一、癫痫与离子通道的分子遗传学研究进展（论文文献综述）
康庆云,廖红梅,杨赛,廖彩时,方红军,杨理明[1]（2021）在《离子通道基因突变相关儿童癫痫性脑病33例临床特征和基因突变分析》文中研究表明目的:探讨离子通道基因突变相关儿童癫痫性脑病的基因突变特点和临床特征,为精准治疗及遗传咨询提供依据。方法:应用靶向捕获二代测序方法,对2016年7月至2020年1月在湖南省儿童医院神经内科就诊的儿童癫痫脑病患儿进行基因变异分析,并应用Sanger测序对变异及来源进行验证。收集分析经基因检测确诊为离子通道基因突变相关儿童癫痫性脑病患儿33例的临床资料,对其临床特征及基因突变进行分析归纳总结。结果:33例离子通道基因突变相关癫痫脑病患儿中,遗传性基因突变4例,新生基因突变29例。其中,SCN1A基因突变14例,KCNQ2基因突变5例,SCN2A基因突变5例,KCNT1基因突变4例,GABRB3基因突变2例,KCNB1基因突变、SCN8A基因突变、CACNA1A基因突变各1例。临床诊断为Dravet综合征14例,婴儿癫痫伴游走性局灶性发作4例,大田原综合征4例,婴儿痉挛症2例,非特异性癫痫性脑病9例。33例均给予多种抗癫痫药物治疗（其中6例联合生酮饮食）。随访3～43个月,癫痫发作未控制17例,癫痫发作部分控制10例,癫痫发作控制6例;患儿均有智力及运动发育落后。结论:离子通道基因突变是儿童癫痫性脑病常见的遗传性病因,离子通道基因突变可引起不同表型癫痫脑病,基因检测可协助病因诊断,并为精准治疗提供参考。
何娟,戴园园[2]（2021）在《钠离子通道相关基因突变致儿童癫痫17例的临床特征及致病基因谱》文中研究表明目的探讨钠离子通道相关基因突变致儿童癫痫的临床特征及致病基因谱。方法收集2017年6月至2019年10月徐州医科大学附属医院靶向捕获二代测序发现钠离子通道相关基因可疑致病性突变,并经Sanger测序验证基因突变来源的儿童癫痫17例,进行回顾性总结和分析。结果共检测到5种不同类型突变,其中SCN1A 8例（47.06%）,SCN2A 5例（29.41%）,SCN1B 1例（5.88%）,SCN8A 1例（5.88%）,SCN9A 2例（11.77%）;涉及多种突变类型,其中错义突变14例（82.36%）,非编码区突变1例（5.88%）,剪接位点突变1例（5.88%）,移码突变1例（5.88%）;3种已报道的致病突变,14种新发现的突变;9例携带遗传性突变,8例新生突变;涉及多种癫痫综合征,对药物的反应也不同。结论癫痫的发生与编码电压门控钠离子通道的基因突变密切相关,轻者表型如热性惊厥,预后较好,重者表型如Dravet综合征等癫痫性脑病可导致病儿死亡。钠离子通道基因突变以SCN1A基因突变多见,突变类型以错义突变为主。
丁健[3]（2021）在《GEFS+的致病基因验证和海马MRS变化与智力水平研究》文中认为遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（Genetic epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+）是以家系为整体做出诊断的癫痫综合征。目前研究表明,GEFS+表现为常染色体显性遗传的特性。迄今为止,虽然有数量不少的GEFS+家系被研究报道,但是在这些被报道的家系中存在基因突变的家系比例不到20%。GEFS+的致病基因及发病机制并未得到阐明。本研究前期对收集到的GEFS+家系成员进行了致病基因的筛查,在一个家系发现存在着编码钾离子通道β亚基的KCNAB3基因的杂合错义突变c.773A>G（p.H258R）,该基因的位点突变既往在GEFS+家系中未见报道,基因致病性的评估表明突变对蛋白功能的影响为可能致病。我们推测KCNAB3基因可能是中国人群GEFS+的新的致病基因。本研究拟对KCNAB3基因的突变进行细胞功能学的验证,并应用磁共振波谱（Magnetic resonance spectroscopy,MRS）对GEFS+患儿海马进行功能检测以及应用韦氏智力评估工具对患儿进行智力评估。探讨GEFS+的发病机制并了解GEFS+患儿海马及认知功能是否受影响,为GEFS+的病因、预后等研究提供新的理论依据。研究对象和方法对象:收集2016年01月～2019年12月诊断为GEFS+的家系30个。方法:对KCNAB3基因的杂合错义突变c.773A>G（p.H258R）位点构建慢病毒载体质粒,使用293Ta细胞进行慢病毒包装,将重组慢病毒质粒感染人类胚胎肾细胞293（HEK293）,使用全细胞膜片钳技术进行细胞功能学验证。对30个GEFS+家系先证者患儿进行海马1H-MRS波谱值以及智商检测,与对照组比较。结果1.转染野生型KCNA1重组慢病毒质粒HEK293细胞的钾离子电流是不失活的电流。转染野生型KCNA1+野生型KCNAB3重组慢病毒质粒HEK293细胞的钾离子电流出现失活特性。转染野生型KCNA1+突变型KCNAB3重组慢病毒质粒HEK293细胞的钾离子电流失活特性更明显。2.野生型KCNA1组电流密度为 59.674±45.053 pA/pF（n=12）,野生型 KCNA1+野生型KCNAB3组电流密度为35.485±28.695pA/pF（n=11）,野生型KCNA1+突变型KCNAB3组电流密度为22.607±19.473 pA/pF（n=11）,三组比较差异有统计学意义（P<0.05）。3.GEFS+患儿与对照组双侧海马NAA/Cr、Cho/Cr、NAA/（Cho+Cr）数值比较,差异无显着统计学意义。4.GEFS+患儿与对照组智力等级分布比较无显着差异性（P>0.05）。5.GEFS+患儿的言语智商（VIQ）及总智商（FIQ）均低于对照组,存在显着性差异（P<0.05）。操作智商（PIQ）低于对照组,但两者之间无显着性差异（P>0.05）。结论1.KCNAB3基因突变可以加速钾离子通道失活、抑制钾离子电流,提示突变可能提高神经元兴奋性,促进癫痫或惊厥的发作。2.KCNAB3基因可能是中国人群GEFS+新的致病基因。3.本研究中GEFS+患儿的海马MRS改变不明显。4.本研究中GEFS+患儿的言语智商（VIQ）及总智商（FIQ）低于正常儿童,而智力等级分布及操作智商（PIQ）与正常儿童之间无差异。
赵腾[4]（2021）在《NMDA受体亚基GluN2A/GRIN2A功能丧失型基因突变所致癫痫的发病机制及精准药物干预研究》文中提出研究背景:N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体（NR）是脑内兴奋性神经递质-谷氨酸的主要受体。其作为一种配体门控型的离子通道,在突触内主要参与介导兴奋性突触后电流（EPSC）的产生及传递,在突触外还可参与γ-氨基丁酸（GABA）能中间神经元突触前GABA释放,进而影响抑制性突触后电流（IPSC）的产生。而构成神经元网络的兴奋性突触信号和抑制性突触信号的失衡是形成癫痫的重要原因。因此,NR应该是影响神经元网络兴奋/抑制平衡的关键因素。通过一些临床病例及细胞水平受体功能分析证实,NR功能增强型（Go F）基因突变和功能丧失型（Lo F）基因突变均可导致癫痫。而作为NR的亚基之一,GluN2A/GRIN2A突变的患者中78%表现为癫痫,是目前NR基因变异相关癫痫研究的重点。目前,Lo F型NR基因突变所致癫痫的发病机制尚不明确,在转基因动物水平进行在体、离体电生理及行为学研究,进而明确该型基因突变致病的特点和机制意义重大。另外,一些变构调节剂可以逆转部分基因变异所致的NR功能异常。