一、猪瘟病毒新疆南疆野毒株E_2基因高变区扩增及序列分析（论文文献综述）
宋健颖[1]（2021）在《规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整》文中研究表明随着我国养猪业的规模化发展,猪瘟、圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫和猪伪狂犬五种主要疾病防控尤为重要,一旦发病就会造成重大经济损失。本研究通过对新疆南疆某地区3个规模化母猪场母猪群的猪瘟、圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬和口蹄疫等五种主要疫病进行抗体水平监测、病原检查,了解规模化母猪场抗体水平、是否存在野毒感染、野毒基因型,更好地评价免疫程序是否合理,以期提高免疫效果。1.2018年至2020年,对新疆南疆某地区3个规模猪场（A～C）采集的1604份血液进行了猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫和圆环病毒2型的抗体检测。检测结果显示,猪瘟抗体阳性率分别为:A场92.30%（2018）、97.74%（2019）和89.22%（2020）;B场95.27%（2018）、93.04%（2019）和86.81%（2020）;C场91.67%（2018）、86.50%（2019）和90.80%（2020）;伪狂犬病抗体分阳性率别为:A场100.00%（2018）、99.25%（2019）和97.06%（2020）;B场98.82%（2018）、93.67%（2019）和94.44%（2020）;C场98.12%（2018）、84.00%（2019）和96.55%（2020）;猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性率分别为:A场86.15%（2018）、75.19%（2019）和55.88%（2020）;B场86.39%（2018）、88.61%（2019）和88.89%（2020）;C场91.94%（2018）、96.50%（2019）和95.40%（2020）。口蹄疫抗体阳性率分别为:A场90.77%（2018）、100%（2019）和98.04%（2020）;B场100%（2018）、97.47%（2019）和96.53%（2020）;C场95.97%（2018）、97.50%（2019）和96.55%（2020）;圆环病毒2型抗体阳性率分别为:A场80.00%（2018）、100.00%（2019）和92.16%（2020）;B场95.27%（2018）、97.47%（2019）和96.53%（2020）;C场97.04%（2018）、97.50%（2019）和98.85%（2020）。2.以“发现疫病或证明无疫”的抽样策略采集A规模化母猪场血清样本,采用圆环病毒2型抗原ELISA检测,检测结果阳性率为4.4%,证明A场存在圆环病毒2型感染。3.对A规模化母猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征发病猪的样本,采用猪繁殖与呼吸综合征ORF5基因序列特异性引物经RT-PCR扩增、测序、核苷酸同源性比较、系统进化树分析,结果证明,该样本测序结果与NADC30毒株同源性最高,为93.5%,属于类NADC30毒株。4.猪繁殖与呼吸综合征免疫程序进行调整初探,调整后母猪每年普免3次,每次免疫间隔4个月,采集调整后试验的猪群50份血清,进行猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测,抗体阳性率达到96%以上。
关淼[2]（2021）在《辽宁地区PRRSV分型、分布及其区域化精准防制的应用》文中研究指明猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）临床主要引起母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸困难,可以造成感染仔猪的死亡,哺乳仔猪死亡率高达60%以上,保育仔猪达10%～30%不等。高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）感染可以使发病率和死亡率明显增加,仔猪发病率可达100%,死亡率可达70%以上,成年猪发病率和死亡率可达50%以上,母猪流产率达到30%以上。猪群中经典株和高致病株均有流行,在日常免疫和感染后确诊时,都需要加以明确和区分。针对PRRS没有有效的治疗药物,临床主要施行免疫接种对该病进行预防,严格的执行免疫接种防控措施是防控该病最积极有效的措施之一。目前该病在世界范围内普遍存在和流行,由其引发的PRRS疫情不仅给养猪业造成了巨大的经济损失,同时也严重的威胁着人类的食品安全。我国各地区PRRSV优势血清型存在差异,通过使用问卷调查、病原学、分子生物学以及血清学方法,对辽宁地区PRRS的发生和流行进行研究,结果显示在辽宁各地区PRRSV优势血清型和PRRS发生情况不尽相同,因此针对地方优势毒株和流行趋势有针对性的建立区域性精准分型方法和防制策略势在必行。通过结合本研究建立的分型方法和血清学、分子生物学等方法,对全省猪群PRRSV病原感染及免疫抗体情况进行研究。推荐并施行精准防制策略,最后对免疫效果进行评估。为今后辽宁地区PRRS精准防控措施的制定和指导猪场临床生产提供一定的科学依据和技术支撑。主要研究内容和结果如下:（1）PRRSV分型检测方法的建立及应用本研究根据PRRSV基因组NSP2编码区缺失基因的两端设计2条特异性引物,成功的建立了可以鉴别检测PRRSV经典株与高致病株的RT-PCR方法,并对其引物浓度、反应时间和反应温度等条件进行了优化。研究结果发现,该反应的最佳退火温度为58℃,体系中最佳引物浓度为0.4μmol/L。特异性试验结果表明,该方法与CSFV、PRV、PCV2和PEDV等常见感染猪的病毒无交叉反应,具有良好的特异性。通过敏感性试验,表明该方法可以在10-3稀释度扩增出经典株目的条带,在10-4稀释度扩增出高致病性株目的条带,具有良好的敏感性。重复性试验结果表明,试验检测结果之间无明显的差异,具有良好的重复性。本研究建立的分型检测方法对HP-PRRSV具有更高的检出率,经典株检出率与国标检测结果一致。本方法适合兽医实验室和养殖场对PRRSV进行鉴别筛查,指导辽宁地区PRRSV精准防控策略的制定和执行,为PRRSV的快速检测及预警提供了快捷、有效的检测方法和检测依据。（2）PRRS发病情况和病原体核酸检测及分析1)猪群PRRS临诊发病情况及分析通过对2014年～2015年辽宁省内14个地市596家不同规模化的养猪场进行调查,调查结果显示,总体上猪群PRRS临诊发病率为7.05%;随着养猪场养殖规模的增加,PRRS发病率呈下降的趋势;2014年和2015年的PRRS临诊发病情况较为平稳;2015年辽南地区PRRS临诊发病率最低为5.06%,2014年辽北地区最高为8.96%。PRRS临诊发病没有明显的地域特征,在辽宁地区处于一个比较普遍流行的状况,因此做好PRRSV免疫防制是必不可少的。2)病原检测及分析2014年～2018年5年间辽宁省假定健康猪群HP-PRRSV病原核酸平均阳性率为5.96%,其中2015年HP-PRRSV平均阳性率最高（14.70%）,2017年最低（0.97%）;四个季度HP-PRRSV平均阳性率第一季度最高（8.93%）,第三季度最低（8.40%）;辽北地区平均阳性率最高（7.54%）,辽南地区最低（4.26%）。2017年至2018年较2014年至2016年,辽宁省HP-PRRSV病原检出率下降。使用PRRSV分型检测方法进行检测,结果表明2016年和2017年疑似感染病例高致病株检出数量高于经典株,至2018年经典株检出数量高于高致病株,在辽宁省范围内高致病株为主要流行株,同时伴有经典株的流行,近年来高致病株流行趋势下降,经典株感染病例相应增多。在制定免疫政策的时候,应该根据具体情况选择弱毒疫苗免疫。对猪群进行主要传染性疫病病原核酸检测结果表明,PRRSV和PCV2混合感染率最高（43.72%）,与PRV的混合感染率最低（0.64%）。3)PRRSV及其他主要病毒性疫病分子演化分析本研究测定的基因序列均为HP-PRRSV株。ORF5基因间同源性为91.5%～99.0%,NSP2基因间同源性为92.9%～99.5%。与VR-2332相比,ORF5氨基酸序列的第39位均由L39突变为I39,与高致病性毒株JXA1、HUN4、TJM相同;和VR-2332相比,第13位均由Q突变为R,LNeast2015第151位由R突变为K;同时在第137位均为S,表明本研究鉴定的毒株均为野毒株。进化树分析表明辽宁省PRRSV毒株发生了一定程度的基因变异,并且与疫苗毒有很近的亲缘关系。这些疫苗株相关分离株的出现可能与减毒修饰的活PRRS疫苗的广泛使用有关,结合氨基酸序列分析,提示为野毒株和疫苗株的基因重组毒株。对CSFV、PRV和PCV2目的基因进行序列分析结果表明,病原出现不同程度的变异并且发现部分强致病性毒株,辽宁地区部分病原与其他地区病原亲缘关系较近,存在较大的传入风险。（3）PRRSV疫苗免疫后抗体检测及分析2014年～2018年5年间辽宁省猪群PRRSV抗体平均阳性率为91.33%,其中2015年最高（94.26%）,2017年最低（87.76%）;四个季度抗体平均阳性率第四季度最高（93.31%）,第一季度最低（89.99%）;辽东地区抗体平均阳性率最高（93.82%）,辽南地区抗体平均阳性率最低（89.24%）。PRRSV抗体阳性率始终保持在70%以上,能够对群体提供免疫保护。不同生长时期猪血清样品PRRSV抗体总阳性率为94.39%,其中断奶仔猪最低（81.67%）,后备母猪、经产母猪和种公猪最高（100%）;病原总体阳性率为6.52%,其中种公猪最低（0%）,育肥猪最高（16.67%）;不同品系猪群血清样品中大白猪群PRRSV抗体阳性率最高（96%）,二元杂交阳性率最低（78%）。不同年龄阶段、不同品系PRRSV抗体阳性率差异不显着,并且都可以达到70%以上。对弱毒苗免疫后仔猪进行抗体动态检测结果表明,免疫后第1至4周仔猪体内抗体水平较低,免疫后5周开始上升,8～9周抗体水平达到峰值,可以持续到免疫后16周。免疫高致病株PRRSV弱毒苗的仔猪比免疫经典株PRRSV弱毒苗的早一周到达抗体阳性率峰值,但是二者之间没有显着的差别。因此建议在25～35日龄对仔猪进行首免,4个月后二免。（4）PRRS精准免疫防制措施实施效果及分析结合本研究建立的PRRSV分型检测方法和免疫程序,推荐精准免疫防制策略,在猪场实施以后取得了良好的效果,为辽宁地区PRRSV防控计划和猪场免疫防制措施的制定提供了很高的参考价值。试验猪场在实施精准免疫防制措施后,免疫抗体阻断率明显升高,水平趋于一致,大部分达到了0.8以上。PRRSV病原核酸检测结果表明,免疫后病原检出率明显降低。比对免疫前后母猪和哺乳仔猪的生产指标可以看出,免疫后母猪的流产发生率、木乃伊胎以及总死亡率明显降低,保胎率和仔猪成活率升高。按照推荐免疫程序进行免疫的猪群产生的抗体离散度更低,个体之间抗体水平差异性较小,具有更好的整体保护力。对辽宁地区抽样猪场进行调查及检测结果表明,2016年猪群免疫均为PRRSV高致病株疫苗,2017年、2018年PRRSV高致病株疫苗使用率降低,经典株疫苗使用率增加;在辽西、辽北部分市推广使用精准免疫措施后,辽西和辽北地区PRRS发生率下降;2018年相较2017年,各地区PRRSV高致病株检出数量均减少,辽西地区和辽北地区的经典株检出数量减少;2018年相较2017年,辽西地区和辽北地区抗体阳性率上升。2018年精准免疫防制措施推广场与未推广场相比,具有更低的病原阳性率和平均发病率,具有更高的抗体阳性率。猪场在制定并施行免疫防制策略的时候,应根据本猪场、周边环境、整个县市的PRRSV流行趋势,选择适合本猪场的弱毒苗和免疫程序。PRRSV阴性场如果周边场、县没有HP-PRRSV的流行应该尽量选择经典株弱毒苗进行免疫;PRRSV阳性场,应先确定本猪场发生的是哪种PRRSV血清型感染,再选择弱毒苗进行紧急的全群免疫。
