一、骨肉瘤中PTEN基因蛋白的表达及临床意义（论文文献综述）
武太勇[1]（2021）在《LATS1基因去甲基化在人骨肉瘤增殖、凋亡和侵袭中的作用》文中认为目的:探究LATS1基因在骨肉瘤中发挥的作用,利用去甲基化药物使LATS1基因的表达增高,从而研究其对人骨肉瘤细胞功能的影响。方法:（1）免疫组织化学染色检测人骨肉瘤组织和正常骨组织中的大肿瘤抑制基因-1（Large Tumor Suppressor gene 1,LATS1）基因的表达差异情况。采用q RT-PCR检测人骨肉瘤组织、正常骨组织和成骨细胞（Hfob1.19）、人骨肉瘤细胞系（Saos2、U2）中m RNA水平的表达差异。使用蛋白免疫印迹法（Western-Blot）检测成骨细胞（Hfob1.19）、人骨肉瘤细胞系（Saos2、U2）蛋白水平的表达差异。（2）应用甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR,MSP）检测人骨肉瘤细胞系（Saos2和U2）中LATS1的甲基化状态,利用5-氮杂-2脱氧胞苷（5-Aza-2′Deoxycytidine,DAC）去甲基处理Saos2细胞和U2细胞。分别设置对照组、溶剂组和实验组。应用q RT-PCR检测各组细胞中LATS1的m RNA表达,利用Western-Blot检测各组细胞中LATS1的蛋白表达。检测药物处理后各组细胞中LATS1对骨肉瘤细胞增殖（RTCA）、凋亡（流式细胞术）和侵袭（Transwell）等生物学特性的影响。结果:（1）免疫组化结果显示:LATS1呈胞质表达,骨组织中的表达量高于骨肉瘤组织（P<0.0001）。q RT-PCR结果显示:LATS1在骨肉瘤中呈低表达（P<0.0001）;LATS1在骨肉瘤细胞系Saos2、U2中呈低表达（P<0.001）。Western-Blot结果显示:LATS1在骨肉瘤细胞系Saos2、U2中呈低表达（P<0.001）。（2）LATS1基因在骨肉瘤细胞系Saos2和U2中存在甲基化。q RT-PCR结果显示,LATS1在Aza-Saos2组中表达量高（P<0.0001）,在Aza-U2组中表达量高（P<0.05）。Western-Blot结果显示,LATS1在Aza-Saos2中呈高表达（P<0.001）,在实验组Aza-U2中呈高表达（P<0.01）。RTCA结果显示与骨肉瘤Saos2和U2细胞相比,实验组Aza-Saos2的增殖明显降低（P<0.01）,实验组Aza-U2的增殖明显降低（P<0.01）;流式细胞术结果显示,与骨肉瘤Saos2和U2细胞相比,实验组Aza-Saos2的凋亡明显增高（P<0.01）,实验组Aza-U2的凋亡明显增高（P<0.0001）;Transwell结果显示,与骨肉瘤Saos2和U2细胞相比,实验组Aza-Saos2的侵袭能力明显减弱（p<0.0001）,实验组Aza-U2的侵袭明显减弱（p<0.01）。细胞划痕实验结果显示:与骨肉瘤Saos2和U2细胞相比,实验组Aza-Saos2的迁移明显减弱Saos2（P<0.001）,实验组Aza-U2的迁移率明显减弱U2（P<0.001）。结论:（1）LATS1基因在骨肉瘤的发生发展中起到了重要作用。（2）LATS1基因在骨肉瘤细胞中甲基化程度较高。（3）给予去甲基化药物处理后能够显着上调LATS1基因m RNA和蛋白水平。（4）LATS1基因能够抑制Saos2和U2细胞的增殖能力,诱导其发生凋亡,阻止其发生侵袭。
武太勇,李健,付海军,程才统,吕智,冯毅[2]（2021）在《骨肉瘤相关基因甲基化研究进展》文中认为骨肉瘤的发生与多种癌基因、抑癌基因有关。DNA甲基化是表观遗传的重要特征,能够引起癌基因的激活与抑癌基因的失活。DNA甲基化是研究骨肉瘤的转移、复发乃至耐药的重要因素之一。研究骨肉瘤相关基因的甲基化,为研究骨肉瘤的发生、转移以及耐药提供理论支持,同时为临床诊断、预后预测和靶向治疗及新型药物的研究提供理论依据。
黄少兵[3]（2020）在《3D组织工程建立快速原位骨肉瘤动物模型的实验研究》文中进行了进一步梳理背景:骨肉瘤是最常见的骨源性（原发）恶性肿瘤,多发于青少年,恶性度高,并且很容易发生肺转移或化疗耐药,治疗效果差,其五年生存率50-70%。虽然近年来骨肉瘤的研究取得一定进展,但其具体的发病及耐药机制还有待进一步研究深入。动物模型的建立是研究的重要途径,有助于研究骨肉瘤转移机制,阐明原发或转移瘤对化疗药或靶向药产生耐药的原因,对研究疾病的发病机制、控制骨肉瘤肺转移、降低治疗过程中的耐药、寻找靶向性治疗位点和提高骨肉瘤总体临床疗效具有非常重要的意义,是目前研究骨肉瘤转移和耐药机制的主要工具。细胞悬液注射法是目前骨肉瘤动物模型的制备应用的主要方法,文献报道该方法在注射部位达到一定细胞浓度和数量时可形成肿瘤,但存在细胞存活率低、细胞损失多、成瘤率不一致等不足。最新的研究表面,3D细胞培养技术为骨肉瘤的体外研究提供了一种新技术,且其具有高精度、低成本、适用性强等优点。目的:采用组织工程技术研制具有3D结构的肿瘤细胞片、细胞环,用于研发更高效、标准化的骨肉瘤动物模型,为骨肉瘤疾病研究与治疗提供新的参考方向。方法:1.对人骨肉瘤143B-LUC细胞进行培养,制备143B-LUC细胞片与细胞悬浮液,使用制备好的细胞片与细胞细胞悬浮液分别构建骨肉瘤裸鼠动物模型,并使用活体成像技术观察裸鼠活体内肿瘤成瘤情况,接种28天后处死裸鼠进行病理学检查与组织切片的HE染色检测;2.对人骨肉瘤143B-LUC细胞,成纤维细胞进行培养,制备143B-LUC细胞环与细胞悬浮液,使用制备好的细胞环与细胞细胞悬浮液分别构建骨肉瘤裸鼠动物模型,并使用活体成像技术观察裸鼠活体内肿瘤成瘤情况,接种28天后处死裸鼠进行病理学检查与组织切片的HE染色检测。数据采用SPSS 20统计学软件进行分析,数据变量采用均数±标准差（?x±s）表示,方差齐性检验采用Levene检验,多组间比较采用LSD检验。结果:（1）3D骨肉瘤细胞片与传统2D细胞培养的生物学差异性观察显示,细胞片培养板内143B-LUC细胞剧集叠加生长,为立体三维结构,与传统平面培养的细胞形态具有明显差异。143B-LUC骨肉瘤细胞片与143B-LUC骨肉瘤细胞悬浮液进行动物模型构建对比,细胞片模型组在移植后7天肉眼就可在股骨远端看见突出皮肤的软组织包块,活体成像结果也进一步证实瘤体形成,成瘤率可达到100%。而相同数量的细胞悬液注射法成瘤率仅为66.6%,成瘤时间需要21天甚至更久。细胞片形成的肿瘤大小比较均匀一致,肿瘤增长迅速。标本样本Micro CT显示:细胞片移植股骨产生了明显的骨质破坏和软组织肿块,具有典型的骨肉瘤病变特点。肺部HE染色有超过80%的小鼠肺部出现转移瘤,显示了骨肉瘤容易发生肺转移的特点。（2）143B-LUC骨肉瘤细胞环与143B-LUC骨肉瘤细胞悬浮液进行动物模型构建对比,细胞环模型组在移植后7天肉眼就可在股骨远端看见突出皮肤的软组织包块,活体成像结果也进一步证实瘤体形成,成瘤率仍可达到100%。而相同数量的细胞悬液注射法成瘤率仅为66.6%,成瘤时间需要21天甚至更久。细胞环形成的肿瘤大小比较均匀一致,肿瘤增长迅速。标本样本的Micro CT显示:细胞环移植股骨产生了明显的骨质破坏和软组织肿块,具有典型的骨肉瘤病变特点。肺部HE染色有超过80%的小鼠肺部出现转移瘤,显示了骨肉瘤容易发生肺转移的特点。结论:细胞片与细胞环两种方法均可以建立快速原位骨肉瘤动物模型,与细胞悬液注射比较,具有有成瘤周期短,成功率高等优点。而细胞环比细胞片更稳定,适合推广应用。
