2复合侵染本生烟特异性地引起14个本生烟miRNAs表达水平的变化,其中6个为显着上调,8个为显着下调。以上结果解析了病毒协生互作对病毒vsiRNAs以及寄主miRNAs的影响。同时,对Polerovirus新病毒进行了分子鉴定与序列分析。从豌豆和蚕豆样品中发现并鉴定了一种新的马铃薯卷叶病毒属病毒,暂命名为豌豆温和褪绿病毒（Pea mild chlorosis virus,PMCV）。另外,从甜菜样品中发现了甜菜西方黄化病毒（Beet western yellows virus,BWYV）的一种新株系并获得了其全长基因组序列,该株系存在两种基因型,即BWYV-BJA和BWYV-BJB。这两种基因型全长序列一致性为93.0%,序列差异主要位于基因组的5’端区域,其它区域则相对保守。系统发育进化树分析和重组分析表明BWYV-BJA和BWYV-BJB可能是重组病毒。
范宝超[6]（2015）在《猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Tregs细胞和中和抗体的功能蛋白及其关键氨基酸位点的解析》文中认为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是造成世界养猪业重大经济损失的主要病原之一。病毒基因存在较大变异。PRRSV感染可以引起免疫抑制,导致持续性感染,而宿主所产生的获得性免疫反应可作为病毒的选择性压力,在病毒基因进化过程中发挥重要的作用。但目前对PRRSV免疫抑制和免疫逃逸的机制尚不十分清楚。本研究从我国中部某发病猪场发现GP3部分基因缺失的PRRSV毒株。通过单核衍生树突状细胞（MoDCs）与外周血淋巴细胞（PBMCs）的共培养方法,确定高致病性PRRSV（HP-PRRSV）毒株较传统毒株（C-PRRSV）诱导调节性T细胞（Tregs）的能力更强,并发现PRRSV N蛋白的15N和46R两位氨基酸酸（aa）在诱导Tregs中起重要作用。同时,通过病毒体外中和抗体下连续传代获得抗性毒株,采用中和抗体试验和cDNA感染性克隆技术,发现GP5蛋白第102和104位aa,及M蛋白第70位aa为诱导PRRSV中和抗体的关键位点,对阐明PRRSV免疫抑制机制和PRRSV抗原变异监测有重要意义。主要研究内容分为以下4个部分:1.我国出现新的PRRSV GP3部分基因缺失毒株本研究于2012年我国上海市某规模猪场患病仔猪中分离获得一株PRRSV,命名为SH1211。全基因组测序结果显示,除去3’端多聚腺苷酸尾巴（Poly:A）,该毒株基因组全长15,313个碱基。与HP-PRRSV毒株JXA1的基因同源性达94.9%。ORFs推导的aa与美洲型PRRSV毒株相比,SH1211毒株GP3第68和69缺失两位aa;GP2和GP5与JXA1相应蛋白的同源性分别为91.5%和85.1%。进化树分析表明,SH1211全长与我国HP-PRRSV分离株距离最近,其中,GP2和GP5与QYYZ毒株距离最近。基因重组分析表明,SH1211为JXA1和QYYZ的重组毒株,重组位置位于GP2和GP5基因编码区域。因此,SH1211是一株具有明显变化的新型PRRSV毒株,丰富了该病毒流行病学资料。2.PRRSV诱导Tregs功能蛋白及其关键氨基酸位点的解析本研究首先建立了外周血单核细胞衍生树突状细胞（MoDCs）培养方法和CD4+CD25+Foxp3+ Tregs的检测方法;然后通过不同毒力的美洲型PRRSV毒株体外感染MoDCs和淋巴细胞的共培养系统,经测定发现,HP-PRRSV毒株较C-PRRSV诱导Tregs能力更强,并且其诱导产生的Tregs具有抑制PHA刺激的同源淋巴细胞增殖的能力。为了探索PRRSV诱导Tregs的功能蛋白,我们采用杆状病毒表达系统获得HP-PRRSV毒株纯化重组GP5、M和N蛋白,结果证明只有N蛋白具有诱导Tregs的能力。然后通过使用覆盖N蛋白全长的16条合成肽,进行Tregs诱导试验,发现N蛋白中3个aa区域15-21、42-48和88-94在诱导Tregs中起重要作用。最后利用HP-PRRSV感染性cDNA克隆获得的点突变重组病毒,确定N蛋白的15N和46R残基为诱导Tregs的关键位点,并且Tregs的表型与分泌TGF-β的Th3型Tregs非常相似。该研究对阐明PRRSV感染的免疫机制作用有重要意义。3.PRRSV诱导中和抗体功能蛋白及其关键氨基酸位点的解析本研究采用HP-PRRSV BB0907毒株在PRRSV中和抗体血清（NAb）环境中连续传代,经蚀斑纯化获得5株抗性毒株BB5s、BB10s、BB20s、BB30s和BB34s,且BB34s的中和滴度显着降低。经测序发现该毒株结构蛋白区域发生9个aa突变,分布于 GP2（G198V）、GP3（P69S、K71R 和 S226P）、GP4（D43N 和 F44S）、GP5（Y102C和G104R）和M（R70K）。为确定上述aa突变对抗体中和作用的影响,利用HP-PRRSV感染性cDNA克隆获得含有相应点突变的重组病毒,经中和试验确定,GP5蛋白的第102和104位aa、M蛋白的第70位aa为HP-PRRSV NAb作用的关键位点。并且aa序列比对发现,GP5的Y102C和G104R,以及M的R70K变异频繁存在于美洲型PRRSV毒株之中。最终,本研究确定GP5蛋白第102和104位aa,及M蛋白第70位aa为PRRSV NAb作用的关键位点,并且上述位点aa的改变调节了 PRRSV对NAb中和作用的敏感性。4.HP-PRRSV对高原藏香猪的致病性研究藏香猪是一种特殊类型的猪种,对HP-PRRSV易感性尚未见报道。本研究我们在高原地区,选择15头PRRSV阴性的4周龄藏香仔猪,随机分为3组,每组5头。第1组滴鼻接种HP-PRRSV毒株BB0907;第2组与接种猪（第1组感染猪）接触饲养2天后分开;第3组为空白对照组。所有组隔离饲养观察14天。结果为:攻毒组和接触组仔猪第3-5天体温达40.0。C以上,并出现精神沉郁、厌食、嗜睡、眼睛有粘性分泌物和后肢麻痹等症状,死亡率分别为80%和40%,主要病变为间质性肺炎。感染后4-14天出现病毒血症;感染仔猪的血清、肺部灌洗液和淋巴结组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等细胞因子显着升高,证明HP-PRRSV毒株对藏香猪有较强致病作用,加强我国高原地区PRRSV预防和控制十分必要。
刘巧[7]（2010）在《油茶蛋白磷酸酶基因的全长cDNA克隆与序列分析》文中研究表明可逆性蛋白磷酸化的发现是人类研究细胞信号转导工作中的里程碑。蛋白激酶和蛋白磷酸酶是催化可逆性蛋白磷酸化和脱磷酸的2种关键酶类。由蛋白磷酸酶所催化的脱磷酸化作用可以改变信号通路中许多关键蛋白质的生理生化特性,如酶催化活性以及蛋白质亚细胞定位等,从而影响细胞的增殖、分化和凋亡以及个体生长和发育。本论文主要研究结果如下：1)油茶蛋白磷酸酶基因的分离与鉴定。在本实验室已构建的油茶cDNA文库中,鉴定出四条PPase基因,其中1条为MPP基因,长度1436bp；1条为PTP基因,长1067bp；2条为PP2C基因,分别长823bp和1501bp；除最后一条PP2C基因外,它们均含有poly（A）。将此四条cDNA序列经过经过在线翻译并同其它物种的同类蛋白质序列进行比对发现,MPP基因第194-982bp属于编码区,对应其他物种的同种蛋白质的首位至末位氨基酸,相似性很高,推断此cDNA克隆是蛋白磷酸酶MPP基因全长,命名为CoMPP1基因；PTP基因第9-878bp属于编码区,对应于其它物种的同种蛋白质的第16或第45个氨基酸至末位氨基酸,相似性很高,推断此cDNA克隆是蛋白磷酸酶PTP基因的部分序列,其5’端缺失了编码约16～45个氨基酸残基及非编码区的cDNA序列,命名为CoPTPl基因；长度为823bp的PP2C基因第1-518bp属于编码区,对应于其它物种的同种蛋白质的第240个氨基酸至末位氨基酸,相似性很高,推断此cDNA克隆是蛋白磷酸酶PP2C基因部分序列,其5’端缺失了编码约240个氨基酸残基及非编码区的cDNA序列,命名为COPP2C1;另一条PP2C基因第2～1162bp属于编码区,对应于其它物种的同种蛋白质的第12个氨基酸至末位氨基酸,相似性很高,推断此cDNA克隆是蛋白磷酸酶PP2C基因部分序列,其5’端缺失了编码约12个氨基酸残基及非编码区的cDNA序列,3’端缺失了部分非编码区cDNA序列,命名为CoPP2C2。2)油茶蛋白磷酸酶基因的全长cDNA克隆。以优良无性系湘林1号种子为材料提取RNA,将其反转录的cDNA作为模板,根据实验室已构建的EST文库核苷酸序列片段以及从油茶近成熟种子cDNA文库中分离鉴定出的三条不完整的PPase基因片段进行拼接,用专业软件Primer Premier 5.0设计RACE特异引物,通过RACE技术扩增出蛋白磷酸酶CoPTP1基因和CoPP2C1基因的完整5’端,克隆产物经过插入pMD18-T载体,以及转化大肠杆菌DH5α菌株等一系列操作之后送至生物公司测序,克隆片断测序结果通过Vector NTI 9.0等生物信息学软件的分析,相互之间有序的拼接,获得了1170bp的CoPTP1基因和1453bp的CoPP2C1基因的全长cDNA序列。3)油茶蛋白磷酸酶的生物信息学分析。通过生物信息学软件Vector NTI 9.0对测序结果进行分析：CoMPP1基因cDNA长度1436bp,含有一个786bp的ORF,编码262个氨基酸,5’端和3’端非编码区分别为193bp、454bp; CoPTPl基因cDNA长度1170bp,含有一个927bp的ORF,编码309个氨基酸,5端、3端非编码区分别长51bp、189bp; CoPP2C1基因cDNA序列长1453bp,含有一个1113bp的ORF,编码371个氨基酸,5’端、3端非编码区分别为48bp和289bp。在GenBank序列BLAST比对获知三条蛋白磷酸酶CoMPP1、CoPTP1和CoPP2C1与其它物种的同种蛋白序列相似性分别达到84%、71%、79%。根据三条蛋白磷酸酶基因的cDNA序列推导出蛋白质的氨基酸序列,应用一系列生物信息学软件对理化性质、高级结构等进行预测分析,结果显示：CoMPP1蛋白等电点5.17,分子量29.7kDa,不稳定系数32.82,脂肪系数77.75；CoPTPl蛋白等电点7.56,分子量34.7kDa,不稳定系数45.99,脂肪系数103.73；CoPP2C1蛋白等电点5.33,分子量40.2kDa,不稳定系数53.73,脂肪系数80.35；三个磷酸酶均无跨膜结构区域,无信号肽位点,是非分泌蛋白。
卢秉国[8]（2009）在《龙眼子叶胚发育相关的若干基因克隆及序列分析》文中提出龙眼（Dimocarpus Longan Lour）属无患子科（Sapindaceae ）龙眼属,是我国南方诸省较重要而有特色的一种热带亚热带木本果树。由于龙眼合子胚遗传背景复杂,童期长,阻碍对其胚胎发育相关基因的研究。本文以龙眼子叶胚为材料,建立cDNA-AFLP技术体系,分析龙眼胚胎发育相关的基因差异表达,为研究龙眼胚胎发育奠定基础。建立了RACE体系,克隆了看家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（GAPDH）,并作为后续试验的内参;以这个RACE体系克隆了一系列与龙眼胚胎发育相关的基因,同时对这些基因在胚胎发育中的表达特性也进行了研究。1利用cDNA-AFLP技术分析龙眼子叶胚的发育分别以小量法和大量法提取‘红核子’龙眼谢花后35天子叶胚（早期子叶胚）和谢花后50天子叶胚（晚期子叶胚）的RNA,经过合成双链cDNA、酶切、加接头、预扩增和选择性扩增一系列步骤,建立适宜于龙眼子叶胚的cDNA-AFLP分析体系,得到了条带清晰、对应良好、信号强度基本一致、分布均匀的cDNA-AFLP指纹图谱,对41个差异片段回收克隆和序列分析,发现其中21个与已知功能基因具有高度同源性,这些基因的功能主要涉及侧生器官的离轴极性、糖酵解、能量代谢、离子转运、细胞壁伸长、细胞周期调控、RNA转录、RNA翻译和调控、蛋白磷酸化调控和降解、信号转导等;另外20个片段与已知基因的同源性较低或未发现同源性。随机挑选7个进行RACE扩增,RT-PCR检测其表达情况。2龙眼子叶胚GAPDH基因全长cDNA克隆及序列分析根据Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit特点,设计两端锚定引物,同时根据与已知的GAPDH基因高度同源的EST序列设计巢式引物,成功地扩增出该基因的3′端和5′端,说明这种RACE方法适合用于扩增龙眼子叶胚的基因。序列分析表明,该基因的cDNA全长为1395bp,包括一个长1008bp,编码336个氨基酸的开放阅读框,其核苷酸和氨基酸序列与其他物种的GAPDH基因具有高度同源性。GAPDH基因是组成型表达,可以作为内参基因。3龙眼子叶胚离轴极性基因YABBY2的克隆和序列分析采用巢式的RACE方法,获得与拟南芥YABBY2同源的基因,共获得三个全长YAB2-1,YAB2-2,YAB2-3和三个片段YAB2-4,YAB2-5,YAB2-6。生物信息学分析表明这几个基因有不同的3′端非编码区和5′端非编码区,有高度一致的开放阅读框,在YAB2-1,YAB2-2,YAB2-3的5′端非编码区发现疑似的IRES序列。半定量RT-PCR分析表明YAB2-3在早期子叶胚显着地表达,在晚期子叶胚中微量表达;YAB2-1和YAB2-2在早期和晚期胚都显着表达,但早期表达量大;YAB2-4是微量表达的基因,在晚期胚胎表达量较大。4龙眼胚胎FVE、Remorin、CCR4-NOT等基因克隆和序列分析采用巢式的RACE方法,成功地扩增龙眼的FVE、Remorin、CCR4-NOT的全长序列,获得硫转运蛋白基因的5′端序列、脱水应答蛋白相关基因3′端序列和几丁质酶基因3′端序列。FVE基因具有WD40superfamily结构域,表达量极其显着,早期表达量较大;Remorin基因在早期胚中显着地表达,在晚期胚微弱地表达;CCR4-NOT基因在早期和晚期胚都显着表达,早期胚胎表达量较大;硫转运蛋白基因是微量表达的基因,在早期胚胎中表达量较大;几丁质酶基因也是微量表达的基因,在晚期胚胎表达量较大。脱水应答蛋白的相关基因在早期胚显着表达,但晚期胚微量表达。