向萌[3]（2021）在《ASFV、PRRSV、CSFV和PRV一步法多重荧光定量RT-PCR方法的建立及应用》文中研究说明非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪伪狂犬病毒（PRV）是目前国内生猪养殖过程中最常见且危害极为严重的4种重要猪病病原。自2018年来,ASFV在国内流行呈持续上升态势,PRRSV、CSFV和PRV流行毒株基因组出现不同程度的遗传变异,基因多样性增加,导致部分现有检测方法的检测灵敏性降低。同时,相关弱毒疫苗的广泛使用也对传统方法的检测结果造成不同程度的干扰。基于上述现状,本研究旨在建立一种快速鉴别检测ASFV、PRRSV、CSFV和PRV野毒感染的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法,并初步应用于临床样本的检测,以期为上述病原的检测和流行病学调查提供精准有力的工具,也进一步了解上述疫病在四川地区的流行情况及其分子特征,为相关疫病的防控和净化提供参考。1、ASFV、PRRSV、CSFV和PRV一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立本研究分别以ASFV B646L基因、PRRSV ORF6基因、CSFV 3’UTR基因和PRV gE基因为靶点设计4对特异性引物及探针并构建核酸标准品,对其引物浓度、探针浓度、反转录酶浓度和退火温度等进行优化,测定其特异性、敏感性和重复性,并与荧光定量PCR商品化试剂盒同时对255份已知临床样本进行检测,比较检测结果符合率。结果显示,本研究建立的一步法多重荧光定量RT-PCR检测法在总体系50 μL,反转录酶1μL（20U/μL）,ASFV、CSFV、PRRSV和PRV引物浓度分别为 0.1 μmol/L、0.1 μmol/L、0.06 μmol/L,0.14 μmol/L,探针浓度均为0.05 μmol/L,退火温度58℃时的扩增效果最佳。该方法对CSFV“C株”疫苗株、PRVBartha-k61 gE基因缺失疫苗株、BVDV、及10种猪病病原均不检出,具有良好的特异性;该方法对不同核酸标准品检测下限分别为:ASFV 3.41 ×101 copies/μL、CSFV 4.02×101 copies/μL、PRRSV 5.91 copies/μL 和 PRV 3.92 ×102 copies/μL;重复性实验结果显示此方法在组内、组间的变异系数均小于2%,表明该方法具有良好的批内和批间重复性;该方法与商品化荧光定量PCR试剂盒的检测符合率分别为:ASFV 100%（k=1）、PRRSV 100%（k=1）、CSFV 100%（k=1）和PRV 100%（k=1）。2、2020～2021年四川部分地区四种猪重要疫病的流行病学调查及PRV流行株遗传变异分析本研究运用上述建立的方法对2020～2021期间四川巴中、达州、南充、广安、内江、广元和宜宾7市、13个猪场共293份样本中PRRSV、CSFV和PRV感染情况进行检测,其中仔猪样本共计90份,成年猪样本共计203份,结果显示,CSFV 未检出,PRRSV 和 PRV 的阳性率分别为:7.8%（23/293）和 13.3%（39/293）。PRRSV仅在在宜宾和广元地区有检出,在宜宾地区检出率高达（34.8%）,而PRV则在除广元和宜宾外5个地区均有检出,阳性猪场比例为53.84%（7/13）,说明PRRSV和PRV在我国四川地区广泛存在,需要进一步强化区域内的防控和净化措施。对2020～2021年四川地区的PRV阳性样本的gB、gC、gD和gE基因进行了 PCR扩增,并对流行毒株的gB、gC、gD和gE基因进行同源性、氨基酸变异及遗传进化分析。结果显示:本研究共获得5株流行株的gB、gC、gD和gE基因序列,5株流行株的主要毒力基因与NCBI上已登录的所有毒株的核苷酸同源性分别为gB基因94.9～99.0%、gC基因90.1～99.7%、gD基因96.9～99.2%、gE基因93.1～100%,氨基酸同源性分别为:gB蛋白95.3～99.2%、gC蛋白89.6～99.6%、gD蛋白97.1～98.8%、gE蛋白93.3～100%,5个流行毒株在gB蛋白上均存在独有氨基酸变异,分别为:SWUN01株3个、SWUN02株6个、SWUN03株 8 个、SWUN04 株 7 个、SWUN05 株 5 个,仅 SWUN02 的 38aa、39aa,SWUN05的137aa在gC蛋白上存在独有氨基酸变异,且经Protean分析显示,部分独有氨基酸变异位点引起了明显的抗原指数的变化,而在gD和gE蛋白上仅存在个别独有氨基酸变异;对5个流行株的PRV gB、gC和gE构建遗传进化树显示,5个流行株均属G1群,与国内近年流行毒株处于同一大支,与早期四川流行毒株的遗传关系较远。此外,本次流行毒株同日本、韩国毒株共处一大支,与欧美毒株遗传关系均较远,推测这5个流行毒株可能存在相似的演化关联。
廖迅[4]（2016）在《猪瘟病毒C株重组标记疫苗候选株免疫原性与鉴别检测》文中指出猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的一类能在家猪和野猪中流行,具有高度传染性的传染病,严重威胁养猪业发展。CSFV是一种含有囊膜的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科瘟病毒属成员,基因组长约12.3kb。病毒蛋白中,结构蛋白E2、Erns以及非结构蛋白NS3为主要免疫原性蛋白,其中E2诱导中和抗体,与病毒入侵和致病性紧密相关。我国对于猪瘟防控的主要策略为猪瘟兔化弱毒苗群体免疫,但无法通过血清学方法区分疫苗免疫和自然感染动物。研究表明,CSFV流行毒株也已经从之前的group 1转向group2,新基因亚型毒株不断出现。CSF呈现地方性流行,症状非典型化,甚至在免疫猪群中也有发病。因此,开发新型猪瘟分子标记弱毒疫苗仍然是当今研究热点。本课题主要研究目标：（1）利用特异性单克隆抗体探明猪瘟病毒1型和2型E2抗原区的差异；（2）构建基于疫苗C株、携带流行毒株E2基因的嵌合重组病毒,评估其安全性和免疫原性；（3）探索猪瘟病毒Erns核心抗原区氨基酸变异对病毒复制和病毒粒子形成的影响；（4）构建以C株为骨架、携带牛病毒性腹泻病毒Erns基因的嵌合重组病毒,评估其安全性和免疫原性。1.针对猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备与表位鉴定为探究猪瘟病毒疫苗株C-strain与强毒株和流行毒株囊膜糖蛋白E2抗原差异性,我们利用原核表达的SM株和HZ1-08株E2-AD抗原区蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术结合ELISA和IFA筛选,获得了两株稳定分泌抗E2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B10和4F4。免疫印迹、IFA和ELISA鉴定表明,2B10仅能与SM株反应,不能与C株和2型毒株反应；4F4能与2型流行毒株反应,与C株无反应性。已知第737位Cys突变的重组E2会破坏B/C区构象,从而影响相应单抗对该区域的识别。我们通过真核表达携带该位点突变的E2以鉴定不同单抗的识别区域,发现2B10识别线性表位,不受二级结构的影响；4F4识别构象表位,位于E2抗原区域B/C中。差异氨基酸反应性鉴定证实了2B10识别的线性表位仅存在于SM株E2,丙氨酸定点突变分析进一步证实其识别表位为707IXPXGXGG714。4F4识别构象表位位于流行毒株E2的N端高变区1（HAR1）, Glu713为关键氨基酸。二株单抗均具备潜在鉴别诊断价值。2.携带流行毒株E2的嵌合重组猪瘟病毒疫苗C株的鉴定与免疫原性鉴于CSFV流行毒株的E2蛋白的抗原多样性,特别是它们与疫苗毒株之间的较大差异,可能影响疫苗的免疫保护效力。因此,在本实验室之前建立的CSFV-C株反向遗传学操作系统的基础上,构建了基于C株、携带流行毒株HZ1-08的E2主要抗原区域（870bp）和N端抗原高变区1（HAR1,90bp）的感染性克隆,拯救获得了2株嵌合重组病毒RecC-HZ-E2和RecC-HARl;HAR1缺失的感染性克隆无法拯救获得子代病毒。两株嵌合重组病毒与亲本病毒RecC在体外生长没有差异,能在兔体内复制,并诱导产生定型热反应和特异性抗体。嵌合重组病毒免疫猪后没有出现体温变化和临床症状：免疫后第14天RecC-HZ-E2免疫猪能够检测到低水平的病毒血症。免疫后第7-10天血清中能够检测到特异性E2和Erns抗体,嵌合重组病毒诱导产生的免疫血清与流行毒株E2的反应性和体外中和能力都明显高于亲本株RecC;免疫猪能够抵御强毒SM株以及流行毒株QZ14攻击,表明改造后的嵌合重组病毒可能比亲本株更有效提供对流行毒株的保护力。3.猪瘟病毒Erns核心抗原区氨基酸变异对病毒复制的影响猪瘟病毒Erns也能够诱导动物产生特异性抗体,我们证实核心抗原区AR2蛋白（aa84-160）占优势,其中aa117-125为关键氨基酸,单一突变这些氨基酸在体外能影响抗体的结合。我们试图在C株Erns上找到影响抗体结合而不影响病毒复制的关键氨基酸或抗原区,为开发“负筛选标记”弱毒疫苗奠定基础。结果表明,在C株全长感染性克隆上,核心抗原区AR2中aa117-125任一氨基酸单点或者连续缺失都无法拯救获得子代病毒粒子；而在SM株全长感染性克隆上,上述突变却都能够拯救获得病毒粒子,最长甚至可以将117-125全部缺失。我们推测Erns该区域在SM和C株之间作用有所差异,为探寻这一差异,我们以C株结构蛋白嵌合SM非结构蛋白的重组病毒（C和G）和SM结构蛋白嵌合C株非结构蛋白的重组病毒（D和E）的全长感染性克隆为骨架进行突变,能够获得117-118突变（缺失和Ala替换）的子代病毒,但其他位点氨基酸突变也无法拯救重组病毒。说明C株和SM株之间在Erns核心抗原区缺失对子代病毒产生的影响有差异,结构蛋白和非结构蛋白在其中均发挥作用。但由于以上重组病毒都无法在兔体内复制,也未能诱导特异性抗体,无法进行血清学分析。4.携带牛病毒性腹泻病毒Erns的嵌合重组猪瘟病毒C株的拯救及其生物学特性鉴定为开发能够区分野毒感染动物和疫苗免疫动物（Differentiation of infected and vaccinated animals, DIVA）的新型弱毒疫苗,我们构建了以C株为骨架,携带牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）基因型1b分离株Erns基因的嵌合重组病毒（RecC-B-Erns）作为候选疫苗株。RecC-B-Erns在体外培养细胞中生长特性与RecC一致；体内试验证明,它保持了亲本毒株RecC在兔体内复制并诱导产生定型热反应和特异性抗体的能力。猪免疫后第7-10天能够检测到与RecC相当水平的针对E2的特异性抗体,而针对Erns抗体生成时间较E2迟1-3天。重组病毒RecC-B-Erns的兔和猪全血清与BVDV 1b型Erns截短蛋白B-tErns-X反应性良好,而与C株截短蛋白C-Erns-Y没有反应性；相反RecC诱导产生血清或流行毒株感染血清与C-tErns反应性良好,而与B-tErns较差。受试猪未呈现任何临床症状,但能有效诱导体液免疫应答,并能抵御强毒株和流行毒株的攻毒,证明其良好的安全性和保护力,能够作为猪瘟标记弱毒疫苗的候选。此外,我们制备了分别针对C株Erns和BVDV 1b型Erns的单克隆抗体3E8和4D6,这两个单抗识别的均为线性表位,并且3E8只与猪瘟病毒Erns核心抗原区有反应,4D6只与BVDV 1b型Erns蛋白反应,二者识别抗原表位可用于下一步鉴别诊断试剂盒的开发。综上所述,本研究利用单克隆抗体探明了流行毒株与疫苗C株在E2部分区域抗原结构的差异,探明了E2高变区HAR1与中和抗体的形成密切相关；携带流行毒株E2或HAR1的嵌合重组病毒诱导针对2型的中和抗体能力高于亲本株RecC,免疫猪能够抵御强毒的攻击；携带BVDV Erns的嵌合重组C株猪瘟病毒对猪安全,具有良好的免疫原性。上述研究为新型分子标记弱毒疫苗的开发奠定了良好基础。
