一、番木瓜环斑病毒PCR检测技术研究（论文文献综述）
赵梅胜[1]（2021）在《马铃薯Y病毒和番茄褐色皱果病毒弱毒突变体筛选及交叉保护效果测定》文中研究说明病毒病是危害作物安全生产的重要病害。马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）可侵染马铃薯、烟草等茄科作物,其N株系侵染普通烟会产生叶脉坏死症状,严重影响烟草生产、烟叶品质;番茄褐色皱果病毒（tomato brown rugose fruit virus,To BRFV）侵染番茄引起果实坏死,严重影响番茄产量和品质。目前生产上的主栽烟草品种不抗PVY,也没有对To BRFV有很好抗性的番茄品种,在缺少有效抗病毒药剂的情况下,交叉保护是防治植物病毒病的良好选择。本文基于PVY-GZ和To BRFV-SD全长c DNA侵染性克隆,利用定点突变技术获得了一系列弱毒突变体,评估了弱毒突变体的交叉保护效果,获得了有田间应用潜力的弱毒突变体。主要结果如下:1、证明CP参与PVY引起的烟草叶脉坏死,获得了含有两个或三个位点突变、对野生型PVY有良好保护效果的弱毒突变体。利用PVY-GZ全长c DNA侵染性克隆,构建了7个单位点突变体。接种珊西烟发现,与野生型一样,突变体HC（K50E）和HC（K124R）仍在珊西烟上表现叶脉坏死,但突变体HC（K124L）、HC（K182R）和CP（D6N）在珊西烟上不引起烟草叶脉坏死症状,而突变体HC（N166A）和CP（G9R）丧失侵染力。聚合叶脉坏死能力丧失的突变位点,获得了双位点突变体HC（K124L＿K182R）、HC（K124L）-CP（D6N）、HC（K182R）-CP（D6N）和三位点突变体HC（K124L＿K182R）-CP（D6N）。接种珊西烟发现,与野生型相比,以上四个突变体在珊西烟上均不引起烟草叶脉坏死症状,病毒CP的蛋白积累量和RNA积累量分别下降了50%、53%、40%、57%和98%、99%、60%、98%。将这四个弱毒突变体保护接种珊西烟15天后挑战接种,与未进行保护接种的珊西烟相比,弱毒突变体保护接种的珊西烟不表现叶脉坏死症状并且症状减轻,检测不到野生型病毒GFP的蛋白积累,相对防治效果分别是63%、54%、22%和63%。2、证明复制酶Y697和D711突变后影响To BRFV的致病力,弱毒突变体Y697A对野生型To BRFV有良好的交叉保护效果。利用To BRFV-SD全长c DNA侵染性克隆,构建了14个单位点突变体,其中Y697A、D711A接种本氏烟后不表现任何症状。将弱毒突变体Y697A和D711A保护接种本氏烟15天后挑战接种,与未进行保护接种的本氏烟相比,弱毒突变体Y697A保护接种的本氏烟无明显症状,并且野生型病毒GFP的蛋白积累量和RNA积累量分别降低了79%和99.9%。保护接种15天后挑战接种,弱毒突变体Y697A在番茄品种齐达利和上海惠合405上的相对防治效果分别为43%和32%。本研究筛选获得了有良好交叉保护作用效果的PVY和To BRFV弱毒突变体,对指导PVY和To BRFV的田间防治具有积极作用。
王凯玥[2]（2020）在《西葫芦PRSV-W抗病基因紧密连锁分子标记的开发与育种应用》文中提出西葫芦（Cucurbita pepo L.）是葫芦科南瓜属重要的栽培蔬菜,世界范围内广泛种植,我国的栽培面积及产量均居世界首位。西葫芦适应性强、产量高、易管理、口感好、营养价值高,深受生产者和消费者的喜爱。目前,西葫芦设施栽培面积逐年增加,实现了周年供应。而生产方式的转变,也加重了病毒病等病害的危害。番木瓜环斑病毒病西瓜株系（PRSV-W）是危害西葫芦等葫芦科作物的主要病害之一,西葫芦植株被侵染后,出现花叶、泡斑、植株矮化、果实畸形等现象,可造成40%以上的产量损失,严重者甚至绝产。目前尚没有防治病毒病的有效药剂,培育抗病品种是防治PRSV-W病毒病最为经济、安全有效的措施。国内对西葫芦PRSV-W抗病鉴定技术及抗病种质鉴定的研究较少,导致抗性种质资源缺乏;同时传统抗病育种效率低、周期长,严重阻碍了抗病品种的选育,导致抗病品种少,满足不了生产需求。在前期初步探索工作的基础上,本研究进一步完善了西葫芦PRSV-W苗期抗性评价鉴定技术,对收集的西葫芦种质资源及当前主栽品种进行了抗性评价筛查,并构建六世代群体以揭示PRSV-W抗性遗传规律;进一步对西葫芦PRSV-W抗病基因进行了定位研究;开发了与PRSV-W抗病基因紧密连锁的分子标记并应用于西葫芦分子标记辅助选择育种。获得以下主要结果:1.西葫芦种质资源及主栽品种的抗性评价筛查及PRSV-W抗性遗传规律的揭示利用进一步完善的西葫芦PRSV-W苗期抗性评价鉴定技术体系,结合DAS-ELISA和RT-PCR检测技术,对收集的148份西葫芦品种及种质资源进行抗性评价筛查,获得抗PRSV-W病毒病材料33份,感病材料115份。其中,高代自交系“BV21”表现为高度抗病,接种PRSV-W病毒病后与对照无明显差异;自交系“BV37”表现为高度感病。利用这两个自交系配制六世代群体,并对单株进行抗性鉴定,结果显示:F1植株均表现为抗病;F2群体中137株抗病,55株感病,符合显性单基因控制性状的分离比例3:1（χ2=1.36,P=0.24）;BC1P1（F1×BV21）群体均为抗病,而BC1P2（F1×BV37）群体中,抗病与感病植株的分离比例为1:1。结果表明西葫芦材料“BV21”的PRSV-W抗性性状由一对显性抗病基因控制。2.PRSV-W抗病基因的定位利用897对SSR分子标记,在抗、感亲本间进行多态性分子标记筛查,获得149对具有多态性的分子标记。采用集群分离分析法（BSA）,利用筛选获得的亲本间多态性SSR分子标记对F2群体内植株进行分析,筛查获得4个与抗病基因CpPRSV-W紧密连锁的分子标记。其中,与抗病基因连锁最为紧密的标记SSR47,与抗病基因遗传距离为1.0 cM;另一侧的标记SSR113与抗病基因遗传距离为1.5cM;其余两个标记SSR21、SSR276遗传距离相对较远。为缩小抗病基因候选区间,进一步通过双亲重测序,在上述分子标记SSR47与SSR113之间开发新的InDel标记后筛查交换单株。最终将抗病基因CpPRSV-W定位在InDel标记ID523与ID1317之间,该区间包含753 Kb序列。根据西葫芦基因组注释信息,该候选区域包含30个候选基因。3.与PRSV-W抗病基因紧密连锁分子标记的开发及其在分子标记辅助选择育种中的应用在抗病基因候选区域内设计新的InDel标记,筛查获得多态性好、扩增稳定的分子标记ID307。利用ID307建立高效分子标记辅助选择育种技术,苗期对西葫芦抗病转育单株进行检测选择,淘汰非目标单株。自2018年以来,对西葫芦回交转育的四个批次植株材料,约20000株,进行苗期抗性筛查,获得6707株抗病植株。病毒接种鉴定结果显示,分子标记筛查获得的转育抗病植株获得了PRSV-W病毒病抗性。本文研究结果为PRSV-W抗病基因的高效利用、快速创制抗病西葫芦新种质及选育抗病新品种提供了技术支持,也为进一步分离鉴定抗病基因、揭示抗性分子机制奠定了基础。
彭斌[3]（2019）在《中国葫芦科作物病毒的分布、多样性及进化研究》文中进行了进一步梳理葫芦科作物是我国重要的经济作物。在中国28种以上病毒侵染为害葫芦科作物,每年可造成高达300亿元人民币的损失。随着全球气候变暖,国际贸易交流频繁,种植地域的扩张以及种植模式的多样化,侵染葫芦科作物的病毒病种类发生报道也逐年增加。本研究调查全国西瓜和甜瓜的主要产区的病毒病的发生情况并采集疑似病毒样本应用二代测序技术（next-generation sequencing,NGS）结合常规检测方法鉴定和检测病毒种类;鉴定了2种葫芦科作物上新发生的马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒;鉴定了1种侵染西葫芦的马铃薯卷叶病毒属（Polerovirus）新病毒;对4种常见的病毒进行系统进化和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）分析,本文取得如下主要结果:（1）明确了中国葫芦科作物病毒种类与分布。调查了华南沿海冬季产区,长江以南丘陵产区,华中平原优势产区,西南坡地和山区种植区以及西北旱地优势产区为代表的9个省份,31个区县,52块种植地块的以西瓜和甜瓜为主的葫芦科作物上病毒病发生情况。共采集了288份疑似病毒样本,其中西瓜109份,甜瓜95份,南瓜57份,其他葫芦作物共27份。初步比较了小RNA测序（Small RNA sequencing,sRNA-seq）和去核糖体RNA测序（Ribo-minus RNA sequencing,rmRNA-seq）技术应用于鉴定和检测病毒的差异。应用NGS测序技术和常规检测技术检测到12个属22种病毒,其中已知病毒种21个,新病毒种1种。以病毒核酸类型分类比较,正单链RNA病毒（Positive-sense single-stranded RNA virus,+ssRNA virus）占优;以病毒属分类比较:马铃薯Y病毒属占优;以病毒种分类比较:小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus）占优;以田间传播类型分类比较:以蚜虫传播方式占优;以侵染单个样本的病毒数量分类;单个病毒侵染样本数量占优。比较分析了不同葫芦科作物中检出病毒的种类与分布差异。比较分析了不同种植地区病毒发生与分布情况,其中明显差异是华南地区以蓟马传播病毒种类占优,而其他地区均是以蚜虫传播方式占优。（2）明确了小西葫芦虎纹花叶病毒和番木瓜畸形花叶病毒的生物学特性和基因组信息。在NGS和RT-PCR鉴定的基础上,测定了小西葫芦虎纹花叶病毒（zucchini tigre mosaic virus）和番木瓜畸形花叶病毒（papaya leaf distortion mosaic virus）的全基因组序列,分析了其基因组特性。ZTMV是一种重组病毒;PLDMV与目前报道的番木瓜株系基因组水平差异较大。通过重组融合方法成功构建了ZTMV和PLDMV侵染性克隆,从多种病毒复合侵染样本中获得2种病毒3个分离物纯化病毒材料并验证了其侵染性和传毒能力。测定了2种病毒4个分离物的寄主范围以及在不同葫芦科作物上的症状表现。（3）发现和鉴定一株马铃薯卷叶病毒属新病毒。我们鉴定了新疆维吾尔自治区阜康市西葫芦上的一株马铃薯卷叶病毒属新病毒命名为小西葫芦蚜传黄化病毒（zucchini aphid-borne yellows virus）。测定该病毒的全长基因组序列5792nt并分析其基因组符合马铃薯卷叶病毒属病毒基因组特性。