干细胞生长分化特征及移植治疗急性心肌梗死的研究进展

一、干细胞的生长分化特性及移植治疗急性心肌梗死的研究进展（论文文献综述）

孙维兴^[1]（2021）在《缺血性心衰心脏m1A甲基化谱》文中研究表明背景:缺血性心血管疾病,尤其是心肌梗死（Myocardial infarction,MI）严重威胁人类健康。针对MI后引发的心脏重构及心衰进展,目前药物、冠状动脉内支架植入术、冠状动脉旁路移植术等治疗虽取得了良好的治疗效果,但MI后仍然存在相当部分的心肌细胞丧失,心室不良重构以及心功能恶化。研究发现,表观遗传在MI后心脏保护中发挥重要作用。目前关于表观遗传与心脏重构之间的研究主要集中在DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰层面。而RNA表观转录后修饰的研究相对较少。新近研究显示RNA表观转录后修饰目前已发现150种类型,包括N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）、N1-甲基腺苷（N1-methyladenosine,m1A）、N5-甲基胞嘧啶（N5-methylcytidine,m5C）、4-乙酰化胞嘧啶（N4-acetylcytidine,ac4C）等等。其中,m6A是最常见的真核生物内部mRNA修饰的主要类型。研究表明,在MI后心衰小鼠中,m6A去甲基化酶分子肥胖基因（Fat mass and obesity,FTO）通过下调m6A可改善缺血后心脏功能;m6A甲基化酶甲基转移酶样3（Methyltransferase-like 3,METTL3）可调节心肌肥大并促进心功能恶化。可见mRNA甲基化修饰在心脏病领域发挥着重要作用。然而,在心血管疾病中关于m1A甲基化修饰的研究尚未见报道。我们推测,与m6A修饰类似,m1A修饰可能在心脏疾病中亦发挥重要作用。由此,我们对人缺血性心衰心肌组织实施了m1A甲基化免疫共沉淀测序试图揭示人类心脏的m1A甲基化修饰图谱。我们同时在鼠缺血性心衰心脏中,检测了心肌梗死后不同时间点m1A及其甲基化修饰相关酶的表达,并筛选出去甲基化酶Alk B同源物3（Alk B homolog 3,ALKBH3）,其基因水平总体显着上调,且随心梗时间延长,呈持续上调状态。为进一步探索ALKBH3依赖的m1A修饰对MI后心脏的修复作用,我们在MI小鼠体内注射了ALKBH3抑制剂进一步观察了其对MI后心脏保护的功能表型。本研究揭示了人类心力衰竭的心脏m1A甲基化修饰图谱,并对m1A修饰的关键酶ALKBH3在缺血心脏中的保护作用进行了初步探索。本研究的实施将为靶向RNA表观转录后修饰作为缺血性心脏病的诊疗提供潜在的理论依据及实验补充。第一部分缺血性心衰心脏中m1A甲基化修饰图谱改变目的:对人缺血性心衰的心脏组织进行了RNA甲基化免疫沉淀测序（methylatedRNA immunoprecipitation sequencing,MeRIP-seq）及数据分析,揭示人的正常及缺血性心衰心脏中m1A甲基化修饰图谱改变。方法:1.MeRIP测序:使用NanoDrop ND-1000仪测量每个样品的RNA浓度,采用Qubit3.对RNA定量及分析。GenSeq TM m1ARNA IP试剂盒（GenSeq）进行m1ARNA免疫沉淀反应。NEBNext?Ultra II DirectionalRNA Library Prep试剂盒对InputRNA样品,以及免疫沉淀后的IPRNA样品进行RNA测序文库构建。通过Bio Analyzer2100分析仪进行文库质检。在Illumina Novaseq 6000测序仪进行高通量测序。经过Illumina Novaseq 6000测序仪测序,图像分析,碱基识别和质控后,产生原始reads。对差异甲基化的编码基因进行GO和Pathway分析。2.mRNA测序:RNA定量质控、完整性质控和文库质量丰富MeRIP测序。用Ribo-Zero rRNA Removal Kits移除总RNA中的rRNAs,使用Tru Seq Stranded TotalRNA Library Prep Kit预处理RNA,构建测序文库。使用Bio Analyzer 2100仪器进行文库质控和定量。根据Illumina测序说明,将10 p M文库变性为单链DNA分子,在Illumina Nova Seq 6000测序仪上进行测序。