韩希然[4]（2020）在《LASS2/TMSG1基因通过神经酰胺途径参与人肺癌A549细胞增殖、凋亡及其机制的研究》文中研究说明目的本课题旨在深入了解LASS2/TMSG1基因对体外培养人肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响,并观察LASS2/TMSG1基因在裸鼠皮下移植瘤生长过程中的作用,并初步探讨LASS2/TMSG1基因诱导人肺癌A549细胞凋亡的相关分子机制。方法1.流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测LASS2/TMSG1基因过表达前后人肺癌A549细胞的凋亡情况。2.平板克隆形成实验检测LASS2/TMSG1基因过表达前后人肺癌A549细胞的体外增殖能力。3.构建人肺癌裸鼠皮下移植瘤模型,观察LASS2/TMSG1基因过表达前后裸鼠皮下移植瘤的生长情况。4.苏木精-伊红染色,观察裸鼠皮下肿瘤组织的镜下形态、克隆形成情况、凋亡坏死情况及肿瘤转移情况。5.免疫组织化学染色观察LASS2/TMSG1基因过表达前后裸鼠皮下肿瘤组织中Ki67的表达情况。6.ELISA方法检测LASS2/TMSG1基因过表达前后人肺癌A549细胞上清液及裸鼠肿瘤组织匀浆中神经酰胺及P38 MAPK蛋白的表达情况。7.运用SPSS22.0软件分析数据,P<0.05（作为分析标准）认为差异显着,有统计学意义。结果（1）本课题组先前的实验结果显示,在人肺癌A549细胞中,经Western Blot检测发现过表达组肺癌细胞内LASS2/TMSG1蛋白表达水平明显升高,表明已成功构建LASS2/TMSG1基因过表达组。（2）流式细胞术结果显示,LASS2/TMSG1基因过表达组细胞的凋亡率（%）显着高于阴性对照组,分别为:31.51±1.41、11.72±1.07,（t=1.10,P<0.05）。（3）平板克隆形成实验结果显示,LASS2/TMSG1基因过表达组细胞克隆形成百分比（%）显着低于阴性对照组,分别为:12.17±4.51、31.83±10.13,（t=3.07,P<0.05）。（4）裸鼠移植瘤形成实验结果表明,与阴性对照组相比,LASS2/TMSG1基因过表达组裸鼠肿瘤体积（mm3）增长较慢,但无统计学意义（P>0.05）。测量两组裸鼠肿瘤组织的最终质量与体积,LASS2/TMSG1基因过表达组肿瘤组织的平均质量（g）略低于阴性对照组,分别为0.23±0.10,0.28±0.13,（t=0.75,P>0.05）;LASS2/TMSG1基因过表达组肿瘤组织的平均体积（mm3）低于阴性对照组,分别为90.60±45.26,143.90±89.40,（t=1.41,P>0.05）,差异不显着。（5）通过苏木精-伊红染色观察发现,两组肿瘤细胞均呈现低分化腺癌形态;LASS2/TMSG1基因过表达组肿瘤细胞平均克隆形成数目（1.29±0.49）明显低于阴性对照组（2.29±0.95）,（t=2.48,P<0.05）;与阴性对照组相比,LASS2/TMSG1基因过表达组肿瘤组织的坏死灶较大较彻底;两组裸鼠均未发现肝、脾、肾及淋巴结转移。（6）通过免疫组织化学染色发现,LASS2/TMSG1基因过表达组的裸鼠肿瘤组织中Ki67阳性率（%）（27.15±9.36）明显低于阴性对照组（44.80±6.05）,（t=4.48,P<0.05）。（7）ELISA检测结果显示,在人肺癌A549细胞上清液中LASS2/TMSG1基因过表达组的神经酰胺含量（μmol/L）显着高于阴性对照组,分别为155.00±3.83、128.50±13.71,（t=3.22,P<0.05）;裸鼠肿瘤组织匀浆中LASS2/TMSG1基因过表达组的神经酰胺含量（μmol/L）显着高于阴性对照组,分别为265.00±19.34、226.20±7.99,（t=3.21,P<0.05）;人肺癌A549细胞上清液中LASS2/TMSG1基因过表达组的P38 MAPK蛋白含量（ng/m L）显着高于阴性对照组,分别为86.47±1.04、78.38±1.38,（t=8.14,P<0.05）;裸鼠肿瘤组织匀浆中LASS2/TMSG1基因过表达组的P38 MAPK蛋白含量（ng/m L）显着高于阴性对照组,分别为89.93±3.92、62.32±3.54,（t=9.06,P<0.05）,差异显着。结论LASS2/TMSG1基因作为一种肿瘤转移抑制基因,不仅可以调节肿瘤细胞的增殖,对肿瘤细胞的凋亡过程也有一定影响。LASS2/TMSG1基因可能会通过诱导神经酰胺的合成,进一步激活其下游的效应分子P38 MAPK蛋白等,启动级联信号传导通路,从而发挥促进人肺癌细胞凋亡,抑制人肺癌细胞增殖的作用。
白曼莫,王炳南,杨济,禹志军,毕方方[5]（2020）在《磷酸酯酶与张力蛋白同源物基因甲基化在骨肉瘤发病机制、病情及预后评估中的价值》文中指出目的探讨磷酸酯酶与张力蛋白同源物（PTEN）基因甲基化在骨肉瘤发病机制、病情及预后评估中的价值。方法研究对象为2016年1月至2019年12月三亚市中医院诊治的120例骨肉瘤患者（骨肉瘤组）,检测骨肉瘤患者（骨肉瘤组）和良性骨疾病患者（对照组）PTEN基因甲基化并分析与临床病理因素的关系。合成设计不同寡核苷酸（MON、UON、CON1、CON2和CON组）转染MG-63骨肉瘤细胞,对比转染前、转让后细胞PTEN基因甲基化、吸光度值、细胞增殖和凋亡的差异。两组间比较采用t或χ2检验,多组间均值比较采用SNK法分别比较组间差异。结果骨肉瘤组PTEN基因甲基化率显着高于对照组（70.8%比3.3%,χ2=12.376,P<0.05）,差异有统计学意义。Saos-2、HOS和OS-732骨肉瘤细胞中PTEN呈甲基化状态,在MG-63骨肉瘤细胞为未甲基化状态。骨肉瘤组患者在Enneking分期、分化程度、肿瘤最大径和远处转移方面的PTEN基因甲基化率差异有统计学意义（χ2=4.288、3.916、5.807、7.241,P<0.05）,差异均有统计学意义。MON组可成功诱导MG-63骨肉瘤细胞PTEN基因甲基化,S期、G2/M期、增殖指数和凋亡率均显着高于UON、CON1、CON2和CON组（F=51.245、43.188、71.372和90.129,P<0.05）,G0/G1期显着低于UON、CON1、CON2和CON组（F=61.704,P<0.05）,差异均有统计学意义。结论 PTEN基因在在骨肉瘤中呈高甲基化状态,与骨肉瘤发病机制明显相关,有助于骨肉瘤病情及预后评估。