通过多重比对,系统进化和重组分析明确该病毒由同属的鹰嘴豆褪绿丛矮病毒（chickpea chlorotic stunt virus）与芜菁黄化病毒（turnip yellow virus）,芸苔黄化病毒（brassica yellows virus）进化关系较近的未知病毒重组而来的新病毒。（4）明确了4种常见葫芦科作物病毒的进化特征,发现了一些新类群。基于NGS测序数据获得病毒的近似全长基因组序列用于4种主要病毒系统进化分析。来自本研究的黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus）全基因组序列遗传多样性不高都属于ⅠB亚组,检测到可能的重配现象;ZYMV的遗传多样性丰富,发现一个区别已报道所有ZYMV分离物的新组,提出ZYMV系统进化可能与地理位置相关性的假设;基于西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus）全基因组序列系统进化关系重新规划了病毒群体的系统进化关系;基于番木瓜花叶病毒（papaya ring spot virus）全基因组序列系统进化分析,定义1个PRSV新组,讨论了PRSV系统进化与寄主和地理位置的相关性。基于NGS数据结合生物信息学方法对4种主要病毒基因组的SNP分析。本论文研究通过大量采集以西瓜甜瓜为主的葫芦科病毒病害样本,通过NGS,结合常规检测方法,明确了中国葫芦科作物病毒发生的种类与分布,建立了中国葫芦科病毒组;鉴定了2种新发生病毒、1种病毒新种;分析了4种常见病毒的进化特征,发现了一些类群。这些研究结果,丰富了对中国乃至世界葫芦科病毒发生与分布的认识,有利于病毒病害的防控。
安娜[4]（2018）在《CTS-N诱导下番木瓜对环斑病毒病抗性研究》文中进行了进一步梳理番木瓜（Carica papaya L.）是海南等热带地区常见的一种果树,番木瓜环斑病（Papaya ringspot mosaic virus,PRSV）是一种对番木瓜的生产造成严重威胁的病毒病,病毒肆虐时会导致绝产绝收。CTS-N是一种壳聚糖类植物免疫调节剂,其不仅可以防控细菌、真菌引起的植物病害,同时也可以防控病毒病引起的病害。CTS-N可激活植物对病原的免疫反应,从而达到防控病毒病的作用。本实验设置了5个处理组,分别为处理组 A（0.5ml/LCTS-N）、B（1.0ml/LCTS-N）、C（1.5ml/LCTS-N）以及阴性对照CK-（只灌施清水）和阳性对照CK+（灌施清水并同处理组同期接种病毒）。筛选出最佳浓度1.0ml/L（B处理）后,将阴性对照组CK-、阳性对照组CK+以及B处理进行转录组测序,结合生理试验的结果以及高通量测序结果深入分析CTS-N对番木瓜环斑病防控的作用机理,为防控番木瓜抗病毒病寻找新的思路,奠定理论基础。主要研究结果如下:1.番木瓜接种病毒后第12天植株开始出现病症,然后开始进行发病率的统计。发现施用CTS-N的三组处理（A、B、C）发病率明显低于对照组,并且在第27天时B处理组发病率最低为60%,防病效果最佳,由此可见O.1ml/LCTS-N为最佳施用浓度。两种渗透调节物质Soluble sugar以及Soluble protein含量变化呈现先升高后降低的趋势,PAL、POD、PPO、SOD以及CAT这五个抗氧化酶活性的变化也呈现先升高后降低的趋势,而Chitinase以及Dextranase活性表现出持续升高的趋势,ABA、ETH、JA以及SA这四种植物激素信号转导物质的含量与抗氧化酶变化相似总体表现出先升高后降低的趋势。Soluble sugar以及Soluble protein含量在接种病毒后24h内迅速升高,其中可溶性糖含量处理组显着高于对照组,且B处理可溶性糖含量是最高的。PPO、POD、SOD以及CAT等酶活性也在相同的时间内迅速升高,四种抗氧化酶结果均表明处理B的酶活性显着高于对照组。Chitinase以及Dextranase酶活性表现为持续上升的趋势,且在24h时表现出明显的转折然后上升,且Chitinase活性B处理显着高于其他处理组,且与CK-、CK+处理相比差异极显着,而Dextranase在该点无显着差异。同时ABA、ETH、JA、SA含量在24h时也表现出明显的改变,这四个生理生化指标在该点均显示出B组处理激素含量显着高于其他组。如上分析发现大多数指标在24h时变化明显,因此将14个生理指标该点的数据进行TOPSIS综合分析排序,得到B处理（1.0ml/L CTS-N）在3个处理组中排第一位。通过对以上生理试验指标的分析及TOPSIS的结果,决定将B处理以及CK-和CK+处理的数据进行转录组测序。2.根据发病率的数据结果以及14个生理指标的TOPSIS综合排序,选定B处理以及阴性对照（CK-）和阳性对照（CK+）做转录组测序,每组做三个生物学重复。如下为转录组的基本测序数据:CK+与B组处理存在显着差异的基因有144条,其中上调有112条,下调有32条。CK-组与CK+组基因有18条,其中上调有6条,下调有12条。有6735条基因在GO数据库中被注释到,有4582条基因在KEGG数据库中被注释到。在KEGG中CK+与B处理比较表现为显着上调的基因有22条,表现为显着下调的基因有7条,CK-与CK+处理比较表现为显着上调有2条,表现为显着下调有4条。在CK+与B处理比较中KEGG通路共富集了 25条,其中差异显着的通路有5条（Pvalue<0.05）,与抗病相关的KEGG通路有3条,分别为植物病原体相互作用（8个差异表达基因）、氨基糖和核苷酸糖代谢（4个差异表达基因）以及植物激素信号转导（3个差异表达基因）。在CK-与CK+处理比较中KEGG通路共富集了7条,其中显着差异的通路有3条,无与抗病相关通路。与抗病相关的差异基因挑选出30条,这30条中上调有28条,下调有2条。从30条基因中,再进行进一步的筛选,最后对与本试验最为相关的12条基因进行了 qPCR验证。3.生理试验指标以及转录组测序结果相结合分析可以发现,B处理（1.0ml/L CTS-N）与CK+处理组相比较,抗氧化酶（PPO、SOD、POD、CAT）活性均有所增加,RBOH（活性氧爆发）基因同超氧阴离子含量的多少有关,当RBOH基因显着上调时,植物体内的活性氧成分也会随之增加。差异表达基因中的RBOH上调的结果与超氧阴离子含量上升也是相一致的。可能的原因为超氧阴离子含量的不断上升,激活抗氧化酶系统,代谢掉多余的氧根离子;Chitinase活性以及Dextranase活性的上升与Chitinase基因的表达以及PR1蛋白的上调表达结果也是相一致的,这可能是由于CTS-N被植物细胞膜上的相关受体识别,从而调动了胞外以及胞内的植物防御反应,使Chitinase的活性提高,调节活性氧爆发等生理过程,从而抵御病毒的入侵与繁殖;激素类物质如JA含量的上升其与茉莉酸ZIM结构域蛋白（JAZ）基因的上调表达相一致,内源SA含量的增加和与之间接相关的PR1蛋白基因的上调表达结果相一致。植物激素SA、ETH等信号转导物质,协同调控细胞的正常生理活动。且处理B（1.Oml/L）与处理CK+的差异极显着KEGG通路（Pvalue<0.01）为植物病原体相互作用,该通路存在8个差异显着基因。综合以上分析,CTS-N能够有效的调动植物自身的免疫能力,积极对抗病毒的入侵。
付兰兰[5]（2017）在《番木瓜环斑病毒弱毒株交叉保护防治环斑病毒病的研究》文中提出弱毒株交叉保护作用是防治植物病毒病的重要手段。如何获得有效弱毒株是交叉保护作用的关键因素。本研究通过对马铃薯Y病毒属病毒（强、弱毒株）的全长及部分氨基酸序列比对分析,筛选出在亲本强毒株PRSV-LM的P1和HC-Pro基因上的8个可能与致病性相关的氨基酸突变位点（1309、K481、K598、R728、F753、L754、N787和D944）。采用定点突变技术和Gibson拼接法,分别构建了 4种含有2个突变位点（L754和N787）、4个突变位点（I309、K481、F753和D944）、6个突变位点（1309、K481、F753、L754、N787 和 D944）和 8 个突变位点（1309、K481、K598、R728、F753、L754、N787 和 D944）的 PRSV-LM 全长 cDNA 克隆突变体:pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8。并在强毒株pPRSV-LM的HC-Pro和CP基因之间插入gfp基因,构建含gfp基因的强毒株pPRSV-LM-GFP/CP。构建的5种PRSV-LM全长cDNA克隆经人工接种、病症观察和RT-PCR检测以及荧光检测,结果表明5种PRSV-LM全长cDNA克隆均具有系统侵染性。对突变体pGprsvm2、pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8接种后15周症状观察结果显示,pPRSV-LM-GFP/CP 和 pGprsvm2 具有与 pPRSV-LM 类似病症。pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8在番木瓜植株上的病症远弱于pPRSV-LM,其严重程度出现依次减弱,尤其pGprsvm8的病症最弱。结合四种突变体克隆的症状表现与其在PRSV-LM的P1和HC-Pro基因上的8个突变位点分析,验证K598→E和R728→I可能是影响致病性的关键位点。在获得病症明显减弱的三种弱毒株pGprsvm4、pGprsvm6和pGprsvm8后,分别进行强毒株pPRSV-LM攻毒实验来验证三种弱毒株对亲本强毒株的交叉保护效果。采取保护接种后间隔0天、20天、30天、40天的不同时间段进行以强毒株pPRSV-LM的攻毒实验,经过攻毒后0天、14天、21天、30天、50天、60天的症状观察,显示强弱毒株间隔0天,病症表现有类似甚至强于亲本强毒株的严重病症发生,无交叉保护效果。间隔时间超过20天攻毒,病症表现明显比单独接种亲本强毒株弱,具有更好交叉保护效果。pGprsvm4保护接种后的番木瓜苗,攻毒后有稍明显病症发生,pGprsvm6和pGprsvm8作为保护病毒,攻毒后的番木瓜苗无明显病症发生,具有较好的保护效果。以pGprsvm6和pGprsvm8作为保护病毒验证其对强毒株pPRSV-LM-GFP/CP的保护作用,采取保护接种后间隔10天、20天、30天、40天不同时间段进行强毒株pPRSV-LM攻毒并记录攻毒后0天、14天、21天、30天、50天症状观察,显示pGprsvm6的保护作用属于不完全保护作用,攻毒后出现轻微病症;pGprsvm8几乎具有完全保护作用,攻毒后无明显病症发生。并对攻毒后的番木瓜苗在荧光显微镜观察和紫外灯下发光检测、RT-PCR检测及测序分析,显示攻毒后的番木瓜苗仅检测到保护毒株,攻击病毒则无,说明,保护毒株阻碍了攻击病毒的二次侵染,攻毒后无共侵染现象发生。