结果:通过MeRIP-seq测序分析显示,在正常心脏和缺血性心衰心脏中mRNA m1A的整体分布和m1A峰富集的分布没有明显的差别,两者都主要分布在编码序列区（Coding sequence,CDs）,在起始密码子端附近m1A峰显着富集,3’非翻译区（3’Untranslated regions,3’UTR）区富集最少。相对于正常心脏组织,缺血性心衰心肌mRNA m1A甲基化修饰发生了显着变化。人心脏组织在正常和缺血性心衰两种状态下其mRNA m1A甲基化修饰均有特异性的富集,且m1A甲基化修饰差异程度大。GO/KEGG功能富集分析显示,mRNA m1A甲基化修饰发生了显着差异变化的转录本的功能与心肌收缩功能、氧化应激及心肌纤维化等相关。结合发生显着差异变化的mRNA和mRNA m1A分析提示,在缺血性心衰中同时出现mRNA表达水平显着差异改变及其m1A甲基化修饰显着差异改变的部分相对较少。显着差异表达的mRNA GO/KEGG功能富集分析显示,这些mRNA的功能主要与心肌收缩、心肌能量代谢、炎症、纤维化和细胞凋亡相关。结论:人缺血性心衰发生后,心肌m1A甲基化修饰图谱发生了显着变化,m1A富集到的转录本功能与调节关键的心肌收缩功能、氧化应激及心肌纤维化等生物学过程相关。第二部分ALKBH3对大鼠心肌梗死后心脏修复功能研究目的:检测m1A在MI后的修饰变化,筛选MI后介导m1A修饰改变的关键酶,探索ALKBH3抑制剂对MI后心脏修复的影响。方法:1.m1A和m1A甲基化修饰相关酶检测:动物实验分组:假手术组（n=6）和心肌梗死组（n=6）。我们通过建立SD大鼠心肌梗死模型,分别取假手术组和心肌梗死组AMI后4小时、1天、2天、3天、7天、14天和28天缺血心肌组织进行RT-q PCR和Wester blot实验检测m1A甲基化修饰相关酶基因和靶分子蛋白的表达。Dot blot实验检测上述不同时间点心肌梗死组织中m1A表达。2.ALKBH3抑制剂对MI后心脏修复的功能影响:本部分实验分组:假手术组,心肌梗死组和心肌梗死加HUHS015组。我们通过建立昆明小鼠心肌梗死模型,在建模后48小时,通过模型鼠项背部皮下注射HUHS015 32 mg/kg,每日1次,连续7天,干预后28天取心肌组织进行masson染色,显微镜下观察心肌纤维化变化,用Image J软件定量分析心肌纤维化。结果:1.m1A在心肌梗死心脏中的表达:心肌梗死组织中不同时间点m1A的表达呈现明显动态变化,急性心肌梗死后第1天和第2天最高,与对照组比较明显上调（P<0.05）,第三天开始持续下降,其中第28天降至最低,与对照组比较第3、7、14和28天明显下调（P<0.05）。结果表明随着MI后m1A水平发生了动态改变,且时间延长,总体上呈下调趋势。2.心肌梗死后心脏RNA m1A甲基化修饰相关酶TRMT6、TRMT61A、ALKBH1、ALKBH3和BMT2基因表达水平发生了动态改变,其中ALKBH3表现出显着规律变化,即MI后1天降低,2天后降至最低,与对照组比较降低（P<0.05）,第三天开始持续升高,与对照组比较第14和28天明显升高（P<0.05）。3.ALKBH3蛋白的在MI心脏中的表达:心肌梗死组织中不同时间点ALKBH3的表达亦呈现明显动态改变,急性心肌梗死后第1和第2天后降至最低,与对照组比较有统计学意义（P<0.05）,第三天开始持续升高,其中与对照组比较第7、14和28天显着上调（P<0.05）。ALKBH3的动态改变与m1A表达水平呈负相关。4.抑制ALKHB3的作用后心肌梗死心脏纤维化改变:对心肌组织进行masson染色及Image J软件定量分析心肌纤维化,对比分析发现,相比心肌梗死组,心肌梗死加HUHS015组的心肌纤维化明显减少（P<0.05）,这表明抑制ALKHB3的作用能促进MI后心脏修复。结论:1.在心肌梗死后,心肌中RNA m1A、ALKBH3的mRNA和ALKBH3蛋白表现出规律改变,三者之间改变呈对应调节关系。2.抑制m1A去甲基化酶ALKBH3的活性可改善心肌纤维化,促进心脏功能的修复。