刘超[6]（2019）在《FTO（Fat Mass and Obesity Associated）基因在尤文肉瘤发生发展中的生物学功能研究》文中指出研究目的及背景:尤文肉瘤是一种高度侵袭性的恶性肿瘤,在青少年中发病率较高,由于其转移早,易复发,预后较差,严重危害青少年健康。多项研究表明,FTO（Fat Mass and Obesity Associated）基因与m6A甲基化修饰密切相关,在乳腺癌、胃癌、急性髓性白血病（AML）等多种肿瘤中均有过表达,并且参与了多种肿瘤的发生、发展、侵袭和转移,是未来靶向治疗研究的重要热点。而FTO在尤文肉瘤中的表达及其与尤文肉瘤恶性生物学行为的关系尚未见文献报道。磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）作为一种典型的肿瘤抑制因子在尤文肉瘤中的作用亦鲜有报道。本研究通过探究FTO基因在尤文肉瘤中的表达情况,对尤文肉瘤细胞生物学功能的影响和潜在作用机制,及PI3K/AKT信号通路中抑癌基因PTEN是否参与调控FTO对尤文肉瘤生物学行为的影响,为尤文肉瘤的治疗寻找合适的靶点提供实验依据。研究方法:通过Realtime-qPCR检测尤文肉瘤肿瘤组织及瘤旁组织、尤文肉瘤细胞系和成骨细胞中FTO及PTEN的表达差异情况。构建稳转FTO过表达与敲减尤文肉瘤细胞系,并经Realtime-qPCR与Western印迹法验证细胞系构建的稳定性。采用CCK-8实验、划痕实验、Transwell实验分别检测过表达或者敲低FTO后,尤文肉瘤细胞系增殖、迁移及侵袭能力的变化。经Realtime-qPCR与Western印迹法检测FTO过表达与敲减尤文肉瘤细胞系中PTEN的表达情况。采用m6A特异性抗体的免疫共沉淀实验检测FTO过表达与敲减尤文肉瘤细胞系中PTEN的mRNA甲基化修饰水平,并通过转录抑制实验检测PTEN的mRNA的稳定性变化。PTEN回复后采用CCK-8实验检测其对FTO过表达尤文肉瘤细胞系增殖能力的影响结果:尤文肉瘤肿瘤组织及尤文肉瘤细胞系中FTO的表达量显着高于瘤旁对照组织及成骨细胞中的表达,而PTEN则相反,二者呈负相关。FTO过表达的尤文肉瘤细胞在72小时增殖能力、相对迁移距离以及侵袭细胞数均较尤文肉瘤细胞系即对照组显着提高,而FTO过表达尤文肉瘤细胞中PTEN的mRNA及蛋白表达水平,mRNA甲基化修饰水平、mRNA稳定性均有所下降。FTO敲减的尤文肉瘤细胞在72小时增殖能力、相对迁移距离以及侵袭细胞数均较尤文肉瘤细胞系即对照组显着降低,PTEN的mRNA及蛋白表达水平、mRNA甲基化修饰水平、mRNA稳定性均有所提高。PTEN回复后FTO对尤文肉瘤细胞的增殖促进作用被逆转,差异均有统计学意义。结论:FTO在尤文肉瘤中表达上调与尤文肉瘤的发生、发展有关。上调FTO表达可以促进尤文肉瘤细胞的增殖,迁移和侵袭,而下调FTO表达则取得相反的结果。该基因可能通过影响PTEN的mRNA甲基化修饰对尤文肉瘤的增殖起到促进作用。
朱振国[7]（2019）在《姜黄素联合5-Aza-CdR对骨肉瘤抑癌基因P16，PTEN的去甲基化作用研究》文中提出目的:研究姜黄素联合5-Aza-CdR是否能增强对骨肉瘤抑癌基因P16,PTEN的去甲基化作用。方法:（1）单独或联合使用不同质量浓度的姜黄素与5-Aza-CdR作用于骨肉瘤细胞;（2）观察细胞的生长情况和形态变化（采用倒置相差显微镜）;（3）CCK-8法检测细胞生长抑制率;（4）甲基化特异性聚合酶链反应（methyl-ation specific PCR,MSP）法检测干预前后骨肉瘤Saos-2细胞PTEN基因和P16基因的甲基化状态;（5）RT-PCR检测相关基因P16,PTEN的表达情况;（6）western blot检测P16,PTEN蛋白水平的表达情况。结果:（1）姜黄素和5-Aza-CdR均呈现出以时间和浓度梯度依赖性的关系抑制骨肉瘤细胞的生长。（2）MSP法检测结果提示姜黄素与5-Aza-CdR单独及联合使用均有一定的去甲基化作用,二者联合使用时去甲基化作用比单独作用时效果明显增强。（3）与空白对照组相比,RT-PCR和western blot结果提示姜黄素与5-Aza-CdR联合使用时,P16,PTEN的基因、蛋白表达水平均增高（P<0.05）。结论:（1）姜黄素、5-Aza-CdR均能抑制人骨肉瘤Saos-2细胞的增殖及诱导其发生凋亡;（2）姜黄素、5-Aza-CdR均可增强人骨肉瘤Saos-2细胞抑癌基因P16,PTEN的去甲基化水平;（3）姜黄素联合5-Aza-CdR作用于人骨肉瘤Saos-2细胞可增强人骨肉瘤抑癌基因P16,PTEN的去甲基化水平,较单独作用时的效果明显。
胡勇[8]（2014）在《抑癌基因PTEN对骨肉瘤细胞粘附、侵袭和迁移的影响》文中研究说明目的：抑癌基因PTEN（phosphatase and tensin homolog, PTEN）,是第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因,该基因位于人类染色体10q23.31,全长200kb。研究发现该基因在人类多种恶性肿瘤组织和细胞株中存在缺失或突变,其编码的蛋白质具有脂质磷酸酶和蛋白质磷酸酶双重特异性磷酸酶活性,是迄今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN编码多种特殊的蛋白质,调节细胞的生长、增殖和迁移等细胞生物学过程,包括抑制某些肿瘤细胞周期进程,促进细胞凋亡等。研究发现人类多种肿瘤如神经胶质瘤、乳腺癌、前列腺癌、白血病、胃肠道肿瘤等的发生、发展和预后,可能与PTEN基因的表达异常有相关性。PTEN基因的表达下调和功能缺失可能在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用。在骨肉瘤中也发现PTEN基因编码的缺失,但PTEN基因的表达异常在骨肉瘤的发生、发展中是否发挥直接作用以及这种作用的分子机制尚不明确；本课题首先检测抑癌基因FTEN在骨肉瘤和骨软骨瘤中的表达并比较其表达率的差异。然后将体外扩增的野生型PTEN基因,克隆至质粒载体p-EGFP-N1,再将此重组的真核表达载体p-EGFP-N1-PTEN （GFP-PTEN）转染至人骨肉瘤U2-OS细胞系中,检测PTEN基因在U2-OS细胞系中的表达情况及其对U2-OS细胞的粘附,侵袭及迁移的影响,以及U2-OS细胞系中MMP-2、MMP-9、FAK的表达和FAK的磷酸化水平,进而为进一步探讨抑癌基因PTEN与骨肉瘤细胞的恶性表型的关系以及相关分子表达的影响,并为骨肉瘤的诊治寻找新的作用靶点提供实验基础。方法：1、采用免疫组化S-P法检测PTEN蛋白在25例骨肉瘤组织及36例骨软骨瘤组织中的表达；2、取自人外周血的淋巴细胞分离、纯化后,在无RNA酶及无菌环境中,用试剂提取纯化后的淋巴细胞总RNA；3、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）体外扩增,并以凝胶电泳分离提取PTEN基因的cDNA片段,将PTEN基因的cDNA片段与空白质粒p-EGFP-N1同时进行EcoRI、BamHI双酶切,将2种酶切产物纯化后经DNA连接酶连接后,将连接产物导入感受态大肠杆菌DH-5α,挑取阳性克隆进行扩增,经PCR法、双酶切法和测序法对重组载体进行鉴定,测序结果用软件与基因库之数据库进行同源性分析；4、取纯化的重组质粒GFP-PTEN （p-EGFP-N1-PTEN）,利用脂质体（LipofectamineTM-2000）转染人骨肉瘤U2-OS细胞系。