通过细胞水平筛选并在动物水平干预,可能筛选出对Lo F型NR较为有效的正向变构调节剂（positive allosteric modulator s,PAMs）,从而为临床精准化治疗提供重要理论和实践支持。研究方法:本课题以临床报道及细胞水平受体功能分析证实较为典型的Lo F型突变GluN2A/GRIN2A-V685G为研究位点。首先利用非洲爪蟾卵母细胞在细胞水平进行NR功能验证,并根据文献资料选择了孕烯醇酮硫酸酯（PS）、24（S）羟基胆固醇（24（S）-HC）、妥布霉素、花生四烯酸、D-丝氨酸、精胺以及谷氨酸、甘氨酸做为备选药物在细胞水平进行敏感药物筛选,选出1-2种最为敏感的药物作为干预药物。利用胚胎显微注射法制备GluN2A/GRIN2A-V685G转基因小鼠,而后将小鼠分为空白组（WT）、功能丧失型突变组（Lo F）、空白治疗组（WT+drug）、突变治疗组（Lo F+drug）。在行为学方面,观察各组小鼠自发癫痫发作的情况,进行癫痫等级评分。若无自发癫痫的表型,则在各组建立高热癫痫模型,评估癫痫发作的阈值（发作潜伏期）。应用新颖物体识别实验（NOR）以及新颖物体位置识别（NOL）实验评估各组小鼠的认知状况;应用悬尾实验、糖水偏好实验和强迫游泳实验评估各组小鼠的抑郁行为状况。在体检测各组小鼠皮层脑电图异常放电水平,并将各组小鼠断头取脑,应用膜片钳技术检测海马CA1区锥体神经元突触后膜NR所介导的电流（EPSC）以及GABA能中间神经元所介导的m IPSC水平,同时检测全锥体神经元动作电位的变化。最后利用Real-time PCR和Western blot技术检测GluN2A亚基的表达情况。研究结果:本课题利用非洲爪蟾卵母细胞在细胞水平进行了NR功能验证,结果显示转染GRIN2A-V685G突变c DNA的蛙卵表面NR电流较对照组明显下降,功能基本丧失。将备选药物应用到转染细胞,结果显示24（S）-HC可以部分逆转该突变的NR功能。结合相关文献,最终选择可以增加脑内及血清24（S）-HC水平且已经临床应用于抗HIV治疗的依法韦仑（efavirenz,EFV）作为干预药物。而后将动物分为了WT组、Lo F组、WT+EFV组、Lo F+EFV组。行为学评价显示,各组小鼠均未出现自发性癫痫发作,在建立高热惊厥模型后,Lo F组小鼠癫痫发作潜伏期较短,而Lo F+EFV组癫痫发作潜伏期则较Lo F组明显延长,各组小鼠的发作强度和发作时持续时间无明显差异。在认知功能评价中,各组在新颖物体识别实验（NOR）中无明显差异,在新颖物体位置识别实验（NOL）中,Lo F组与WT组差异也无显着性,但观察趋势可见Lo F组小鼠较WT组识别指数稍有降低。而Lo F+EFV组的NOL识别指数较Lo F组明显增高,差异有显着性,可见Lo F小鼠可能存在空间记忆能力减退,而EFV可以逆转这种趋势。在抑郁行为评估中,各组小鼠均未发现明显差异,且Lo F组和Lo F+EFV组小鼠在悬尾不动实验中不动时间反而更短。在体电生理学检测显示Lo F组小鼠的皮层脑电图出现癫痫样放电（seizure-like events,SLEs）的频率明显增加,而Lo F+EFV组则较少出现SLEs,说明EFV可以部分抑制突变小鼠的脑内异常放电。随后利用膜片钳进行突触内NR电流（EPSC）水平检测显示Lo F组电流幅度和最大电流面积均明显降低,Lo F+EFV组则较Lo F组明显升高,差异均有显着性。m IPSC水平检测显示各组电流的振幅峰值（peak amplititude）检测中未发现明显差异,但在电流发放频率（event frequency）检测中,Lo F组较WT组明显下降,而Lo F+EFV组则无下降。随后进行全细胞动作电位检测显示与WT组相比,Lo F组小鼠海马CA1区锥体细胞动作电位阈值有所下降,动作电位幅度值增加,动作电位输入电阻增加,相同电流刺激下动作电位根数明显增加,差异有显着性。而Lo F+EFV组较Lo F组在动作电位上述指标中有逆转的趋势,但差异无显着性。而后进行的Real-time PCR和Western blot检测显示各组在GluN2A表达中无明显差异。研究结论:（1）GRIN2A-V685G突变可使GluN2A亚基配体结合结构域（ABD）功能障碍,致谷氨酸效力丧失,进而导致NMDA受体功能障碍。（2）GluN2A/GRIN2AV685G转基因小鼠海马CA1区锥体神经元突触内NR介导的EPSC降低,而由突触外NMDAR参与的GABA能中间神经元所介导的m IPSC也下降。使神经元网络的兴奋/抑制平衡失调,最终导致锥体神经元兴奋性增高。（3）GluN2A/GRIN2A-V685G转基因小鼠容易出现癫痫发作,其皮层脑电图可见异常放电增多。（4）抗HIV药依法韦仑（EFV）可以通过增加脑内24（S）羟基胆固醇水平来部分恢复GluN2A/GRIN2A-V685G突变所致的NMDAR功能丧失,减少皮层的异常放电,抑制转基因小鼠的癫痫发作。
郑芳[5]（2021）在《儿童睡眠中癫痫性电持续状态的分子遗传学研究进展》文中进行了进一步梳理儿童睡眠中癫痫性电持续状态（electrical status epilepticus during sleep,ESES）是一种特殊的脑电图,涉及多种癫痫综合征,可导致不同程度的运动、认知、行为、语言退化。目前病因尚未明确,文献报道已发现8个致病基因与ESES发病有关,分别为GRIN2A、CNKSR2、SCN2A、KCNA2、KCNQ2、KCNB1、SLC6A1和WAC基因,现阐述近年来该病的分子遗传学研究进展。
李信晓[6]（2021）在《GABRG2突变导致遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（GEFS+）的分子遗传学特征及机制研究》文中研究指明第一部分构建GABRG2敲除细胞系及探讨温度对相关蛋白的影响目的运用CRISPR/Cas9基因编辑工具在小鼠海马神经元细胞系（HT22）中构建GABRG2基因敲除的体外细胞模型,并采用RNA-seq分析细胞基因的表观遗传特征,探讨在不同温度条件下对其他蛋白表达的影响。方法（1）在NCBI-gene中查找GABRG2基因的DNA序列以及蛋白信息,根据GABRG2基因序列特征,选择第三个转录本进行靶向删除;（2）根据蛋白质保守区特点,在外显子前1/3设计guide RNA（g RNA）;（3）利用CRISPR设计软件和网站筛选sg RNA序列,生成一系列sg RNA序列,选择分值高的前三个sg RNA序列,以降低同源序列及脱靶效应;（4）将筛选的g RNA送公司合成后,将其插入p Sp Cas9（BB）-2A-Puro（PX459）V2.0质粒载体,选择阳性克隆进行摇菌培养,进行酶切鉴定;（5）将构建好的PX459-GABRG2-1/2/3质粒转染入HT22细胞,提取基因组DNA进行测序,验证质粒活性;（6）运用Western blot和RT-q PCR技术分别检测GABRG2的蛋白和m RNA表达情况,验证GABRG2基因敲除效果,以质粒转染细胞敲除效率最高组为基因敲除组,以野生型为对照组;（7）提取对照组和实验组细胞总RNA,行转录组测序,对筛选差异基因并进行信号通路和蛋白质互作分析;（8）在不同温度条件下检测GABAA受体及MMP家族相关蛋白的表达。