郜刚[9]（2008）在《青枯菌诱导的马铃薯防卫相关基因克隆与表达》文中进行了进一步梳理马铃薯（Solanum tuberosum）是重要的粮菜兼用作物,其适应性强、丰产性好、营养丰富、经济效益高、适于加工,在食物安全结构中具有举足轻重的地位。马铃薯种植和生产常受青枯病（Ralstonia solanacearum）的严重威胁。因此加速病害控制和抗病育种研究显得非常重要,这就迫切要求阐明马铃薯与青枯菌互作的分子机理,挖掘和利用优良抗性基因用于马铃薯抗病遗传结构的改造。目前关于马铃薯应对青枯菌的防卫或抗病相关基因的种类、数量及其表达调控等知之甚少。本论文针对马铃薯与青枯菌互作早期受病菌诱导的防卫相关基因及其表达模式进行初步研究,目的在于为揭示马铃薯与青枯菌互作的分子机制提供一些有用信息。本研究以伤根灌菌法接种马铃薯,应用抑制差减杂交技术构建病原诱导后差异表达EST文库;应用SMART技术构建富集青枯菌诱导的防卫相关基因cDNA文库;从差异表达EST文库中筛选与防卫相关的增强表达基因片段,采用基因本体论（gene ontology,GO）对其进行功能注释和分类;结合快速扩增cDNA末端技术获得部分防卫相关基因的全长cDNA,然后对其诱导表达模式进行qRT-PCR和Northern杂交验证。主要结果如下:1.通过构建马铃薯与青枯菌互作早期受病菌诱导表达基因的差减EST文库,筛选鉴定出上调表达EST共计189条。利用同源检索结合GO术语（GO term）初步确定了防卫相关基因122个,它们分别属于生物过程（25.42%）、分子功能（40.98%）、细胞组分（15.57%）。随机抽取5条EST做RT-PCR分析,证明其在病程早期明显受到青枯菌的诱导上调表达。2.结合GO分类和先验基因功能分析,展示了自根系接种青枯菌诱导感病马铃薯基因型防卫相关基因的EST内容;通过与同类病害的相关EST的纵向比较以及与另外一种维管束系统病害葡萄皮尔斯病病原苛养木杆菌诱导的葡萄EST转录谱的横向比较分析,找出了它们与本研究中防卫相关基因EST的异同;初步鉴别出一些可用于辨识抗性的关键防卫基因,这些基因可用来作为开发抗病品种可能的分子靶标。3.利用富集青枯菌诱导的防卫相关基因cDNA文库与RACE结合的方法,克隆了11条关键防卫基因的全长cDNA,包括非特异性脂质转移蛋白（StLTPa1,StLTPa7,StLTPb1,StLTPb3, StLTPf10）、印膜蛋白（StREMa4）、植物铁蛋白（StFb8）、开心蛋白（StYPa5）、蛋白酶抑制子（StPIa3）、MBF转录因子（StMBFb7）、NAC转录因子（StNACb4）等。4.结合青枯菌诱导、化学处理、环境扫描电子显微镜和EDAX能谱分析,发现非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7在马铃薯与青枯菌互作早期表现与钙相关、受病菌诱导的系统表达模式,非生物激发子水杨酸、茉莉酸、脱落酸以及一定浓度的氯化钙能够诱导该基因增强表达,钙离子通道抑制剂钌红可以抑制其表达;原位杂交显示其转录物主要在马铃薯茎、叶维管束系统的韧皮部细胞中积累,暗示其在青枯菌入侵和定殖的微管束系统中发挥作用。StLPTa7基因可能参与马铃薯系统获得抗性中的长距离信号转导。对这种钙离子相关的基因表达模式在抗病反应中的作用机制提出了一个可能的工作模型。5.对另一个非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa1的表达分析表明,该基因在马铃薯的抗病基因型和感病基因型中差异诱导表达:在抗病基因型中的诱导表现得更快、更高、更强。在远离根部接种位点的组织和靠近接种位点的组织中的表达差异明显。该基因同样受水杨酸、茉莉酸和脱落酸的诱导并产生一定时间的持续效应。原位杂交结果显示StLTPa1主要在马铃薯茎、叶维管束系统的韧皮部细胞中表达。其表达特性与植物的抗病类型有一定的因果关系。6.从马铃薯根际土壤和块茎中分离到两株低温适应型青枯菌菌株,对其进行微生物学、病理学特征分析和分子鉴定,发现其属于青枯菌生理小种3号、生化变种2号,具有小菌落、小细胞、胞壁加厚、生长缓慢、细胞自聚、对固体培养基具强粘附性、潜伏感染等诸多小菌落变异株（small colony variants,SCVs）特征。检测其潜伏感染马铃薯后,非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7和StLTPa1的表达,结果表明SCV不能诱导这两个基因的上调表达,说明该防卫基因的表达与病菌的致病性相关。通过文库构建、基因克隆及其表达模式研究,本论文确定了自根系接种的感病马铃薯基因型早期防卫相关基因的种类、数量;初步确定了非特异性脂质转移蛋白的表达模式;发现青枯菌诱导的马铃薯防卫相关基因与苛养木杆菌诱导的葡萄防卫相关基因在生物过程和分子功能方面具有很大的相似性,而在细胞组分上具有较大的差别,而且不同的接种方法诱导的马铃薯青枯病防卫相关基因有很大的差异;青枯菌小菌落变异株不能诱导nsLTP基因的上调表达表明了该基因的表达与青枯菌的致病性有关。这些实验结果为进一步大范围基因表达分析、深入研究青枯病防卫机制奠定了基础。
刘君[10]（2008）在《乙烯对麦冬光合作用的影响及相关基因的克隆》文中进行了进一步梳理乙烯（ethylene,ETH）在植物生长发育过程中具有重要的生理作用。本研究的目的是在分析乙烯（ETH）对麦冬（Ophiopogon japonicus）光合作用影响的基础上,利用SSH等分子生物学实验技术,从麦冬中克隆与植物衰老相关的基因,为培育绿期长的草坪草新品种奠定基础。通过测定麦冬的光响应曲线和CO2响应曲线得知麦冬的光饱和点在为500μmol·m-2·s-1,光补偿点为10μmol·m-2·s-1,CO2的饱和点为1200μmol·m-2·s-1,CO2补偿点为20μmol·m-2·s-1。乙烯可明显抑制麦冬的净光合速率,使其随处理时间的延长呈下降趋势,乙烯利各浓度间、处理时间之间差异极显着,即随着处理浓度的增加和处理时间的延长,麦冬净光合速率迅速地降低。在乙烯利不同浓度和时间的胁迫下,Fo、Fv/Fm、Fv’/Fm’、ΦPSⅡ、qP、ETR等荧光参数逐渐下降,NPQ逐渐升高,说明乙烯利在植物体内不断分解释放出乙烯,对光系统Ⅱ结构及光系统Ⅱ的光合电子传递链有较大的影响。为进一步从分子水平探明乙烯对麦冬光合作用的影响,通过SSH方法,以0.5g/L乙烯利处理6h的麦冬一年生叶片的cDNA为Tester,对照为Driver,构建了一个含有576个克隆的差减cDNA文库,差异片段大小在100～1500bp之间。通过斑点杂交,从576个克隆中筛选出259个阳性克隆,经测序分析,最终得到237条EST序列,经BLASTx分析,发现有16条EST序列在GenBank中没有找同源序列,可能代表新基因;74条EST序列在数据库中检索到同源性序列,但其功能尚不清楚;147条序列在GenBank中能找到与其它物种已知基因部分区域的同源序列,同源性为25～100%。在建立全长cDNA文库的基础上,根据获得的EST序列设计引物,从全长cDNA文库中筛选出叶绿素结合蛋白（CAB）基因和一个编码未知蛋白（UNP）基因,经测序分析:CAB基因的全长序列为1055bp,其编码区为18～1812之间,编码区为795bp,5’UTR为1～17bp,包含17个bp;3’UTR为813～11055bp,包含243bp。同源性比较结果为:麦冬CAB基因与二球悬铃木(（Platanus xacerifolia）、水稻（Oryza sativa）、烟草（Nicotiana tabacum）等植物有86%～73%的同源性。系统发育分析:其与龙舌兰（Agave tequilana）CAB基因亲缘关系较近,与烟草CAB基因最远。其编码的蛋白质由264个氨基酸组成,分子量为28kDa,理论等电点pI为5.29,Asp+Glu为26个,Arg+Lys为21个,分子组成为C1272H1943N327O367S10。CAB基因编码蛋白的疏水性的最大值为2.222、最小值为-1.844。三维结构具有3个α螺旋结构。UNP基因全长序列为916bp,其编码区为55-762之间,编码区为708bp,5’UTR为1～54bp,包含54bp;3’UTR为763-～916bp,包含154bp。BLAST分析:与非冗余核苷酸数据库（nr）、STS、GSS、HTGS比对,未发现相似性高的同源序列;与EST数据库比对,发现与鹅掌楸（Liriodendron tulipifera）花芽cDNA文库中的四条EST序列同源性为73%;随后又将这一序列与非冗余蛋白数据库（nr）比对分析,其与葡萄（Vitis vinifera）、黑杨（Populus trichocarpa）等植物有37～54%同源性。系统发育分析:麦冬UNP编码蛋白与葡萄、黑杨、拟南芥（Arabidopsis thaliana）等UNP编码蛋白亲缘关系较近,和其他植物之间的亲缘关系比较远。其编码的蛋白质由235个氨基酸组成,分子量为27kDa,理论等电点pI为6.47,Asp+Glu为37个,Arg+Lys为36个,原子组成为C1188H1871N333O361S13。UNP基因编码蛋白的疏水性最大值为1.511、最小值为-3.267。以pCAMBIA1303为基础,引入BamHⅠ和KpnⅠ的酶切位点,构建了pCAMBIA1303-CAB（+）、pCAMBIA1303-CAB（-）、pCAMBIA1303-UNP（+）、pCAMNIA1303-UNP（-）等四种植物表达载体,并导入到土壤农杆菌LBA4404中。以pET-30a（+）为基础,构建了原核表达载体pET-30a-CAB和pET-30-UNP,转化到大肠杆菌BL21中,经不同浓度IPTG分别诱导0、1、2、3、4和5h后,SDS-PAGE电泳分析结果为:在IPTG的诱导下,外源基因CAB与UNP都能在大肠杆菌BL21中表达,CAB基因表达的蛋白的电泳条带在28kDa左右,UNP基因表达的蛋白的电泳条带在27kDa左右,理论推测结果相一致。在一定的IPTG浓度和诱导时间的范围内,随着浓度和时间的延长,CAB与UNP基因表达的蛋白量增大。
二、一个新的胎肝发育相关因子cDNA的克隆与序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一个新的胎肝发育相关因子cDNA的克隆与序列分析（论文提纲范文）
（1）水稻纹枯病菌中2个双分体病毒的基因组结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词及英汉对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 水稻纹枯病研究进展 |
| 1.1.1 水稻纹枯病及其病原菌 |
| 1.1.2 水稻纹枯病菌的致病机理 |
| 1.1.3 水稻纹枯病菌的防治 |
| 1.2 真菌病毒的研究进展 |
| 1.2.1 真菌病毒的主要类群 |
| 1.2.1.1 +ssRNA病毒 |
| 1.2.1.2 -ssRNA病毒 |
| 1.2.1.3 ssDNA病毒 |
| 1.2.1.4 dsRNA病毒 |
| 1.2.2 双分体真菌病毒 |
| 1.2.2.1 双分体真菌病毒的发展历程和分类 |
| 1.2.2.2 双分体真菌病毒与寄主的相互作用 |
| 1.2.2.3 双分体真菌病毒的转染和脱除 |
| 1.2.3 弱毒真菌病毒在植物病害生物防治中的应用 |
| 1.2.3.1 弱毒真菌病毒的发现 |
| 1.2.3.2 弱毒真菌病毒在植物病害生物防治中的应用 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 1.4 本研究的技术路线 |