王擎擎^[2]（2021）在《活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究》文中研究说明背景:当代以干细胞技术为核心的再生医学的迅速发展,为心肌梗死的治疗带来新的希望,其中干细胞移植治疗心梗,有望修复坏死的心肌组织,改善受损的心功能,但是梗死区缺血、缺氧局部微环境使MSCs移植后存活率降低,极大地限制了 MSCs用于治疗MI的疗效。中药促进MSCs移植后存活的研究目前也显示出了很好的疗效,可以调控MSCs的归巢、定植,提高MSCs移植后存活率。导师姚魁武教授基于中医胸痹心痛“阳微阴弦”的基本病机,常用活血温通法治疗冠心病,临床疗效显着,并根据多年临床经验拟定了具有活血温通效果的经验方—活血温通方。我们前期研究也发现活血温通方可以显着改善心肌缺血模型组大鼠心功能,明显缩小心肌梗死面积,而且能够降低炎症反应、抑制心肌细胞凋亡、减少胶原纤维面积以及促进血管新生,同时发现活血温通方减轻心肌缺血损伤可能与Sirt1信号通路激活有关。而活血温通方联合MSCs移植治疗心梗,还没有相关的报道。目的:1.总结导师姚魁武教授活血温通法治疗冠心病阳虚证的用药规律、治疗思路,并进行系统的经验总结。2探索活血温通方对BMSCs移植治疗心梗疗效的影响以及可能的作用机制。方法:1.收集2016年1月—2020年12月就诊于中国中医科学院广安门医院姚魁武主任医师门诊,应用中药汤剂治疗且符合纳排标准的全部初诊原始病案。通过“中医传承计算平台（V3.0）”软件系统进行数据分析,根据分析得到到药物频次、常用药物组合、潜在处方等,分析探讨姚魁武教授活血温通法治疗冠心病的用药规律、诊疗思路,并做系统总结。2.提取大鼠BMSCs,培养至第三代时,用流氏细胞仪进行细胞鉴定。用活细胞染色剂CM-Dil进行荧光标记,以检测移植后细胞的存活情况。3.通过结扎左冠状动脉前降支制备心机梗死模型。SD大鼠随机分为5组：假手术组（Sham组）：冠状动脉只穿线不结扎，术后灌胃纯水，持续28天；心梗组（MI组）:按AMI造模方法进行造模,造模成功后于梗死区边缘心肌组织的2个位点直接注入共100μL的PBS。术后灌胃纯水,持续28天;BMSCs移植组（BMSCs组）:按AMI造模方法进行造模,造模成功后于梗死区边缘心肌组织的2个位点直接注入共100μL的MSCs单细胞悬液（细胞浓度3x106个/100μL）。术后灌胃纯水,连续28天;活血温通方组（HXWTF组）:造模方法同心梗组。术后灌胃活血温通方,连续28天;活血温通方+BMSCs移植组（BMSCs+HXWTF组）:造模方法同BMSCs移植组。术后灌胃活血温通方,连续28天。4.超声心动图检测大鼠心功能、TTC染色用于观察心肌梗死面积大小、HE染色观察心梗大鼠心肌组织形态的改变、荧光显微镜观察BMSCs移植后的存活情况。5.用WST-1法测定大鼠血清SOD活力和TBA法测定大鼠血清MDA水平,以评价各组氧化损伤程度;TUNEL染色观察心肌细胞凋亡;采用ELISA试剂盒检测大鼠血清中炎性因子TNF-a、IL-6、IL-10与生长因子VEGF、bFGF水平,评价炎症反应程度;天狼猩红染色检测各组大鼠心肌纤维化程度;免疫组织化学染色检测梗死边缘区α-SMA和CD31的表达情况,以评价血管新生情况;Western blotting检测心肌组织Sirt1、NF-κB、FoxO1和p53的蛋白的表达水平。结果:1.从用药频次分析,196张处方中,共137味中药,用药频次≥20的中药有39味,用药频次≥50的有22味,用药频次≥50按频次由高到低依次为丹参（193）,桂枝（164）,砂仁（123）,川芎（117）,瓜蒌（109）,白芍（105）,炙甘草（95）,鸡血藤（93）,茯苓（88）,柴胡（87）,炒枳壳（80）,当归（78）,干姜（77）,炒白术（76）,杜仲（64）,党参（61）,麦冬（59）,肉苁蓉（58）,炒酸枣仁（56）,薤白（54）,葛根（54）,五味子（50）。2.196张处方中的137味中药按功效共分为16类,根据药物功效使用频次由高到低排列前10位的依次为补虚类（769）,活血化瘀类（436）,温里类（339）,清热类（210）,化湿类（198）,解表类（184）,理气类（177）,化痰类（155）,利水渗湿类（119）,安神类（114）。3.从药物组合频次分析,药物组合频次≥90的由高到低依次是丹参-桂枝（162）,丹参-砂仁（123）,丹参-川芎（115）,丹参-瓜蒌（108）,丹参-白芍（104）,丹参-桂枝-砂仁（99）;桂枝-砂仁（99）。基于关联规则深入分析用药组合,导师活血温通法治疗冠心病常用的2味药的组合是丹参-瓜蒌,丹参-砂仁,丹参-桂枝,丹参-鸡血藤等;3味药的组合是丹参-砂仁-瓜蒌,丹参-桂枝-瓜蒌,丹参-桂枝-鸡血藤等。