结果（1）酶切鉴定和测序分析显示成功将设计的GABRG2 sg RNA插入PX459质粒,质粒构建成功;（2）采用TA克隆后测序显示,质粒PX459-GABRG2-01、PX459-GABRG2-2和PX459-GABRG2-03分别发生碱基缺失、点突变和点突变,构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性;（3）实验组GABRG2的蛋白和m RNA的表达水平显着低于对照组,其中PX459-GABRG2-03组敲除效率最高,达90%以上;（4）RNA-seq显示共有2157个差异基因,其中上调和下调基因分别是1173个和984个;（5）差异基因KEEG富集分析信号通路主要包括PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路和Rap1信号通路;GO富集分析显示,差异基因多集中于细胞生物学过程、代谢、发育、免疫、细胞凋亡、细胞膜、细胞外、突触及受体活性、转运体活性、酶活性调节等过程;PPI结果显示,GABRG2与GABAA受体其他亚基联系密切,处于其核心地位;（6）在不同温度条件下,GABRG2基因敲除组细胞中GABRA1/GABRB1/GABRB3和CACNA1A的表达量随温度升高逐渐降低,而GABRA5的表达随温度升高逐渐增加。MMP家族的相关因子MMP3和MMP9的表达则升高。结论（1）成功利用CRISPR/Cas9 system构建稳定转染的GABRG2敲除细胞系,为研究GABRG2在遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（GEFS+）中致病机制提供线索;（2）GABRG2基因突变可使GABAA受体的大部分亚基表达量降低,可能导致GABA能信号通路功能受损,致使体内抑制性的神经递质释放降低;（3）通过调节PI3K-Akt和MAPK信号通路影响神经元的凋亡、发育、受体活性、转运体活性、酶活性及相关基因的表达,这些改变在GEFS+发生过程中可能起到重要作用。第二部分GABRG2基因敲除对HT22细胞突触前膜囊泡释放及功能的影响目的评估GABRG2基因敲除后的突触前膜递质释放功能及GABA能抑制性突触的传递活动方法（1）利用FM4-64染料进行细胞突触囊泡释放染色,观察细胞的胞吞和胞吐情况,用以检测基因敲除后细胞递质释放功能;（2）通过全细胞膜片钳技术检测GABRG2基因敲除后细胞系的m IPSC变化。结果（1）与野生组相比,GABRG2基因敲除组细胞FM4-64的阳性簇数量显着减少（WT:4.20±0.21 clusters/10μm;KO细胞:1.60±0.18 clusters/10μm;t-检验;P<0.0001）。KO组细胞中,FM4-64的荧光强度也显着降低（P<0.0001）;（2）KO组细胞的m IPSC频率显着低于对照组（0.79±0.04 Hz vs.1.87±0.16 Hz;P<0.001）,m IPSC的振幅也低于对照组（10.18±0.87 p A vs.24.00±1.10 p A;P<0.001）。此外,WT组和KO组细胞的峰值电流有显着性差异（498±35.5 p A vs.53.4±7.0;P<0.001）。结论γ2亚基功能障碍影响细胞膜递质释放,降低了m IPSCs动作电位的诱发频率和电流幅度,这可能是GEFS+发生的一个重要因素。第三部分构建GABRG2敲除小鼠模型及探讨温度对癫痫行为的影响目的构建海马和新皮质特异性GABRG2基因敲除小鼠模型,探讨不同温度条件下对GABRG2基因敲除小鼠癫痫行为的影响及潜在机制。方法（1）利用Cre/loxp重组酶系统技术,首先构建GABRG2fl/wt转基因小鼠,繁配得到GABRG2fl/fl纯合子小鼠,将其与海马和新皮质组织特异性表达Cre+/+重组酶的工具鼠进行繁配和鉴定,选择子代基因型为GABRG2fl/wt Cre+的小鼠作为实验对象,同窝别的野生型小鼠作为对照组。取子代小鼠的脚趾或尾部,提取基因组DNA,PCR后进行琼脂糖凝胶电泳,鉴别小鼠基因型;（2）采用RT-q PCR,Western Blot和免疫组化方法技术检测GABRG2基因在小鼠海马和新皮质中的m RNA和蛋白质表达水平;（3）用Nissl染色法分析大脑皮层和海马神经元的丢失情况;（4）使用温度加热仪对小鼠加热,记录癫痫发作情况,脑电图（EEG）用于记录脑电活动;（5）使用PTZ诱导癫痫发作,比较热诱导与PTZ诱导癫痫发作的严重程度。结果（1）筛选出子代基因型为GABRG2fl/wt Cre+小鼠作为实验对象;小鼠海马和新皮质中GABRG2的m RNA和蛋白表达水平显着低于野生组;（2）组化结果显示,GABRG2fl/wtCre+小鼠海马和新皮质内的GABRG2表达显着降低,其主要减少部位是海马的CA3区和新皮质的Ⅳ-Ⅴ层;（3）热造模过程中,实验组小鼠癫痫发作更明显。皮层脑电图（EEG）显示实验组小鼠皮层脑电的棘波数量显着高于对照组,杂合子CKO小鼠对热诱导癫痫发作敏感性更高,可以引发全身强制性阵挛癫痫发作,而对照组小鼠不受影响;（4）与同窝野生型小鼠相比,GABRG2fl/wt Cre+小鼠利用PTZ诱导癫痫发作的潜伏期较短、癫痫发作持续的时间延长、死亡率及严重程度增加。结论（1）成功构建了海马和新皮质特异性GABRG2基因敲除小鼠模型;（2）GABRG2fl/wtCre+小鼠再现了人类热性惊厥的许多特征,是研究遗传性癫痫伴热性惊厥附加症的良好模型;（3）GABRG2fl/wt Cre+小鼠具有显着的温度易感性。第四部分GABRG2基因敲除小鼠的表观遗传学特征目的探讨GABRG2基因敲除后引起遗传性癫痫伴热性惊厥附加症的表观遗传学特征。方法（1）采用RNA-seq技术,基于Illumina测序平台,分别提取海马与皮质组织的总RNA,进行建库测序和生物信息分析;（2）利用ATAC-seq技术,基于Illumina技术测序平台,分别提取海马与皮质组织细胞的细胞核,加入T5转座酶后进行纯化,构建文库测序和生物信息学分析。结果（1）RNA-seq测序结果显示,正常体温下,GABRG2fl/wtCre+小鼠与野生型小鼠海马组织内差异基因个数为667个,上调基因和下调基因个数分别为496和171;皮层组织内差异基因个数为552个,上调基因和下调基因个数分别为170和383。热诱导癫痫发作情况下（40℃）,海马组织内差异基因的个数为681个,上调基因和下调基因个数分别为440和241;皮层内差异基因的个数是743,上调基因和下调基因的个数分别是382和361。GO生物学富集结果显示,主要包含神经肽信号通路、神经递质代谢过程、蛋白细胞外基质、细胞外基质、受体活性调节及G-蛋白偶联受体结合;KEEG分析显示,主要富集的信号通路有MAPK pathway、Toll样受体通路、IL-17 pathway、NF-κB pathway、c AMP通路和PI3K-Akt pathway;（2）ATAC-Seq结果显示,每组样品的clean base数均在17.5G以上。进一步数据显示,正常体温下,GABRG2fl/wtCre+小鼠与野生型小鼠海马组织内差异peak数为106187个,皮层组织内差异peak数为118,620个;热诱导癫痫发作情况下（40℃）,海马组织内差异peak数为116,754个,皮层内的差异peak数为121,874个。根据这些差异peak数进行基因注释同时进行信号通路分析,在正常体温下,海马组织差异基因数共16,418个,上调和下调基因数分别为1,767和14,651个;皮层内差异基因个数为12,716个,上调和下调基因分别为852和11,864个;热诱导条件下,海马组织内差异基因总数为6530个,上调和下调基因个数分别是4,410个2,120个;皮层内差异基因总数为5,249个,上调和下调基因分别为2,884和2,365个;另外,我们也分析了差异peak上存在的差异motif,选取最显着的25个motif作为实验对象。再将其与已知转录因子进行motif的富集,共发现14个关系最密切的转录因子。结论（1）RNA-seq和ATAC-seq的分析结果较为一致,共同的信号通路有PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、m TOR信号通路及Toll样受体信号通路;（2）motif富集分析显示涉及14个重要的转录因子