| 第2章 水稻纹枯病菌中新的真菌病毒的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 供试菌株与培养基 |
| 2.2.2 酶和其他试剂 |
| 2.2.3 仪器和设备 |
| 2.2.4 供试菌株的活化、培养与菌丝收集 |
| 2.2.5 真菌病毒筛选引物 |
| 2.2.6 Total RNA提取及c DNA合成 |
| 2.2.6.1 总RNA体取 |
| 2.2.6.2 模板cDNA的合成 |
| 2.2.7 RT-PCR的方法筛选目的菌株 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 总RNA提取及c DNA合成结果 |
| 2.3.2 RT-PCR筛选结果 |
| 2.3.2.1 以病毒RsV1片段1检测 |
| 2.3.2.2 以病毒RsV1片段2检测 |
| 2.3.2.3 以病毒RsPV2片段1检测 |
| 2.3.2.4 以病毒RsPV2片段2检测 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 水稻纹枯病菌A105中dsRNA全长cDNA克隆与序列分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株及培养基 |
| 3.2.2 载体和引物 |
| 3.2.3 酶及其他试剂 |
| 3.2.4 仪器和设备 |
| 3.2.5 全基因组cDNA克隆 |
| 3.2.5.1 病毒核酸的抽提 |
| 3.2.5.2 病毒核酸性质鉴定 |
| 3.2.5.3 病毒核酸样品的纯化 |
| 3.2.5.4 随机引物合成cDNA |
| 3.2.5.5 pMD18-T转化和阳性克隆的筛选 |
| 3.2.5.6 DsRNA末端序列的扩增 |
| 3.2.6 序列拼接及分析 |
| 3.2.7 病毒粒子提取与观察 |
| 3.2.8 SDS-PAGE凝胶的制备及病毒粒子结构蛋白的检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 A105 菌株中病毒的核酸类型和dsRNA的 c DNA合成 |
| 3.3.2 A105 菌株中两条dsRNA片段的全基因组序列 |
| 3.3.3 蛋白质序列比较和系统进化分析 |
| 3.3.4 病毒粒子的负染观察及核酸检测 |
| 3.3.5 病毒粒子结构蛋白 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 水稻纹枯病菌D122 菌株中dsRNA的全长c DNA克隆与序列分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 真菌菌株及培养基 |
| 4.2.2 载体和引物 |
| 4.2.3 酶及其他试剂 |
| 4.2.4 仪器和设备 |
| 4.2.5 全基因组cDNA克隆 |
| 4.2.5.1 病毒核酸的提取和dsRNA样品纯化 |
| 4.2.5.2 随机引物合成cDNA |
| 4.2.5.3 pMD18-T转化和阳性克隆的筛选 |
| 4.2.5.4 DsRNA末端序列的扩增 |
| 4.2.5.5 序列拼接及分析 |
| 4.2.6 D122菌株中的病毒粒子 |
| 4.2.6.1 病毒粒子提取与观察 |
| 4.2.6.2 病毒粒子核酸检测 |
| 4.2.7 Northern杂交 |
| 4.2.7.1 探针的制备和标记 |
| 4.2.7.2 定量标记反应效率 |
| 4.2.7.3 DsRNA样品的电泳 |
| 4.2.7.4 DsRNA的转膜和固定 |
| 4.2.7.5 Northern杂交 |
| 4.2.7.6 免疫检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 D122 菌株中病毒的核酸类型和病毒dsRNA的 c DNA合成 |
| 4.3.2 D122 菌株中两条dsRNA片段的全基因组序列结构分析 |
| 4.3.3 蛋白质序列比较和系统进化分析 |
| 4.3.4 病毒粒子的负染观察及核酸检测 |
| 4.3.5 RsRV5病毒粒子结构蛋白 |
| 4.3.6 D122菌株中病毒cDNA序列的验证 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 真菌病毒RsRV5的转染和脱除 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 供试菌株及其培养基 |
| 5.2.2 酶及试剂 |
| 5.2.3 仪器和设备 |
| 5.2.4 水稻纹枯病菌原生质体的制备 |
| 5.2.4.1 酶液的配制 |
| 5.2.4.2 菌丝体的培养 |
| 5.2.4.3 原生质体的制备 |
| 5.2.5 RsRV5的转染 |
| 5.2.5.1 对峙培养法转染 |
| 5.2.5.2 病毒粒子转染 |
| 5.2.6 RsRV5的脱除 |
| 5.2.6.1 菌丝尖端法 |
| 5.2.6.2 病毒抑制剂和菌丝尖端结合法 |
| 5.2.6.3 菌丝碎段法 |
| 5.2.6.4 原生质体再生法 |
| 5.2.7 病毒RsRV5的转染和脱除检测 |
| 5.2.8 RsRV5对寄主真菌的影响 |
| 5.2.8.1 衍生菌株D122-P培养性状的测定 |
| 5.2.8.2 衍生菌株D122-P致病力的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 RsRV5的转染和脱除检测结果 |
| 5.3.2 衍生菌株D122-P生物学性状的测定 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 水稻纹枯病菌等基因系的带毒D122和不带毒D122-P的转录组分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 供试菌株和培养基 |
| 6.2.2 酶和其他试剂 |
| 6.2.3 仪器与设备 |
| 6.2.4 测序样品制备及Hiseq3000测序 |
| 6.2.4.1 总RNA提取与质量检测 |
| 6.2.4.2 文库构建 |
| 6.2.4.3 Hiseq3000测序 |
| 6.2.5 生物信息学分析 |
| 6.2.5.1 基因组注释整理及表达量分析 |
| 6.2.5.2 差异表达基因分析 |
| 6.2.5.3 差异表达GO富集分析和PATHWAY富集分析 |
| 6.2.5.4 差异表达基因聚类分析 |
| 6.2.5.5 可变剪切分析 |
| 6.2.5.6 SNV和 InDel分析 |
| 6.2.6 荧光定量qRT-PCR验证 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 总RNA质量检测 |
| 6.3.2 测序数据质量分析 |
| 6.3.2.1 数据质量统计 |
| 6.3.2.2 数据质量评估 |
| 6.3.3 与参考基因组比对分析 |
| 6.3.4 基因表达分析 |
| 6.3.5 RNA-seq整体质量评估 |
| 6.3.6 基因表达水平对比 |
| 6.3.7 基因差异表达分析 |
| 6.3.8 可变剪接分析 |
| 6.3.9 SNV/InDel在基因组功能区分布 |
| 6.3.10 荧光定量qRT-PCR验证 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 全文讨论与结论 |
| 7.1 关于水稻纹枯病菌中新dsRNA真菌病毒的快速有效筛选 |
| 7.2 关于水稻纹枯病菌A105 菌株中的dsRNA病毒及其分类 |
| 7.3 关于水稻纹枯病菌D122 菌株中的dsRNA病毒及其分类 |
| 7.4 关于水稻纹枯病菌D122 菌株中的dsRNA病毒与寄主真菌的互作 |
| 7.5 本研究的主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 本文中用到的部分试剂的配方 |
| 附录 B 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（2）凝集素、Dorsal及Ras在主要经济虾中的免疫功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 综述 |
| 1.1 无脊椎动物先天免疫概述 |
| 1.1.1 模式识别受体 |
| 1.1.2 细胞免疫 |
| 1.1.3 体液免疫 |
| 1.1.4 信号转导途径 |
| 1.2 凝集素研究进展 |
| 1.2.1 C-型凝集素 |
| 1.2.2 L-型凝集素 |
| 1.3 小G蛋白研究进展 |
| 1.3.1 小G蛋白的发现及分类 |
| 1.3.2 小G蛋白的结构和作用机制 |
| 1.3.3 小G蛋白的功能 |
| 1.4 本论文研究的目的及意义 |
| 第2章 日本沼虾含Clip结构的C-型凝集素在细菌感染过程中的功能研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 菌株和载体 |
| 2.2.2 试剂和仪器 |
| 2.2.3 实验动物及免疫刺激 |
| 2.2.4 总RNA提取和cDNA合成 |
| 2.2.5 Mn-clip-Lec全长克隆 |
| 2.2.6 序列分析 |
| 2.2.7 组织分布与表达模式分析 |
| 2.2.8 RNA干扰实验 |
| 2.2.9 Mn-clip-Lec重组蛋白的表达及纯化 |
| 2.2.10 细菌结合实验 |
| 2.2.11 细菌凝集实验 |
| 2.2.12 糖结合实验 |
| 2.2.13 体内清除实验 |
| 2.2.14 Mn-clip-Lec基因诱饵载体的构建及酵母双杂交筛选 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 Mn-clip-Lec全长cDNA克隆及序列分析 |
| 2.3.2 Mn-clip-Lec的组织分布分析 |
| 2.3.3 金黄色葡萄球菌刺激机体后的表达模式分析 |
| 2.3.4 Mn-clip-Lec基因沉默抑制proPO激活系统成员的表达以及抗菌肽的合成 |
| 2.3.5 金黄色葡萄球菌感染过程中proPO系统的激活以及抗菌肽的合成受到Mn-clip-Lec基因的调控 |
| 2.3.6 Mn-clip-Lec基因沉默抑制proPO系统的激活 |
| 2.3.7 Mn-clip-Lec重组蛋白的细菌结合与细菌凝集活性 |
| 2.3.8 Mn-clip-Lec重组蛋白的糖结合活性 |
| 2.3.9 Mn-clip-Lec重组蛋白参与细菌清除作用 |
| 2.3.10 酵母双杂交筛选与Mn-clip-Lec互作的蛋白 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 罗氏沼虾L-型凝集素对细菌和病毒感染的免疫应答研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株、载体、试剂和仪器 |
| 3.2.2 罗氏沼虾免疫刺激与MrVIP36全长克隆 |
| 3.2.3 序列与进化分析 |
| 3.2.4 qRT-PCR分析MrVIP36的组织分布及表达模式 |
| 3.2.5 MrVIP36的LTLD重组表达载体构建 |
| 3.2.6 rMrLTLD的表达及纯化 |
| 3.2.7 细菌结合实验 |
| 3.2.8 细菌凝集实验 |
| 3.2.9 多糖结合实验 |
| 3.2.10 体外细菌生长抑制实验 |
| 3.2.11 体内细菌清除实验 |
| 3.2.12 病毒拷贝数检测 |
| 3.2.13 存活率统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MrVIP36全长cDNA克隆及序列分析 |
| 3.3.2 MrVIP36的组织分布及表达模式分析 |
| 3.3.3 rMrLTLD能够结合和凝集细菌 |
| 3.3.4 rMrLTLD能够直接结合多糖 |
| 3.3.5 rMrLTLD在体外抑制细菌的生长活性 |
| 3.3.6 rMrLTLD在体内加快机体对细菌的清除速度 |
| 3.3.7 rMrLTLD抑制病毒的复制并提高罗氏沼虾的存活率 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 罗氏沼虾Dorsal转录因子在WSSV感染过程中调控甲壳肽的表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 动物与病毒 |
| 4.2.2 组织收集与病毒刺激 |
| 4.2.3 总RNA提取和cDNA合成 |
| 4.2.4 cDNA全长克隆及序列分析 |
| 4.2.5 dsRNA介导的RNA干扰实验 |