黄静[6]（2017）在《基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征验证》文中研究表明番木瓜（Carica papaya L.）广泛种植于热带和亚热带地区,番木瓜环斑病毒（Papayaringspot virus,PRSV）是主要的番木瓜病害,并严重制约着番木瓜产业的可持续发展。对于防治番木瓜环斑病最直接有效的措施是种植抗病品种。在番木瓜栽培品种尚未发现具有抗病性的品系,有些野生型品种具有抗性,但是由于存在生殖隔离无法通过杂交育种方法将抗性转移到商业化种植的番木瓜品种中。由于PRSV存在地理株,目前转基因番木瓜采用序列同源依赖抗病性,因此转夏威夷或台系湾PRSV外壳蛋白基因的品种只对夏威夷或台湾的PRSV株系具有抗性。对于海南的PRSV株系进行调查分析发现,海南PRSV分离株与其他地区的株系差异性较大,迫切需要培养抗海南PRSV番木瓜新种质。本研究中,根据RNAi策略利用海南PRSV-CP基因保守序列构建抗海南番木瓜环斑病毒植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS,通过基因枪法将载体导入番木瓜的愈伤组织中,经卡那霉素抗性筛选后再分化成为植株。进而描述阳性转化植株474株系的分子特征同时进行抗病毒试验分析其抗病性。Southern分析和微滴数字PCR（ddPCR）验证474株系为单拷贝插入;抗病毒实验表明,在温室条件下转基因474株系能抵抗海南PRSV病毒株系的侵染,主要结果如下:（1）ddPCR分析显示,转基因番木瓜474株系含有1.0拷贝。Southern印迹分析结果显示,474株系分别用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ进行单酶切后进行杂交,Hind Ⅲ酶切大约在5.2 kb处产生一条杂交信号;BamH Ⅰ酶切大约在2.2 kb处产生一条信号,Southern杂交产生的信号条带大小与预测的基本吻合。ddPCR与Southern印迹分析的结果一致,表明474为单拷贝。（2）hiTAIL-PCR验证结果是在番木瓜第7号染色体supercontig61的717141位点插入,没有插入到任何基因中离插入位点上下游最近的基因距离为1.2 kb,预测此插入不会影响番木瓜正常生长。（3）为了进一步验证插入的真实性,在插入位点上下游设计特异引物扩增产物为192 bp。用设计的一对特异的引物和CP的下游引物进行巢式PCR,结果发现有两条带,一条192 bp为基因组上的条带,另外一条大概1.2 kb这条与预测插入大小相符;同时阴性对照只有基因组上的条带。因此可以判定,检测的样品474为杂合子。（4）通过接种海南PRSV的Hainan Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个类型病毒的混合物,在接种病毒后的0-28天内,对转基因474和非转基因1280植株的病毒积累量进行检测。1280植株在12天后表现出明显病症,在24天后病症加明显加重;整个过程中,转基因植株无症状。本研究中转基因株系主要是RNAi策略致使病毒的PRSV的CP基因沉默从而阻止病毒的复制。TO代在温室里检测结果显示为阳性。然而对于RNAi的遗传稳定性需要对转入PRSV-CP的植株进行多代田间试验验证。
黄静,贾瑞宗,孔华,郭静远,王绪朋,郭安平[7]（2017）在《基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征验证》文中研究说明根据RNAi原理构建的抗海南番木瓜环斑病毒（PRSV）植物表达载体p CAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS,通过基因枪法将载体导入番木瓜的愈伤组织中,经卡那霉素抗性筛选后再分化成为植株。描述转化植株的分子特征同时进行抗病毒试验分析其抗病性。实验结果显示:转基因株系474为单拷贝插入的杂合子,插入位点在第7号染色体supercontig61的717 141位置;抗病毒试验中,在接种病毒后28 d内非转基因株系1280有高浓度的病毒积累并很快表现出明显的病症,而转基因株系474基本无病毒积累且无发病症状。表明转基因株系474具有较好的PRSV抗性,有待于进一步田间试验。
赵辉[8]（2016）在《利用RNAi技术创制高效广谱抗环斑病毒番木瓜新种质》文中进行了进一步梳理番木瓜（Carica papaya）位居世界最有营养价值十大水果首位,是热带地区重要的消费和出口水果。番木瓜环斑病毒病（papaya ringspot virus;PRSV）是番木瓜生产上最大的限制因子,危害严重时可导致大幅度减产甚至绝收。海南是我国最大番木瓜种植区,目前生产上还没有表现较好的抗番木瓜环斑病毒病品种,番木瓜产业受到该病的严重威胁。由于缺少抗病种质,常规育种方法不能培育出抗病毒品种;且此种病害尚无有效药剂治理;因而采用转基因策略培育抗病品种是解决番木瓜病毒病危害经济有效的最主要途径之一。PRSV存在地理株系,不同地域的病毒株系有差异,已有的研究发现,转夏威夷或台湾PRSV外壳蛋白基因的品种只对夏威夷或台湾的病毒株系具有较好的抗性。因而尽管转基因番木瓜“Rainbow”于1998年就在美国通过安全性评价被批准商业化,是全球商业化应用较早的转基因农作物之一,但它只对夏威夷的PRSV株系有抗性,而不能为其他地区所推广应用。迄今为止,被实际生产上应用的番木瓜抗病毒基因都是来自其病毒本身的基因,这类转基因番木瓜的抗病行为是由RNA所诱导的转录后基因沉默（RNA-mediated post-transcriptional gene silencing;PTGS）后所致,亦即RNA干扰。RNAi（反向重复双链RNA分子）被认为是最适宜的RNA沉默启动者,一般来说转病毒单链正义或者反义基因赋予植物的病毒抗性只有20%左右,但是转入能够产生dsRNA的反向重复IR序列的植物对病毒的抗性却高达90%。本研究在对海南PRSV株系进行多样性分析和对关键基因保守序列分析的基础上通过分析不同PRSV株系关键基因的保守序列并采用RNAi发夹结构高效抗病设计策略进行三类载体构建,通过优化后的遗传转化体系进行转化,获得3000多个转化体,从中分子鉴定、筛选出一批高效广谱性抗病株系已进入转基因生物安全评价程序,为尽快培育出抗病优质高产新品种打下了良好的基础。主要研究结果如下:1、通过调查、采样、PCR鉴定、测序、聚类分析等工作,对海南的PRSV病毒株系的种类与分布,在生理水平和分子水平上进行了研究。（1）确认了早期发现的两类海南PRSV类型（Hainan Ⅱ,and Ⅲ）;（2）发现和报道了一个新的PRSV类型（Hainan Ⅰ）;（3）三种类型的PRSV在海南不同种植区间分布不同,Hainan Ⅰ组株系主要分布在三亚,Hainan Ⅱ组株系主要分布在澄迈,HainanⅢ组株系主要分布在文昌和昌江,乐东位于3类株系的交汇处,病毒株系最为复杂,变异多样;（4）对海南PRSV种类与分布的调查和接种鉴定结果,证实了台湾和夏威夷的转基因番木瓜不抗海南的PRSV株系;（5）由于受达尔文和非达尔文选择的极大影响,海南PRSV具有较高的变异率,需要在育种中加以考虑。2、根据前人番木瓜抗病转基因育种经验,选择PRSV病毒重要功能基因 CP、Nib、Hc-Pro为研究对象,针对这些基因挑选海南各地区有代表性的株系进行测序,将测序结果进行生物信息学比对,找到这些基因功能区的保守区域,克隆海南PRSV典型株系关键基因保守区域;利用CP、RPa Hc-Pro基因功能区的保守区域构建高效RNAi干扰载体转化番木瓜,获得批量转基因株系;该设计结合了分别转化CP、RP、Hc-Pro基因使番木瓜获得抗PRSV的成功经验和不足,并且将RNAi的设计理念引入番木瓜抗病基因工程育种中。3、在分子水平上对转基因番木瓜株系进行鉴定;扩繁转基因株系,在实验室和温室条件下对转基因株系的抗病能力与抗病范围进行评估。4、下一步工作重点是进一步开展转基因番木瓜株系及第三代抗性植株的抗性及抗性稳定性评价,完成转基因生物安全评价的相关实验。本论文综合应用病毒学、生物信息学、抗病生理学、分子生物学、转基因遗传育种学等多种技术手段,培养具有高效广谱抗海南PRSV转基因番木瓜新种质,项目的成功将获得具有我国自主知识产权的、在我国海南及华南地区广谱抗番木瓜环斑病毒的转基因当家品种,将大大推进我国番木瓜产业的发展。
刘芳[9]（2016）在《番木瓜环斑病毒与番木瓜畸形花叶病毒之交互作用的研究》文中研究说明番木瓜是重要的热带果蔬之一,影响番木瓜产业的重要限制因子为番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus,PRSV）以及番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV）,尤其,近几年发现了 PRSV和PLDMV存在混合感染的现象,且发病率逐年递增,极有可能成为威胁番木瓜产业新的限制因素,因此急需对其混合感染机制作深入研究,本研究所进行的研究内容及取得研究结果如下:1、PRSV/PLDMV混合感染样品中核苷酸序列和氨基酸序列分析:运用RT-PCR和RACE方法从海南陵水采集到的PRSV/PLDMV混合感染的番木瓜病叶中分离到两种病毒（分别命名PRSV-LM和PLDMV-LM,GenBank登录号分别为:KT633943和KT633944）,通过测序获得两种病毒的基因组全长,大小分别为1,0325 bp和1,0153 bp（不包括3’端的polyA）,序列分析表明:PRSV-LM分离物与单感染样品中的PRSV海南分离物Hainan-DF（GenB ank登录号:EF183499）的核苷酸序列和氨基酸序列相似性最高（均为94%）,PLDMV-LM分离物与单感染样品中的PLDMV海南分离物Hainan-DF（GenBank登录号:JX974555）核苷酸和氨基酸序列相似性最高（分别为99%和97%）。通过系统进化树分析可以看出,PRSV-LM分离物和PLDMV-LM分离物均与海南地区其他PRSV和PLDMV分离物具有亲缘关系。2、PRSV/PLDMV两种病毒单独感染番木瓜的研究:利用酵母同源重组系统,成功构建了适用农杆菌侵染法接种的PRSV-LM和PLDMV-LM的侵染性克隆,经过侵染性测试,结果成功获得了具有侵染能力的PRSV-LM和PLDMV-LM克隆,并且PRSV-LM侵染番木瓜的病症表现要比PLDMV-LM严重。