郑芳[7]（2021）在《颞叶癫痫伴睡眠中癫痫性电持续状态预后相关因素分析》文中研究表明目的:对颞叶癫痫伴睡眠中癫痫性电持续状态（electrical status epilepticus during sleep,ESES）患儿的临床特点及预后进行分析,评估可能影响其预后的相关因素,以期对临床决策提供依据。研究方法:收集2018年9月至2020年1月在中国医科大学附属盛京医院小儿神经内科门诊及病房收治的颞叶癫痫伴ESES患儿,对其临床资料进行回顾性分析,包括性别、首次癫痫发作年龄、ESES初发年龄、首次癫痫发作至出现ESES的间隔、围生期、既往史、家族史、癫痫发作类型、病原学、脑电图放电侧别、SWI、神经影像学检查、基因检测、治疗药物等。依据观察终点癫痫发作、SWI、神经心理损害有无好转分为预后良好组与预后不良组,采用χ2检验或t检验对上述各方面进行单因素分析,并进一步行Logistic回归分析探讨上述方面与颞叶癫痫伴ESES患儿预后的关系。结果:在138例患儿中,96例（69.6%）为预后良好组,42例（30.4%）为预后不良组。单因素分析提示,两组患儿在首次癫痫发作年龄、ESES初发年龄、ESES持续时间、SWI方面差异有统计学意义（P<0.05）。多因素回归分析提示:ESES持续时间（P<0.05,OR=1.497）、SWI（P<0.05,OR=2.610）是颞叶癫痫伴ESES患儿预后的危险因素,ESES初发年龄（P<0.05,OR=0.840）是保护因素,而性别、首次癫痫发作至出现ESES的间隔、围生期、既往史、家族史、癫痫发作类型、病原感染、MRI异常、脑电图放电侧别、激素冲击治疗、应用苯二氮卓类药物、多药联合应用等因素均不是颞叶癫痫伴ESES患儿预后的相关因素（P>0.05）。结论:ESES持续时间、SWI是影响颞叶癫痫伴ESES患儿预后的危险因素,ESES初发年龄是患儿预后的保护因素,年龄越大,预后较好。
丁梦肖[8]（2021）在《78例儿童癫痫性脑病的临床特征及遗传学研究》文中进行了进一步梳理目的:探析儿童癫痫性脑病的临床特征,并进行基因遗传学研究,为更深入的了解癫痫性脑病及探讨其遗传学病因提供理论支撑和实验室方法:以2019年1月～2020年12月于河北省儿童医院神经内科诊断为癫痫性脑病的住院患儿78例为研究对象。首先回顾性分析其临床特点,其次采用二代基因测序法检测患儿的遗传学特征。结果:1.78例癫痫性脑病患儿的男女性别比为1:1.11（女童41例,男童37例）,绝大多数（65.38%）患儿就诊年龄在1岁以上。88.46%（69/78）的患儿起病年龄在婴幼儿时期（0-3岁）。2.有65例患儿采集了出生史,其中出生史异常者13例,异常率为20.00%;71例患儿采集了家族遗传史,结果显示有20例存在家族史,占全部患儿的25.64%;有69例患儿做了发育评估（0-6岁患儿做Gesell智力测试,6岁以上患儿做韦氏智力量表）,其中发育异常者52例,异常率为75.36%,大部分患儿存在智力障碍、认知障碍、语言障碍、个人社交、精细运动障碍、大运动障碍中的一项或多项,其中以全面性发育障碍为主;有72例患儿做了脑电图检查,其中67例脑电图异常,异常率达93.06%;有66例患儿做了头颅MRI检查,其中11例头颅MRI检查异常,异常率为16.6%。3.78例癫痫性脑病患儿癫痫发作类型多样化,包括局灶性发作15例（19.23%）,全面强直性阵挛13例（16.67%）,痉挛13例（16.67%）,强直性发作12例（15.38%）,阵挛性发作6例（7.69%）,局灶继发全面性发作5例（6.41%）、失神发作5例（6.41%）,其他（非特异性）19例（24.36%）。4.53例患儿共检测出54个致病或可能致病突变,其中有1例患儿携带两种可能致病突变。54个致病或可能致病突变分布于23个基因,其中有2例以上患儿的基因共有9个,分别为SCN1A（11例）、KCNQ2（7例）、PCDH19（5例）、SCN2A（4例）、SCN9A（2例）KCNT1（2例）、SCN8A（2例）、GRIN2A（2例）、DEPDC5（2例）、CHD2（2例）。其余15个基因每个基因均有1例患儿出现了（可能）致病突变,15个基因分别如下:PACS2、DNM1、TSC2、CDKL5、CYFIP2、OTC、PRRT2、SCN1B、GABRA1、TBC1D24、SYNGAP1、GABRB3、CRIN2D、SZT2。其中,新生突变所占比例为87.04%（47/54）,遗传自亲属的所占比例12.96%（7/54）。错义突变所占比例为79.63%（43/54）,移码突变所占比例为9.26%（5/54）,无义突变所占比例为5.56%（3/54）,缺失突变所占比例为3.70%（2/54）,剪接突变1例,占1.85%?5.在功能各异的不同基因中,突变数量最多的为编码离子通道的基因,占全部（可能）致病突变基因总数量的57.41%（31/54）,其中SCN1A基因排在第一位（11/54）。其次为编码钙依赖细胞粘附蛋白的基因,突变数量占全部（可能）致病突变基因总数量的9.26%（5/54）。结论:1.癫痫性脑病可能并不存在明显的发病性别差异。多为低年龄起病,相当比例的患儿病程迁延,或病情呈持续性进展。2.出生史异常、神经系统疾病家族史可能与癫痫性脑病存在关联。3.癫痫性脑病患儿基因检测异常率高,提示遗传因素是疾病发生的重要影响因素。4.本研究通过检测,发现了54个致病或可能致病基因突变,共分布于24个基因。其中,离子通道基因突变为发现最多的基因突变类型。
张贺博[9]（2021）在《Nedd4-2介导Kir4.1通道蛋白泛素化修饰对癫痫发病机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:神经前体细胞表达发育下调基因4（Nedd4-2）,编码泛素连接酶E3。近期研究发现,部分癫痫患者中Nedd4-2基因发生突变,并指出Nedd4-2通过介导AMPA受体的亚基Glu A1的泛素化,影响神经元的活动和癫痫发作易感性。近年来研究表明,癫痫的发生与离子通道、神经递质、突触连接等有着密切联系。泛素化修饰的底物中有很多是影响中枢神经兴奋性的离子通道蛋白,泛素化修饰通过调控这些通道蛋白表达水平,进一步影响神经元的兴奋性,与癫痫的发生密切相关。然而是否还有其它未知与癫痫相关的Nedd4-2的底物有待进一步的研究。本研究利用CRISPR/Cas9技术,构建了Nedd4-2基因敲除（Nedd4-2+/-）小鼠模型,该模型中Nedd4-2长亚型和短亚型在脑中表达水平均减半。本研究通过戊四唑（PTZ）诱导实验组Nedd4-2+/-（KO）小鼠与对照组Nedd4-2+/+（WT）小鼠发生癫痫,采用Label-free蛋白组学检测和体内体外实验等方法,比较KO与WT小鼠海马组织蛋白质表达差异,以期发现新的Nedd4-2靶蛋白,揭示Nedd4-2参与癫痫发生的新机制。方法:1、Nedd4-2基因敲除小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司构建。2、小鼠每天给于PTZ 35mg/kg腹腔注射一次,癫痫发作评分按Racine分级。3、采用Label-free-LC-MS/MS技术检测PTZ诱导癫痫成功点燃的KO小鼠与WT小鼠海马体组织中的差异表达的蛋白质,并进行Cluster,GO和KEGG生物信息分析,筛选出与癫痫相关的差异蛋白。