使用荧光显微镜观察GFP绿色荧光蛋白的表达以检测转染效率；5、实验对照设3组：U2-OS细胞组、含空白质粒的GFP/U2-OS组和转染PTEN基因的GFP-PTEN/U2-OS组,分别培养后作细胞划痕实验、细胞粘附实验和细胞侵袭实验,比较3组细胞培养体系中不同时相3种实验指标的差异；6、收集转染48h后的U2-OS细胞,利用RT-PCR和Western blot分别测定PTEN基因的mRNA和蛋白质的表达情况；7、分别提取3组细胞的mRNA和蛋白质,RT-PCR和Western blot检测3组细胞的FAK、MMP-2、MMP-9的表达,并比较组间表达的差异。结果：1、骨肉瘤组PTEN蛋白阳性表达率44%,显着低于骨软骨瘤组的83.3%阳性表达率,差异有统计学意义（P<0.05）。2、成功获取人外周血淋巴细胞的总RNA；3、经RT-PCR扩增后获得一大小为1210bp的完整的PTEN基因cDNA片段,并成功构建真核表达载体GFP-PTEN,经双酶切和PCR扩增后分别获得了一个大小一致的插入片段,经测序和同源性分析鉴定证实重组质粒载体构建成功；4、真核表达载体GFP-PTEN成功转染U2-OS细胞,24小时后可见绿色荧光蛋白的表达；5、转染48小时后,观察不同时相细胞粘附实验结果：10min、30min、60min, GFP-PTEN/U2-OS细胞组的粘附率与U2-OS细胞组和GFP/U2-OS细胞组比较明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。而U2-OS细胞组和GFP/U2-OS细胞组之间粘附率比较差异无统计学意义（P>0.05）；细胞划痕实验结果显示,划痕后各时间点内,各组细胞均向划痕区域迁移,12h后,U2-OS和GFP/U2-OS组细胞组划痕达到愈合,而GFP-PTEN/U2-OS细胞组的划痕未愈合。细胞侵袭实验结果显示：转染24小时后,U2-OS细胞组、GFP/U2-OS细胞组和GFP-PTEN/U2-OS细胞组穿透transwell小室微孔的细胞数量分别为141.33±17.09,152.67±24.66和84.33±7.09,转染GFP-PTEN后U2-OS细胞的侵袭能力明显减弱,GFP/U2-OS组与GFP-PTEN /U2-OS组比较,差异有统计学意义（P<0.01）；6、转染48小时后收集、裂解细胞,分别提取3组细胞总mRNA和蛋白质,RT-PCR和Western blot检测该PTEN基因质粒表达载体在U2-OS细胞中成功表达出PTEN基因的mRNA和蛋白质,凝胶电泳可见与PTEN大小相一致的条带,Western blot结果在83kD处可见阳性条带；7、在高表达PTEN基因的细胞株中FAK、MMP-2和MMP-9的mRNA和蛋白质表达水平显着降低,尤其是MMP-9的表达水平降低更明显,GFP/U2-OS组与GFP-PTEN/U2-OS组比较,差异有统计学意义（P<0.01）。结论：1、PTEN基因在骨肉瘤组织中呈低表达；2、成功地从人外周血淋巴细胞基因组中获取PTEN基因片段；3、获得的PTEN基因cDNA片段,成功构建真核表达载体GFP-PTEN,经双酶切、PCR扩增、测序和同源性分析鉴定证实重组质粒载体构建成功；4、真核表达载体GFP-PTEN成功转染U2-OS细胞,并获得稳定表达；5、转染GFP-PTEN真核表达载体后的人骨肉瘤U2-OS细胞粘附能力降低；划痕未愈合能力和侵袭能力明显减弱,提示PTEN基因可抑制人骨肉瘤U2-OS细胞的粘附、侵袭和迁移能力；6、转染重组PTEN基因的真核表达载体致U2-OS细胞中,能稳定表达出PTEN mRNA和PTEN蛋白；7、PTEN基因可以显着降低人骨爵瘤U2-OS细胞的FAK, MMP-2和MMP-9的表达水平以及FAK的磷酸化水平。初步揭示PTEN基因可能与骨肉瘤细胞的粘附、侵袭和迁移等细胞生物学行为具有相关性。
罗一[9]（2013）在《PTEN甲基化在骨肉瘤发生中的作用及5-Aza-CdR去甲基化对其MG-63细胞生物学行为的影响》文中提出骨肉瘤（Osteosarcoma）是起源于间胚叶组织的最常见的原发性恶性骨肿瘤,其生物学性状极为复杂,有关其发病机理仍未完全清楚,诊断和治疗的方法依然有限。现代医学认为,肿瘤的发生是一个多阶段、多因素和多基因综合作用的过程,其生物学本质是细胞内遗传调控和表观遗传调控的紊乱与失调。近年来以不基于基因序列改变为特征的表观遗传调控在肿瘤发生中的作用备受关注,其主要表现形式是DNA甲基化,它可以直接导致相关基因的表观遗传转录沉默。基因DNA甲基化有助于肿瘤发生的早期预测及预后评估。癌基因的低甲基化、抑癌基因的高甲基化和整体基因组的低甲基化是DNA甲基化失衡状态的三种经典现象,其中尤以抑癌基因的高甲基化与肿瘤的关系最为密切,它是抑癌基因转录失活的主要途径,甚至可能成为调控基因转录的唯一的机制。PTEN是迄今为止发现的第一个具有双特异性磷酸酶活性的抑癌基因,是抑癌基因家族中继P53发现后在人类肿瘤中突变及缺失率最高的又一明星分子。PTEN具有抑制肿瘤生长、促进细胞凋亡及抑制血管生成等作用,能负性调控PI3K/AKt及抑制MAPK的信号转导通路对肿瘤产生影响。已有研究表明在很多人类恶性肿瘤中都存在PTEN的异常甲基化,但关于其与骨肉瘤的关系却鲜见报道。了解骨肉瘤中PTEN的甲基化状态,对寻找骨肉瘤早期诊断可能的分子标志物具有重要的临床意义。由于DNA甲基化不涉及DNA序列改变,因此,它是一个可逆的表观遗传学修饰过程。任何一个基因的甲基化状态是一个甲基化和去甲基化的动态平衡过程,处于甲基化异常的抑癌基因对阻断其DNA甲基化的药物非常敏感,临床上可利用这种敏感性进行基因治疗。5-Aza-CdR是已被美国FDA批准应用于骨髓增殖异常综合征及急性粒细胞白血病临床治疗的去甲基化药物,它能在体内外激发DNA的去甲基化过程,导致被甲基化沉默的抑癌基因持续激活。目前已有5-Aza-CdR作用于乳腺癌、非小细胞肺癌及前列腺癌等肿瘤的相关研究,但其与骨肉瘤的关系的研究却还是空白。因此,探讨5-Aza-CdR对肿瘤的去甲基化作用机制对防治骨肉瘤亦具有重要的临床意义。本研究分成三个部分。第一部分,通过MSP技术检测骨肉瘤标本中PTEN的甲基化状态并将其与患者的临床病理参数结合进行分析,以期探讨PTEN甲基化在骨肉瘤发生中的作用及其相关预后影响因素,为探寻骨肉瘤早期诊断可能的分子靶标提供依据；第二部分,通过MSP技术对三株人骨肉瘤细胞MG-63、SAOS-2和U2-OS进行筛选,选取其中PTEN完全甲基化的一株细胞进行后续细胞学功能实验,以5-Aza-CdR对其进行去甲基化干预,探讨5-Aza-CdR作用的最佳浓度与时间、细胞的生物学行为及甲基化状态,为阐明5-Aza-CdR的体外去甲基化作用机制提供实验依据；第三部分,建立人骨肉瘤MG-63细胞荷瘤裸鼠模型,以5-Aza-CdR经尾静脉注射去甲基化干预4周,观测移植瘤体积生长的动态变化及检测移植瘤的病理形态学、PTEN蛋白表达及其甲基化情况,明确5-Aza-CdR的体内去甲基化作用机制。