经测序发现,PRSV-LM基因组序列第1825位碱基由A突变为G,但对应氨基酸未发生变化,仍为苏氨酸,PLDMV-LM未发生突变,所以可以进行后续试验。3、PRSV/PLDMV两种病毒之间的相互作用的研究:以同步及非同步接种PRSV-LM和PLDMV-LM到非转基因番木瓜品种蔬罗（solo）上,并运用荧光实时定量PCR监测病毒积累量及增殖动态,结果发现PRSV-LM和PLDMV-LM混合感染的病症介于两种病毒单独感染的之间,且差别不大;而两种病毒积累量变化动态中,发现不同处理下,从接种3周后开始,PRSV-LM积累量总体大于PLDMV-LM,PRSV-LM积累量比较稳定,约在107～108拷贝数之间,而PLDMV-LM病毒积累量在103～108拷贝数之间,波动比较大。同步接种时,PLDMV-LM积累量在103～105拷贝数之间,PRSV-LM积累量高于PLDMV-LM,且增殖情况稳定,非同步接种中先接种PRSV-LM后接种PLDMV-LM时,与同步接种时的情况大致相当,说明侵染能力较强的PRSV-LM在空间及养分等条件的竞争中占优势地位;而先接种PLDMV-LM后接种PRSV-LM时,侵染能力较弱的PLDMV-LM在接种初期比较占优势,对PRSV-LM有类似于交叉保护的作用,到后期PRSV-LM积累量会超过PLDMV-LM,最终,两种病毒会稳定共存于寄主番木瓜中。由此可见,混合感染中的PRSV-LM与PLDMV-LM之间可能有一定的干扰和竞争作用,但两者最后都能稳定共存于田间。以上可作为后续混合感染交互作用研究的基础,用作推测田间可能发病生态及制定正确有效防治措施的参考。
庹德财[10]（2015）在《番木瓜畸形花叶病毒检测鉴定及侵染性克隆构建与应用》文中研究说明番木瓜（Carica papaya L.）是海南重要热带经济果树之一,除了番木瓜环斑病毒（Papaya ringspot virus, PRSV）和番木瓜花叶病毒（Papaya mosaic virus, PaMV）对番木瓜种植造成严重的病害之外,本研究于2012年首次在海南东方市转基因抗PRSV的番木瓜植株上,发现一种新的危害番木瓜栽培的番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leafdistortion mosaic virus, PLDMV）。以上三种病毒在番木瓜上的病症极为相似,在田间难以通过症状表现进行鉴别,给防治工作带来极大的困难。为此,本研究建立了灵敏快速检测这三种病毒的反转录-环介导等温扩增（Reverse transcription loop mediated isothermal amplification, RT-LAMP）和多重RT-PCR的方法。目前,对PLDMV的致病机理的研究较少,而植物病毒侵染性cDNA克隆是研究病毒基因功能的重要工具。本研究通过对PLDMV海南东方市分离物（PLDMV-DF）全长基因组序列进行测定并对其分子特征进行生物信息学分析,并成功构建了可系统侵染番木瓜的PLDMV-DF全长cDNA克隆和表达GFP的PLDMV-DF病毒表达载体,为进一步研究该病毒基因功能、病症发生及病毒致病机理奠定了基础。另外,利用表达GFP的PLDMV-DF侵染性克隆和番木瓜叶片原生质体的RNA干扰体系,快速筛证了靶向PLDMV CP基因的具有较高沉默效率的ihpRNA载体,为后续进行转基因抗PLDMV研究奠定了基础。主要研究结果如下：（1） PLDMV的发现与寄主范围本研究首次在中国大陆报道发现了PLDMV,对其寄主范围鉴定发现PLDMV-DF既能侵染转基因抗PRSV番木瓜也能侵染非转基因番木瓜,但不能侵染西葫芦（Cucurbita pepo）和本生烟（Nicotiana benthamiana）.（2）克隆了PLDMV-DF分离物全长基因组序列PLDMV-DF分离物全长基因组序列由10153nt组成（GenBank登录号：JX974555）。5’端和3’端UTR分别为134nt和209nt,含一个编码3269个氨基酸的多聚蛋白和一个编码75个氨基酸的小ORF。与日本J56P、台湾KS和CZ分离物的全长核苷酸序列相似性为94.3%-94.9%,氨基酸序列相似性为95.9%-96.3%。核苷酸及氨基酸序列的进化树分析显示,PLDMV-DF分离物与日本J56P分离物为一支,表明PLDMV-DF分离物与地理位置相对较远的日本分离物J56P可能具有共同的进化起源。（3）建立了RT-LAMP和多重RT-PCR检测方法成功建立了检测PLDMV、PRSV和PaMV三种病毒的RT-LAMP可视化检测体系和同时检测这三种病毒的多重RT-PCR检测方法。利用多重RT-PCR对海南岛内番木瓜病毒病害发病生态进行调查发现,PRSV、PLDMV和PapMV的发病率分别为：54.5%,27.3%和0.9%,而且首次发现PRSV和PLDMV存在混合感染的现象17.3%。（4）利用In-Fusion融合的方法快速获得PLDMV-DF的全长cDNA侵染性克隆,成功地通过体外转录获得了具有侵染活性的病毒RNA转录本为了克服其在E.coli细胞中的不稳定性,本研究采用插入内含子intron2和intron IV2的策略[内含子intron2插入到P3（第3709/3710nt）区域；intron IV2插入到CI（第5028/5029nt）区域；内含子intron2和intron IV2分别插入到P3（第3709/3710nt）和CI（第5028/5029nt）区域],成功构建了2个侵染性克隆：pT7-FL-In2（内含子intron2插入到P3（第3709/3710nt）区域）和PT7-FL-In2/IV2（内含子intron2和intron IV2分别插入到P3（第3709/371011t）和CI（第5028/5029nt）区域）。pT7-FL-In2和pT7-FL-In2/IV2体外转录产物接种番木瓜都表现出系统性侵染,未添加帽子结构类似物的体外转录产物接种的侵染效率达到58.8%-61.1%,而添加帽子结构类似物的体外转录产物接种的侵染效率高达73.7%-75.0%。（5）利用酵母同源重组系统,建立了一种改良的快速构建植物病毒侵染性克隆的方法,成功地通过农杆菌接种获得了具有侵染活性的PLDMV-DF侵染性克隆本实验对酵母同源重组系统方法进行改进,成功构建了两种适用农杆菌侵染法接种的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2（内含子intron2插入到P3（第3709/3710nt）区域）,共获得4个农杆菌克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34和p35S-FL-In22-1、p35S-FL-In22-3。以上4个克隆与构建的PLDMV-DF的沉默抑制子HC-Pro瞬时表达载体pBI121-HC-Pro混合接种番木瓜植株的侵染效率（85.7%-91.4%）比单独接种的侵染效率（64.7%-69.4%）高,而且能提前2-3天表现出症状。（6）利用改良的酵母同源重组系统,将PLDMV-DF改造为病毒表达载体,在番木瓜中GFP获得系统性表达利用改进后酵母重组方法,成功构建了在PLDMV-DF的P1与HC-Pro之间和NIb与CP之间插入gfp外源基因的病毒表达载体P35S-FL-P1/GFP-8、p35S-FL-P1/GFP-9、p35S-FL-P1/GFP-In2-5、p35S-FL-GFP/CP-23-1、p35S-FL-GFP/CP-38-1和p35S-FL-GFP/CP-38-2。GFP获得系统性表达的克隆为p35S-FL-P1/GFP-9、p35S-FL-GFP/CP-38-1和p35S-FL-GFP/CP-38-2,侵染效率达73.5%-93.9%,在共聚焦荧光显微镜和UV灯下都能检测到GFP发光,,western blot检测到GFP表达。而p35S-FL-P1/GFP-9的位点突变影响其病症,可能突变为弱毒株,可用于交叉保护防治PLDMV。而p35S-FL-GFP/CP-23-1的位点突变影响GFP表达,但不影响其侵染性（66.7%）,但病症延迟30-40天。在接种90天后,gfp报告基因从插入位点会发生丢失现象。（7）利用表达GFP的PLDMV-DF侵染性克隆和番木瓜叶片原生质体的RNA干扰体系,快速筛证了靶向PLDMV CP基因的具有较高沉默效率的ihpRNA载体利用OZ-LIC法,成功构建了4种不同CP基因片段长度的ihpRNA植物表达载体pRNAi-CP879、pRNAi-CP400、pRNAi-CP326和pRNAi-CP140。在接种克隆p35S-FL-GFP/CP-38-1的番木瓜原生质体中,通过共聚焦荧光显微镜和RT-PCR分析,快速验证出pRNAi-CP879、pRNAi-CP400和pRNAi-CP326有较高的沉默效率
二、番木瓜环斑病毒PCR检测技术研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、番木瓜环斑病毒PCR检测技术研究（论文提纲范文）
（1）马铃薯Y病毒和番茄褐色皱果病毒弱毒突变体筛选及交叉保护效果测定（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 马铃薯Y病毒 |
| 1.1.1 危害特点 |
| 1.1.2 基因组结构 |
| 1.1.3 HC-Pro功能 |
| 1.1.4 CP功能 |
| 1.2 番茄褐色皱果病毒 |
| 1.2.1 危害特点 |
| 1.2.2 基因组结构 |
| 1.2.3 检测技术及防治对策 |
| 1.3 利用交叉保护防治植物病毒病 |
| 1.3.1 交叉保护作用机制 |
| 1.3.2 交叉保护应用实例 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试植物 |
| 2.1.2 菌株、侵染性克隆质粒和抗血清 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 酶和各种生化试剂 |
| 2.1.5 主要实验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 侵染性克隆质粒定点突变 |
| 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞转化 |
| 2.2.3 质粒提取 |
| 2.2.4 农杆菌感受态细胞转化 |
| 2.2.5 农杆菌浸润接种烟草 |