4、提取鼠尾DNA,PCR鉴定小鼠基因型。5、实时荧光定量PCR检测Nedd4-2和Kir4.1表达6、小鼠海马,皮质和髓质Western Blot检测Nedd4-2和Kir4.1的表达。7、尼氏染色检测小鼠脑组织中神经元数量的变化。8、免疫组织学方法检测Kir4.1在小鼠脑组织中的表达。9、Co-IP检测脑组织内Nedd4-2与Kir4.1以及Kir4.1与Ub的结合。10、细胞转染,Western Blot检测Nedd4-2和Kir4.1的表达,Co-IP验证转染后Kir4.1的泛素化程度变化。11、Kir4.1表达载体和突变载体转染细胞,Co-IP验证Nedd4-2与Kir4.1的结合。12、Kir4.1表达载体和Kir4.1突变体T312A转染细胞,给于放线菌酮（100μg/ml）处理,Western Blot检测Kir4.1表达变化。13、14-3-3表达载体转染细胞,给于R18处理,Western Blot检测Kir4.1表达变化,Co-IP验证Nedd4-2与Kir4.1的结合程度变化。14、Kir4.1表达载体分别和Nedd4-2表达载体或空载体共转染HEK293细胞,Kir4.1表达载体和Kir4.1突变体T312A分别转染HEK293细胞,记录Ba2+敏感的内向钾离子电流。结果:1、Rt-qPCR和Western Blot结果显示,KO小鼠与WT小鼠相比,Nedd4-2在海马,皮质和髓质m RNA和蛋白表达水平均下降约一半。2、小鼠经PTZ注射后,根据Racine评分标准,结果显示KO小鼠癫痫发作评分持续高于WT组。脑组织的尼氏染色结果显示,KO小鼠与WT对照组小鼠相比,尼氏体数量减少,说明神经元损伤更明显。3、海马体蛋白组学分析鉴定的3379个蛋白中,与WT小鼠对照相比,有55个蛋白被认为在KO小鼠中发生改变,其中内向整流k+通道Kir4.1上调了1.83倍。4、分别提取KO小鼠与WT小鼠海马、皮质和髓质总蛋白进行Western Blot实验,结果显示,与对照组WT小鼠相比,Nedd4-2表达明显降低（P<0.01）,Kir4.1表达明显增高（P<0.01）。5、免疫组化结果显示,KO小鼠与WT小鼠相比,Kir4.1表达升高。6、Co-IP结果显示,与WT组小鼠相比,KO小鼠海马中Kir4.1的泛素化修饰水平明显下调（P<0.01）。7、Co-IP实验证实,在KO与WT小鼠海马组织中,Nedd4-2与Kir4.1存在相互作用,另外,与WT组相比,KO组中Kir4.1与Nedd4-2结合程度明显减弱（P<0.01）。8、c6细胞转染Nedd4-2干扰载体,与对照组相比,Kir4.1蛋白表达升高。Co-IP结果显示,Kir4.1的泛素化水平明显降低。9、Kir4.1表达载体以及三种突变载体,分别和Nedd4-2共转染c6细胞,CoIP实验结果显示,Kir4.1突变体T312A与Nedd4-2相互作用明显减弱。10、T312A突变的Kir4.1表达载体和野生Kir4.1表达载体分别和Nedd4-2表达载体共转染c6细胞,给于Cycloheximide处理,与WT组相比,突变的Kir4.1仍保持较高水平（P<0.0001）。11、Co-IP结果显示,14-3-3与Kir4.1存在相互作用。c6细胞转染14-3-3表达载体,与空载组相比,Kir4.1表达水平降低,Kir4.1与Nedd4-2相互作用增强。相反,给于14-3-3抑制剂R18处理,与对照组相比,Kir4.1表达水平升高,Kir4.1与Nedd4-2相互作用增强。12、在HEK293细胞中,与空载体组相比,转染Nedd4-2表达载体的细胞中,Ba2+敏感的内向钾离子电流显着降低;与转染野生型Kir4.1表达载体相比,转染T312A突变体的Kir4.1 Ba2+敏感的内向钾离子电流为野生型3.5%。结论:1、在PTZ诱导癫痫的KO和WT小鼠海马组织中,共鉴定到3379个蛋白质,筛选出了55个差异蛋白,与WT组相比,在KO组中21个高表达13个低表达。2、Nedd4-2单倍剂量不足引起癫痫易感性升高。3、Nedd4-2是Kir4.1的泛素E3连接酶,Nedd4-2通过与Kir4.1的苏氨酸312-脯氨酸这一基序相互作用,并介导其发生泛素化修饰和降解。4、KO小鼠脑组织中,Kir4.1表达明显上调,Kir4.1泛素化修饰水平下调。5、适配器蛋白14-3-3促进了Nedd4-2介导的Kir4.1的泛素化。
贾婉莹[10]（2021）在《CaM调控自闭症电压门控型钠通道NaV1.2突变R1902C的作用及机制》文中进行了进一步梳理目的:电压门控钠通道（voltage-gated sodium channel）是可兴奋细胞中动作电位快速上升的基础,也是调节细胞内离子浓度和影响信号传导途径的关键决定因素。迄今为止,已经认识到10种哺乳动物Na V亚型可形成VGSCs超家族。其中,Na V1.2对于动作电位沿主要在神经细胞和肌肉中发现的无髓轴突的传播至关重要。钙调蛋白（CaM）是许多真核细胞信号转导途径的基本蛋白,是Ca2+结合蛋白之一。CaM以Ca2+依赖性的方式在大多数VGSCs的α亚基中识别出两个细胞内位点。CaM分子包含两个环,每个环（N或C环）都包含两个Ca2+结合位点——EF手。CaM通过IQ（异亮氨酸和谷氨酰胺）结构域与许多离子通道结合,包括VGSC和电压门控钙通道（VGCC）。所有十种VGSC同工型均包含经典CaM结合的IQ区域。Na V1.2 C末端的序列包含IQ结构域,该区域与Ca2+信号转导相关,并通过调节细胞内游离Ca2+浓度来调节反应活性。自闭症是一种遗传性疾病,大约90%的自闭症都具有遗传性,三分之一的自闭症患者会发作癫痫。自闭症易感基因座位于一组VGS基因簇附近。编码Na V1.2的基因SCN2A突变导致全身性癫痫伴高热惊厥加（GEFS+）。此外,SCN2A中的突变是自闭症谱系障碍和婴儿癫痫发作的必不可少的危险因素。已证明与野生型Na V1.2IQ域相比,Na V1.2 IQ域R1902C中的自闭症相关突变会影响CaM和Na V1.2 IQ域之间的结合。先前的研究表明Na V1.2突变体通道（R1902C）显示出持续的Na+电流增加。然而,Ca2+/CaM与Na V1.2 IQR1902C域结合的机制仍不清楚。此外,通过α-螺旋接头彼此连接的CaM组成蛋白（N-和C-环）在结构上可以进行比较。但是,C环和Ca2+之间的结合能力是N环的10-25倍。我们先前发现,在调节Na V1.1通道时,CaM的组成蛋白（N环和C环）具有环特异性。但是,尚未很好地证明Na V1.2 IQR1902C域上CaM的环特异性调节。本研究中,我们通过分子生物学方法首先检查了CaM与Na V1.2 IQR1902C域在各种Ca2+浓度下的结合,证明了CaM与Na V1.2 IQR1902C域之间的不同结合特性。我们还发现,在不同Ca2+条件下,CaM与Na V1.2 IQR1902C结构域之间的环特异性相互作用。我们的研究提供了自闭症中Ca2+/CaM调控Na V1.2 IQR1902C域的新机制,为自闭症的机制的阐明提供新的理论及实验基础。方法:1.体外结合实验通过PCR产生人Na V1.2的野生型IQ结构域的相应cDNA（1901Lys-1927Lys）。使用Quickchange TM试剂盒（QIAGEN）进行Na V1.2 IQR1902C突变体的构建,以进行定点诱变。将载体在表达与靶蛋白的融合肽的大肠杆菌BL21（DE3）中扩增为谷胱甘肽-S-转移酶（GST）。GST-IQ,CaM和CaM的叶以Bradford方法定量,以牛血清白蛋白（BSA）为标准,校正因子为:0.83（GST-IQ）,1.22（CaM）,2.74（CaM的N环）,和0.74（CaM的C环）。