| 4.2.6 qRT-PCR分析基因表达 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 MrDorsal的全长序列分析 |
| 4.3.2 MrDorsal的组织分布和表达模式分析 |
| 4.3.3 甲壳肽基因的表达模式分析 |
| 4.3.4 沉默MrDorsal抑制病毒感染后MrDorsal的表达上调 |
| 4.3.5 沉默MrDorsal抑制病毒感染后甲壳肽基因的表达上调 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 日本囊对虾小G蛋白家族的3个成员在WSSV感染过程中的功能鉴定 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株、载体、试剂和仪器 |
| 5.2.2 免疫刺激及样品制备 |
| 5.2.3 总RNA提取和cDNA合成 |
| 5.2.4 全长克隆及序列分析 |
| 5.2.5 qRT-PCR分析 |
| 5.2.6 沉默MjRal和WSSV感染 |
| 5.2.7 WSSV拷贝数检测 |
| 5.2.8 MjRal重组表达及纯化 |
| 5.2.9 WSSV共孵育rMjRal刺激对虾后VP28的转录分析及病毒拷贝数检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 MjRal、MjRap和MjRas的cDNA克隆及序列分析 |
| 5.3.2 WjRal、 MjRap和MjRas的组织分布和表达模式分析 |
| 5.3.3 MjRal干扰效果检测 |
| 5.3.4 沉默MjRal促进病毒复制 |
| 5.3.5 MjRal重组蛋白抑制病毒复制 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 日本沼虾Mn-clip-Lec参与抗细菌免疫防御及激活酚氧化酶原系统 |
| 6.2 罗氏沼虾MrVIP36参与抗细菌和抗病毒免疫 |
| 6.3 罗氏沼虾MrDorsal转录因子在WSSV感染过程中调控甲壳肽的表达 |
| 6.4 日本囊对虾MjRal参与抗病毒免疫反应 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章 |
| 致谢 |
（3）半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病相关QTL定位及免疫相关基因筛选和功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语的中英文对照 |
| 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 半滑舌鳎研究进展 |
| 1.1 半滑舌鳎简介 |
| 1.1.1 生态习性 |
| 1.1.2 繁殖习性 |
| 1.1.3 雌雄生长差异 |
| 1.1.4 半滑舌鳎养殖现状 |
| 1.2 半滑舌鳎遗传学和基因组学研究进展 |
| 1.2.1 半滑舌鳎基因组学研究 |
| 1.2.2 半滑舌鳎性别决定的研究 |
| 1.2.3 抗病家系选育 |
| 2 鱼类分子标记辅助育种 |
| 2.1 分子标记 |
| 2.1.1 SSR |
| 2.1.2 RAPD |
| 2.1.3 RFLP |
| 2.1.4 AFLP |
| 2.1.5 SNP |
| 2.2 分子标记在水产上的应用 |
| 2.2.1 群体之间的遗传多样性分析 |
| 2.2.2 亲缘关系鉴定 |
| 2.2.3 性状连锁标记的筛选 |
| 2.2.4 遗传连锁图谱的构建 |
| 2.2.5 生物性状相关基因座定位 |
| 2.2.6 GWAS |
| 2.2.7 基因组选择 |
| 3 鱼类抗病免疫相关基因研究进展 |
| 3.1 鱼类抗病免疫相关基因 |
| 3.2 半滑舌鳎抗病免疫相关基因研究进展 |
| 3.3 抗病免疫基因功能研究方法 |
| 3.3.1 感染实验 |
| 3.3.2 重组蛋白抑菌实验 |
| 3.3.3 RNAi干扰 |
| 3.3.4 甲基化 |
| 第二章 半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病QTL定位及抗病免疫相关基因筛选 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用鱼 |
| 2.1.2 实验仪器耗材 |
| 2.1.3 实验试剂及配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因组DNA |
| 2.2.2 SSR标记检测和引物设计 |
| 2.2.3 PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳 |
| 2.2.4 基因分型 |
| 2.2.5 遗传连锁图谱的构建和QTL定位 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 遗传图谱构建 |
| 3.2 QTL定位 |
| 3.3 单标记分析 |
| 3.4 抗病候选基因筛选 |
| 4 讨论 |
| 4.1 抗病免疫相关基因座定位 |
| 4.2 抗病免疫相关基因筛选 |
| 5 小结 |
| 第三章 半滑舌鳎dctn5基因的克隆和特征分析,及dctn5_tv1在免疫应答反应中的功能初步分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用鱼 |
| 2.1.2 实验仪器耗材 |
| 2.1.3 实验试剂及配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA、DNA提取和cDNA合成 |
| 2.2.2 dctn5_tv1和dctn5_tv2 ORF区序列和dctn5基因的基因组序列验证 |
| 2.2.3 全长cDNA的扩增 |
| 2.2.4 序列分析 |
| 2.2.5 进化分析 |
| 2.2.6 Real time-PCR |
| 2.2.7 重组蛋白质粒构建 |
| 2.2.8 重组蛋白质原核表达 |
| 2.2.9 Western blot |
| 2.2.10 重组蛋白质变性、纯化、复性 |
| 2.2.11 重组蛋白质谱鉴定 |
| 2.2.12 重组蛋白质体外抑菌活性检测 |
| 2.2.13 重组蛋白质体外与细菌结合 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 dctn5基因两个转录本全长cDNA克隆 |
| 3.2 序列特征分析 |
| 3.2.1 dctn5基因基因组序列分析 |
| 3.2.2 氨基酸多重比对 |
| 3.3 进化分析 |
| 3.4 Real-time PCR分析 |
| 3.4.1 dctn5_tv1和dctn5_tv2 mRNA的组织分布 |
| 3.4.2 哈维氏弧菌感染后dctn5_tv1在免疫组织中表达 |
| 3.5 Dctn5_tv1蛋白的重组表达 |
| 3.5.1 SDS-PAGE和Western blot |
| 3.5.2 重组蛋白的质谱鉴定 |
| 3.6 重组蛋白Dctn5_tv1的体外抑菌 |
| 3.7 Dctn5_tv1重组蛋白体外与细菌结合试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基因序列分析 |
| 4.2 基因的表达分析 |
| 4.3 重组蛋白Dctn5_tv1验证和变性复性 |
| 4.4 重组蛋白Dctn5_tv1体外抑菌 |
| 5 小结 |
| 第四章 半滑舌鳎stat5bl基因的克隆、鉴定及在免疫应答反应中的表达模式分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用鱼 |
| 2.1.2 实验仪器耗材 |
| 2.1.3 实验试剂及配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA、DNA提取和cDNA合成 |
| 2.2.2 stat5bl ORF区部分序列和stat5bl基因的基因组序列验证 |
| 2.2.3 全长cDNA的扩增 |
| 2.2.4 序列分析 |
| 2.2.5 进化分析 |
| 2.2.6 Real time-PCR |
| 2.2.7 细胞培养 |
| 2.2.8 RNAi干扰 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 stat5bl基因全长cDNA克隆 |
| 3.2 序列特征分析 |
| 3.2.1 stat5bl基因组结构分析 |
| 3.2.2 氨基酸多重比对 |
| 3.3 进化分析 |
| 3.4 Real-time PCR分析 |
| 3.4.1 stat5bl mRNA的组织分布 |
| 3.4.2 哈维氏弧菌感染后stat5bl在免疫组织中表达 |
| 3.5 肝脏细胞培养 |
| 3.6 RNAi干扰 |
| 3.6.1 siRNA有效靶点筛选 |
| 3.6.2 RNAi干扰后免疫基因的表达情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基因序列分析 |
| 4.2 进化分析 |
| 4.3 基因的表达分析 |
| 4.4 stat5bl基因RNAi干扰 |
| 5 小结 |
| 第五章 半滑舌鳎r-spondin家族新成员(rspo2l)的分子特征、表达及功能初步分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验用鱼 |
| 2.1.2 实验仪器耗材 |
| 2.1.3 实验试剂及配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA、DNA提取和cDNA合成 |
| 2.2.2 rspo2l ORF区序列验证 |
| 2.2.3 全长cDNA的扩增 |
| 2.2.4 序列分析 |
| 2.2.5 进化分析 |
| 2.2.6 Real time-PCR |
| 2.2.7 重组蛋白质粒构建 |
| 2.2.8 重组蛋白质原核表达 |
| 2.2.9 Western blot |
| 2.2.10 重组蛋白质变性、纯化、复性 |
| 2.2.11 重组蛋白质谱鉴定 |
| 2.2.12 重组蛋白质体外抑菌活性检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 rspo2l全长cDNA克隆 |
| 3.2 序列特征分析 |
| 3.2.1 rspo2l的基因组结构分析 |
| 3.2.2 氨基酸多重比对 |
| 3.3 进化分析 |
| 3.4 Real-time PCR分析 |
| 3.4.1 rspo2l mRNA的组织分布 |
| 3.4.2 哈维氏弧菌感染后rspo2l和β-catenin在免疫组织中表达 |
| 3.5 Rspo21蛋白的重组表达 |
| 3.5.1 SDS-PAGE和Western blot |
| 3.5.2 重组蛋白的质谱鉴定 |
| 3.6 重组蛋白Rspo21的体外抑菌 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基因序列分析 |
| 4.2 基因的表达分析 |
| 4.3 重组蛋白Rspo21验证和变性复性 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 全文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 攻读博士学位期间获得的荣誉 |
（4）猪繁殖与呼吸综合征病毒上调猪树突细胞CD83的表达及其分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因功能及致病机制研究进展 |
| 1 病毒基因及编码蛋白功能 |
| 1.1 病毒粒子和基因组结构 |
| 1.2 病毒蛋白功能 |
| 2 病毒致病性及免疫特性 |
| 2.1 病毒致病性 |
| 2.2 病毒免疫特性 |
| 3 病毒与宿主免疫应答 |
| 3.1 病毒抑制宿主天然免疫应答 |
| 3.2 病毒影响干扰素的产生 |
| 4 病毒感染引起的炎性反应 |
| 4.1 PRRSV与抗炎因子IL-10 |
| 4.2 PRRSV与促炎因子TNF-α |
| 4.3 PRRSV诱导的炎性反应 |
| 5 CD83分子概述 |
| 5.1 CD83的结构和生物学特性 |
| 5.2 CD83分型及生物学功能 |
| 6 PRRSV先天性免疫相关信号通路 |
| 6.1 PRRSV与NF-κB信号通路 |
| 6.2 Sp1信号通路 |
| 7 树突细胞(Dendritic cells)生物学特性 |