| 2.2.6 Western blotting检测蛋白表达水平 |
| 2.2.7 qRT-PCR检测RNA表达水平 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PVY弱毒突变体的筛选及交叉保护效果测定 |
| 3.1.1 PVY突变体的构建 |
| 3.1.2 PVY单位点突变体在珊西烟上的致病力 |
| 3.1.3 PVY单位点弱毒突变体在珊西烟上的交叉保护效果 |
| 3.1.4 PVY多位点突变体在珊西烟上的致病力 |
| 3.1.5 PVY多位点弱毒突变体在珊西烟上的交叉保护效果 |
| 3.2 ToBRFV弱毒突变体的筛选及交叉保护效果测定 |
| 3.2.1 烟草花叶病毒属病毒复制酶p126 保守氨基酸的分析 |
| 3.2.2 ToBRFV复制酶p126 单位点突变体在本氏烟上的致病力 |
| 3.2.3 ToBRFV弱毒突变体Y697A和 D711A在本氏烟上的交叉保护效果 |
| 3.2.4 ToBRFV弱毒突变体Y697A在番茄上的交叉保护效果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PVY CP参与烟草叶脉坏死症状形成 |
| 4.2 马铃薯Y病毒属保守基序的功能存在种间差异 |
| 4.3 氨基酸极性的改变会影响蛋白功能 |
| 4.4 ToBRFV突变体Y697A和 D711A可能通过影响RNA沉默抑制活性影响致病力,进而影响病毒积累和症状形成 |
| 4.5 突变VSR有望获得有良好交叉保护效果的弱毒突变体 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（2）西葫芦PRSV-W抗病基因紧密连锁分子标记的开发与育种应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 西葫芦概述 |
| 1.2 西葫芦病毒病类型及流行原因 |
| 1.3 番木瓜环斑病毒的研究进展 |
| 1.3.1 株系划分、寄主范围和传播方式 |
| 1.3.2 分布与危害 |
| 1.3.3 抗病性鉴定和检测技术 |
| 1.3.4 西葫芦PRSV-W病毒病的防治 |
| 1.4 抗病种质筛查与抗病性状遗传规律 |
| 1.4.1 种质资源的筛选与利用 |
| 1.4.2 抗性遗传规律分析 |
| 1.5 分子标记技术及应用 |
| 1.5.1 分子标记概述 |
| 1.5.2 分子标记主要方法 |
| 1.5.3 PCR技术 |
| 1.5.4 分子标记技术在植物抗病育种中的应用 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 第二章 西葫芦PRSV-W抗病种质鉴定及抗性遗传规律分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验工具 |
| 2.1.3 PRSV-W苗期接种鉴定 |
| 2.1.4 病毒病的DAS-ELISA及 RT-PCR检测 |
| 2.1.5 荧光定量PCR |
| 2.1.6 试验结果统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 西葫芦PRSV-W病毒病苗期人工接种抗性评价 |
| 2.2.2 西葫芦PRSV-W抗病种质鉴定筛查 |
| 2.2.3 西葫芦PRSV-W抗病性状遗传分析 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 2.3.1 西葫芦PRSV-W抗病种质的评价鉴定 |
| 2.3.2 西葫芦PRSV-W病毒病的抗性遗传规律 |
| 第三章 西葫芦PRSV-W抗病基因紧密连锁分子标记的开发 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器与试剂 |
| 3.1.3 PRSV-W苗期接种技术 |
| 3.1.4 西葫芦DNA提取 |
| 3.1.5 西葫芦DNA质量和浓度检测 |
| 3.1.6 PCR扩增 |
| 3.1.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测与银染 |
| 3.1.8 0.8%琼脂糖凝胶电泳: |
| 3.1.9 试验结果统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 DNA样品质量检测 |
| 3.2.2 抗、感亲本间多态性分子标记的筛查 |
| 3.2.3 抗病基因定位 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 第四章 PRSV-W抗病基因紧密连锁分子标记在西葫芦抗病育种中的应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 PCR扩增及电泳检测分析 |
| 4.3 试验结果统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 亲本间分子标记适用性筛查 |
| 4.4.2 西葫芦PRSV-W抗病种质检测 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 西葫芦PRSV田间抗病种质检测 |
| 4.5.2 分子标记辅助育种在抗病育种中的应用 |
| 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（3）中国葫芦科作物病毒的分布、多样性及进化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 侵染葫芦科作物的病毒种类 |
| 1.3 中国葫芦科作物发生现状 |
| 1.3.1 布尼亚病毒目 |
| 1.3.2 小RNA病毒目 |
| 1.3.3 芜菁黄花叶病毒目 |
| 1.3.4 混合病毒科 |
| 1.3.5 雀麦花叶病毒科 |
| 1.3.6 长线型病毒科 |
| 1.3.7 内生病毒科 |
| 1.3.8 双生病毒科 |
| 1.3.9 黄症病毒科 |
| 1.3.10 双分病毒科 |
| 1.3.11 马铃薯Y病毒科 |
| 1.3.12 番茄丛矮病毒科 |
| 1.3.13 植物杆状病毒科 |
| 1.4 主要葫芦科作物病毒的遗传多样性研究 |
| 1.4.1 番茄斑萎病毒属遗传多样性 |
| 1.4.2 黄瓜花叶病毒遗传多样性 |
| 1.4.3 马铃薯卷叶病毒属遗传多样性 |
| 1.4.4 马铃薯Y病毒属遗传多样性 |
| 1.4.5 甜瓜坏死斑点病毒遗传多样性 |
| 1.5 应用高通量测序技术鉴定植物病毒及遗传变异的研究进展 |
| 1.5.1 应用NGS于植物病毒鉴定的测序方法 |
| 1.5.2 植物病毒组数据分析 |
| 1.5.3 NGS测序应用园艺作物病毒检测和鉴定 |
| 1.6 技术路线与研究目的和意义 |
| 第二章 中国葫芦作物病毒种类与地理分布特点 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 病毒样本采集 |
| 2.2.2 研究方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 中国葫芦科作物病毒田间样品采集 |
| 2.3.2 两种不同NGS测序方法的鉴定植物病毒初步比较 |
| 2.3.3 中国葫芦科作物病毒发生种类 |
| 2.3.4 中国主要产区间病毒种类和传毒方式比较 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 小西葫芦虎纹花叶病毒和番木瓜叶畸形花叶病毒侵染性克隆的构建和生物学特性研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究材料 |
| 3.2.2 研究方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 ZTMV和 PLDMV田间症状以及VirusDetect组装contig结果 |
| 3.3.2 ZTMV和 PLDMV全基因组特性及系统进化分析 |
| 3.3.3 ZTMV和 PLDMV侵染性克隆构建与生物学鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 1种侵染西葫芦的马铃薯卷叶病毒属病毒的发现鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 病毒材料来源 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 血清学和RT-PCR检测 |
| 4.3.2 NGS测序结果分析 |
| 4.3.3 ZABYV基因组特性 |
| 4.3.4 ZABYV基因组的系统进化和重组分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 中国主要葫芦科作物病毒的系统进化与SNP变异初步分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 NGS数据中获取病毒全基因组序列 |
| 5.2.2 系统进化分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 CMV系统进化分析 |
| 5.3.2 ZYMV的系统进化分析 |
| 5.3.3 WMV的系统进化分析 |
| 5.3.4 PRSV系统进化分析 |
| 5.3.5 CMV,ZYMV,WMV和 PRSV的 SNP分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文结论及展望 |
| 6.1 全文结论 |
| 6.2 下一步研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 Ⅰ 葫芦科作物病毒名录 |
| 附录 Ⅱ 本研究用于RT-PCR检测于鉴定的引物 |
| 附录 Ⅲ 采样地理信息表 |
| 附录 Ⅳ 病毒样本信息以及检测结果 |
| 附录 Ⅴ 作者简介 |
| 附录 Ⅵ 研究生期间已发表论文 |
| 致谢 |
（4）CTS-N诱导下番木瓜对环斑病毒病抗性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 番木瓜环斑病毒病(PRSV)研究的相关概述 |