对于CaM结合测定,将固定的GST-IQ或其突变体（2-4μg）与各种[CaM]（0.07、0.21、0.7、1.4、2.1μM）在4℃于300μL Tris中孵育4小时。存在各种Ca2+浓度的缓冲液（pH=8.0）([Ca2+]≈free:Tris缓冲液,5m M EGTA和pH=8.0;100n M:Tris缓冲液,5m M EGTA,4.7883m M Ca Cl2和pH=8.0;500n M:Tris缓冲液,5m M EGTA,5.096m M Ca Cl2和pH=8.0;2 m M:Tris缓冲液,0.1M Ca Cl2和pH=8.0)。然后,通过使用与上述相同的洗涤缓冲液将反应混合物轻轻洗涤两次。用5x SDS-PAGE上样缓冲液洗脱结合的CaM,并溶解在15%SDS-PAGE凝胶中。2.计算机分子对接在Discovery Studio 2017中,我们使用了创建同源性模型工具从Na V1.2 IQ-CaM复合体（PDB:2KXW）导出Na V1.2的IQ母题的晶体结构。在Discovery Studio（DS）中,我们使用ZDOCK和RDOCK协议执行对接研究。在我们的案例中,ZDOCK得分越高,对接姿势应表现出更好的交互性。此后,使用CHARMM力场从ZDOCK中选择了10个最高得分姿势,以实现RDOCK协议中的能量最小化。最后,我们将分子模型图中所示的结合界面分析中的RDOCK能量最低的最高姿势（E＿RDOCK）进行了改进。ZDOCK和RDOCK程序的结合有助于更好地定义Na V1.2 IQ基序与CaM的组成蛋白（截短的N环和C环）的良好相互作用。对于图中所示的单个相互作用,对接结果显示为具有最低RDOCK相互作用能的N-/C环-IQ配合物最佳姿势的实心带。3.统计分析将Pull down实验中获得的胶图通过Image J基于分子质量将量化的灰度转换为摩尔量。使用软件Sigma Plot 12.0（版本12,Sigma-Aldrich,北京,中国）将数据拟合至理论曲线。对于C环与Na V1.2 IQwt基序之间的结合,我们选择了一个位点拟合模型,并采用了希尔方程:y=Bmax·x/（Kd+x）;对于除C环和Na V1.2 IQwt基序之间的结合以外的组合,我们选择了两个位点的模型,并选择了希尔方程:y=Bmax1·x/（Kd1+x）+Bmax2·x/（Kd2+x）（Kd:表观解离常数）。差异的统计显着性采用ANOVA评估,然后采用Tukey测试（Graph Pad Software,圣地亚哥,加利福尼亚）进行评估,并且P<0.05被认为具有统计学意义。结果:1.我们通过分子对接技术发现N环和Na V1.2 IQR1902C基序的最佳取向的ZDOCK得分和E＿RDOCK分别为11.78和-48.67 k J/mol,而C环与Na V1.2 IQR1902C基序的相互作用分别为11.72和-33.77 k J/mol。除此之外,CaM与Na V1.2 IQR1902C的最佳ZDOCK得分和E＿RDOCK为13.86和-68.36 k J/mol。2.我们通过pull-down技术发现CaM与Na V1.2 IQR1902C基序的结合特性,发现Na V1.2IQR1902C基序和CaM在500 n M[Ca2+]处具有最大结合。然而,CaM和IQwt域之间的组合呈U形,在[Ca2+]≈free时最高,而在100 n M[Ca2+]时最低。因此,与IQwt相比,CaM与IQR1902C结合的Ca2+依赖性几乎消失,在100和500 n M[Ca2+]下与IQR1902C的结合增加。3.我们通过pull-down技术发现CaM的结构域组成蛋白（截短的N环和C环）与Na V1.2 IQR1902C基序之间的结合特性,发现CaM的结构域组成蛋白N环与C环与Na V1.2 IQR1902C基序之间的结合。R1902C的突变体减弱它在特定的[Ca2+]浓度(包括≈free和2 m M[Ca2+])下与N环结合的能力。与Na V1.2 IQwt基序相比,R1902C的突变降低了与C环的结合能力。4.我们将Na V1.2 IQwt基序中的R1902突变为半胱氨酸C之后,相邻氨基酸之间容易形成二硫键,所以我们加入二硫苏糖醇（DTT）作为还原剂,进行重复实验。结果为是否加入DTT并不会影响CaM与Na V1.2 IQR1902C基序的结合。结论:1.与IQwt相比,在100和500 n M[Ca2+]下CaM与IQR1902C的结合增加。2.在IQR1902C突变体中,CaM域结合的Ca2+依赖性几乎消失。3.CaM结构域的两个组成蛋白（截短的N环和C环）都可以与IQR1902C突变体结合,并且主要与C环相互作用。4.与Na V1.2 IQwt基序相比,R1902C的突变降低与CaM的C环的结合能力。5.加入还原剂DTT后,并不会影响CaM与Na V1.2 IQR1902C基序的结合。综上所述,我们的研究揭示了IQR1902C基序（自闭症相关突变）的CaM调节的新机制,为自闭症的产生和发展机制以及联合抗癫痫/自闭症药物的作用靶点的寻找提供了新方向。
二、癫痫与离子通道的分子遗传学研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、癫痫与离子通道的分子遗传学研究进展（论文提纲范文）
（1）离子通道基因突变相关儿童癫痫性脑病33例临床特征和基因突变分析（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床特征 |
| 2.2 基因突变分析 |
| 2.3 治疗和预后 |
| 3 讨论 |
（2）钠离子通道相关基因突变致儿童癫痫17例的临床特征及致病基因谱（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2方法 |
| 1.3 诊断标准 |
| 1.4 抗癫痫药物的疗效 |
| 2 结果 |
| 2.1 钠离子通道基因突变结果 |
| 2.2 临床表型特点 |
| 2.2.1 SCN1A基因突变病儿临床表型特点 |
| 2.2.2 SCN1B基因突变病儿临床表型特点 |
| 2.2.3 SCN2A基因突变病儿临床表型特点 |
| 2.2.4 SCN8A基因突变病儿临床表型特点 |
| 2.2.5 SCN9A基因突变病儿临床表型特点 |
| 3 讨论 |
（3）GEFS+的致病基因验证和海马MRS变化与智力水平研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 遗传性癫痫伴热性惊厥附加症致病基因的验证 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 基因异常与癫痫 |
| 1.2 遗传性癫痫伴热性惊厥附加症的概念 |
| 1.3 GEFS~+的致病原理 |
| 1.4 GEFS~+的相关的基因 |
| 1.4.1 编码电压门控性钠离子通道亚基的基因 |
| 1.4.2 编码配体门控性氯离子通道GABA＿A亚基的基因 |
| 1.5 钾离子通道 |
| 1.5.1 Kv通道 |
| 1.5.2 内向整流通道 |
| 第二章 研究对象 |
| 第三章 试剂和仪器 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要试剂盒 |
| 3.3 主要设备和仪器 |
| 3.4 相关溶液配方 |
| 3.5 生物信息途径及主要软件 |
| 第四章 实验方法 |
| 4.1 质粒构建 |