王国超[5]（2014）在《牛病毒性腹泻病毒新疆流行株的分离鉴定及E2基因遗传变异研究》文中研究说明牛病毒性腹泻-黏膜病（BVD）是由牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（BVDV）引起的牛的一种急性、热性传染病，主要表现为腹泻、粘膜脱落、母畜流产、死胎和畸胎，持续性感染、免疫耐受与免疫抑制等。流行病学调查发现，该病在许多养牛业发达的国家和地区广泛流行，在我国有20多个省、市、自治区流行该病，并且有较高的感染率。新疆北疆作为新疆畜牧业的重要产区，近年来引种数量较大，牛、羊存栏量较多，贸易频繁，导致BVD的广泛流行。为了对北疆地区BVD进行有效防控，开展新疆北疆BVDV分子流行病学调查，弄清本地区BVDV流行株基因型和遗传变异情况具有重要的意义。本研究对采集新疆北疆地区疑似BVDV感染牛病料进行BVDV核酸检测，选取阳性样品进行BVDV的分离鉴定，并对流行株E2基因进行克隆及遗传变异分析。主要研究方法和结果如下：1、新疆北疆部分地区BVDV分子流行病学调查研究为了解新疆北疆部分地区BVDV流行株的分子背景，本研究根据GenBank中公布的BVDV5-UTR的基因序列，设计特异性引物，对采集的116份样品进行BVDV核酸检测，选取部分阳性样品经5-UTR基因克隆测序后进行BVDV流行株基因分型研究。结果66份为阳性样品，感染率为56.90%，表明在北疆地区BVDV感染较为严重。随机选择的12份测序样品中，11份属于BVDV-1型，1份属于BVDV-2型。研究结果证实北疆地区是以BVDV-1流行占据优势地位，但也存在BVDV-2型感染。2、BVDV-2新疆流行株的分离鉴定对BVDV-2RT-PCR检测阳性样品处理后接种MDBK单层细胞，进行BVDV流行株的分离鉴定。结果成功分离出1株可产生明显细胞病变（CPE）的BVDV cp型毒株。该毒株引起的CPE主要表现为病变细胞逐渐变圆、脱落，聚集成堆，出现拉网，脱落死亡。通过对该分离株的E2部分基因扩增、测序和序列比较，进一步证实所分离的毒株（BVDV2-SW）为BVDV-2型。3、BVDV新疆流行株E2基因的克隆与遗传变异分析利用套式PCR方法扩增BVDV E2基因全长，克隆、测序后与国内外不同地区BVDVE2基因进行比较分析。结果成功克隆了BVDV-SW和BVDV2-SW流行株E2基因，长度为1120个核苷酸。序列分析发现，BVDV-SW流行株E2基因核苷酸序列与国内分离株changchun184株，新疆分离株Manasi株和MNS2株同源性为86%；推导氨基酸序列同源性为84%。与NADL株和C24V株相比，其核苷酸和推导氨基酸序列同源性均低于80%。BVDV2-SW流行株与XJ-04和890株的核苷酸同源性分别为87%和84.7%，推导氨基酸同源性分别为80.8%和79.9%。遗传进化分析显示，BVDV-SW和BVDV2-SW流行株在基因分型上分别属于BVDV-1和BVDV-2。抗原表位优势区域BVDV-SW与shihezi148基本一致，而BVDV2-SW与890和XJ-04相同。BVDV-SW和BVDV2-SW流行株E2基因均存在变异现象。
胡继明[6]（2012）在《山东地区猪繁殖障碍相关疾病的分子流行病学调查及发病相关性研究》文中研究表明为了摸清山东地区近年来猪繁殖障碍疾病对猪群健康的危害,建立了可鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR-RFLP检测方法,可区分高致病性PRRSV和经典PRRSV的RT-PCR方法,PCV2和PRV野毒的单重PCR和CSFV、 PRRSV、 PCV2和PRV多重PCR检测方法。通过对山东地区2010-2012年的分子流行病学调查和部分基因的遗传演化分析,揭示当前该省猪群疫病的分子衍化规律和分子流行病学本底,并为制定山东省猪群疫病防控规划提供参考依据。参照GenBank收录的CSFV、 PRRSV、 PCV2和PRV基因组序列,设计四对特异性引物,结果CSFV RT-PCR扩增片段为825bp,产物经RFLP分析,野毒株的PCR产物能被Apal酶切为322bp和503bp两个片段；高致病性PRRSV预期产物406bp,经典低致病性毒株预期产物496bp。临床应用,单重PCR和多重PCR检测的阳性数符合率高达94.5%。应用ELISA和PCR方法检测了2010-2012年来自于山东地区不同区域养殖场288份血清、658份送检病料和全血样品中的CSF、 PRRS、 PCV2、 PR的抗原和抗体。结果显示,CSF、 PRRS、 PCV2和PR抗体阳性率分别为62.32%、70.81%、76.56%和75.76%。CSFV、 PRRSV、 PCV2和PRV抗原阳性率别为30.85%、58.35%、60.03%和15.65%；混合感染CSFV和PRRSV阳性率18.24%；混合感染PRRSV和PCV2阳性率36.47%,值得关注的是在检出的384份PRRSV阳性病料中就有240份PCV2检出,PRRSV与PCV2的混合感染率可达到62.50%。PRRS和PCV2之间存在着很强的正相关关系（P=0.010）,相关系数为0.823；即当PRRS与PCV2的流行率同时升高或同时下降。PCV2与PR之间存在着较强的正相关关系（P=0.045）,相关系数为0.637。PCV2与CSF之间、PR与CSF之间存在着较弱的负相关关系,当PR流行率升高时,CSF滞后于PR的流行,或者,PR的流行影响这未来几个月CSF的流行,但是这种影响是不显着的。对山东部分地区的分离CSFV的EO基因、PRRSV的ORF5基因、PCV2全基因扩增、克隆和测序,用DNAStar软件分析所测序列。结果表明：山东8株流行野毒株除SD13为2.1a群外,其余都为2.1b群,与Shimen、 HCLV和Brescia等国外经典毒株（基因1群）遗传关系较远,山东猪瘟流行毒株正朝着远离疫苗毒的方向演变。通过EO基因RNase活性区、细胞表位序列的比较分析,所测8株流行株的RNase活性区序列EWNKHGWC（aa75-aa82）高度保守,推测这些毒株EO蛋白在空间结构上不会有太大的差异。EO基因有两个细胞表位,TWFGAYA这个B细胞表位在8个流行毒株及22个参考毒株中均保守,抗原表位基序DKN有变异：在8个流行毒株中有1株为DNN,1群参考毒株为DKD。分离到的14个山东流行株部分NSP2、ORF5基因与国内代表株国内变异株JXA1的核苷酸同源性分别为95.7-99.2%,98.6-99.7%,而与欧洲代表株LV的同源性分别28.6-30.6%、65.3-66.2%。进化树分析表明2010-2012山东地区流行的PRRSV毒株仍属北美洲亚群1,它们与国内2006年-2010年间的分离株亲缘关系较近,而与更早的分离株和疫苗MLV株亲缘关系较远。NSP2和ORF5的主要抗原表位有变异,这些变异与目前HP-PRRSV是否有关系有待进一步证明。PCV2全基因测序表明PCV2b是目前我省流行株,与国内流行株一致,PCV2基因型与地域无明显相关性。国内流行的圆环病毒的遗传演化规律为PCV2a型→PCV2b型。本研究通过对山东地区CSFV的EO、PRRSV的NSP2、ORF5和PCV2的全基因的变异性分析,了解2010-2012年PRRSV在山东地区的变异情况,为猪繁殖障碍疾病的防控以及疫苗的免疫提供了理论基础。
蔺涛[7]（2012）在《中国部分地区CSFV与PRRSV流行情况调查与PRRSV标记毒株的研究》文中提出2006年,我国猪群中暴发一种以高热、腹式呼吸、咳嗽、食欲不振、便秘或腹泻、眼分泌物增多等为主要症状的传染病。最初对该病的病因没有明确定论,故将之定名为“猪无名高热”或“猪高热病”。为了研究“猪高热病”中主要病毒性病原在国内的流行情况,本研究对猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒进行了分子流行病学调查;分析了PRRSV国内流行株与国内外其它毒株间的遗传演化关系。在对病原基因组本身认识加深的基础上,利用反向遗传学手段获得了一株PRRSV标记毒株株并对其进行了初步免疫实验研究；进一步对PRRSV活病毒载体疫苗的可行性进行了探索。本研究为我国猪群中主要病毒病原的分子流行病学特征提供科学依据,同时也为PRRSV的防控提供了新的思路,奠定了理论基础。本研究具体内容如下：1、中国部分地区猪瘟病毒分子流行病学调查为了研究中国猪瘟病毒（CSFV）的分子流行病学,本试验用巢式RT-PCR检测2008年1月到2011年3月送检的不同猪场病料,并对其中103个CSFV分离株的E2基因序列进行分析。进化分析结果表明这些毒株分属1群的1.1亚群和2群的2.1和2.2亚群,没有3群毒株存在。2.1亚群毒株为优势流行毒株,流行范围覆盖大陆绝大部分地区。这些结果丰富了国内CSFV基因变异情况的数据,将为新的诊断方法的建立、流行病学监测以及有效的防控措施制定提供理论基础。2、中国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查对来自2006-2010年中国15个不同省、自治区、直辖市的疑似猪繁殖与呼吸合征（PRRS）发病猪场的送检病料进行猪繁殖与呼吸合征病毒（PRRSV）的检测,并对其部分ORF5基因进行测序,以确定当前PRRSV在中国的分子流行病学特征,并分析PRRSV在中国的遗传变异规律。使用RT-PCR的方法对采集的样品进行PRRSV检测,并对PRRSV检测呈阳性的69份病料进行ORF5基因的序列测定和分析。1196份病料中共检测到247份阳性样品,阳性率为20.7%。对ORF5序列进行分析表明,69株PRRSV毒株序列均属于2型,与GenBank中高致病性蓝耳病（HP-PRRSV）参考毒株的氨基酸同源性为94.0%-100%。所测序列与PRRSV参考株一并,共可分为5个亚型,亚型Ⅳ与HP-PRRSV遗传距离最近。同时,进化树分析结果表明,69个毒株在空间分布上存在散在性,来源于不同省市的PRRSV毒株的遗传关系存在交叉,病毒分型并没有呈现明显的地域性；PRRSV在中国的流行株为HP-PRRSV, PRRSV在目前中国的遗传演进相对稳定。