第一部分骨肉瘤中PTEN的甲基化情况及其与相关临床病理参数的关系目的明确骨肉瘤中抑癌基因PTEN的甲基化情况,寻找早期诊断可能的分子标志物。分析PTEN甲基化和骨肉瘤临床病理参数的关系,探讨PTEN甲基化对其相关预后影响因素的影响。方法采集于2001年4月～2011年4月间在湖南省肿瘤医院、中南大学湘雅二医院及湘雅医院进行治疗并确诊的46例骨肉瘤患者的病理标本,其中新鲜组织21例（同时采集癌旁组织21例）、石蜡标本25例,采用HE染色、免疫组化（S-P）法检测肿瘤组织的病理形态学及PTEN表达水平,然后采用甲基化特异性PCR （MSP）技术检测骨肉瘤组织中PTEN启动子区甲基化的状态；整合所纳入骨肉瘤患者的临床资料,采用x2检验或Fisher’s确切概率法分析PTEN启动子区甲基化与临床病理参数之间的关系。结果HE染色及免疫组化结果显示,骨肉瘤组织中病理形态学呈明显肉瘤特征,而PTEN表达较癌旁组织明显减少,两组比较有统计学差异（P<0.05）。 MSP结果显示,骨肉瘤组织中存在PTEN高甲基化状态,癌旁组织中呈低甲基化或未甲基化状态,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。 PTEN高甲基化与骨肉瘤的Enneking肿瘤外科分期（P=0.023）。 Price组织学分级（P=0.001）及肿瘤发生的部位（P=0.030）表现出显着的正相关（P<0.05）,而与年龄、性别、病程及化疗前AKP水平等一般临床资料无明显相关（P>0.05）。PTEN高甲基化患者术后5年生存率明显低于PTEN低甲基化患者,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论1、PTEN在骨肉瘤中表达下调,其DNA启动子区存在高甲基化状态,PTEN高甲基化是骨肉瘤早期发生的分子特征之一。2、PTEN高甲基化状态与骨肉瘤的病理分期及分级呈显着正相关,是其独立的预后影响因素之一。第二部分5-Aza-CdR去甲基化对人骨肉瘤MG-63细胞生物学行为及PTEN甲基化的影响目的筛选PTEN完全甲基化的骨肉瘤细胞株,明确5-Aza-CdR对骨肉瘤细胞的体外去甲基化作用及对PTEN甲基化的影响,证实PTEN负性调控骨肉瘤中PI3K/AKt信号转导通路的作用机制。方法选取三株经典的人成骨肉瘤细胞株MG-63、SAOS-2和U2-OS,用MSP法检测其中PTEN甲基化的情况,筛选出PTEN完全甲基化的一株细胞进行后续实验,以5-Aza-CdR对其进行去甲基化干预,同时筛选出PTEN甲基化状态被完全去除时5-Aza-CdR作用的最佳浓度及时间点,并检测该细胞的生物学行为及其PTEN甲基化的情况,采用Western-Blotting法检测经去甲基化干预后该细胞株中PI3K和AKt信号分子的蛋白表达水平。结果在三株人骨肉瘤MG-63、SAOS-2和U2-OS中,MG-63细胞中PTEN完全甲基化,其被5-Aza-CdR完全去甲基化的最佳浓度和时间点分别为10μmol/L和24h。PTEN被完全去甲基化后的MG-63细胞在细胞凋亡、细胞周期、细胞侵袭迁移能力等细胞生物学行为方面与处理前比较差异有统计学意义（P<0.05）。 Western-Blotting结果显示,经5-Aza-CdR干预的MG-63细胞中PI3K和AKt分子蛋白的表达水平较对照组明显降低,两者表现出统计学差异（P<0.05）。结论1、PTEN在人骨肉瘤MG-63细胞中完全甲基化；2、MG-63细胞中PTEN甲基化被5-Aza-CdR完全去除时具有时间和浓度的依赖性；3、5-Aza-CdR能对MG-63细胞的生物学行为产生影响,能增加肿瘤细胞的凋亡率、抑制细胞生长周期及降低细胞的侵袭转移能力；4、5-Aza-CdR能降低MG-63细胞中PI3K和AKt蛋白的表达水平,证实了PTEN负性调控MG-63细胞中PI3K/AKt信号转导通路的作用机制。第三部分5-Aza-CdR去甲基化对裸鼠模型移植瘤PTEN表达及其甲基化的影响目的构建人骨肉瘤MG-63细胞荷瘤裸鼠模型；探讨5-Aza-CdR对荷瘤裸鼠模型移植瘤的影响及其在动物体内的去甲基化作用机制。方法采用细胞悬液异种移植皮下接种法,将人骨肉瘤MG-63细胞单悬液以1×107/200μl的活细胞浓度接种于4～6周龄裸鼠左腋肩部皮下,共接种18只动物,构建荷瘤裸鼠模型。成功建模后,将实验动物分成实验组和对照组,每组9只动物；实验组以10μmol/L浓度、1μ/g剂量的5-Aza-CdR进行尾静脉注射行去甲基化干预,而对照组则注射等量的PBS溶液,4周后处死动物,解剖移植瘤,观测并动态比较两组移植瘤体积大小和病理形态学的变化。采用IHC免疫组化法检测两组移植瘤瘤体组织中PTEN的表达情况,采取MSP技术检测两组瘤体组织中PTEN的甲基化状态,以Western-Blotting法检测并比较两组瘤体组织中PTEN蛋白表达的情况。结果细胞接种4周后裸鼠移植瘤的大小为5mm3,表明成功地建立了人骨肉瘤MG-63细胞荷瘤裸鼠模型。两组裸鼠模型移植瘤体积大小动态比较,在5-Aza-CdR干预至第4周时两组瘤体体积大小比较差异有统计学意义（P<0.05）,实验组优于对照组。IHC结果显示,实验组移植瘤中PTEN表达明显上调,较对照组有统计学差异（P<0.05）。MSP结果显示,实验组移植瘤中PTEN呈低甲基化状态,与对照组比较有统计学差异（P<0.05）。Western-Blotting结果显示,实验组移植瘤中PTEN蛋白表达量明显增加,较对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论1、采用1×107/200μ1浓度的细胞悬液行皮下接种法能成功建立人骨肉瘤MG-63细胞荷瘤裸鼠动物模型；2、5-Aza-CdR能抑制人骨肉瘤MG-63细胞裸鼠模型移植瘤的生长,上调移植瘤中PTEN的表达,抑制其中PTEN的高甲基化状态,在体内发挥了其去甲基化作用。