| 4.1.1 载体的线性化及infusion反应 |
| 4.1.2 目的片段和载体的连接--Fast-Fusion~(TM)反应 |
| 4.1.3 转化 |
| 4.1.4 PCR法筛选重组克隆 |
| 4.1.5 质粒DNA酶切 |
| 4.2 制备慢病毒 |
| 4.2.1 培养包装细胞 |
| 4.2.2 制备DNA-EndoFectin转染复合物 |
| 4.2.3 转染包装细胞 |
| 4.2.4 收获慢病毒颗粒 |
| 4.3 慢病毒滴度检验 |
| 4.4 转染目的细胞 |
| 4.5 基因表达检测 |
| 4.5.1 RT-PCR检测 |
| 4.5.2 荧光显微镜检测 |
| 4.6 膜片钳检测 |
| 4.7 统计学分析 |
| 第五章 研究结果 |
| 5.1 KCNAB3基因突变家系资料 |
| 5.2 突变型质粒酶切鉴定 |
| 5.3 慢病毒滴度检验(荧光法) |
| 5.4 HEK293细胞的转染结果检测 |
| 5.4.1 RT-PCR检测结果 |
| 5.4.2 荧光显微镜检测 |
| 5.5 膜片钳全细胞记录检测结果 |
| 5.5.1 KCNAB3基因突变对电压依赖钾通道动力学的影响 |
| 5.5.2 电流密度的比较 |
| 第六章 讨论 |
| 6.1 电压依赖性钾离子通道 |
| 6.2 KCNAB3基因 |
| 第七章 结论 |
| 第二部分 遗传性癫痫伴热性惊厥附加症患儿海马MRS变化与智力水平研究 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 GEFS~+与海马硬化的关系 |
| 1.2 海马的结构与功能 |
| 1.3 磁共振波谱(Magnetic Resonance Spectroscopy, MRS) |
| 1.4 癫痫与智力低下 |
| 1.4.1 癫痫发作与智力低下 |
| 1.4.2 癫痫持续状态与智力低下 |
| 1.4.3 热性惊厥与智力低下 |
| 第二章 研究对象及方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 试验组 |
| 2.1.2 对照组 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 视频脑电图监测 |
| 2.2.2 头颅MRI平扫+MRS检查 |
| 2.2.3 海马硬化诊断标准 |
| 2.2.4 智力测试 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第三章 研究结果 |
| 3.1 GEFS~+家系临床表型分析 |
| 3.2 GEFS~+家系先证者的临床资料 |
| 3.3 GEFS~+组与对照组性别及年龄对比分析 |
| 3.4 GEFS~+组与对照组左右两侧海马波谱值对比分析 |
| 3.5 GEFS~+患儿组与对照组双侧海马波谱平均值对比分析 |
| 3.6 GEFS~+患儿组与对照组智力评估对比分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 GEFS~+患儿海马MRS变化分析 |
| 4.2 GEFS~+患儿智力测试分析 |
| 4.3 GEFS~+患儿海马损伤与智力关系分析 |
| 第五章 结论 |
| 创新点和不足 |
| 参考文献 |
| 综述 遗传性癫痫伴热性惊厥附加症基因研究现状 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）NMDA受体亚基GluN2A/GRIN2A功能丧失型基因突变所致癫痫的发病机制及精准药物干预研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 癫痫的病因学研究进展 |
| 2.1.1 癫痫相关的神经结构与功能 |
| 2.1.2 脑结构性病因与癫痫 |
| 2.1.3 感染性病因与癫痫 |
| 2.1.4 免疫性病因与癫痫 |
| 2.1.5 代谢性病因与癫痫 |
| 2.1.6 遗传性病因与癫痫 |
| 2.2 NMDA受体基因变异与癫痫的相关性研究进展 |
| 2.2.1 NMDA受体的结构及功能 |
| 2.2.2 NMDA受体的分布 |
| 2.2.3 NMDA受体基因变异与癫痫 |
| 2.2.4 NMDA受体基因变异的药物调节 |
| 第3章 研究内容 |
| 3.1 细胞水平评估突变的NMDA受体功能及干预药物筛选 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.2 结果 |
| 3.2 GluN2A/GRIN2A-V685G转基因鼠制备 |
| 3.2.1 基因信息 |
| 3.2.2 蛋白信息 |
| 3.2.3 转基因载体构建及目的基因片段的获得 |
| 3.2.4 显微注射 |
| 3.2.5 小鼠出生与检测 |
| 3.2.6 交配扩繁 |
| 3.3 转基因鼠癫痫发病机制及精准干预药物研究 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 GluN2A/GRIN2A-V685G 突变对 NMDA 受体功能的影响 |
| 4.2 GluN2A/GRIN2A-V685G突变特异性功能增强剂的筛选 |
| 4.3 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠行为学改变 |
| 4.3.1 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠癫痫发作的特点 |
| 4.3.2 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠认知功能变化 |
| 4.3.3 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠抑郁行为的表现 |
| 4.4 通过在体及离体电生理学检测探讨 GluN2A/GRIN2A-V685G 突变小鼠癫痫发病的机制 |
| 4.5 依法韦仑(EVF)对 GluN2A/GRIN2A-V685G 突变小鼠行为学、电生理的影响及应用前景 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）GABRG2突变导致遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（GEFS+）的分子遗传学特征及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 构建GABRG2 敲除细胞系及探讨温度对相关蛋白的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 GABRG2 基因敲除对HT22 细胞突触囊泡释放及功能的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 构建GABRG2敲除小鼠模型及探讨温度对小鼠癫痫行为的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 GABRG2 基因敲除小鼠的表观遗传学特征 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| GABRG2 基因突变致遗传性癫痫伴热性惊厥附加症的分子遗传学研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（7）颞叶癫痫伴睡眠中癫痫性电持续状态预后相关因素分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 收集临床资料 |