3、PRRSV中国流行株全基因组序列的测定与分析为了进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒在国内的遗传变异情况及分子生物学特征,本研究在上一章研究的基础上,对一株国内分离株JS0922株进行了全基因组的序列测定。根据ATCC VR-2332标准株和JX143高致病性蓝耳病代表株的序列设计引物,对1株2009年的PRRSV江苏分离毒株JS0922全基因进行了分段扩增并测序,将测序结果拼接后,得到病毒的全基因,然后进行序列的比对分析。分析数据显示,PRRSV JS0922株属于基因2毒株,它与2006年以前的分离株相比存在明显差异,与国内早期BJ-4株的核苷酸同源性仅为89%；而与高致病蓝耳病病毒（HP-PRRSV）的同源性较高,达98%以上。就基因组各开放阅读框而言,JS0922的ORF3、ORF4基因变异较大,ORF6则较为保守。分析发现,JS0922基因组具有HP-PRRSV的分子特征,但部分位点氨基酸的突变明显区别于HP-PRRSV。综上,JS0922毒株发生了部分变异,具备了一些新的特点,但总体上划归于HP-PRRSV演化中的一个分支,属于目前国内PRRSV的优势流行株。4、猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白N蛋白N端非必需区的研究为了确定猪繁殖与呼吸综合征病毒nucleocapsid （N）蛋白N末端非重叠区域的非必需区的范围,我们在单纯将PRRSV ORF6与ORF7重叠区拉开的背景质粒上进行了系列研究。本实验参照骨架质粒p7PNX的序列设计引物,选取其N蛋白N端从起始密码子之后的氨基酸进行系列缺失,构建一系列缺失突变体。通过转染BHK-21细胞进行病毒拯救,确定在ORF7无重叠区的情况下,N末端的2-7位氨基酸对于病毒的感染性是非必需的。对缺失体盲传后发现,缺失区域在体外遗传性能稳定。对缺失体进行多步生长曲线和空斑实验,发现缺失体生长动力学和空斑形态学特征与野生型相似。本研究首次确定了2型PRRSV的N蛋白non-overlapping背景下N末端的缺失区域,为进一步解析N蛋白结构与功能、创制新型基因工程标记疫苗奠定了基础。5、猪繁殖与呼吸综合征结构蛋白N蛋白标记毒株的构建及初步免疫实验研究当前的PRRSV疫苗对疫苗免疫猪和自然感染猪上无法提供血清学鉴别。因此,我们需要利用新的方法制备一种新型的,更为有效的疫苗。利用反向遗传技术,我们构建了一个基因标记毒株—v7APMa,该候选株的核衣壳蛋白与野生毒株（vAPRRS,2型PRRSV）有所差异,v7APMa在体外的细胞培养中显示了良好的遗传稳定性,并且其基因标记的病毒特性在子代病毒中能够很好的得到复制。在体内感染实验中,标记病毒v7APMa和亲本病毒vAPRRS一样,能够诱导感染猪产生相当水平的抗N蛋白抗体,也能诱导相似滴度的中和抗体。同时,两组免疫组仔猪血清中的IL-4和IFN-γ的含量也明显升高。说明标记病毒和亲本病毒一样,能够刺激机体产生正常的免疫应答。v7APMa感染猪在在感染后14天能够产生抗基因标记特异性多肽的抗体。但是vAPRRS和对照组在整个过程未能产生针对基因标记特异性多肽的抗体。说明诊断ELISA方法能够区分vAPRRS病毒和标记病毒v7APMa。在实验28天PRRSV强毒株JX143攻毒后,对照组出现典型的PRRS临床症状,表现为体温升高、食欲下降,眼睑水肿,流鼻涕,咳嗽,皮肤发红等临床症状,且在攻毒后11天和14天分别有1头仔猪死亡。而v7APMa和vAPRRS免疫的猪体温也有体温升高,但持续时间短,临床症状较轻,无猪只死亡。说明vAPRRS和v7APMa均可以对异源毒株JX143攻毒提供一定的免疫保护。结果表明,通过这种新的方法制备出的基因标记毒株为PRRSV标记疫苗的创制提供了新的思路。6、猪繁殖与呼吸综合征病毒活载体疫苗候选株的构建及其病毒学特性的研究为了获得以PRRSV作为活病毒载体的疫苗候选株,并探究在PRRSV的ORF4与ORF5之间运载外源蛋白基因的可行性,本实验将（equine arteritis virus, EAV）的ORF4嵌合入PRRSV基因组中,经PCR、酶切和基因测序鉴定,筛选获得阳性重组质粒pAPRRS（EAV4）。转染对数生长期的BHK-21细胞,拯救获得了重组嵌合病毒vAPRRS（EAV4）。经MARC-145连续传代,证明其基因组在体外可以稳定遗传。Northern-blot、亚基因组测序和间接免疫荧光表明,PRRSV自身基因组可完成复制、转录、翻译各过程,但嵌合入的EAV的ORF4没有转录的发生。对嵌合体进行多步生长曲线和空斑实验,发现嵌合体生长动力学和空斑形态学特征与野生型相似。从而为进一步研究动脉炎病毒各个结构蛋白的功能、开发新型PRRSV活载体疫苗、标记疫苗奠定了基础。
任艳[8]（2010）在《牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白E2与牛胚胎滋养层细胞相互作用的分子机制研究》文中提出牛病毒性腹泻病（BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的一类以腹泻、流产、呼吸道疾病和免疫机能障碍为主要症状的疾病,目前已在世界范围内广泛传播,给养牛业国家造成了巨大的经济损失。我国BVDV感染具有特征性临床症状的病例并不多见,多半是隐性感染,未能引起足够重视。BVDV感染胎盘组织,通过胎盘屏障将病毒传播给胎儿,造成母胎持续性感染是该病防治的难点和重点。妊娠母畜在怀孕早期通过子宫内感染非致细胞病变型（ncp） BVDV,此时胎儿免疫系统尚未成熟,不能产生免疫应答反应。此种牛一出生即为持续感染牛,外表健康,但终生带毒、排毒,成为畜群主要的传染源。胚胎滋养层细胞是母体和胎儿的联系纽带,同时也是BVDV垂直传播的靶细胞,目前有关BVDV感染胚胎滋养层细胞的分子机制尚不清楚。寻找与BVDV主要囊膜蛋白相互作用的细胞受体,确定受体在病毒感染细胞过程中的功能,是研究BVDV垂直传播机制的重要内容之一,也为家畜抗病育种提供新的理论依据。为此,本研究以BVDV和胚胎滋养层细胞为研究对象,主要展开以下研究工作：1.新疆部分地区奶牛场BVDV的分子流行病学调查和基因型分布。根据BVDV保守区基因5’-UTR设计引物,采用RT-PCR方法,对新疆石河子、玛纳斯、喀什、等7个地区、14个奶牛场的274份牛粪样品进行核酸检测及测序。结果表明：BVDV阳性率为18.61%（51/274）,北疆地区阳性率为21.34%（51/239）,南疆地区未检测出病原。其中有23对母子对应样品,母牛阳性率为39.13%（9/23）,犊牛阳性率为30.43%（7/23）。35头牛表现临床症状,阳性率为45.71%（16/35）,其余为临床健康牛,阳性率为17.16%（35/204）。调查数据显示新疆地区奶牛BVDV存在隐性感染,且垂直感染较严重。通过序列比对,系统发生分析表明所分析序列与已公布的BVDVⅠ型序列核苷酸同源性最高,达97.5%,并且主要是BVDVⅠb亚型。对临床发病症状明显的初检阳性病料进一步分离培养和鉴定。采用免疫学实验、细胞培养和电镜观察、理化特性测定以及同源性比较等方法分离、鉴定了1株BVDV分离株,命名为BVDVshz132株。2.牛胚胎滋养层细胞体外分离培养及BVDV shz132株感染实验：采用胶原酶消化方法,从牛子叶组织中分离双核滋养层巨细胞（Binucleate trophoblast giant cells,TGC）。实验分离的细胞经台盼蓝染色后记录细胞存活率大于90%,核染可见典型双核特征；经差异贴壁法纯化后纯度可达95%。抗细胞角蛋白抗体检测呈阳性,抗波形蛋白抗体检测呈阴性。细胞经过4次传代后,可以存活60天。通过制备细胞爬片,接种BVDVshzl32株,分别培养12-60h,采用BVDV5’-UTR基因实时荧光定量PCR检测病毒拷贝数在培养12h和60h的增殖情况。结果表明60h病毒拷贝数明显高于12h,病毒可在TGC细胞中复制、增殖。3.建立牛胚胎滋养层细胞的cDNA文库,采用酵母双杂交技术筛选与BVDVshzl32株主要囊膜蛋白E2相互作用的TGC细胞结合蛋白。文库的库容为1.3×106,插入片段大小在0.2-4kb；取杂交后35个克隆进行测序,用BlastN进行序列同源性比对,筛选得到与BVDV感染TGC细胞相关的捕获蛋白有Bos taurus tryptophanyl-tRNA synthetase （色氨酰-转移核糖核酸合成酶）、similar to WARS protein（色氨酸-转移核糖核酸合成酶--TRRRS-基因标记符号）、actin and beta （肌动蛋白）、p21 protein （Cdc42/Rac）-activated kinase 4（p21-活性激酶,PAK4）、pyruvate kinase（丙酮酸激酶）和clathrin heavy-chain（网格蛋白重链）。通过在线软件分析捕获蛋白的二级结构,预测各个蛋白结构域的功能。结果发现网格蛋白重链接头蛋白（heavy-chain linker）介于网格蛋白与配体-受体复合物之间起到连接作用,通过网格蛋白包被囊泡的内吞作用使配体-受体复合物进入细胞。分析表明网格蛋白介导的内吞作用是BVDV感染细胞的一种途径。采用免疫共沉淀方法验证网格蛋白与诱饵蛋白之间的相互作用。以上研究结果表明：通过对新疆地区的BVDV流行病学调查发现,本地区阳性感染率较高,垂直传播严重,基因型分布主要以BVDVIa和Ib型为主。对流行病学阳性样品进一步分离,鉴定了一株BVDV野毒株（shz132株）,为非致细胞病变型；成功体外培养了牛胚胎滋养层巨细胞,对细胞进行了鉴定,并成功感染BVDV shz132株；构建了牛胚胎滋养层细胞的cDNA文库；通过酵母双杂交筛选得到6个与BVDV shz132株E2蛋白相互作用的牛胚胎滋养层细胞蛋白,其中网格蛋白是与BVDV感染滋养层细胞相关的蛋白。通过本研究,为揭示BVDV垂直传播,导致持续性感染的分子机制提供线索,也为该病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。