| 8 本研究的研究目的和意义 |
| 参考文献 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导树突细胞CD83表达及关键功能蛋白的探寻 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒与病毒 |
| 1.2 仪器与试剂 |
| 1.3 病毒增殖与滴度测定 |
| 1.4 PBMC分离与MoDCs制备 |
| 1.5 流式细胞术检测CD86和CD83 |
| 1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 1.7 夹心ELISA检测sCD83蛋白 |
| 1.8 CD83启动子基因克隆鉴定 |
| 1.9 CD83启动子报告载体的构建 |
| 1.10 去内毒素质粒提取 |
| 1.11 双荧光报告基因Luciferase检测系统验证CD83启动子活性 |
| 1.12 PRRSV对pCD83的作用 |
| 1.13 PRRSV编码蛋白真核表达质粒的构建 |
| 1.14 Western blotting |
| 1.15 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MoDCs制备与鉴定 |
| 2.2 PRRSV感染对MoDCs分泌CD83蛋白水平的影响 |
| 2.3 PRRSV不同毒力毒株上调CD83的比较 |
| 2.4 PRRSV感染诱导CD83上调具有剂量依赖性 |
| 2.5 PRRSV诱导CD83上调具有时间依赖性 |
| 2.6 猪CD83启动子的克隆和序列分析 |
| 2.7 猪CD83启动子活性的鉴定 |
| 2.8 PRRSV编码蛋白真核表达质粒的构建与鉴定 |
| 2.9 PRRSV及其编码蛋白对猪CD83启动子活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白诱导树突细胞CD83表达及其分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒与试剂 |
| 1.2 N蛋白截断突变表达载体的构建 |
| 1.3 质粒DNA提取 |
| 1.4 Western-blotting |
| 1.5 PRRSV N基因突变毒株感染性cDNA克隆的构建及病毒拯救 |
| 1.6 重组病毒RNA提取 |
| 1.7 cDNA合成 |
| 1.8 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 1.9 PRRSV空斑实验 |
| 1.10 PRRSV生长曲线的测定 |
| 1.11 重组病毒对Marc-145中pCD83的作用 |
| 1.12 重组病毒对MoDCs中CD83的作用 |
| 1.13 Sp1基因干扰RNA干扰试验 |
| 1.14 信号通路抑制剂的干扰试验 |
| 1.15 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRRSV N蛋白对CD83启动子活性的上调作用 |
| 2.3 N蛋白突变体的构建及其对CD83启动子的作用 |
| 2.4 PRRSV感染性cDNA克隆突变体构建及重组病毒拯救 |
| 2.5 PRRSV N蛋白基因突变重组病毒对CD83启动子活性的影响 |
| 2.6 PRRSV突变病毒感染MoDCs后对CD83蛋白水平的影响 |
| 2.8 Sp1 siRNA抑制PRRSVN蛋白CD83启动子的上调 |
| 2.9 NF-κB抑制剂抑制PRRSVN蛋白对猪CD83启动子的激活 |
| 2.10 PRRSV能够诱导MoDCs中Sp1和NF-κB上调 |
| 2.12 PRRSV N蛋白突变体对Sp1及NF-κB mRNA水平的影响 |
| 2.14 PRRSVN蛋白突变体通过Sp1及NF-κB调节CD83启动子活性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 第四章 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp10诱导树突细胞CD83表达及其分子机制 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒与试剂 |
| 1.2 Nsp10蛋白截断突变表达载体的构建 |
| 1.3 质粒的提取 |
| 1.4 Western-blotting |
| 1.5 PRRSV nsp10突变毒株感染性cDNA克隆构建 |
| 1.6 PRRSV nsp10突变毒株的拯救 |
| 1.7 重组病毒RNA的提取 |
| 1.8 RT-PCR扩增各片段 |
| 1.9 病毒空斑试验 |
| 1.10 病毒生长曲线的测定 |
| 1.11 重组病毒对Marc-145细胞中pCD83的作用 |
| 1.12 重组病毒对MoDCs中CD83的作用 |
| 1.13 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Nsp10对CD83启动子活性的上调作用 |
| 2.2 Nsp10突变体的构建及其对CD83启动子的作用 |
| 2.4 PRRSV nsp10突变毒株感染性cDNA克隆构建与病毒拯救 |
| 2.5 PRRSV nsp10突变病毒对CD83启动子活性的影响 |
| 2.6 PRRSV nsp10突变病毒感染MoDCs对CD83蛋白水平的影响 |
| 2.7 Sp1 siRNA抑制PRRSV nsp10蛋白CD83启动子的上调 |
| 2.8 NF-κB抑制剂抑制PRRSV nsp10蛋白对猪CD83启动子的激活 |
| 2.9 PRRSV nsp10蛋白突变体对Sp1和NF-κB mRNA水平的影响 |
| 2.10 SP1干扰RNA和NF-κB抑制剂抑制Nsp10蛋白突变重组病毒激活CD83基因启动子活性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 第五章 猪繁殖与呼吸综合征病毒通过CD83介导抑制树突细胞免疫调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 原核表达质粒pGEX-6P-1-sCD83的构建 |
| 1.4 刺激细胞(MoDCs)的制备 |
| 1.5 反应细胞的制备 |
| 1.6 混合淋巴细胞反应 |
| 1.7 sCD83蛋白对树突细胞培介导T细胞增殖的抑制实验 |
| 1.8 PRRSV对树突细胞培养介导T细胞增殖的抑制实验 |
| 1.9 western blotting |
| 1.10 RT-PCR |
| 1.11 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪sCD83基因克隆、表达和鉴定 |
| 2.2 sCD83融合蛋白的纯化及其含量的测定 |
| 2.3 sCD83蛋白抗原性测定 |
| 2.4 sCD83作用的MoDCs对T细胞增殖的影响 |
| 2.5 sCD83对MoDCs抗原提呈相关蛋白的抑制效应 |
| 2.6 PRRSV对MoDCs介导的T细胞增殖抑制效应 |
| 2.7 PRRSV对MoDCs抗原提呈相关蛋白的抑制效应 |
| 2.8 PRRSV由CD83介导抑制MoDCs抗原提呈相关蛋白 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 第六章 猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp1α诱导树突细胞CD83表达及关键氨基酸位点解析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒与试剂 |
| 1.2 Nsp1α蛋白截断突变表达载体的构建 |
| 1.3 质粒的提取 |
| 1.4 Western-blotting |
| 1.5 利用BB0907毒株感染性cDNA克隆构建相应的突变体和回复体 |
| 1.6 病毒拯救 |
| 1.7 重组病毒RNA的提取 |
| 1.8 RT-PCR扩增各片段 |
| 1.9 空斑试验 |
| 1.10 生长曲线的测定 |
| 1.11 重组病毒对Marc-145中pCD83的作用 |
| 1.12 重组病毒对MoDCs中CD83的作用 |
| 1.13 T细胞的制备 |
| 1.14 混合淋巴细胞反应 |
| 1.15 sCD83蛋白对树突细胞培介导T细胞增殖的抑制实验 |
| 1.16 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Nsp1α激活CD83报告基因活性 |
| 2.2 Nsp1α截断体以及突变体的构建及其对CD83启动子的作用 |
| 2.3 PRRSV nsp1α突变重组病毒的构建与鉴定 |
| 2.4 PRRSVnsp1α突变病毒对CD83启动子活性的影响 |
| 2.5 PRRSV nsp1α突变病毒对树突细胞中CD83表达的影响 |
| 2.6 PRRSVnsp1α突变病毒对MoDCs介导的T细胞增殖的影响 |
| 2.7 PRRSV nsp1α突变病毒对MoDCs抗原提呈相关蛋白的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 全文总结 主要创新点 致谢 |
（5）BrYV与PEMV2协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 植物病原间协生互作的研究进展 |
| 1.2 植物病毒与病毒互作 |
| 1.3 病毒协生互作产生的影响 |
| 1.4 参与病毒协生互作的病毒因子 |
| 1.5 利用演化博弈论研究病毒协生 |
| 1.6 马铃薯卷叶病毒属病毒及其韧皮部局限特性 |
| 1.7 幽影病毒属病毒简介 |
| 1.8 黄症病毒科病毒与幽影病毒属病毒互作的研究进展 |
| 1.9 马铃薯卷叶病毒属病毒的分类研究概况 |
| 1.10 本论文研究意义与目的 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 溶液及培养基的配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 第三章 BrYV与PEMV 2协生互作的生物学特征 |
| 3.1 BrYV与PEMV2在本生烟中存在协生互作 |
| 3.2 PEMV 2能使BrYV进行摩擦接种 |
| 3.3 BrYV与PEMV-2复合侵染时能突破韧皮部局限 |
| 3.4 探索BrYV病毒中参与BrYV与PEMV 2协生互作的蛋白 |
| 3.5 P0~(Br)、ORF3~(PE)和ORF4~(PE)转基因本生烟的培育 |
| 3.6 小结与讨论 |
| 第四章 BrYV与PEMV 2协生互作所引起的植物转录组变化特征分析 |
| 4.1 样品采集与转录组测序 |
| 4.2 差异表达基因的鉴定 |
| 4.3 差异表达基因的GO分析 |
| 4.4 差异表达基因的KEGG分析 |
| 4.5 光合作用相关基因的变化 |
| 4.6 乙烯相关基因的变化 |
| 4.7 植物防御相关基因的变化 |
| 4.8 RNA沉默相关基因的变化 |
| 4.9 转录因子的变化 |
| 4.10 蛋白翻译相关基因的变化 |
| 4.11 RT-qPCR验证转录组测序结果 |
| 4.12 本章小结与讨论 |
| 第五章 BrYV与PEMV 2协生互作引起siRNAs的变化特征 |
| 5.1 BrYV与PEMV 2协生互作时病毒siRNAs的特征 |
| 5.2 BrYV与PEMV 2协生互作时miRNAs的变化特征 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 Polerovirus新病毒的分子鉴定与序列分析 |
| 6.1 一种侵染豆科作物的Polerovirus新病毒的分子鉴定与序列分析 |
| 6.2 甜菜西方黄化病毒北京株系的分子鉴定与序列分析 |
| 6.3 本章小结与讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录Ⅰ 联合培养期间的主要研究工作 |
| 附录Ⅱ 载体构建和检测所用引物 |
| 附录Ⅲ 病毒vsiRNA杂交所用引物 |
| 附录Ⅳ RT-qPCR相关引物 |
| 个人简历 |
（6）猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Tregs细胞和中和抗体的功能蛋白及其关键氨基酸位点的解析（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫学研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 病毒基因组结构和亚基因组mRNA |