| 2.3 研究分组 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般临床资料 |
| 3.2 预后的单因素分析 |
| 3.2.1 性别、年龄对ESES患儿预后的影响 |
| 3.2.2 围生期、既往史、家族史对ESES患儿预后的影响 |
| 3.2.3 癫痫发作类型对ESES患儿预后的影响 |
| 3.2.4 EEG放电侧别、SWI、ESES持续时间对ESES患儿预后的影响 |
| 3.2.5 头颅MRI、病原感染对ESES患儿预后的影响 |
| 3.2.6 治疗对ESES患儿预后的影响 |
| 3.3 预后的多因素分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 儿童睡眠中癫痫性电持续状态的分子遗传学研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）78例儿童癫痫性脑病的临床特征及遗传学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 儿童癫痫性脑病的临床特征及遗传学研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）Nedd4-2介导Kir4.1通道蛋白泛素化修饰对癫痫发病机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验相关试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验主要试剂 |
| 2.1.2 实验主要仪器 |
| 2.2 生物信息学和计算机软件 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.3.1 小鼠模型构建 |
| 2.3.2 小鼠饲养 |
| 2.3.3 小鼠癫痫模型构建 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 Nedd4-2+/-(KO)和Nedd4-2+/+(WT)小鼠鉴定 |
| 2.4.2 动物取材 |
| 2.4.3 Label-free定量蛋白组学检测 |
| 2.4.4 生信分析 |
| 2.4.5 细胞和组织蛋白提取 |
| 2.4.6 BCA蛋白浓度测定 |
| 2.4.7 细胞培养 |
| 2.4.8 细胞转染 |
| 2.4.9 质粒提取 |
| 2.4.10 免疫共沉淀 |
| 2.4.11 Western Blot |
| 2.4.12 组织总RNA提取 |
| 2.4.13 逆转录反应和实时定量荧光PCR反应 |
| 2.4.14 免疫组化 |
| 2.4.15 尼氏染色 |
| 2.4.16 全细胞膜片钳记录 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Nedd4-2+/-小鼠表现出Nedd4-2 单倍剂量不足 |
| 3.2 Nedd4-2 单倍剂量不足导致癫痫易感性增加 |
| 3.3 PTZ诱导癫痫小鼠的海马蛋白组学分析 |
| 3.4 Nedd4-2介导的泛素化受损导致Kir4.1表达上调 |
| 3.5 敲低Nedd4-2使Kir4.1的泛素化水平降低 |
| 3.6 Nedd4-2通过苏氨酸312-脯氨酸基序与Kir4.1相互作用 |
| 3.7 14-3-3蛋白部分促进了Nedd4-2介导的Kir4.1的泛素化 |
| 3.8 Kir5.1于脑组织及c6细胞低表达 |
| 3.9 全细胞膜片钳记录 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 泛素蛋白酶体途径在癫痫发病机制中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）CaM调控自闭症电压门控型钠通道NaV1.2突变R1902C的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.2 主要试液 |
| 2.2.1 Pull-Down实验溶液配制 |
| 2.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂配制 |
| 2.2.3 蛋白纯化实验溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 蛋白下拉实验 |
| 2.3.2 计算机分子对接实验 |
| 2.3.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 CaM可以与Na_V1.2 IQ_(R1902C)基序结合 |
| 3.2 CaM以及CaM的组成蛋白(截短的N环和C环)与Na_V1.2 IQ_(R1902C)基序之间的结合的分子对接结果 |
| 3.3 CaM与 Na_V1.2 IQ_(R1902C)基序的结合特性 |
| 3.4 CaM结构域组成蛋白(截短的N环和C环)与Na_V1.2 IQ_(R1902C)基序之间的结合特性 |
| 3.5 DTT对于CaM与 Na_V1.2 IQ_(R1902C)结合的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 癫痫中电压门控性钠通道 Na_V1.2 的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、癫痫与离子通道的分子遗传学研究进展（论文参考文献）
- [1]离子通道基因突变相关儿童癫痫性脑病33例临床特征和基因突变分析[J]. 康庆云,廖红梅,杨赛,廖彩时,方红军,杨理明. 神经损伤与功能重建, 2021(12)
- [2]钠离子通道相关基因突变致儿童癫痫17例的临床特征及致病基因谱[J]. 何娟,戴园园. 安徽医药, 2021(06)
- [3]GEFS+的致病基因验证和海马MRS变化与智力水平研究[D]. 丁健. 南方医科大学, 2021(02)
- [4]NMDA受体亚基GluN2A/GRIN2A功能丧失型基因突变所致癫痫的发病机制及精准药物干预研究[D]. 赵腾. 吉林大学, 2021(01)
- [5]儿童睡眠中癫痫性电持续状态的分子遗传学研究进展[J]. 郑芳. 国际儿科学杂志, 2021(03)
- [6]GABRG2突变导致遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（GEFS+）的分子遗传学特征及机制研究[D]. 李信晓. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [7]颞叶癫痫伴睡眠中癫痫性电持续状态预后相关因素分析[D]. 郑芳. 中国医科大学, 2021(02)
- [8]78例儿童癫痫性脑病的临床特征及遗传学研究[D]. 丁梦肖. 河北医科大学, 2021(02)
- [9]Nedd4-2介导Kir4.1通道蛋白泛素化修饰对癫痫发病机制的研究[D]. 张贺博. 中国医科大学, 2021(02)
- [10]CaM调控自闭症电压门控型钠通道NaV1.2突变R1902C的作用及机制[D]. 贾婉莹. 中国医科大学, 2021(02)