徐生林[10]（2012）在《PTEN基因真核表达载体的构建及在MG63中表达》文中提出目的体外扩增野生型PTEN基因，克隆至真核表达载体pEGFPN1，转染至骨肉瘤MG63细胞系，并表达出PTEN蛋白。利用此真核表达载体，为进一步探讨PTEN基因在骨肉瘤发生及转移中的价值提供实验基础。方法①pEGFPN1/PTEN真核表达载体的构建及鉴定：收集、纯化人淋巴细胞，在无菌、无RNA酶的条件下利用Trizol试剂提取出淋巴细胞总RNA。利用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增出PTEN基因片段，电泳分析结束后回收纯化PCR产物，将PCR产物与空白质粒pEGFPN1同时进行双酶切，两种酶切产物经高保真T4DNA连接酶作用后，转化入感受态大肠杆菌TOP10，LB琼脂平板中培养过夜。经PCR初筛，阳性克隆通过PCR、双酶切和测序的方式对重组载体进行鉴定，测序结果使用BLAST软件与GeneBank数据库进行同源性分析。②MG63细胞的转染和重组人PTEN蛋白的表达及检测：取纯化除菌的重组质粒pEGFPN1/PTEN，在转染试剂Lipofecta mineTM2000的作用下转染至MG63细胞。通过倒置荧光显微镜观察GFP绿色荧光蛋白的表达情况了解转染效率。转染48h后收集细胞，RT-PCR和Westernblot鉴定PTEN mRNA和蛋白在MG63细胞中的表达情况。结果①反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增成功获得一具有1209bp完整开放读码框的PTEN的cDNA片段。成功地将其克隆入真核表达载体pEGFPN1；将构建载体pEGFPN1/PTEN做EcoRI、BamH I双酶切和PCR，分别获得了一个大小与其相应PCR扩增产物一致的插入片段；经测序及Blast分析鉴定重组质粒构建成功。②脂质体法转染MG63细胞24小时后可见绿色荧光蛋白的表达，48小时后收集转染细胞，RT-PCR和Western blot鉴定重组PTEN真核表达载体在MG63细胞中能表达出PTENmRNA和蛋白，电泳图上可见于PTEN大小相一致的条带，Western结果在54kD处可见阳性条带。结论成功地从人淋巴细胞基因组DNA中获取了PTEN基因，成功构建了pEGFPN1/PTEN真核表达质粒，RT-PCR及Western-blot表明，pEGFPN1/PTEN真核表达载体在MG63细胞中获得了高效表达。本研究为PTEN在骨肉瘤中表达突变缺失的进一步研究创造了条件。
二、骨肉瘤中PTEN基因蛋白的表达及临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、骨肉瘤中PTEN基因蛋白的表达及临床意义（论文提纲范文）
（1）LATS1基因去甲基化在人骨肉瘤增殖、凋亡和侵袭中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 Lats1基因在骨肉瘤和正常骨中的表达差异 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 组织和细胞来源 |
| 1.2 主要仪器及耗材 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 骨组织和骨肉瘤组织的HE染色及免疫组化 |
| 1.5 实时荧光定量PCR检测Lats1基因mRNA表达 |
| 1.6 Western Blot检测Lats1基因的蛋白表达 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 LATS1在人骨肉瘤组织中呈低表达 |
| 2.2 LATS1在骨肉瘤中mRNA呈低表达 |
| 2.3 LATS1在骨肉瘤细胞中蛋白呈低表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 LATS1基因去甲基化对骨肉瘤细胞的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验仪器及耗材 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 骨肉瘤细胞对照组及实验组细胞培养 |
| 1.4 CCK8 |
| 1.5 骨肉瘤Saos2、U 2-OS进行实时无标记动态细胞分析技术(Real Time Cellular Analysis) |
| 1.6 MSP检测骨肉瘤细胞Saos2、U2-OS中LATS1基因的甲基化情况 |
| 1.7 实时荧光定量PCR检测Lats1基因mRNA表达 |
| 1.8 Western Blot检测Lats1基因的蛋白表达 |
| 1.9 Transwell实验检测LATS1对骨肉瘤细胞的侵袭能力 |
| 1.10 划痕实验检测LATS1对骨肉瘤细胞迁移能力的影响 |
| 1.11 利用流式细胞术检测LATS1对骨肉瘤细胞的凋亡情况 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 CCK8选择药物最适浓度 |
| 2.2 LATS1基因在骨肉瘤中甲基化表达情况 |
| 2.3 去甲基化使LATS1在人骨肉瘤细胞中mRNA表达升高 |
| 2.4 去甲基化使LATS1在人骨肉瘤细胞中蛋白升高 |
| 2.5 LATS1高表达抑制骨肉瘤的增殖 |
| 2.6 LATS1高表达促进骨肉瘤细胞的凋亡 |
| 2.7 LATS1高表达抑制骨肉瘤细胞的侵袭能力 |
| 2.8 LATS1高表达抑制骨肉瘤细胞的迁移能力 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨肉瘤相关基因甲基化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）骨肉瘤相关基因甲基化研究进展（论文提纲范文）
| 1 PTEN基因甲基化与骨肉瘤 |
| 2 Wnt信号转导通路相关基因甲基化与骨肉瘤 |
| 2.1 APCDD1基因甲基化与骨肉瘤 |
| 2.2 Wnt5a基因甲基化与骨肉瘤 |
| 2.3 SFRP2基因甲基化与骨肉瘤 |
| 2.4 mi R-370甲基化与骨肉瘤 |
| 2.5 WIF-1基因甲基化与骨肉瘤 |
| 3 ARHI基因甲基化与骨肉瘤 |
| 4 BMP-2基因甲基化与骨肉瘤 |
| 5 STAT3基因甲基化与骨肉瘤 |
| 6 结语 |
（3）3D组织工程建立快速原位骨肉瘤动物模型的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 第2章 骨肉瘤细胞片原位成瘤实验 |
| 2.1 实验材料与实验方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 细胞片成功制作 |
| 2.2.2 细胞片移植转移模型裸鼠模型的成功构建 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 骨肉瘤细胞环原位成瘤实验 |
| 3.1 实验材料与实验方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 细胞环成功制作 |
| 3.2.2 细胞片移植转移模型裸鼠模型的成功构建 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 骨肉瘤研究进展综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
| 致谢 |