| 1.2 病毒非结构蛋白 |
| 1.3 病毒结构蛋白 |
| 1.3.1 病毒粒子及N蛋白 |
| 1.3.2 主要外膜蛋白 |
| 1.3.3 次要外膜蛋白 |
| 1.4 病毒生物学特性 |
| 2 免疫学 |
| 2.1 宿主抗病毒感染免疫应答 |
| 2.2 机体对PRRSV的先天性免疫应答 |
| 2.2.1 PRRSV对干扰素诱导的干扰作用 |
| 2.2.2 PRRSV编码蛋白对IFN诱导和激活信号的抑制 |
| 2.2.3 毒株和细胞对干扰素诱导的影响 |
| 2.3 获得性免疫应答 |
| 2.3.1 体液免疫反应 |
| 2.3.2 细胞介导的免疫应答 |
| 2.4 调节性T细胞与PRRSV |
| 2.4.1 Tregs的背景 |
| 2.4.2 病毒介导的Tregs活性 |
| 2.4.3 猪Tregs的表型和分布 |
| 2.4.4 猪Tregs抑制机制和目标 |
| 2.4.5 Tregs与PRRSV |
| 3 疫苗 |
| 4 结论和展望 |
| 参考文献 第二章 我国出现猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3部分基因缺失的新毒株 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 PAMs分离与培养 |
| 1.3 病毒分离 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 RNA提取及RT-PCR扩增 |
| 1.6 PCR产物的纯化与回收。 |
| 1.7 PCR回收产物的克隆与转化 |
| 1.8 重组质粒的提取 |
| 1.9 重组质粒的鉴定和测序 |
| 1.10 核苷酸和aa序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的分离 |
| 2.2 RT-PCR扩增及全基因组测序 |
| 2.3 全基因组序列比对和分析 |
| 2.4 系统进化分析 |
| 2.5 病毒基因重组分析 |
| 2.6 UTRs基因序列分析 |
| 2.7 GP3推导的氨基酸序列比对分析 |
| 2.8 GP5推导的氨基酸序列比对分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 第三章 不同毒力美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Tregs能力的比较 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和病毒 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.2 猪PBMCs的分离 |
| 1.3 MoDCs细胞的培养 |
| 1.4 HP-PRRSV对PBMCs的感染 |
| 1.5 不同PRRSV毒株对MoDCs的感染 |
| 1.6 抗体标记及流式检测 |
| 1.7 CD4~+CD25~(high)细胞的分选 |
| 1.8 抑制活性测定 |
| 1.9 细胞因子测定 |
| 1.10 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MoDCs的培养 |
| 2.2 PRRSV感染共培养系统对Tregs的诱导作用 |
| 2.3 Tregs的抑制功能检测 |
| 2.4 不同毒力PRRSV毒株对Tregs的诱导 |
| 2.5 细胞因子TGF-β和IL-10的测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 第四章 核衣壳蛋白第15N和46Raa残基在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Tregs细胞中的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和病毒 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 合成肽 |
| 1.2 表达PRRSV结构蛋白重组杆状病毒的构建 |
| 1.2.1 PRRSV结构蛋白基因片段克隆引物设计和合成 |
| 1.2.2 目的片段扩增及重组pFastBac Dual载体的获得 |
| 1.2.3 重组质粒的酶切和测序鉴定 |
| 1.2.4 重组Bacmid的构建与鉴定 |
| 1.2.5 重组杆状病毒的获得与扩增 |
| 1.2.6 重组结构蛋白杆状病毒的表达与Western Blot鉴定 |
| 1.2.7 重组杆状病毒表达蛋白的纯化 |
| 1.3 PRRSV N蛋白基因点突变毒株全长cDNA克隆的构建 |
| 1.3.1 BB0907全长cDNA克隆质粒pCMV-BB的构建 |
| 1.3.2 BB0907毒株相关点突变毒株cDNA全长克隆的构建 |
| 1.4 重组病毒的拯救 |
| 1.5 病毒蚀斑检测 |
| 1.6 病毒生长曲线测定 |
| 1.7 猪Tregs细胞诱导试验 |
| 1.8 流式方法检测Tregs细胞 |
| 1.9 细胞因子测定 |
| 1.10 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 HP-PRRSV结构蛋白重组杆状病毒的构建及表达 |
| 2.1.1 目的片段扩增及重组pFastBac Dual载体的构建 |
| 2.1.2 重组Bacmid的鉴定 |
| 2.1.3 重组杆状病毒的获得及目的基因表达 |
| 2.1.4 重组杆状病毒表达蛋白的纯化 |
| 2.2 重组蛋白诱导Tregs细胞的检测 |
| 2.3 不同毒力PRRSV毒株N蛋白诱导Tregs能力比较 |
| 2.4 N蛋白合成肽诱导Tregs细胞的检测 |
| 2.5 合成肽突变体诱导Tregs细胞的检测 |
| 2.6 PRRSVN蛋白基因突变毒株的构建 |
| 2.7 重组PRRSV毒株对Tregs诱导能力比较 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 第五章 猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体抗性毒株的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和病毒 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 中和抗体血清 |
| 1.2 中和抗体抗性突变毒株的获得 |
| 1.3 抗性毒株基因测序 |
| 1.4 血清中和试验 |
| 1.5 病毒蚀斑检测 |
| 1.6 抗体于病毒结合能力分析 |
| 1.7 病毒生长曲线 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 NAb抗性毒株的获得 |
| 2.2 NAb抗性毒株序列分析 |
| 2.3 抗性毒株与抗体结合能力测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 第六章 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白诱导中和抗体的关键氨基酸位点的确定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和病毒 |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 中和抗体血清 |
| 1.2 血清中和试验 |
| 1.3 PRRSV感染性cDNA克隆的构建 |
| 1.3.1 BB和BB34s株全长cDNA克隆质粒的构建 |
| 1.3.2 BB和BB34s毒株相关点突变毒株cDNA全长克隆的构建 |
| 1.4 重组病毒的拯救 |
| 1.5 病毒蚀斑检测 |
| 1.6 抗体结合分析 |
| 1.7 病毒生长曲线 |
| 1.8 在PAMs进行的病毒单复制周期中和测定试验 |
| 1.9 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组PRRSV拯救 |
| 2.2 中和抗体结合位点的确定 |
| 2.3 抗性毒株与抗体结合能力分析 |
| 2.4 GP5蛋白Y102C和G104R突变抵抗NAb中和作用能力比较 |
| 2.5 不同NAb血清对抗性突变株的中和滴度测定 |
| 2.6 抗性毒株在PAMs上的中和滴度测定 |
| 2.7 抗性毒株与野生型毒株序列比对 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 第七章 高致病性PRRSV对高原藏香猪的致病性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 细胞和病毒 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 试验动物 |
| 1.2 PAMs感染试验 |
| 1.3 猪体感染试验 |
| 1.4 病理学检查 |
| 1.4.1 病理组织切片制备 |
| 1.4.2 HE染色 |
| 1.5 免疫组化检测PRRSV |
| 1.6 荧光定量PCR检测PRRSV |
| 1.6.1 样品RNA提取 |
| 1.6.2 反转录 |
| 1.6.3 Real-time PCR |
| 1.7 PRRSV TCID_(50)测定 |
| 1.8 M-ELISA方法测定细胞因子 |
| 1.9 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PAMs培养感染试验 |
| 2.2 猪体感染试验 |
| 2.2.1 临床症状观察 |
| 2.2.2 病理学观察 |
| 2.2.3 病毒血症测定结果 |
| 2.2.4 不同脏器组织中PRRSV测定 |
| 2.3 细胞因子水平的测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 全文总结 本论文主要创新点 致谢 攻读博士学位期间发表论文 |
（7）油茶蛋白磷酸酶基因的全长cDNA克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 1 绪言 |
| 1.1 蛋白磷酸酶的分类、结构和功能 |
| 1.1.1 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶的分类 |
| 1.1.2 酪氨酸蛋白磷酸酶的分类 |
| 1.1.3 蛋白磷酸酶的结构 |
| 1.1.4 蛋白磷酸酶的生物学功能 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 1.4 本研究的主要内容和技术路线 |
| 2 油茶蛋白磷酸酶MPP基因全长CDNA克隆 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 重组子PCR检测电泳结果 |
| 2.2.2 油茶MPP基因全长cDNA的获得 |
| 2.2.3 CoMPP1核酸序列分析 |
| 2.2.4 CoMPP1蛋白质序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 3 油茶蛋白磷酸酶PTP基因全长CDNA克隆 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和用品 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 PTP基因全长cDNA克隆与分析 |
| 3.2.1 油茶种子胚乳总RNA提取 |
| 3.2.2 电泳检测 |
| 3.2.3 mRNA反转录获得cDNA |
| 3.2.4 PTP基因的5'RACE PCR |
| 3.2.5 目的片段回收 |
| 3.2.6 感受态细胞的制备 |
| 3.2.7 T载体重组子的制备 |
| 3.2.8 重组子转化 |
| 3.2.9 PCR鉴定重组子 |
| 3.2.10 PCR产物测序 |
| 3.3 PTP基因克隆结果电泳检测 |
| 3.3.1 油茶种子总RNA的提取质量 |
| 3.3.2 PTP基因5'RACE产物龟泳检测 |
| 3.4 油茶CoPTP1基因的生物信息学分析 |
| 3.4.1 CoPTP1核苷酸序列分析 |
| 3.4.2 CoPTP1蛋白质序列分析 |
| 3.5 讨论 |
| 4 油茶蛋白磷酸酶PP2C基因全长CDNA克隆 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和用品 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 PP2C基因全长cDNA克隆与分析 |