从用药关联规则网络拓扑图可以看出,关联性比较大的药物组合是丹参、桂枝、鸡血藤、瓜蒌、川芎、砂仁。4.基于复杂算法的聚类分析在深入挖掘可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的核心组合。3种药物聚类核心组合为丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,鸡血藤;丹参,桂枝,川芎,白芍,砂仁;丹参,桂枝,川芎,砂仁,茯苓。4种药物聚类核心组合为;丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,川芎,鸡血藤;丹参,桂枝,麦冬,炙甘草,川芎,生地黄;丹参,桂枝,砂仁,鸡血藤,川芎,降香;丹参,桂枝,砂仁,干姜,茯苓,瓜蒌。5种药物聚类核心组合为;丹参,桂枝,鸡血藤,瓜蒌,川芎,党参;桂枝,丹参,麦冬,川芎,炙甘草,炒白术;丹参,桂枝,干姜,砂仁,茯苓,黄连;丹参,桂枝,砂仁,瓜蒌,川芎,白芍;丹参,砂仁,桂枝,川芎,鸡血藤,降香。5.基于方剂频数分析,可以得出196例病案中共涉及方剂54个,方剂频数为2以上的药物有32个,方剂频数为5以上的方剂有24个,方剂频数为10以上的方剂有13个,方剂频数为20以上的药物有6个。可以看出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂有丹参饮（118）,四逆散（73）,桂枝甘草龙骨牡蛎汤（25）苓桂术甘汤（23）、瓜蒌薤白白酒汤（21）等。6.根据方剂配伍的使用频次,可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂配伍是丹参饮-四逆散（47）,丹参饮-黄芪赤风汤（11）,丹参饮-交泰丸（11）,丹参饮-瓜蒌薤白白酒汤（11）,丹参饮-半夏泻心汤（11）,丹参饮-瓜蒌薤白半夏汤（11）等。基于关联规则深入分析用方组合,可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的方剂配伍是丹参饮-四逆散-瓜蒌薤白半夏汤,丹参饮-四逆散-黄芪赤风汤,丹参饮-四逆散-桂枝甘草龙骨牡蛎汤等。根据方剂组合规律关联规则网络拓扑图可以看出关联比较大的方剂是丹参饮、四逆散、生脉散、桂枝甘草龙骨牡蛎汤、瓜蒌薤白半夏汤、瓜蒌薤白白酒汤、交泰丸等。基于复杂算法的聚类分析在深入挖掘可以得出导师活血温通法治疗冠心病常用的核心方剂组合是生脉散,丹参饮,枳实薤白桂枝汤,补中益气汤,四君子汤;丹参饮,交泰丸,半夏泻心汤,苓桂术甘汤,越鞠丸;丹参饮,四逆散,黄芪赤风汤,瓜蒌薤白半夏汤,桂枝甘草龙骨牡蛎汤。7.BMSCs的鉴定:用流氏细胞仪检测第3代BMSCs表面标记物CD44、CD90、CD45的表达情况,结果显示CD44表达率为99.2%,CD90表达率为97.4%,CD45的表达率为6.7%。8.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心功能的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组EF均有明显改善（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,活血温通方联合 BMSCs 移植组 EF比BMSCs移植组和活血温通方组改善明显（***P<0.001,**P<0.01）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组FS均有明显改善（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,活血温通方联合BMSCs移植组FS 比 BMSCs移植组和活血温通方组改善明显（***P<0.001,***P<0.001）。9.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心肌梗死面积的影响:假手术组无梗死,完整心脏表面和心脏切片均呈现红色,无苍白色区域。心梗组完整心脏表面和心脏切片苍白色区域均最大,故心梗面积最大,且心梗处明显凹陷,心梗处心肌明显变薄。