（4）LASS2/TMSG1基因通过神经酰胺途径参与人肺癌A549细胞增殖、凋亡及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 抑癌基因的研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（6）FTO（Fat Mass and Obesity Associated）基因在尤文肉瘤发生发展中的生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、FTO 与尤文肉瘤 |
| 二、PTEN抑癌基因在骨与软组织肉瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 材料与方法 |
| 一、主要试剂和材料 |
| 二、主要实验所需溶液的配制 |
| 三、实验方法 |
| 四、统计学分析 |
| 实验结果 |
| 一、FTO在尤文肉瘤组织和细胞中的表达 |
| 二、构建FTO稳定过表达尤文肉瘤细胞株 |
| 三、FTO稳定过表达尤文肉瘤细胞株迁移、侵袭能力改变 |
| 四、构建FTO稳定敲减尤文肉瘤细胞株 |
| 五、FTO稳定敲减尤文肉瘤细胞株迁移、侵袭能力改变 |
| 六、PTEN在尤文肉瘤组织和细胞中的表达 |
| 七、FTO稳定过表达尤文肉瘤细胞株中验证PTEN的表达情况 |
| 八、FTO稳定敲减尤文肉瘤细胞株中验证PTEN的表达情况 |
| 九、尤文肉瘤细胞株中FTO过表达对PTEN基因m6A甲基化修饰水平的影响 |
| 十、尤文肉瘤细胞株中FTO基因下调对PTEN基因m6A甲基化修饰水平的影响 |
| 十一、PTEN回复显着取消FTO对尤文肉瘤细胞增殖水平的促进作用 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（7）姜黄素联合5-Aza-CdR对骨肉瘤抑癌基因P16，PTEN的去甲基化作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株来源 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 器材的准备 |
| 2.2.2 人骨肉瘤Saos-2 细胞的复苏、培养和传代 |
| 2.2.3 用倒置相差显微镜观察细胞形态 |
| 2.2.4 CCK-8 法测定Saos-2 细胞增殖 |
| 2.2.5 细胞的DNA提取 |
| 2.2.6 亚硫酸氢盐修饰基因组DNA |
| 2.2.7 Western-blot检测相关蛋白表达水平 |
| 2.2.8 RT-PCR检测相关基因表达水平 |
| 2.3 统计学处理 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 细胞形态观察 |
| 3.2 细胞增值测定 |
| 3.3 药物作用于人骨肉瘤Saos-2 细胞前后的p16和PTEN基因甲基化的变化 |
| 3.4 RT-PCR检测各组PTEN、P16 mRNA表达水平的结果 |
| 3.4.1 总RNA完整性检测 |
| 3.4.2 RT-PCR结果及灰度分析结果显示 |
| 3.5 Western blot检测各组PTEN、P16蛋白的表达水平 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与不足之处 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 不足之处 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| References |
（8）抑癌基因PTEN对骨肉瘤细胞粘附、侵袭和迁移的影响（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1. 骨肉瘤相关的研究现状 |
| 2. PTEN基因 |
| 3. PTEN基因在骨肉瘤细胞中的表达 |
| 第一部分、PTEN基因在骨肉瘤组织中的表达 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 病历资料 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2. 实验步骤 |
| 2.1 HE染色 |
| 2.2 免疫组织化学 |
| 2.3 结果判定 |
| 3. 数据处理 |
| 4. 结果 |
| 第二部分、PTEN基因表达载体的构建 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 淋巴细胞的分离和提取 |
| 1.2 质粒、大肠杆菌菌株和人骨肉瘤U2-OS细胞系 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 溶液的配制 |
| 1.5 实验仪器 |
| 2. 实验步骤 |
| 2.1 人体正常组织中PTEN基因的表达 |
| 2.2 外周血淋巴细胞的分离提取 |
| 2.3 提取淋巴细胞的总RNA |
| 2.4 细胞总RNA的纯度测定 |
| 2.5 目的基因扩增 |
| 2.6 PTEN基因片段的酶切 |
| 2.7 目的基因与质粒的链接 |
| 2.8 大肠杆菌DH-5α菌株感受态细胞的制备及转化 |
| 2.9 阳性克隆的提取和筛选 |
| 2.10 阳性克隆的扩增 |
| 2.11 阳性克隆的鉴定 |
| 2.12 骨肉瘤U2-OS细胞株的培养 |
| 2.13 质粒载体的转染 |
| 2.14 检测转染后U2-OS细胞PTEN mRNA的表达 |
| 2.15 检测转染后U2-OS细胞PTEN蛋白的表达 |
| 3. 数据处理 |
| 4. 结果 |
| 4.1 淋巴细胞的总RNA纯度和含量 |
| 4.2 阳性克隆的筛选及鉴定结果 |
| 4.3 PTEN基因的序列分析 |
| 4.4 p-EGFP-N1-PTEN载体转染U2-OS细胞后荧光蛋白的表达 |
| 4.5 PTEN mRNA的表达检测结果 |
| 4.6 PTEN蛋白质的表达检测结果 |
| 第三部分 PTEN基因对骨肉瘤U2-OS细胞的粘附、侵袭及迁移的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 质粒载体和骨肉瘤U2-OS细胞株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 溶液的配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2. 实验步骤 |
| 2.1 骨肉瘤U2-OS细胞株的培养 |
| 2.2 质粒载体的转染 |
| 2.3 骨肉瘤U2-OS细胞粘附实验 |
| 2.4 骨肉瘤U2-OS细胞迁移实验 |
| 2.5 骨肉瘤U2-OS细胞侵袭实验 |
| 2.6 收集细胞,分别检测转染后各组细胞中相关分子mRNA的表达 |
| 2.7 收集细胞,分别检测转染后各组细胞中相关分子蛋白质的表达 |