| 4.2.1 油茶胚乳总RNA提取、电泳检测、mRNA反转录 |
| 4.2.2 PP2C的文库片段菌液PCR |
| 4.2.3 CoPP2C1基因的5'RACE |
| 4.3 CoPP2C1基因克隆结果电泳检测 |
| 4.4 PP2C的生物信息学分析 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 核苷酸序列分析 |
| 4.5.2 氨基酸序列分析 |
| 5 结论与创新 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新 |
| 参考文献 |
| 附录A 实验药品 |
| 附录B 主要仪器设备 |
| 附录C 硕士研究生阶段发表的论文 |
| 致谢 |
| 课题来源 |
（8）龙眼子叶胚发育相关的若干基因克隆及序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 龙眼分子生物学研究进展 |
| 1.1.1 龙眼品种分类和鉴定 |
| 1.1.1.1 龙眼品种的RAPD 鉴定 |
| 1.1.1.2 龙眼品种的ISSR 和ITS 鉴定 |
| 1.1.1.3 龙眼品种的AFLP 鉴定 |
| 1.1.2 龙眼开花和成花逆转研究 |
| 1.1.3 龙眼胚胎发育研究 |
| 1.1.3.1 龙眼胚胎发育的生物大分子和激素研究 |
| 1.1.3.2 龙眼胚胎发育的蛋白质组和转录组研究 |
| 1.1.3.3 龙眼体细胞胚及转基因的研究 |
| 1.2 cDNA-AFLP 技术的应用 |
| 1.2.1 cDNA-AFLP 技术分析植物发育基因表达 |
| 1.2.2 cDNA-AFLP 技术分析植物逆境基因表达 |
| 1.2.3 cDNA-AFLP 技术分析植物抗病和抗虫基因表达 |
| 1.2.4 cDNA-AFLP 技术分析植物生理过程基因表达 |
| 1.3 本研究的目的和技术路线 |
| 第二章 龙眼子叶胚不同发育时期cDNA-AFLP分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 仪器和试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 龙眼子叶胚总RNA 的提取 |
| 2.2.1.1 花后35 天龙眼子叶胚总RNA 的提取 |
| 2.2.1.2 花后50 天龙眼子叶胚总RNA 的提取 |
| 2.2.2 双链cDNA 的合成 |
| 2.2.2.1 第一链cDNA 合成 |
| 2.2.2.2 第一链cDNA 纯化 |
| 2.2.2.3 cDNA 的 LD-PCR 扩增 |
| 2.2.2.4 双链cDNA- PCR 产物纯化 |
| 2.2.3 cDNA-AFLP 的引物合成和接头制备 |
| 2.2.4 酶切和加接头 |
| 2.2.5 预扩增 |
| 2.2.6 选择性扩增 |
| 2.2.7 琼脂糖电泳 |
| 2.2.8 聚丙烯酰胺电泳 |
| 2.2.9 银染 |
| 2.2.9.1 银染试剂的配制 |
| 2.2.9.2 银染操作步骤 |
| 2.2.10 差异片段的克隆 |
| 2.2.10.1 差异片段的二次扩增 |
| 2.2.10.2 差异片段的PCR 产物回收 |
| 2.2.10.3 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.2.10.4 连接和转化 |
| 2.2.10.5 鉴定 |
| 2.2.11 差异片段序列分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 龙眼胚胎总RNA 提取和cDNA 合成 |
| 2.3.2 限制性酶切、接头连接、预扩增和选择性扩增 |
| 2.3.3 差异片段的克隆 |
| 2.3.4 差异条带的BLAST 分析 |
| 2.4 小结和讨论 |
| 第三章 龙眼子叶胚GAPDH 基因的cDNA 克隆及序列分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 RACE 反应体系建立 |
| 3.2.3 GAPDH 生物信息学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 GAPDH 基因的3′-RACE 和5′-RACE |
| 3.3.2 GAPDH 基因cDNA ORF 的获得 |
| 3.3.3 GAPDH 基因全长cDNA 序列分析 |
| 3.4 小结和讨论 |
| 第四章 龙眼子叶胚YA82 基因的cDNA 克隆及序列分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 YA82 基因的3′-RACE、5′- RACE 及cDNA 全长扩增 |
| 4.2.3 龙眼YA82 生物信息学分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 YA82 基因的的3′-RACE 和5′-RACE |
| 4.3.2 YA82 基因全长cDNA 的获得 |
| 4.3.3 YA82 基因全长cDNA 序列分析 |
| 4.3.4 YA82基因的RT-PCR表达分析 |
| 4.4 小结和讨论 |
| 第五章 龙眼子叶胚Remorin、FVE 和CCR4-NOT 基因全长cDNA 克隆及其他基因部分cDNA 克隆与序列分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 3′- RACE 和 5′- RACE |
| 5.2.3 生物信息学分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 Remorin 基因的 cDNA 克隆及序列分析 |
| 5.3.2 FVE 基因的 cDNA 克隆及序列分析 |
| 5.3.3 CCR4-NOT 基因的 cDNA 克隆及序列分析 |
| 5.3.4 硫转运蛋白、几丁质酶和脱水应答相关蛋白基因的 3′或 5′- RACE 及 RT-PCR 表达分析 |
| 5.4 小结和讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间发表论文 |
（9）青枯菌诱导的马铃薯防卫相关基因克隆与表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 马铃薯-青枯菌互作及相关研究进展 |
| 1.1.1 病原 |
| 1.1.2 寄主 |
| 1.1.3 相互作用 |
| 1.1.4 病害管理 |
| 1.1.5 问题与展望 |
| 1.2 本论文的研究内容与目的及拟解决的关键问题 |
| 第二章 青枯菌诱导的马铃薯防卫相关基因的筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 植物材料与菌种 |
| 2.2.2 总RNA 抽提 |
| 2.2.3 cDNA 反转录 |
| 2.2.4 cDNA Rsa I 酶切 |
| 2.2.5 cDNA Rsa I 酶切产物的接头连接 |
| 2.2.6 第一轮差减杂交 |
| 2.2.7 第二轮差减杂交 |
| 2.2.8 PCR 扩增反应 |
| 2.2.9 差减文库克隆 |
| 2.2.10 反向Northern 斑点杂交 |
| 2.2.11 RT-PCR 验证 |
| 2.2.12 序列分析和功能注释 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 青枯菌PO41在马铃薯中的居群动态 |
| 2.3.2 SSH 文库构建 |
| 2.3.3 差异表达片段的RT-PCR 验证 |
| 2.3.4 序列测定与同源检索及GO 分类 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 SSH-EST 克隆的有效性和局限性 |
| 2.4.2 GO 术语注释和分类防卫相关基因功能的准确性 |
| 2.4.3 青枯病防卫反应中部分关键基因的分子功能 |
| 2.4.4 关于青枯菌诱导的防卫相关基因参与的生物学通路 |
| 2.4.5 比较两种细菌性维管束病害中寄主EST揭示了防卫相关基因的异同 |
| 2.4.6 两种不同诱导方法揭示的青枯病防卫相关基因的异同 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 StLTPa7 基因在马铃薯与青枯菌互作早期的表达模式 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 植物材料、菌种与接种 |
| 3.2.2 富集青枯菌诱导表达马铃薯cDNA文库的构建 |
| 3.2.3 化学处理 |
| 3.2.4 马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7cDNA 全长的获得 |
| 3.2.5 序列测定和生物信息学分析 |
| 3.2.6 Real-Time PCR、RT-PCR 和Northern 杂交 |
| 3.2.7 环境扫描电子显微镜和EDAX 能谱分析 |
| 3.2.8 原位杂交 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 富集马铃薯与青枯菌互作早期诱导表达的防卫相关基因的cDNA文库 |
| 3.3.2 StLTPa7 cDNA 的克隆、结构与进化分析 |
| 3.3.3 青枯菌诱导StLTPa7 基因的时空表达 |
| 3.3.4 EDAX 分析和氯化钙诱导的StLTPa7 基因的表达 |
| 3.3.5 非生物激发子对StLTPa7 基因表达的诱导效应 |
| 3.3.6 钌红对StLTPa7 基因表达的抑制效应 |
| 3.3.7 StLTPa7 基因表达的原位杂交定位 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 关于马铃薯与青枯菌互作早期诱导表达的防卫相关基因的cDNA文库 |
| 3.4.2 StLTPa7 基因的结构与抗病性功能 |
| 3.4.3 青枯菌和非生物激发子诱导的StLTPa7 基因上调表达与防卫反应 |
| 3.4.4 StLTPa7 基因转录的时空特征表明其可能参与系统获得抗性 |
| 3.4.5 StLTPa7 基因可能涉及一种复杂的Ca2+ 相关的基因表达模式 |
| 3.4.6 StLTPa7 作为防卫基因参与马铃薯青枯病抗性的机制探讨 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 StLTPa1 基因在不同抗、感病基因型中的差异表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 植物材料和青枯菌株 |
| 4.2.2 化学处理 |
| 4.2.3 RNA/DNA 制备 |
| 4.2.4 抑制差减杂交和序列分析 |
| 4.2.5 分离全长nsLTP cDNA |
| 4.2.6 Real-Time PCR、RT-PCR 和Northern 杂交 |
| 4.2.7 组织原位杂交 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 克隆和鉴定StLTPa1 基因 |
| 4.3.2 青枯菌诱导StLTPa1 基因在不同抗、感病基因型中的表达模式 |
| 4.3.3 StLTPa1 基因表达受非生物激发子的影响 |
| 4.3.4 StLTPa1 基因表达的组织定位 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 StLTPa1 基因结构与进化 |
| 4.4.2 青枯菌诱导StLTPa1 基因在不同抗、感病基因型中的表达模式 |
| 4.4.3 StLTPa1 基因的表达受非生物因子的影响 |
| 4.4.4 StLTPa1 基因与StLTPa7 的关系 |
| 4.5 结论 |
| 第五章 潜伏感染菌株不能诱导 StLTPa7 和 StLTPa1 基因的表达 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 青枯菌、植物材料和生长条件 |
| 5.2.2 SCV 菌株的分离 |
| 5.2.3 生理检测 |
| 5.2.4 分子鉴定 |
| 5.2.5 电镜检测 |
| 5.2.6 致病性检测 |
| 5.2.7 StLTPa7 和StLTPa1 基因表达检测 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 青枯菌R.solanacearum SCVs的特征 |