BMSCs移植组和活血温通方组较心梗组,完整心脏表面和心脏切片的苍白色区域均明显减少,说明BMSCs移植和活血温通方药物干预均能减少心梗面积。活血温通方联合BMSCs移植组心脏苍白色区域最小,心梗处轻微凹陷,说明活血温通方能提高BMSCs移植改善心梗大鼠心肌梗死面积的疗效。10.活血温通方联合MSCs移植对心梗大鼠心肌组织形态的影响:HE染色显示与假手术组相比,其余各组梗死区均有不同程度的炎性细胞浸润。心梗组细胞排列紊乱,细胞间隙增大,炎性细胞浸润最严重。BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组这些病变均有明显改善,炎性细胞浸润有不同程度的降低。与BMSCs移植组、活血温通方组相比较,活血温通方联合BMSCs移植组细胞排列更有序,炎性细胞浸润更少。11.活血温通方对BMSCs移植四周后存活的影响:在全景数字扫描显微镜下观察,可以看到活血温通方联合BMSCs移植组红色荧光分布更广。红色荧光与蓝色荧光重叠的数量明显更多。12.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清SOD、MDA的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组SOD活力均有显着升高（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组SOD活力均有显着升高（***P<0.001,**P<0.01）;与心梗组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组MDA水平均有显着降低（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs 移植组 MDA 均有显着降低（***P<0.001,**P<0.01）。13.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠心肌细胞凋亡的影响:与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组细胞凋亡水平显着降低（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs 移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组细胞凋亡水平均有显着降低（***P<0.001,***P<0.001）。14.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-10的影响:与假手术组相比,MI组TNF-α、IL-6和IL-10水平水平显着升高（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合 BMSCs 移植组 TNF-α 显着降低（**P<0.01,**P<0.01,***P<0.001）,IL-6 显着降低（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）,IL-10 显着升高（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs 移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组TNF-α显着降低（**P<0.01,**P<0.01）,IL-6显着降低（***P<0.001,**P<0.01）,IL-10显着升高（***P<0.001,***P<0.001）。15.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠心肌纤维化的影响:与假手术组相比,MI组心肌纤维化明显（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组心肌纤维化面积明显减少（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组心肌纤维化面积明显减少（*P<0.05,**P<0.01）。16.