| 3 数据处理 |
| 4. 结果 |
| 4.1 转染后各组细胞的粘附率 |
| 4.2 转染后各组细胞的迁移活性 |
| 4.3 转染后各组细胞的侵袭活性 |
| 4.4 转染后各组细胞中PTEN,MMP-2和MMP-9 mRNA的表达 |
| 4.5 转染后各组细胞PTEN,MMP-2,MMP-9,FAK,p-FAK蛋白的表达 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 本课题的研究意义 |
| 5.2 抑癌基因PTEN与肿瘤的相关性 |
| 5.3 PTEN在骨肉瘤中的表达及其对相关分子表达的影响 |
| 5.4 存在的问题和进一步研究设想 |
| 结论 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述：抑癌基因PTEN与骨肉瘤相关的研究进展 |
| 1. 骨肉瘤的诊治与研究现状 |
| 2. PTEN基因与肿瘤发生、发展的关系 |
| 3. PTEN在骨肉瘤细胞中的表达 |
| 4. PTEN的生物学活性 |
| 5. 问题与展望 |
| 参考文献 |
（9）PTEN甲基化在骨肉瘤发生中的作用及5-Aza-CdR去甲基化对其MG-63细胞生物学行为的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 骨肉瘤中PTEN的甲基化情况及其与相关临床病理参数的关系 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 1、实验材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.1.1 标本组织来源 |
| 1.1.2 临床病理资料 |
| 1.2 主要实验仪器及材料 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 其他常用试剂 |
| 1.5 主要配制试剂 |
| 2、实验方法 |
| 3、统计学分析方法 |
| 结果 |
| 1、骨肉瘤组织病理形态学情况 |
| 2、骨肉瘤组织中PTEN蛋白表达情况 |
| 3、骨肉瘤组织中PTEN的甲基化情况 |
| 4、PTEN启动子区高甲基化与临床病理参数之间的关系 |
| 讨论 |
| 1、DNA甲基化与肿瘤的关系 |
| 2、DNA甲基化检测方法的选择及评价 |
| 3、PTEN及其甲基化与肿瘤的关系 |
| 4、PTEN高甲基化与骨肉瘤发生的关系 |
| 5、PTEN高甲基化与临床病理参数的关系及其对预后的影响 |
| 结论 |
| 第二部分 5-Aza-CdR去甲基化对人骨肉瘤MG-63细胞生物学行为及PTEN甲基化的影响 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 3、结果评定及图像分析方法 |
| 4、统计学分析方法 |
| 结果 |
| 1、MG-63、SAOS-2和U_2-OS细胞中PTEN的甲基化情况 |
| 2、5-Aza-CdR完全去除MG-63细胞PTEN甲基化的最佳浓度和时间 |
| 3、5-Aza-CdR去甲基化对MG-63细胞生物学行为的影响情况 |
| 4、5-Aza-CdR处理前后MG-63细胞中PI3K及AKt蛋白的表达变化 |
| 讨论 |
| 1、5-Aza-CdR的去甲基化作用机制探讨 |
| 2、5-Aza-CdR对MG-63细胞PTEN甲基化及行为学的影响 |
| 3、5-Aza-CdR对骨肉瘤中PTEN_PI3K/AKt信号转导通路的影响 |
| 结论 |
| 第三部分 5-Aza-CdR去甲基化对裸鼠模型移植瘤PTEN表达及其甲基化的影响 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 1、实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 3、结果评定及图像分析方法 |
| 4、统计学分析方法 |
| 结果 |
| 1、荷瘤裸鼠模型成瘤情况及动态观测结果 |
| 2、两组移植瘤组织病理形态学情况 |
| 3、两组移植瘤IHC免疫组织化学检测结果 |
| 4、荷瘤裸鼠模型经5-Aza-CdR作用后移植瘤中PTEN蛋白表达比较 |
| 5、MSP检测两组移植瘤中PTEN甲基化的情况 |
| 讨论 |
| 1、骨肉瘤移植性肿瘤模型方法的选择与评价 |
| 2、5-Aza-CdR的去甲基化作用机制与肿瘤的关系 |
| 3、5-Aza-CdR去甲基化对裸鼠移植瘤PTEN表达及甲基化的影响 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要的研究成果 |
| 致谢 |
（10）PTEN基因真核表达载体的构建及在MG63中表达（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 材料与仪器 |
| 3 实验方法和步骤 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
四、骨肉瘤中PTEN基因蛋白的表达及临床意义（论文参考文献）
- [1]LATS1基因去甲基化在人骨肉瘤增殖、凋亡和侵袭中的作用[D]. 武太勇. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]骨肉瘤相关基因甲基化研究进展[J]. 武太勇,李健,付海军,程才统,吕智,冯毅. 海南医学院学报, 2021
- [3]3D组织工程建立快速原位骨肉瘤动物模型的实验研究[D]. 黄少兵. 南华大学, 2020(01)
- [4]LASS2/TMSG1基因通过神经酰胺途径参与人肺癌A549细胞增殖、凋亡及其机制的研究[D]. 韩希然. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [5]磷酸酯酶与张力蛋白同源物基因甲基化在骨肉瘤发病机制、病情及预后评估中的价值[J]. 白曼莫,王炳南,杨济,禹志军,毕方方. 中华实验外科杂志, 2020(04)
- [6]FTO（Fat Mass and Obesity Associated）基因在尤文肉瘤发生发展中的生物学功能研究[D]. 刘超. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(04)
- [7]姜黄素联合5-Aza-CdR对骨肉瘤抑癌基因P16，PTEN的去甲基化作用研究[D]. 朱振国. 南昌大学, 2019(01)
- [8]抑癌基因PTEN对骨肉瘤细胞粘附、侵袭和迁移的影响[D]. 胡勇. 安徽医科大学, 2014(05)
- [9]PTEN甲基化在骨肉瘤发生中的作用及5-Aza-CdR去甲基化对其MG-63细胞生物学行为的影响[D]. 罗一. 中南大学, 2013(03)
- [10]PTEN基因真核表达载体的构建及在MG63中表达[D]. 徐生林. 安徽医科大学, 2012(01)