| 1.1.1 番木瓜环斑病毒病(PRSV)的主要症状与危害特征 |
| 1.1.2 番木瓜环斑病毒病(PRSV)的防控概述 |
| 1.2 CTS-N防病抗病应用进展 |
| 1.3 转录组学在植物逆境中的应用 |
| 1.4 本课题的设计思想及技术路线 |
| 1.4.1 本课题目的及意义 |
| 1.4.2 本课题研究内容 |
| 1.4.3 本课题技术路线 |
| 1.4.4 本课题创新点 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验地点与材料 |
| 2.1.1 番木瓜品种的选择栽培地点与试验苗肥水管理 |
| 2.1.2 番木瓜环斑病毒来源 |
| 2.2 试验设计与方法 |
| 2.3 取样及样品处理方法 |
| 2.3.1 CTS-N的施用方法 |
| 2.3.2 番木瓜环斑病毒的接种 |
| 2.3.3 番木瓜试验叶片的处理 |
| 2.4 相关指标与方法 |
| 2.4.1 番木瓜环斑病毒的鉴定与保存 |
| 2.4.2 番木瓜发病率的测定 |
| 2.4.3 番木瓜病理叶片电镜观察 |
| 2.4.4 番木瓜抗逆相关酶活性测定 |
| 2.4.5 番木瓜渗透调节物质含量的测定 |
| 2.4.6 番木瓜抗逆相关激素水平及小分子信号物质的测定 |
| 2.4.7 转录组测序及qPCR荧光定量验证 |
| 2.5 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 番木瓜环斑病毒的鉴定与CTS-N对发病率的影响 |
| 3.1.1 番木瓜环斑病毒鉴定与保存 |
| 3.1.2 CTS-N对番木瓜发病率的影响 |
| 3.2 PRSV感染情况分子检测结果 |
| 3.3 番木瓜环斑病毒透射电镜观察结果 |
| 3.4 渗透调节物质 |
| 3.4.1 CTS-N处理后对可溶性糖变化的影响 |
| 3.4.2 CTS-N处理后对可溶性蛋白含量变化的影响 |
| 3.5 抗病相关酶活性影响 |
| 3.5.1 CTS-N处理对番木瓜苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的变化影响 |
| 3.5.2 CTS-N处理后对多酚氧化酶(PPO)性影响 |
| 3.5.3 CTS-N处理后对植物超氧化物歧化酶(SOD)的影响 |
| 3.5.4 CTS-N处理后对过氧化物酶(POD) |
| 3.5.5 CTS-N处理后对植物过氧化氢酶(CAT)影响 |
| 3.5.6 CTS-N处理对番木瓜β-1,3-葡聚糖酶活性的影响 |
| 3.5.7 CTS-N对番木瓜几丁质酶活性的变化影响 |
| 3.6 不同处理对抗逆相关激素水平及小分子物质含量的影响 |
| 3.6.1 乙烯(ETH)的变化 |
| 3.6.2 水杨酸(SA)的变化 |
| 3.6.3 茉莉酸(JA)的变化 |
| 3.6.4 脱落酸(ABA)的变化 |
| 3.7 植物抗逆效果指标结果分析 |
| 3.7.1 超氧阴离子含量的变化 |
| 3.7.2 Topsis综合排名结果分析 |
| 3.8 不同处理番木瓜叶转录组结果分析 |
| 3.8.1 样品RNA质量评估结果 |
| 3.8.2 Illumina高通量测序及比对 |
| 3.8.3 CTS-N诱导番木瓜抗环斑病形成的差异表达基因分析 |
| 3.8.4 差异表达基因的GO分析 |
| 3.8.5 差异表达基因的KEGG分析 |
| 3.8.6 30个差异表达基因分析 |
| 3.8.7 CTS-N诱导植物抗性相关基因分析 |
| 3.9 实时荧光定量PCR验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 番木瓜抗环斑病毒病的生理机理 |
| 4.1.1 CTS-N处理提高抗逆酶活性对抗番木瓜病毒病机理 |
| 4.1.2 CTS-N处理平衡细胞渗透调节物质对抗番木瓜病毒病机理 |
| 4.1.3 CTS-N处理协调相关激素对抗番木瓜病毒病机理 |
| 4.1.4 抗逆效果相关指标讨论分析 |
| 4.2 番木瓜抗环斑病毒病的分子机理 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 在读硕士期间论文发表情况 |
| 附图 |
| 附表 |
| 致谢 |
（5）番木瓜环斑病毒弱毒株交叉保护防治环斑病毒病的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 番木瓜简介 |
| 1.2 番木瓜环斑病毒 |
| 1.2.1 PRSV基本特征 |
| 1.2.2 PRSV病害特征 |
| 1.3 PRSV病害防治 |
| 1.4 弱毒株系的应用 |
| 1.5 交叉保护作用机制 |
| 1.6 弱毒株系获得 |
| 1.7 本研究目的意义 |
| 1.8 技术路线 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒来源及供试植物 |
| 2.1.2 菌株、质粒 |
| 2.1.3 酶与各种生化试剂 |
| 2.1.4 主要实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 马铃薯Y病毒属病毒强弱毒株氨基酸序列多重比对分析 |
| 2.2.2 引物设计合成 |
| 2.2.3 亚克隆pMD-M1-3、pMD-M4-6和pMD-M1-6的构建 |
| 2.2.4 4种PRSV-LM弱毒突变体及含gfp的PRSV-LM侵染性克隆的构建 |
| 2.2.5 农杆菌感受态的制备和电击转化方法 |
| 2.2.6 突变体克隆侵染性检测和接种后的症状观察 |
| 2.2.7 强毒株PRSV-LM的攻毒实验 |
| 2.2.8 强毒株pPRSV-LM-GFP/CP的攻毒实验 |
| 2.2.9 pPRSV-LM-GFP/CP攻毒后荧光检测 |
| 2.2.10 pPRSV-LM-GFP/CP 攻毒后 RT-PCR检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 马铃薯Y病毒属病毒强弱毒株氨基酸序列比对分析 |
| 3.2 亚克隆pMD-M1-3、pMD-M4-6和pMD-M1-6的构建 |
| 3.3 4种PRSV-LM弱毒突变体克隆及含加强毒株克隆的构建 |
| 3.4 弱毒突变体和含gfp强毒株克隆侵染性检测及致病相关位点分析 |
| 3.4.1 4种弱毒突变体克隆及含gfp强毒株克隆接种后病症表现 |
| 3.4.2 4种弱毒突变体及含gfp强毒株克隆接种后分子检测及荧光观察 |
| 3.4.3 影响PRSV-LM致病性的相关位点分析 |
| 3.5 强毒株pPRSV-LM的攻毒实验 |
| 3.5.1 pPRSV-LM与pGprsvm8间隔0天攻毒 |
| 3.5.2 pPRSV-LM间隔20天攻毒 |
| 3.5.3 pPRSV-LM间隔30天攻毒 |
| 3.5.4 pPRSV-LM间隔40天攻毒 |
| 3.5.5 攻毒60天后的交叉保护效果 |
| 3.6 强毒株pPRSV-LM-GFP/CP的攻毒实验 |
| 3.6.1 pPRSV-LM-GFP/CP间隔10天攻毒 |
| 3.6.2 pPRSV-LM-GFP/CP间隔20天攻毒 |
| 3.6.3 pPRSV-LM-GFP/CP间隔30天攻毒 |
| 3.6.4 pPRSV-LM-GFP/CP间隔40天攻毒 |
| 3.7 pPRSV-LM-GFP/CP攻毒后荧光观察 |
| 3.8 pPRSV-LM-GFP/CP攻毒后紫外灯观察 |
| 3.9 pPRSV-LM-GFP/CP攻毒后RT-PCR检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PRSV-LM毒力弱化相关位点分析 |
| 4.2 用于交叉保护的弱毒株 |
| 4.3 影响交叉保护作用的因素 |
| 4.4 三种弱毒株的交叉保护效果比较 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1.1 培育抗番木瓜环斑病毒(PRSV)番木瓜的研究进展 |
| 1.1.1 番木瓜概述 |
| 1.1.2 番木瓜主要病害 |
| 1.1.3 番木瓜环斑病毒(PRSV) |
| 1.1.4 转基因抗病毒策略 |
| 1.1.5 番木瓜抗病毒研究进展 |
| 1.2 基于RNAI策略的转基因抗病毒研究 |
| 1.2.1 RNAi作用机制 |
| 1.2.2 RNAi特点 |
| 1.2.3 RNAi介导抗病毒方法 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 1.4 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 质粒、菌株与病毒株系 |
| 2.1.3 试剂与仪器 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 PCR引物使用 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 制备转化番木瓜的受体材料 |
| 2.2.2 基因枪法转化番木瓜 |
| 2.2.3 转基因阳性植株的筛选 |
| 2.2.4 微滴数字PCR(ddPCR)进一步验证转化特异事件 |
| 2.2.5 高效热不对称性交错PCR(hiTAIL-PCR)验证转化事件 |
| 2.2.6 hiTAIL-PCR插入位点的分析 |
| 2.2.7 Southern blotting分析转基因番木瓜的拷贝数 |
| 2.2.8 转基因番木瓜接种PRSV |
| 2.2.9 RT-PCR检测病毒积累量 |
| 2.2.10 荧光定量PCR检测病毒积累量 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 转化体系阳性植株的筛选 |
| 3.2 转入CP基因片段植株的分子特征描述 |
| 3.2.1 微滴数字PCR(ddPCR)定量的结果分析 |
| 3.2.2 hiTAIL-PCR验证转化事件插入位点 |
| 3.2.3 Southern blotting分析转基因番木瓜的拷贝数 |
| 3.3 转基因番木瓜的PRSV的抗性评价 |
| 3.3.1 转基因番木瓜接种PRSV |
| 3.3.2 荧光定量PCR |
| 4 讨论 |
| 4.1 番木瓜的转化效率 |
| 4.2 转基因植株的分子验证 |