张兴娟[9]（2010）在《同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1型的三重荧光定量RT-PCR方法的建立》文中提出猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（HCV或CSFV）引起的一种高度接触性传染病,是危害养猪业最严重的传染病之一。世界动物卫生组织（OIE）将其列入OIE名录,我国将其列为一类传染病。其基因组为单股正链RNA,大小约为12.3 kb,含有1个大的开放阅读框（ORF）,两侧为高度保守的5′和3′非编码区（UTR）。牛病毒性腹泻病毒（BVDV）和CSFV同为黄病毒科瘟病毒属成员,根据BVDV基因组的差异,我们将其分为两个基因型,即基因型1（BVDV-1）和基因型2（BVDV-2）。同属的成员还包括:绵羊边界病病毒（BDV）和长颈鹿瘟病毒（Pestivirus of Giraffe）。由于BVDV不仅可以感染牛还可以感染猪,引起与猪瘟相似的临床症状和病理变化,同时BVDV与CSFV存在血清学交叉反应,因此很容易被误诊为猪瘟。此外,猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）在我国的大规模应用,使猪瘟野毒感染、疫苗接种的区分变得非常困难和必要。因此,亟待建立一种可以准确区分猪瘟野毒感染、疫苗接种以及BVDV感染的快速、高效、敏感而特异的检测方法。本研究旨在建立一种能同时区分CSFV野毒、HCLV和BVDV-1的敏感、特异、重复性好的三重荧光定量RT-PCR鉴别检测方法。根据CSFV NS5B区域分别设计了针对CSFV野毒、HCLV的引物和TaqMan水解探针,依据BVDV 5′-UTR设计了一对针对BVDV-1的引物和TaqMan水解探针,在优化反应条件的基础上,建立了同时区分CSFV、HCLV和BVDV-1的三重荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的CSFV野毒株、HCLV以及BVDV-1完全区分开来,而不与其它猪源病毒发生非特异反应,在107-101拷贝/μL范围内,对CSFV、HCLV和BVDV标准品模板的检测具有良好的线性关系,最低检测限分别为4.5 TCID50（CSFV野毒）、7.8个拷贝（HCLV）或3.2 TCID50（BVDV-1）。用本方法与实验室建立的RT-nPCR、鉴别猪瘟野毒和弱毒的荧光定量RT-PCR和检测BVDV-1的RT-PCR方法分别对176份临床样品72份HCLV疫苗进行检测,符合率均达到了97.0%以上。本方法可以同时定量检测和区分三种病毒,用于现地疑似猪瘟病料、商品化牛血清的检测,同时还可以对猪瘟疫苗的质量进行监控。
贾怀杰[10]（2009）在《猪繁殖障碍性疫病流行毒株的分离、鉴定及其多重PCR诊断方法的建立》文中进行了进一步梳理猪繁殖障碍性疫病是近年来养猪生产实践中最为普遍和突出的问题,已给我国养猪业带来了巨大的危害和损失。其中猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、圆环病毒和伪狂犬病毒等在临床上多引起猪的繁殖障碍性疫病,且常呈混合或继发感染。本研究采集临床疑似猪繁殖障碍性疫病病料,在初步分析和鉴别诊断的基础上,对繁殖障碍性疫病流行病毒株的分离和鉴定,克隆并分析其重要功能基因,为研制新型疫苗奠定基础;并建立适于临床应用的快速诊断方法,为猪病防控提供有效的技术手段。主要研究如下:1、采集江西省某猪场疑似猪繁殖障碍性疫病病料,经RT-PCR检测为猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）阳性,病料处理后接种Marc-145细胞盲传,传至第6代时出现明显的细胞病变,RT-PCR检测为阳性,继续传代增殖,扩增、克隆和分析其基因代表序列,测定病毒感染细胞和靶动物的能力,电镜观察病毒粒子形态。结果测定PRRSV的感染滴度为108.02/mL TCID50;感染实验仔猪可复制到猪蓝耳病典型的临床症状和病理变化;电镜观察可见约20nm的典型的PRRS病毒粒子,表明已成功地分离到一株美洲型PRRSV流行株（命名为JX0708株）。随后利用RT-PCR分段扩增法,从分离株中分别扩增PRRSV Nsp2非结构蛋白、ORF2～ORF7结构蛋白全基因,其中Nsp2非结构蛋白长3496bp,结构蛋白全基因长3176bp。NSP2非结构蛋白氨基酸序列分析发现,该毒株与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株的同源性高达99.4%（JX143株,EU708726）,与美洲型代表株VR-2332相比缺失了30个氨基酸,这表明该毒株为变异的美洲型PRRSV毒株。结构蛋白基因遗传演化关系分析进一步证实该毒株的变异存在某种地域上的相关性,但每个基因的变异,并不严格遵从地域上的相关性。2、采集甘肃兰州某猪场疑似猪瘟病料,处理后接种PK-15细胞盲传,经RT-PCR检测为猪瘟病毒（CFSV）E2基因阳性,继续传代增殖,测定病毒感染细胞和动物的能力,电镜观察病毒粒子形态。电镜观察可见约25nm的典型的CSF病毒粒子。细胞毒接种于家兔无体温变化,接种30日龄仔猪可复制到猪瘟典型的临床症状和病理变化,证实已分离到猪瘟强野毒株CSFV GSLZ株。已CSFV GSLZ株分离毒为材料,采用RT-PCR技术扩增到了其E2全基因,长度为1111bp,与标准参考毒株及其国内外分离株同源性比较,发现与其有较高的同源性。与中国C株的氨基酸序列及其抗原表位比较,发现在主要抗原区发生了变异。3、利用PCR技术从断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）疑似病料中,扩增、克隆和分析了两株PCV2全基因组,全长均为1767bp,同源性和结构特性分析显示两种毒株的变异主要发生在ORF2区段,ORF1区段相对较保守。遗传演化关系分析显示,本试验克隆的2株PCV2皆属于欧洲型毒株,2株病毒全基因组序列同源性为95.8%,分别命名为PCV2 GSLZ（登录号为FJ447482）和GSBY毒株,这对PCV2的分子流行病学调查以及预防控制提供了理论依据。4、本研究在建立CSFV、PCV2、PRRSV和PRV单项PCR诊断方法的基础上,成功建立了同时检测CSFV、PCV2、PRRSV和PRV的多重PCR诊断方法,并对30份临床样品检测,证明该方法具有很好的特异性、敏感性和重复性,这为上述几种繁殖障碍性疫病的早期诊断和鉴别诊断提供了一种快速、敏感、特异的诊断方法,也为其病原的分离、分子流行病学调查以及免疫预防控制提供了理论依据。
二、猪瘟病毒新疆南疆野毒株E_2基因高变区扩增及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪瘟病毒新疆南疆野毒株E_2基因高变区扩增及序列分析（论文提纲范文）
（1）规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猪瘟的研究概况 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 病原学 |
| 1.1.3 猪瘟流行病学和临床症状 |
| 1.1.4 诊断方法 |
| 1.2 伪狂犬的研究概况 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 病原学 |
| 1.2.3 伪狂犬流行病学和临床症状 |
| 1.2.4 诊断方法 |
| 1.3 猪繁殖与呼吸综合征的研究概况 |
| 1.3.1 概述 |
| 1.3.2 病原学 |
| 1.3.3 猪繁殖与呼吸综合征流行病学和临床症状 |
| 1.3.4 诊断方法 |
| 1.4 口蹄疫病的研究研究概况 |
| 1.4.1 概述 |
| 1.4.2 病原学 |
| 1.4.3 口蹄疫病流行病学和临床症状 |
| 1.4.4 诊断方法 |
| 1.5 圆环病毒2 型的研究概况 |
| 1.5.1 概述 |
| 1.5.2 病原学 |
| 1.5.3 圆环病毒2型病流行病学和临床症状 |
| 1.5.4 诊断方法 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 3 个规模化母猪场5 种疫病抗体检测与分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品来源 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 样品处理 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 猪瘟病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.2 伪狂犬病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.4 口蹄疫病毒抗体ELISA检测 |
| 2.2.5 圆环病毒2 型抗体ELISA检测 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 规模母猪场猪瘟病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.2 规模母猪场伪狂犬病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.3 规模母猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.4 规模母猪场口蹄疫病毒抗体ELISA检测 |
| 2.3.5 规模母猪场圆环病毒2 型抗体ELISA检测 |
| 2.4 讨论与分析 |
| 2.4.1 猪瘟病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.2 伪狂犬病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.4 口蹄疫病毒抗体ELISA检测结果分析 |
| 2.4.5 圆环病毒2 型抗体ELISA检测结果分析 |
| 第三章 A规模化母猪场圆环病毒2 型抗原检测 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验样品来源及抽样原则 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 样品处理 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 圆环病毒2 型抗原ELISA检测 |
| 3.3 检测结果 |
| 3.4 讨论与分析 |
| 第四章 A规模化猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒基因型鉴定及分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 病料采集 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 引物设计与合成 |
| 4.1.5 样品处理 |
| 4.1.6 病毒核酸提取 |
| 4.1.7 PCR产物纯化回收、测序 |
| 4.1.8 序列分析 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 PCR扩增结果 |
| 4.2.2 基因核苷酸同源性分析 |
| 4.2.3 基因遗传进化树分析 |
| 4.3 .讨论 |
| 第五章 A规模化母猪场猪繁殖与呼吸综合征免疫程序调整试验 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 调整后母猪抗体检测结果 |
| 5.2.3 调整前后母猪抗体合格率对比 |
| 5.3 讨论与分析 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）辽宁地区PRRSV分型、分布及其区域化精准防制的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征研究进展 |
| 1.1.1 PRRS国内外流行历史及现状 |
| 1.1.2 病原学特性 |
| 1.1.3 流行病学特征 |
| 1.1.4 PRRSV分子生物学研究进展 |
| 1.1.5 PRRSV免疫学研究进展 |
| 1.1.6 PRRS诊断方法研究进展 |
| 1.1.7 PRRS的综合防制 |