| 5.3.2 青枯菌R. solanacearum SCVs的鉴定 |
| 5.3.3 StLTPa7 基因表达的检测 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 分离的两株低温适应型青枯菌归属于小菌落变异株更为合理 |
| 5.4.2 SCV 不诱导寄主防卫基因表达是逃避寄主免疫系统的一种表现？ |
| 5.4.3 小菌落变异株对马铃薯寄主无症状潜伏感染 |
| 5.4.4 小菌落变异株有利于青枯菌种内进化 |
| 5.4.5 关于青枯病的发生和流行 |
| 5.5 结论 |
| 第六章 其他防卫相关基因cDNA 克隆与序列分析 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 青枯菌、植物材料和生长条件 |
| 6.2.2 马铃薯与青枯菌互作早期受病菌诱导表达基因的SSH cDNA 文库 |
| 6.2.3 富集马铃薯青枯病防卫早期表达基因cDNA 文库 |
| 6.2.4 防卫相关基因cDNA 全长的获得 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 全长cDNA 的克隆 |
| 6.3.2 五条马铃薯非特异性脂质转移蛋白基因的关系 |
| 6.3.3 马铃薯青枯病防卫反应中的铁蛋白 |
| 6.3.4 马铃薯青枯病防卫反应中的印膜蛋白 |
| 6.3.5 马铃薯青枯病防卫反应中的开心蛋白 |
| 6.3.6 马铃薯青枯病防卫反应中的蛋白酶抑制子 |
| 6.3.7 马铃薯青枯病防卫反应中的转录因子 |
| 6.4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）乙烯对麦冬光合作用的影响及相关基因的克隆（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 1 综述 |
| 1.1 乙烯的研究进展 |
| 1.1.1 乙烯的生物合成 |
| 1.1.1.1 乙烯的生物合成途径 |
| 1.1.1.2 乙烯生物合成的关键酶 |
| 1.1.2 乙烯的信号转导 |
| 1.1.2.1 乙烯反应突变体 |
| 1.1.2.2 乙烯受体蛋白 |
| 1.1.2.3 乙烯的信号转导 |
| 1.1.3 乙烯的生理作用及应用 |
| 1.1.3.1 改变生长习性 |
| 1.1.3.2 促进果实成熟 |
| 1.1.3.3 促进叶片衰老和器官脱落 |
| 1.1.3.4 诱导不定根的发生和植株分蘖 |
| 1.1.3.5 促进次生物质的合成与排出 |
| 1.1.3.6 增加黄瓜雌花 |
| 1.2 麦冬的研究进展 |
| 1.2.1 遗传多样性研究 |
| 1.2.2 核型分析 |
| 1.2.3 耐盐性研究 |
| 1.2.4 耐荫性研究 |
| 1.3 差异表达基因克隆的常见方法 |
| 1.3.1 差异显示技术(DDRT-PCR) |
| 1.3.2 代表性差异分析法(RDA) |
| 1.3.3 基因芯片 |
| 1.3.4 抑制性差减杂交(SSH)技术 |
| 1.3.4.1 SSH的基本原理 |
| 1.3.4.2 SSH技术的主要过程 |
| 1.3.4.3 SSH技术的特点 |
| 1.3.4.4 SSH在动植物上的应用 |
| 1.4 本研究的意义、内容与技术路线 |
| 1.4.1 目的与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 技术路线 |
| 2 乙烯对麦冬光合作用的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料与试剂 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.2.1 麦冬光响应曲线的测定 |
| 2.1.2.2 麦冬CO_2响应曲线的测定 |
| 2.1.2.3 乙烯对麦冬光合速率影响的测定 |
| 2.1.2.4 乙烯对麦冬荧光特性影响的测定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 麦冬的光响应曲线 |
| 2.2.2 麦冬的CO_2响应曲线 |
| 2.2.3 乙烯对麦冬光合速率的影响 |
| 2.2.4 乙烯对麦冬各荧光参数影响的测定 |
| 2.2.4.1 乙烯对麦冬最小初始荧光Fo的影响 |
| 2.2.4.2 乙烯对麦冬光化学量子效率Fv/Fm的影响 |
| 2.2.4.3 乙烯对麦冬Fv'/Fm'的影响 |
| 2.2.4.4 乙烯对光系统PSⅡ实际光化学量子产量的影响 |
| 2.2.4.5 乙烯对麦冬光化学猝灭系数的影响 |
| 2.2.4.6 乙烯对麦冬NPQ的影响 |
| 2.2.4.7 乙烯对麦冬ETR的影响 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 2.3.1 植物激素对光合作用的影响 |
| 2.3.2 生理节奏对光合速率的影响 |
| 2.3.3 生长发育 |
| 3 麦冬乙烯诱导表达差减cDNA文库的构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.1.1 植物材料 |
| 3.1.1.2 材料培养与处理 |
| 3.1.1.3 实验试剂及测序 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.2.1 总RNA的提取和纯化 |
| 3.1.2.2 Poly(A)RNA的分离 |
| 3.1.2.3 抑制差减杂交 |
| 3.1.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.1.2.5 正向差减cDNA的克隆 |
| 3.1.2.6 差异筛选cDNA文库 |
| 3.1.2.7 阳性克隆的测序和序列分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 麦冬RNA的提取及纯化 |
| 3.2.2 麦冬mRNA的分离 |
| 3.2.3 差减cDNA文库的构建 |
| 3.2.3.1 酶切与接头连接效率分析 |
| 3.2.3.2 差减效率分析 |
| 3.2.3.3 差减cDNA文库的构建 |
| 3.2.4 差异筛选差减cDNA文库 |
| 3.2.4.1 探针的标记效率 |
| 3.2.4.2 斑点杂交 |
| 3.2.5 阳性克隆的测序与序列分析 |
| 3.2.5.1 阳性克隆的测序 |
| 3.2.5.2 EST序列分析 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 3.3.1 植物总RNA的提取与纯化 |
| 3.3.1.1 防止RNA酶的污染 |
| 3.3.1.2 提取方法与试剂的选择 |
| 3.3.1.3 多糖与杂蛋白的去除 |
| 3.3.1.4 RNA沉淀剂的选择 |
| 3.3.2 mRNA的分离 |
| 3.3.3 差减cDNA文库的建立 |
| 3.3.4 探针的标记 |
| 3.3.5 SSH的应用 |
| 4 叶绿素结合蛋白基因与未知蛋白基因的克隆 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.1.1 植物材料 |
| 4.1.1.2 材料培养与处理 |
| 4.1.1.3 实验试剂 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.2.1 麦冬总RNA的提取与纯化 |
| 4.1.2.2 Poly(A)~+RNA的分离 |
| 4.1.2.3 cDNA文库的构建 |
| 4.1.2.4 CAB与UNP基因的获得 |
| 4.1.2.5 CAB与UNP基因的序列分析与功能预测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 全长cDNA文库的构建 |
| 4.2.2 CAB基因与UNP基因全长序列的获得 |
| 4.2.3 CAB基因序列分析与功能预测 |
| 4.2.3.1 CAB基因开放阅读框(ORF)分析 |
| 4.2.3.2 CAB基因BLAST分析 |
| 4.2.3.3 CAB基因系统发育分析 |
| 4.2.3.4 CAB基因编码蛋白的理化性质分析 |
| 4.2.3.5 CAB基因编码蛋白的疏水性分析 |
| 4.2.3.6 CAB基因编码蛋白的结构预测 |
| 4.2.4 UNP基因的序列分析与功能预测 |
| 4.2.4.1 UNP基因开放阅读框(ORF)分析 |
| 4.2.4.2 UNP基因BLAST分析 |
| 4.2.4.3 UNP基因系统发育分析 |
| 4.2.4.4 UNP基因编码蛋白的理化性质分析 |
| 4.2.4.5 UNP基因编码蛋白的疏水性分析 |
| 4.3 讨论 |
| 5 表达载体构建与原核表达 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 限制性内切酶与常用生化试剂 |
| 5.1.1.2 菌种和质粒 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 正义、反义植物表达载体的构建 |
| 5.1.2.2 表达载体导入农杆菌LBA4404 |
| 5.1.2.3 原核表达载体构建 |
| 5.1.2.4 融合蛋白的诱导表达 |
| 5.1.2.5 SDS-PAGE所需试剂的配制 |
| 5.1.2.6 SDS-PAGE电泳 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 植物表达载体构建 |
| 5.2.1.1 酶切位点的引入 |
| 5.2.1.2 正、反义载体的构建 |
| 5.2.1.3 正、反义表达载体导入农杆菌 |
| 5.2.2 原核表达载体构建 |
| 5.2.3 SDS-PAGE电泳 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 乙烯对麦光合作用的影响 |
| 6.1.1 麦冬的光响应曲线与CO_2响应曲线 |
| 6.1.2 乙烯对麦冬光合速率的影响 |
| 6.1.3 乙烯对麦冬各荧光参数影响 |
| 6.2 差减cDNA文库的构建 |
| 6.2.1 麦冬总RNA的提取与mRNA的分离 |
| 6.2.2 差减cDNA文库的构建 |
| 6.2.3 差异筛选差减cDNA文库 |
| 6.3 叶绿素A/B结合蛋白(CAB)基因的获得 |
| 6.3.1 CAB基因的核甘酸序列分析 |
| 6.3.2 CAB基因编码蛋白的分析及预测 |
| 6.4 UNP基因的序列分析与功能预测 |
| 6.4.1 UNP基因开放阅读框(ORF)分析 |
| 6.4.2 UNP基因编码蛋白的分析 |
| 6.5 表达载体构建与原核表达分析 |
| 6.5.1 植物表达载体构建 |
| 6.5.2 原核表达 |
| 6.6 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 附录Ⅲ |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
四、一个新的胎肝发育相关因子cDNA的克隆与序列分析（论文参考文献）
- [1]水稻纹枯病菌中2个双分体病毒的基因组结构与功能研究[D]. 张美玲. 华南农业大学, 2018(02)
- [2]凝集素、Dorsal及Ras在主要经济虾中的免疫功能研究[D]. 黄欣. 南京师范大学, 2018(02)
- [3]半滑舌鳎抗哈维氏弧菌病相关QTL定位及免疫相关基因筛选和功能分析[D]. 魏敏. 南京农业大学, 2018(07)
- [4]猪繁殖与呼吸综合征病毒上调猪树突细胞CD83的表达及其分子机制[D]. 陈曦. 南京农业大学, 2017(07)
- [5]BrYV与PEMV2协生互作的生物学、转录组学和小RNA表达谱研究[D]. 周翠姬. 中国农业大学, 2017(05)
- [6]猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Tregs细胞和中和抗体的功能蛋白及其关键氨基酸位点的解析[D]. 范宝超. 南京农业大学, 2015(06)
- [7]油茶蛋白磷酸酶基因的全长cDNA克隆与序列分析[D]. 刘巧. 中南林业科技大学, 2010(03)
- [8]龙眼子叶胚发育相关的若干基因克隆及序列分析[D]. 卢秉国. 福建农林大学, 2009(11)
- [9]青枯菌诱导的马铃薯防卫相关基因克隆与表达[D]. 郜刚. 中国农业科学院, 2008(10)
- [10]乙烯对麦冬光合作用的影响及相关基因的克隆[D]. 刘君. 北京林业大学, 2008(12)