| 4.3 转基因株系的抗性分析 |
| 4.4 下一步工作 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 相关药品的配置 |
| 附录二 项目来源及论文发表情况 |
| 致谢 |
（7）基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征验证（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 转化及转基因植株筛选 |
| 1.2.2 PRSV分离与接种 |
| 1.2.3 PCR筛选阳性转化苗 |
| 1.2.4 微滴数字PCR(dd PCR)分析插入的拷贝数 |
| 1.2.5 hi TAIL-PCR验证插入位点 |
| 1.2.6 PRSV的抗性检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCR筛选分析 |
| 2.2 dd PCR定量结果分析 |
| 2.3 hi TAIL-PCR验证转化插入的位点 |
| 2.4 转基因番木瓜对PRSV的抗性评价 |
| 2.5 荧光定量PCR检测病毒积累 |
| 3 讨论 |
（8）利用RNAi技术创制高效广谱抗环斑病毒番木瓜新种质（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 番木瓜环斑病毒研究进展 |
| 1.2 抗番木瓜环斑病毒分子育种研究进展 |
| 1.2.1 PRSV外壳蛋白基因的转化 |
| 1.2.2 PRSV复制酶基因的转化 |
| 1.2.3 PRSV辅助成分-蛋白酶基因的转化 |
| 1.2.4 PRSV核酶基因的转化 |
| 1.2.5 RNA介导的抗PRSV基因工程的研究进展 |
| 1.2.6 PRSV交叉保护措施的运用 |
| 1.3 抗病毒转基因番木瓜商业化应用的成就与挑战 |
| 1.4 基于RNAi技术分子育种研究进展 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 海南PRSV多样性调查与分析 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 病毒样品分子检测,序列及相关性分析方法 |
| 2.2 番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建方法 |
| 2.2.1 实验材料和载体 |
| 2.2.2 RNAi表达载体载体构建方法 |
| 2.3 RNAi表达载体转化番木瓜 |
| 2.3.1 番木瓜转化受体材料及再生方法 |
| 2.3.2 番木瓜基因枪转化方法 |
| 2.3.3 番木瓜转基因株系的检测方法 |
| 2.4 转基因番木瓜抗病性检测方法 |
| 2.4.1 番木瓜转基因株系病毒接种观察法 |
| 2.4.2 ELISA分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 海南PRSV多样性分析 |
| 3.1.1 海南地区番木瓜PRSV感染情况检测 |
| 3.1.2 海南PRSV株系基因变异情况分析 |
| 3.1.3 海南PRSV株系的级联多基因树系统发育分析 |
| 3.1.4 海南PRSV株系的地理分布特点 |
| 3.2 番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建 |
| 3.2.1 海南PRSV基因保守区域分析情况 |
| 3.2.2 具有粘性末端保守区域干扰片断的获得 |
| 3.2.3 干扰片断RNAi发夹结构的获得 |
| 3.2.4 番木瓜抗病毒RNAi植物表达载体的获得 |
| 3.3 RNAi转基因番木瓜株系的获得 |
| 3.3.1 番木瓜RNAi转化抗性苗的获得 |
| 3.3.2 RNAi转基因番木瓜株系的PCR检测 |
| 3.4 转基因番木瓜抗病性检测 |
| 3.4.1 转基因番木瓜株系温室接种抗病表现 |
| 3.4.2 ELISA反应对转基因株系群定性和定量分析 |
| 3.4.3 大田种植转基因株系自然发病情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 海南PRSV株系的生物多样性分析的成因及其对制定番木瓜转基因育种策略的影响 |
| 4.2 RNAi技术是番木瓜高效广谱的转基因抗病育种可行的策略 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 攻读学位期间发表学术论文、申请专利和学术交流情况 |
| 致谢 |
（9）番木瓜环斑病毒与番木瓜畸形花叶病毒之交互作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 番木瓜简介 |
| 1.2 番木瓜环斑病毒 |
| 1.2.1 病毒特征 |
| 1.2.2 寄主范围 |
| 1.2.3 分布 |
| 1.2.4 危害及传播途径 |
| 1.2.5 防治 |
| 1.3 番木瓜畸形花叶病毒 |
| 1.4 马铃薯Y病毒属病毒混合感染的相关研究 |
| 1.5 植物病毒cDNA侵染性克隆的相关研究 |
| 1.6 本研究目的与意义 |
| 1.7 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株及载体 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 主要试剂配方 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 混合感染PRSV/PLDMV病毒分离及基因组全长分段扩增 |
| 2.2.2 混合感染PRSV/PLDMV病毒分离株侵染性cDNA克隆的构建 |
| 2.3 PRSV与PLDMV的交互作用 |
| 2.3.1 植物病毒接种方法 |
| 2.3.2 侵染性克隆侵染性测试 |
| 2.3.3 寄主范围测试 |
| 2.3.4 同步及非同步接种 |
| 2.3.5 PRSV和PLDMV病症表现分级 |
| 2.3.6 利用荧光实时定量PCR检测病毒积累量变化趋势 |
| 3 结果 |
| 3.1 PRSV-LM/PLDMV-LM基因组全长序列分析 |
| 3.1.1 植物叶片总RNA提取检测 |
| 3.1.2 PRSV-LM/PLDMV-LM分离物全长基因组序列的测定及分析 |
| 3.2 构建PRSV-LM和PLDMV-LM全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.3 混合感染PRSV-LM/PLDMV-LM病毒的番木瓜病叶症状表现 |
| 3.3.1 PRSV-LM和PLDMV-LM侵染性及侵染番木瓜的症状表现 |
| 3.3.2 PRSV-LM/PLDMV-LM的寄主范围 |
| 3.3.3 同步及非同步接种PRSV-LM和PLDMV-LM在番木瓜上的症状表现 |
| 3.3.4 病程发展曲线下面积(AUPDC) |
| 3.3.5 Real-Time荧光定量PCR检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PRSV和PLDMV侵染性克隆构建技术难度 |
| 4.2 PRSV和PLDMV交互作用实验关键影响因子 |
| 4.3 PRSV和PLDMV在不同处理下的积累量及其增殖动态 |
| 4.4 PRSV/PLDMV混合侵染的防治策略 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）番木瓜畸形花叶病毒检测鉴定及侵染性克隆构建与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 番木瓜环斑病毒的研究 |
| 1.1.1 PRSV的发现与地区分布 |
| 1.1.2 PRSV的病症与传播途径 |
| 1.1.3 PRSV的寄主范围与生物型 |
| 1.1.4 PRSV的生物学特征及基因结构与功能 |
| 1.2 番木瓜畸形花叶病毒的研究 |
| 1.2.1. PLDMV的发现与地区分布 |
| 1.2.2. PLDMV的病症与传播途径 |
| 1.2.3. PLDMV的寄主范围与生物型 |
| 1.2.4. PLDMV的生物学特征及基因结构 |
| 1.3 番木瓜花叶病毒的研究 |
| 1.3.1. PaMV的发现与地区分布 |
| 1.3.2. PaMV的病症与传播途径 |
| 1.3.3. PaMV的寄主范围及生物学特征 |
| 1.4 植物病毒的检测方法 |
| 1.4.1. 生物学检测法 |
| 1.4.2. 形态学检测法 |
| 1.4.3. 免疫学检测法 |
| 1.4.4. 分子生物学检测法 |
| 1.5 全长cDNA侵染性克隆研究进展 |
| 1.5.1. 体外转录cDNA侵染性克隆 |
| 1.5.2. 体内转录cDNA侵染性克隆 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料和病毒株 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 菌株及载体 |
| 2.1.4 培养基及主要试剂配方 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 植物总RNA的提取及纯度检测 |
| 2.2.2 机械摩擦接种PLDMV及体外转录产物 |
| 2.2.3 酵母感受态细胞的制备、转化及质粒提取 |
| 2.2.4 农杆菌化学转化感受态细胞的制备及转化 |
| 2.2.5 PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、回收、T/A克隆及测序与数据分析 |
| 2.2.6 cDNA第一链的合成及3'RACE |
| 2.2.7 5'RACE |
| 2.2.8 In-Fusion反应 |
| 2.2.9 番木瓜叶片总DNA和总蛋白的提取 |
| 2.2.10 Western blot分析检测GFP表达 |
| 2.2.11 番木瓜叶肉原生质体的分离及转化 |
| 2.2.12 PLDMV的鉴定及病症表现 |
| 2.2.13 PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP可视化检测技术的建立 |