| 1.2 研究的目的和意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试病毒样品 |
| 2.1.2 疫苗 |
| 2.1.3 主要生物制剂和化学试剂 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品的来源、采集及前处理 |
| 2.2.2 PRRSV分型检测方法的建立 |
| 2.2.3 猪群PRRS临诊发病情况调查 |
| 2.2.4 猪主要组织器官中病原核酸检测 |
| 2.2.5 目的基因序列扩增与分析 |
| 2.2.6 PRRSV疫苗免疫后抗体检测 |
| 2.2.7 PRRS精准免疫防制措施的实施及效果评估 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PRRSV分型检测方法的建立 |
| 3.1.1 RT-PCR体系及反应条件优化 |
| 3.1.2 特异性试验 |
| 3.1.3 敏感性试验 |
| 3.1.4 重复性试验 |
| 3.1.5 PRRSV分型检测方法与其他检测方法相符率的比较 |
| 3.2 猪群PRRS临诊发病情况 |
| 3.3 猪群病原核酸检测 |
| 3.3.1 假定健康猪群HP-PRRSV核酸检测 |
| 3.3.2 疑似感染PRRSV分型检测 |
| 3.3.3 PRRSV与 CSFV、PRV和 PCV2混合感染情况 |
| 3.4 PRRSV及其他主要病毒性疫病部分基因扩增与序列分析 |
| 3.4.1 PRRSV ORF5和NSP2基因的扩增 |
| 3.4.2 PRRSV目的基因序列分析 |
| 3.4.3 CSFV、PRV主要致病基因和PCV2基因的扩增及序列分析 |
| 3.5 PRRSV疫苗免疫后抗体检测 |
| 3.5.1 猪场PRRSV抗体检测 |
| 3.5.2 PRRSV抗体动态检测 |
| 3.6 PRRS精准免疫防制措施的实施及效果评估 |
| 3.6.1 免疫程序 |
| 3.6.2 PRRS精准免疫防制措施实施猪场一 |
| 3.6.3 PRRS精准免疫防制措施实施猪场二 |
| 3.6.4 各场抗体水平比较 |
| 3.6.5 辽宁地区 PRRS 精准免疫防制措施实施前后效果评估 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PRRSV分型检测方法的建立 |
| 4.2 PRRS发病情况和病原体核酸检测及分析 |
| 4.2.1 部分猪场PRRS临诊发病情况及分析 |
| 4.2.2 猪群病原检测及分析 |
| 4.2.3 PRRSV及其他主要病毒性疫病分子演化分析 |
| 4.3 PRRSV疫苗免疫后抗体检测及分析 |
| 4.4 PRRS精准免疫防制措施的实施效果及分析 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）ASFV、PRRSV、CSFV和PRV一步法多重荧光定量RT-PCR方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 四种病原及检测方法概述 |
| 1 四种重要猪疫病概述 |
| 1.1 非洲猪瘟 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸综合征 |
| 1.3 猪瘟 |
| 1.4 猪伪狂犬病 |
| 2 四种重要猪疫病在我国流行现状 |
| 3 四种重要猪疫病病原分子特征及遗传变异 |
| 3.1 ASFV基因组及遗传变异 |
| 3.2 PRRSV基因组及遗传变异 |
| 3.3 CSFV基因组及遗传变异 |
| 3.4 PRV基因组及遗传变异 |
| 4 四种猪重要疫病病原的检测方法研究进展 |
| 4.1 病原分离培养法 |
| 4.2 酶联免疫吸附试验 |
| 4.3 免疫层析技术 |
| 4.4 反转录聚合酶链式反应 |
| 4.5 实时荧光定量PCR |
| 4.6 环介导等温扩增技术 |
| 4.7 新型检测方法在ASFV、CSFV、PRRSV和 PRV检测中的应用 |
| 5 研究目的及意义 |
| 第2章 ASFV、PRRSV、CSFV和 PRV一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 菌毒株及临床样本来源 |
| 1.2 主要试剂及仪器设备 |
| 1.3 引物及探针的设计与合成 |
| 1.4 核酸提取 |
| 1.5 质粒标准品的构建 |
| 1.6 反应条件的优化 |
| 1.7 标准曲线的建立 |
| 1.8 特异性试验 |
| 1.9 敏感性试验 |
| 1.10 重复性试验 |
| 1.11 与商品化检测试剂盒比较检测符合率 |
| 2 结果 |
| 2.1 质粒标准品的构建结果 |
| 2.2 反应条件的优化结果 |
| 2.3 标准曲线的建立结果 |
| 2.4 特异性试验结果 |
| 2.5 敏感性试验结果 |
| 2.6 稳定性试验结果 |
| 2.7 符合率的比较结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第3章 2020~2021 年四川地区猪重要疫病的流行病学调查及部分流行株遗传变异分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 样本来源 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 PRV主要基因引物合成 |
| 1.4 核酸的提取 |
| 1.5 临床样本的检测 |
| 1.6 PRV gB、gC、gD和 gE基因序列扩增 |
| 1.7 PRV gB、gC、gD和 gE基因克隆、测序和分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床样本检测结果 |
| 2.2 主要毒力基因的扩增 |
| 2.3 四个主要毒力基因同源性分析 |
| 2.4 四个主要毒力基因的氨基酸变异分析 |
| 2.5 gB基因、gC基因和gE蛋白的遗传进化分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）猪瘟病毒C株重组标记疫苗候选株免疫原性与鉴别检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 猪瘟病毒与猪瘟研究进展 |
| 第一节 猪瘟病毒研究进展 |
| 1. 猪瘟病毒基因组及编码蛋白的功能 |
| 2. 影响猪瘟病毒毒力相关蛋白及其变异 |
| 3. 猪瘟病毒的复制周期 |
| 4. 猪瘟病毒的致病机制 |
| 5. 反向遗传系统在猪瘟病毒研究中的应用 |
| 第二节 猪瘟的免疫预防 |
| 1. 猪瘟的流行 |
| 2. 猪瘟病毒的变异趋势 |
| 3. 猪瘟兔化弱毒疫苗 |
| 4. 猪瘟标记疫苗 |
| 本研究目的及意义 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第二章 猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备与表位鉴定 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 细胞与病毒 |
| 1.2. 菌株与载体 |
| 1.3. 试剂与主要仪器 |
| 1.4. CSFV E2蛋白的原核表达与纯化 |
| 1.5. CSFV E2蛋白的真核表达与纯化 |
| 1.6. 融合蛋白免疫反应性分析 |
| 1.7. 病毒的体外培养 |
| 1.8. 间接免疫荧光(IFA) |
| 1.9. 抗体中和活性检测 |
| 1.10. 质粒抽提 |
| 1.11. E2单点突变重组质粒的构建 |
| 1.12. 重组表达质粒转染 |
| 1.13. 单克隆抗体制备 |
| 1.14. 单克隆抗体反应性鉴定 |
| 1.15. 重组病毒拯救 |
| 2. 结果 |
| 2.1. CSFV E2蛋白不同抗原区域原核蛋白鉴定 |
| 2.2. 猪瘟病毒E2单克隆抗体的制备及反应性鉴定 |
| 2.3. 单克隆抗体识别抗原区的鉴定 |
| 2.4. 单克隆抗体识别关键氨基酸的鉴定 |
| 2.5. 单克隆抗体中和活性的检测 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 携带流行毒株E2的嵌合重组C株病毒鉴定与免疫原性 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 细胞与病毒 |
| 1.2. 菌株与载体 |
| 1.3. 试剂与仪器 |
| 1.4. 实验动物及分组 |
| 1.5. 嵌合重组病毒全长cDNA的构建 |
| 1.6. 毒价测定 |
| 1.7. 病毒体外生长曲线测定 |
| 1.8. 荧光定量PCR测定病毒基因组拷贝数 |
| 1.9. 猪瘟病毒攻毒保护试验 |
| 2. 结果 |
| 2.1. 猪瘟病毒流行毒株E2高变区1变异特征 |
| 2.2. 嵌合重组病毒全长cDNA的拯救与鉴定 |
| 2.3. 嵌合重组病毒与单克隆抗体反应性鉴定 |
| 2.4. 嵌合重组病毒体外生长特性 |
| 2.5. 嵌合重组病毒免疫动物的体温变化 |
| 2.6. 重组病毒免疫动物病毒血症检测 |
| 2.7. 重组病毒免疫动物抗体生成曲线 |
| 2.8. 重组病毒免疫动物中和抗体差异比较 |
| 2.9. 免疫动物抵御猪瘟病毒攻毒 |
| 3. 讨论 |
| 第四章 Erns核心抗原区氨基酸变异对猪瘟病毒复制的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 细胞与病毒 |
| 1.2. 菌株与载体 |
| 1.3. 试剂与仪器 |
| 1.4. Erns抗原区预测 |
| 1.5. 间接ELISA |
| 1.6. 定点突变PCR改造全长cDNA质粒 |
| 1.7. 重组病毒的构建及拯救 |
| 2. 结果 |
| 2.1. 猪瘟病毒C株Erns蛋白B细胞抗原表位预测 |
| 2.2. Erns核心抗原区连续缺失重组蛋白的表达纯化 |
| 2.3. Erns核心抗原区连续缺失重组蛋白反应性鉴定 |
| 2.4. 猪瘟病毒C株Erns核心抗原区突变对病毒复制的影响 |
| 2.5. 猪瘟病毒SM株Erns核心抗原区突变对病毒复制的影响 |
| 2.6. 猪瘟病毒SM株Erns核心抗原区置换Flag和HA标签对病毒复制的影响 |
| 2.7. 嵌合病毒Erns核心抗原区突变对病毒复制的影响 |
| 2.8. Erns核心抗原区多点连续缺失对嵌合重组病毒复制的影响 |
| 2.9. Erns核心抗原区多点连续缺失嵌合重组病毒不诱导兔体反应 |
| 3. 讨论 |
| 第五章 携带牛病毒性腹泻病毒Erns基因重组猪瘟病毒C株的拯救与鉴定 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1. 细胞与病毒 |
| 1.2. 菌株与载体 |
| 1.3. 试剂与仪器 |
| 1.4. BVDV病毒的分离与鉴定 |
| 1.5. 嵌合重组病毒全长cDNA的构建 |
| 1.6. 嵌合重组病毒的拯救 |
| 1.7. 嵌合重组病毒的鉴定 |
| 1.8. BVDV Erns蛋白表达与纯化 |
| 2. 结果 |
| 2.1. BVDV分离株的鉴定 |