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠梗死边缘区α-SMA、CD31表达的影响:与假手术组相比,MI组α-SMA、CD31的表达明显增多（***P<0.001,**P<0.01）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs 移植组 α-SMA、CD31 的表达均显着增多（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组 α-SMA、CD31 的表达显着增多（**P<0.01,*P<0.05;*P<0.05,***P<0.001）。17.活血温通方联合BMSCs移植对心梗大鼠血清生长因子VEGF、bFGF的影响:与假手术组相比,MI组VEGF、bFGF水平显着升高（***P<0.001）;与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组VEGF、bFGF 显着升高（***P<0.001,***P<0.001,***P<0.001）;与 BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组VEGF、bFGF显着升高（***P<0.001,***P<0.001）。18.活血温通方联合BMSCs移植对心肌组织SIRT1、NF-kB、FoxO1和p53蛋白表达的影响:与假手术组相比,MI组Sirt1的表达明显降低（***P<0.001）,NF-kB、Foxo1、p53 的表达明显升高（**P<0.01,**P<0.01,**P<0.01）。与MI组相比,BMSCs移植组、活血温通方组、活血温通方联合BMSCs移植组Sirt1的表达显着升高（**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001）,NF-κB的表达显着降低（*P<0.05,**P<0.01,**P<0.01）,FoxO1 的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05,*P<0.05）,p53 的表达显着降低（*P<0.05,**P<0.01,**P<0.01）;与BMSCs移植组、活血温通方组相比,活血温通方联合BMSCs移植组Sirt1的表达均显着升高（**P<0.01,*P<0.05）,NF-kB的表达显着降低（**P<0.01,*P<0.05）,FoxO1的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05）,p53的表达显着降低（*P<0.05,*P<0.05）。结论:1.导师活血温通法治疗冠心病常活血药与温阳药并重,且用药平和,配伍主次分明,以经方为主。在活血温通法治疗冠心病的组方用药中常含有活血温通方,治疗效果短期的显着,可能是因为改善了心肌缺血缺氧微环境,也初步说明了活血温通方的临床疗效比较显着。2.活血温通方可能是通过改善心梗后缺血缺氧微环境而提高了 BMSCs移植后的存活率,而进一步提高BMSCs移植治疗心梗在抗细胞氧化损伤、抗细胞凋亡、降低炎症反应、抗心肌纤维化和促进血管新生方面的疗效,以及促进移植后的BMSCs的旁分泌功能而进一步修复受损的心肌,缩小心肌梗死面积,改善心功能。3.活血温通方能促进BMSCs移植后Sirt1信号通路的激活,以协同恢复心功能。

官格^[3]（2021）在《负载hiPSC-CM和hiPSC-EC的三维纳米纤维SpGel对心梗的治疗》文中研究指明背景:心血管疾病（CVD）仍然是世界范围内死亡和疾病负担的主要致病因素。心肌梗死后功能性心肌组织的大量死亡,以及心肌组织自身有限的再生能力,导致了心脏损伤的不可逆性。由于心梗后,心肌组织很难再生,临床上心梗（MI）的治疗仍然面临巨大的挑战。近年来,心梗后的细胞治疗已经成为一种具有临床应用前景的治疗方法,通过将人源性诱导多能干细胞（hi PSC）定向诱导成心肌细胞（CMs）或内皮细胞（ECs）可获得大量的移植细胞。由于细胞移植后的低细胞滞留率,以及心肌梗死后恶劣的微环境,导致细胞移植物递送效率低下,成为细胞治疗面临的重大挑战。有研究表明,可注射的水凝胶可作为有效的载体,通过微创的方式递送治疗细胞和生物分子,促进组织再生。不同组织的细胞外基质水凝胶在组织再生和修复中具有组织特异性。脾脏在心肌梗死后,可以分泌心肌保护因子,且在胚胎期,脾脏具有造血干细胞巢的功能。