| 2.2.14 PLDMV、PRSV和PaMV的多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.2.15 构建体外转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆pT7-FL |
| 2.2.16 构建含内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 2.2.17 体外转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 |
| 2.2.18 酵母重组系统构建体内转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 2.2.19 体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆侵染性分析 |
| 2.2.20 酵母重组系统构建PLDMV-DF表达GFP的病毒表达载体 |
| 2.2.21 PLDMV-DF病毒表达载体的表达分析 |
| 2.2.22 植物ihpRNA表达载体在番木瓜原生质体中沉默效果的验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1. PLDMV的发现与病症 |
| 3.1.1 番木瓜叶片总RNA的质量检测 |
| 3.1.2 PLDMV的鉴定发现 |
| 3.1.3 PLDMV-DF在番木瓜、西葫芦及本生烟草上的病症表现 |
| 3.2. PLDMV-DF分离物全长基因组序列的测定 |
| 3.2.1. 构建pMD-A、pMD-B、pMD-C、pMD-D、pMD-E和pMD-F |
| 3.2.2. 5'/3'RACE及质粒pMD-5R和pMD-3R的构建 |
| 3.3. PLDMV-DF分离物全长基因组的结构分析 |
| 3.3.1. PLDMV-DF分离物全长基因组的序列和ORF结构分析 |
| 3.3.2. PLDMV-DF分离物ORF编码的多聚蛋白酶切位点分析 |
| 3.3.3. PLDMV-DF分离物的全长核苷酸和氨基酸的相似性分析 |
| 3.3.4. PLDMV-DF与Taiwan-CZ、Taiwan-KS、Japan-J56P进化树分析 |
| 3.4. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP可视化检测技术的建立 |
| 3.4.1. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP引物设计 |
| 3.4.2. PRSV RT-LAMP检测方法的最佳反应体系和反应条件 |
| 3.4.3. PLDMV RT-LAMP检测方法的最佳反应体系和反应条件 |
| 3.4.4. PaMV RT-LAMP检测方法的最佳反应体系和反应条件 |
| 3.4.5. PLDMV RT-LAMP的特异性与灵敏度分析 |
| 3.4.6. PRSV RT-LAMP的特异性与灵敏度分析 |
| 3.4.7. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP的特异性检测 |
| 3.5. PLDMV、PRSV和PaMV的多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 3.5.1. 引物的特异性及多重RT-PCR最适引物对的筛选 |
| 3.5.2. 单一RT-PCR和多重RT-PCR反应体系及条件的优化 |
| 3.5.3. 单一PCR和多重PCR的灵敏度检测 |
| 3.5.4. 单一RT-PCR和多重RT-PCR对田间样品的检测应用 |
| 3.6. 构建无内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.6.1. 构建pMD-AB、pMD-CD、pMD-EF、pGEM-ABC和pGEM-DEF |
| 3.6.2. 构建无内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.7. 构建含内含子的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.7.1. 马铃薯ST-LS1和菜豆NiR基因的内含子序列测定 |
| 3.7.2. 构建含intron 2的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.7.3. 构建含intron IV2的体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.7.4. 构建含intron2/IV2体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.8. 体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 |
| 3.8.1. PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的体外转录 |
| 3.8.2. 体外转录侵染性克隆的体外转录物接种与症状表现 |
| 3.8.3. 体外转录侵染性克隆体外转录物接种后的RT-PCR检测 |
| 3.8.4. 侵染性克隆pT7-FL-In2和pT7-FL-In2/IV2侵染后的内含子检测 |
| 3.9. 酵母重组系统构建体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.9.1. 构建体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.9.2. 构建含intron 2的体内转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆 |
| 3.10. 体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的侵染性分析 |
| 3.10.1. PLDMV-DF的沉默抑制子HC-Pro瞬时表达载体的构建 |
| 3.10.2. 体内转录侵染性克隆农杆菌注射接种与症状表现 |
| 3.10.3. 体内转录侵染性克隆农杆菌注射接种后RT-PCR检测及侵染效率 |
| 3.11. 酵母重组系统构建PLDMV-DF的病毒表达载体 |
| 3.11.1. 构建PLDMV-DF的P1/HC-Pro之间插入GFP的病毒表达载体 |
| 3.11.2. 构建PLDMV-DF的NIb/CP之间插入GFP的病毒表达载体 |
| 3.12. PLDMV-DF病毒表达载体的表达分析 |
| 3.12.1. PLDMV-DF病毒表达载体的农杆菌注射接种与症状表现 |
| 3.12.2. PLDMV-DF病毒表达载体接种后的RT-PCR检测及侵染效率 |
| 3.12.3. PLDMV-DF病毒表达载体的农杆菌注射接种后GFP荧光检测 |
| 3.12.4. PLDMV-DF病毒表达载体的western blot分析 |
| 3.13. 4种不同长度CP基因植物ihpRNA表达载体的构建 |
| 3.14. 植物ihpRNA表达载体沉默效率的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1. 番木瓜畸形花叶病毒海南东方分离物的鉴定 |
| 4.2. PLDMV-DF全长基因组序列的测定与解析 |
| 4.3. PLDMV、PRSV和PaMV RT-LAMP可视化检测技术的建立 |
| 4.4. PLDMV、PRSV和PaMV的多重RT-PCR检测方法的建立 |
| 4.5. 体外转录PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的构建与侵染性分析 |
| 4.5.1. 无内含子的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的构建与分析 |
| 4.5.2. 含内含子的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆的构建与分析 |
| 4.6. 体内转录的PLDMV-DF全长cDNA侵染性克隆与侵染性分析 |
| 4.7. 插入外源gfp报告基因的PLDMV-DF病毒表达载体的构建与表达 |
| 4.7.1. 在P1/HC-Pro之间插入gfp的病毒表达载体的构建与表达分析 |
| 4.7.2. 在NIb/CP之间插入GFP的病毒表达载体的构建与表达分析 |
| 4.8. 用GFP的病毒表达载体在原生质体中验证ihpRNA载体的沉默效率 |
| 研究结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、番木瓜环斑病毒PCR检测技术研究（论文参考文献）
- [1]马铃薯Y病毒和番茄褐色皱果病毒弱毒突变体筛选及交叉保护效果测定[D]. 赵梅胜. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]西葫芦PRSV-W抗病基因紧密连锁分子标记的开发与育种应用[D]. 王凯玥. 河北工程大学, 2020(02)
- [3]中国葫芦科作物病毒的分布、多样性及进化研究[D]. 彭斌. 华中农业大学, 2019
- [4]CTS-N诱导下番木瓜对环斑病毒病抗性研究[D]. 安娜. 海南大学, 2018(08)
- [5]番木瓜环斑病毒弱毒株交叉保护防治环斑病毒病的研究[D]. 付兰兰. 海南大学, 2017(06)
- [6]基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征验证[D]. 黄静. 海南大学, 2017(02)
- [7]基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征验证[J]. 黄静,贾瑞宗,孔华,郭静远,王绪朋,郭安平. 热带作物学报, 2017(03)
- [8]利用RNAi技术创制高效广谱抗环斑病毒番木瓜新种质[D]. 赵辉. 海南大学, 2016(07)
- [9]番木瓜环斑病毒与番木瓜畸形花叶病毒之交互作用的研究[D]. 刘芳. 海南大学, 2016(05)
- [10]番木瓜畸形花叶病毒检测鉴定及侵染性克隆构建与应用[D]. 庹德财. 海南大学, 2015(07)