| 2.2. BVDV Erns基因进化分析 |
| 2.3. 嵌合重组病毒全长cDNA的拯救与鉴定 |
| 2.4. 嵌合重组病毒Erns遗传稳定性 |
| 2.5. 嵌合重组病毒体外生长特性 |
| 2.6. 嵌合重组病毒的兔体反应性 |
| 2.7. 嵌合重组病毒免疫原性 |
| 2.8. BVDV Erns蛋白纯化 |
| 2.9. BVDV Erns蛋白反应性鉴定 |
| 2.10. 针对Erns单克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 结论与展望 |
| 创新性 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（5）牛病毒性腹泻病毒新疆流行株的分离鉴定及E2基因遗传变异研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 新疆北疆部分地区 BVDV 分子流行病学调查研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 BVDV RT-PCR 检测 |
| 2.2 BVDV 检测结果 |
| 2.3 重组菌液 PCR 的鉴定 |
| 2.4 序列测定结果及分析 |
| 2.5 系统进化分析 |
| 3 讨论 |
| 实验二 牛病毒性腹泻病毒 2 型新疆流行株的分离鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病料样品检测结果 |
| 2.3 BVD 分离毒株 E2 基因部分序列的克隆与测序 |
| 2.4 BVDV E2 基因系统进化分析 |
| 3 讨论 |
| 实验三 BVDV 新疆流行株 E2 基因的克隆与遗传变异分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 BVDV E2 基因扩增结果 |
| 2.2 BVDV E2 基因的重组质粒鉴定 |
| 2.3 BVDV E2 基因测序结果 |
| 2.4 BVDV E2 基因与其他参考株 E2 基因核苷酸序列同源性比较 |
| 2.5 BVDV E2 蛋白推导的氨基酸序列比较分析 |
| 2.6 BVDV E2 推导氨基酸序列同源性比较 |
| 2.7 BVDV E2 基因的遗传进化分析 |
| 2.8 BVDV E2 蛋白抗原表位预测分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（6）山东地区猪繁殖障碍相关疾病的分子流行病学调查及发病相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 猪瘟病毒 |
| 1.2 猪繁殖与呼吸系统综合征病毒 |
| 1.3 猪圆环病毒 |
| 1.4 猪伪狂犬病毒 |
| 试验一 鉴别CSFV、PRRSV、PCV2和PRV多重PCR检测方法的建立及应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株、细胞和临床样本 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物的设计 |
| 1.4 病毒模板的制备 |
| 1.5 单项PCR检测方法的建立 |
| 1.6 多重PCR检测方法的建立 |
| 1.7 临床应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 特异性试验 |
| 2.2 敏感性试验 |
| 2.3 重复性试验 |
| 2.4 猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗RT-PCR-RFLP鉴别检测方法的建立 |
| 2.5 CSFV RT-PCR-RFLP检测方法在实际样品中的应用 |
| 2.6 临床样本检测 |
| 3 讨论 |
| 试验二 山东地区猪繁殖障碍疾病相关病毒的流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 血清与病料 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 抗体和抗原的检测 |
| 1.4 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 抗体检测结果 |
| 2.2 抗原检测结果 |
| 2.3 PRRS、CSF、PCV2、PR混合感染分析 |
| 2.4 PRRS、CSF、PCV2、PR之间的相关性 |
| 3 讨论 |
| 试验三山东省CSFV、PRRSV和PCV2分离株部分基因序列分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 组织病料来源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 细胞、载体及菌株 |
| 1.4 引物设计 |
| 1.5 使用RT-PCR/PCR检测送检样品 |
| 1.6 产物的克隆及序列测定 |
| 1.7 测序结果分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 目的基因扩增、克隆及重组质粒酶切鉴定结果 |
| 2.2 CSFV E0基因序列分析 |
| 2.3 PRRSV NSP2和ORF5基因序列分析 |
| 2.4 PCV2全基因组的序列分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 CSFV E0基因序列分析 |
| 3.2 PRRSV NSP2和ORF5基因序列分析 |
| 3.3 PCV2全基因组的序列分析 |
| 全文结论 |
| 英文缩写词表 |
| 参考文献 |
| 导师组意见 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文和课题参与情况 |
（7）中国部分地区CSFV与PRRSV流行情况调查与PRRSV标记毒株的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第一章 猪高热病研究进展 |
| 1 流行概况 |
| 2 病原研究进展 |
| 2.1 病原多重感染所致 |
| 2.2 蓝耳病病毒变异株引起 |
| 2.3 与猪瘟及其继发感染有关 |
| 2.4 与猪流感病毒感染有关 |
| 2.5 与未知病毒感染有关 |
| 3 防控措施 |
| 3.1 加强管理,科学饲养 |
| 3.2 做好免疫接种工作 |
| 3.3 尽早确诊,及时控制 |
| 3.4 加强监督,防止扩散 |
| 3.5 加强消毒,净化环境 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒及疫苗研究进展 |
| 1 PRRSV的分子生物学 |
| 1.1 病毒的分类地位及理化特性 |
| 1.2 病毒基因组结构与病毒的复制 |
| 1.3 PRRSV在我国的流行及分子生物学特点 |
| 2 PRRSV的编码蛋白及其功能 |
| 2.1 病毒的非结构蛋白 |
| 2.2 病毒的结构蛋白 |
| 3 PRRSV疫苗研究进展 |
| 3.1 需要再检验的免疫学要素 |
| 3.2 基于反向遗传技术的PRRSV疫苗研究进展 |
| 3.3 新型PRRSV疫苗研发潜在策略和方法 |
| 参考文献 |
| 研究部分 |
| 第三章 中国部分地区猪痕病毒分子流行病学调查 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 临床样品 |
| 1.2 RNA提取,RT-套式PCR(RT-nPCR) |
| 1.3 E2基因的克隆与测序 |
| 1.4 进化分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猪瘟病料的采集、检测 |
| 2.2 E2基因序列的同源性分析 |
| 2.3 进化分析 |
| 2.4 氨基酸序列分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第四章 中国部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病料采集 |
| 1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 引物设计与合成 |
| 1.5 病毒RNA的提取与cDNA的合成 |
| 1.6 PCR扩增反应 |
| 1.7 目的基因的克隆、测序 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRRSV感染检测结果 |
| 2.2 ORF5基因的扩增和测序 |
| 2.3 ORF5基因的同源性分析 |
| 2.4 基于ORF5基因的进化分析 |
| 2.5 ORF5编码氨基酸的序列分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第五章 PRRSV中国流行株全基因组序列的测定与分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 毒株、细胞和菌种 |
| 1.2 主要试剂及试剂盒 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 引物的设计及合成 |
| 1.5 病毒RNA的提取 |
| 1.6 病毒cDNA的制备 |
| 1.7 基因组片段的PCR扩增 |
| 1.8 基因的克隆及序列测定 |
| 1.9 基因组cDNA全序列拼接与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PRRSV JS0922株全长基因各片段的RT-PCR扩增 |
| 2.2 PRRSV JS0922株各亚克隆片段的克隆 |
| 2.3 PRRSV JS0922株全长基因组序列的拼接及分析 |
| 2.4 PRRSV JS0922株基因组序列的分析比对 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第六章 猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白N蛋白N端非必需区的研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、细胞和抗体 |
| 1.2 主要试剂盒 |
| 1.3 主要生化试剂 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 连接产物或质粒的转化 |
| 1.6 质粒的抽提 |
| 1.7 胶回收 |
| 1.8 引物设计 |
| 1.9 突变体克隆的构建 |
| 1.10 突变体质粒转染细胞 |
| 1.11 间接免疫荧光检测 |
| 1.12 病毒传代及细胞上清盲传 |
| 1.13 病毒上清RNA的提取 |
| 1.14 细胞总RNA的提取 |
| 1.15 病毒基因组及亚基因组的RT-PCR检测 |
| 1.16 空斑形态与空斑纯化 |
| 1.17 多步生长曲线 |
| 2 结果 |
| 2.1 N蛋白N端缺失突变体的构建 |
| 2.2 N端缺失突变病毒的拯救 |
| 2.3 N端缺失突变病毒的遗传稳定性 |
| 2.4 缺失突变病毒的体外生长特性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第七章 猪繁殖与呼吸综合征结构蛋白N蛋白标记毒株的构建及初步免疫实验研究 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 质粒、抗体和细胞 |
| 1.2 突变体全长cDNA克隆的构建 |
| 1.3 转染和突变病毒的拯救 |
| 1.4 N蛋白和7APMa多肽的间接免疫荧光分析 |
| 1.5 生长动力学和空斑形态学分析 |
| 1.6 RT-PCR和核酸测序检测体外遗传稳定性 |
| 1.7 动物实验 |
| 1.8 体温变化及临床症状 |
| 1.9 qRT-PCR检测病毒血症 |
| 1.10 PP-RSV特异性抗体的检测 |
| 1.11 7APMa多肽特异性抗体的检测 |
| 1.12 中和抗体测定 |
| 1.13 细胞因子的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 v7APMa突变病毒的拯救 |
| 2.2 v7APMa标记毒株生长动力学和空斑形态学分析 |
| 2.3 v7APMa的体外遗传稳定性 |
| 2.4 猪体体温变化及临床表现 |
| 2.5 病毒血症检测 |
| 2.6 PRRSV特异性抗体检测 |
| 2.7 7APMa多肽特异性抗体的检测 |
| 2.8 中和抗体测定 |
| 2.9 细胞因子的测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第八章 猪繁殖与呼吸综合征病毒活载体疫苗候选株的构建及其病毒学特性的研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、细胞和细菌 |
| 1.2 抗体 |
| 1.3 主要生化试剂 |
| 1.4 主要实验仪器 |
| 1.5 引物合成 |
| 1.6 PCR产物回收 |
| 1.7 平末端DNA片段连接 |
| 1.8 转化 |
| 1.9 质粒小量提取 |
| 1.10 高浓度质粒提取 |
| 1.11 SOE-PCR扩增DNA片段 |
| 1.12 全长cDNA克隆的构建与鉴定 |
| 1.13 细胞转染 |
| 1.14 病毒上清RNA的提取及细胞总RNA的提取 |
| 1.15 间接免疫荧光检测 |
| 1.16 空斑形态分析 |
| 1.17 多步生长曲线 |
| 1.18 Northern blot分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 中间质粒的构建 |
| 2.2 全长cDNA克隆构建 |
| 2.3 病毒拯救结果 |
| 2.4 拯救病毒的鉴定 |
| 2.5 嵌合病毒的病毒学特性 |
| 2.6 嵌合病毒的亚基因组mRNA转录谱 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 硕博期间论文发表情况 |
（8）牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白E2与牛胚胎滋养层细胞相互作用的分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 牛病毒性腹泻病毒的分子生物学特征 |
| 第二章 牛病毒性腹泻病毒持续性感染机理 |
| 第三章 牛病毒性腹泻病毒受体的研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第四章 新疆部分地区牛病毒性腹泻病毒的分子流行病学调查及基因分型研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 牛病毒性腹泻病毒石河子株的分离及鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 牛胚胎滋养层巨细胞的体外分离培养及牛病毒性腹泻病毒石河子株感染实验 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 与牛病毒性腹泻病毒石河子株E2蛋白相互作用的牛滋养层细胞捕获蛋白的筛选与验证 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 导师评阅表 |
（9）同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1型的三重荧光定量RT-PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 引 言 |
| 1.1 瘟病毒概述 |
| 1.1.1 猪瘟及猪瘟病毒概述 |
| 1.1.2 猪瘟兔化弱毒疫苗概述 |
| 1.1.3 BVDV 概述 |
| 1.1.4 瘟病毒基因组结构及其功能 |
| 1.1.5 瘟病毒基因组编码的蛋白及其功能 |
| 1.1.6 猪瘟病毒的遗传分型 |
| 1.1.7 BVDV 的遗传分型 |
| 1.2 瘟病毒的诊断方法和研究现状 |
| 1.2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.2.2 血清学诊断 |
| 1.2.3 免疫学诊断 |
| 1.2.4 分子生物学诊断技术 |
| 1.2.5 鉴别检测技术 |
| 1.3 荧光定量 PCR |
| 1.3.1 荧光定量PCR 原理 |
| 1.3.2 荧光定量PCR 的定量形式 |
| 1.3.3 荧光定量PCR 的分类 |
| 1.3.4 多重荧光定量 PCR 及其在病毒研究上的应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1 型的三重荧光定量 RT-PCR 方法的建立 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 主要实验仪器及试剂 |
| 2.1.3 引物和探针 |
| 2.1.4 病毒RNA 的提取和反转录 |
| 2.1.5 三重荧光定量RT-PCR 阳性标准品的制备 |
| 2.1.6 三重荧光定量RT-PCR 反应条件的优化 |
| 2.1.7 特异性试验 |
| 2.1.8 敏感性试验 |
| 2.1.9 重复性试验 |
| 2.1.10 三重荧光定量RT-PCR 与其它方法的符合率试验 |
| 2.1.11 病毒分离的验证 |
| 2.1.12 三重荧光定量 RT-PCR 对现地样品的检测和种系发生分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 三重荧光定量RT-PCR 标准曲线的建立 |
| 2.2.2 三重荧光定量RT-PCR 的特异性 |
| 2.2.3 三重荧光定量RT-PCR 的敏感性 |
| 2.2.4 三重荧光定量RT-PCR 的重复性 |
| 2.2.5 病毒分离的验证结果 |
| 2.2.6 三重荧光定量RT-PCR 与其它方法的符合率 |
| 2.2.7 种系发生分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（10）猪繁殖障碍性疫病流行毒株的分离、鉴定及其多重PCR诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩写词英汉对照(Abbreviation) |
| 第一章 绪论 |
| 一 猪繁殖与呼吸综合征病毒研究进展 |
| 1. 病原学研究 |
| 2 PRRSV 的分子生物学研究 |
| 3 PRRS 病毒的遗传变异 |
| 4. 诊断技术研究 |
| 二 猪瘟病毒研究进展 |
| 1 病原学研究 |
| 2 分子生物学研究 |
| 3. CSF 的诊断技术研究 |
| 三 猪圆环病毒2 型分子生物学及诊断技术研究进展 |
| 1. 分子生物学研究 |
| 2.PCV2 诊断研究进展 |
| 四 猪伪狂犬病毒分子生物学及诊断技术研究进展 |
| 1. 猪伪狂犬病毒分子生物学研究进展 |
| 2. PRV 诊断技术 |
| 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒江西流行株的分离鉴定及结构蛋白基因的克隆. |
| 一、猪繁殖与呼吸综合征病毒江西流行株的分离鉴定 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 二、猪繁殖与呼吸综合征病毒江西流行株结构蛋白基因的克隆及其序列分析. |
| 1. 材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 猪瘟兰州野毒株的分离鉴定及其 E2 基因的克隆 |
| 一 猪瘟兰州野毒株的分离和鉴定 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 二 猪瘟病毒兰州分离株E2 全基因克隆及其遗传变异分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 2 株猪圆环病毒2 型流行株全基因组的克隆及序列分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 试验方法 |
| 3. 结果与分析 |
| 4. 讨论 |
| 第五章 CSFV、PCV2、PRRSV、PRV 多重PCR 诊断方法的建立 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简历 |
四、猪瘟病毒新疆南疆野毒株E_2基因高变区扩增及序列分析（论文参考文献）
- [1]规模化母猪场五种疫病血清学监测及部分病原鉴定、免疫程序调整[D]. 宋健颖. 塔里木大学, 2021(08)
- [2]辽宁地区PRRSV分型、分布及其区域化精准防制的应用[D]. 关淼. 东北农业大学, 2021
- [3]ASFV、PRRSV、CSFV和PRV一步法多重荧光定量RT-PCR方法的建立及应用[D]. 向萌. 西南民族大学, 2021
- [4]猪瘟病毒C株重组标记疫苗候选株免疫原性与鉴别检测[D]. 廖迅. 浙江大学, 2016(02)
- [5]牛病毒性腹泻病毒新疆流行株的分离鉴定及E2基因遗传变异研究[D]. 王国超. 石河子大学, 2014(03)
- [6]山东地区猪繁殖障碍相关疾病的分子流行病学调查及发病相关性研究[D]. 胡继明. 青岛农业大学, 2012(07)
- [7]中国部分地区CSFV与PRRSV流行情况调查与PRRSV标记毒株的研究[D]. 蔺涛. 南京农业大学, 2012(12)
- [8]牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白E2与牛胚胎滋养层细胞相互作用的分子机制研究[D]. 任艳. 石河子大学, 2010(01)
- [9]同时检测和区分猪瘟野毒株和兔化弱毒疫苗株及牛病毒性腹泻病毒1型的三重荧光定量RT-PCR方法的建立[D]. 张兴娟. 扬州大学, 2010(02)
- [10]猪繁殖障碍性疫病流行毒株的分离、鉴定及其多重PCR诊断方法的建立[D]. 贾怀杰. 甘肃农业大学, 2009(06)