目前尚不清楚脾脏细胞外基质是否可用于人体多能干细胞（hi PSCs）的培养,并为细胞移植提供适宜的生存环境以对抗心梗组织缺血微环境。目的:验证脾脏细胞外基质水凝胶是否可能提供诱导多能干细胞（hi PSCs）培养和分化的平台,以获得诱导成熟的内皮细胞（i ECs）和心肌细胞（i CMs）。以及探究脾脏细胞外基质水凝胶是否能作为心肌递送的有效载体,负载hi PSCs来源的心血管细胞。方法:1.脾脏脱细胞基质水凝胶的制备与表征取猪的脾脏组织进行脱细胞、冻干、酶消化处理后,制备可注射的Sp Gel。通过H&E、Masson’s染色和样本内残留DNA浓度测定证明脾脏组织成功脱细胞。通过Picrosirius Red,Verhoeff’s和Alcian Blue染色验证Sp Gel内蛋白成分。通过蛋白质组学分析鉴定Sp Gel中组织特异性蛋白成分。扫描电镜分析凝胶的微观结构。用流变仪测试Sp Gel的粘弹性。通过CCK-8细胞毒性实验和皮下移植实验检测凝胶的细胞相容性和生物降解性。2.脾脏脱细胞基质水凝胶对hi PSCs体外培养和向内皮细胞、心肌细胞的分化影响通过流式细胞术、免疫荧光染色和q PCR分析,证明hi PSCs在脾脱细胞基质水凝胶上向i ECs诱导分化。通过扫描电镜（SEM）分析了纳米纤维凝胶表面的i ECs形貌。通过成管实验验证Sp Gel上诱导分化的i ECs是否具有内皮细胞功能。3.脾脏脱细胞基质水凝胶对hi PSC向心肌细胞分化的影响通过免疫荧光染色和q PCR分析,证明hi PSCs在脾脏脱细胞基质水凝胶上定向诱导分化为i CMs。通过扫描电镜（SEM）观察凝胶上i CMs的形貌。检测Sp Gel水凝胶上诱导的i CMs的收缩频率和电生理特性。通过透射电镜对分别在Sp Gel水凝胶上、Matrigel胶上诱导分化的i CMs的超微结构进行表征。4.脾脏脱细胞基质水凝胶包埋对H2O2的细胞保护作用将在脾脏脱细胞基质水凝胶上诱导成熟的i ECs和i CMs消化下来,包裹在纳米纤维状的Sp Gel中进行3D培养。加入200μM H2O2至培养体系,体外诱导细胞氧化应激损伤,双氧水处理2 h后,活/死细胞染色观察Sp Gel对i ECs/i CMs抗氧化应激的保护作用。Sp Gel包裹和无Sp Gel包裹的细胞经H2O2处理后,用透射电镜观察细胞的超微结构。5.脾脏脱细胞基质水凝胶联合hi PSCs来源的心肌细胞、内皮细胞治疗小鼠心梗建立小鼠急性心肌梗死模型,探究Sp Gel联合i ECs/i CMs注射后,心梗区的细胞滞留率,以及Sp Gel-i ECs/i CMs联合治疗对于心功能的修复作用。通过小动物活动成像检测移植细胞的滞留率。H&E染色和免疫荧光染色比较PKH26标记的i ECs/i CMs在Sp Gel-i ECs/i CMs组和PBS-i ECs/i CMs组中的心梗区滞留率。4周后对小鼠行心脏超声检测,评估各治疗组对心功能修复的影响。通过Masson染色法比较不同组的心肌纤维化程度。通过免疫荧光染色,比较不同治疗组梗死区域的血管新生情况。6.基因修饰的过表达CCL22的hi PSCs募集Treg细胞通过构建过表达CCL22的慢病毒载体,在体外转染hi PSCs。通过q PCR分析和细胞免疫荧光染色鉴定CCL22在m RNA水平的表达。ELISA验证hi PSC-CCL22细胞培养上清中CCL22的分泌。Transwell趋化实验检测hi PSC-CCL22细胞培养上清对Treg的趋化作用。为了验证hi PSC-CCL22细胞的多向分化能力,我们诱导hi PSC-CCL22细胞向心肌细胞和内皮细胞分化。结果1.我们成功研发了一种脾脏脱细胞基质来源的,温敏性的纳米纤维水凝胶（Sp Gel）,可在37°C孵育下成胶。H&E染色、Masson染色和样本内残留的DNA浓度测定均证明无细胞残留。Picrosirius Red染色,Verhoeff’s染色和Alcian Blue染色分别证明Sp Gel保留了胶原蛋白,弹性蛋白和糖胺聚糖（GAGs）等成分。Sp Gel蛋白组学分析鉴定出1481种蛋白。GO富集分析表明,Sp Gel高表达与细胞外结构组织、小分子代谢过程、细胞外结构组织、细胞底物粘附、细胞连接组织、细胞迁移等生物学过程相关的蛋白。KEGG富集分析表明,细胞凋亡、缝隙连接、紧密连接、粘附连接、局灶性粘连、心肌收缩、CMs中肾上腺素能信号通路和Wnt信号通路相关蛋白在Sp Gel中高表达。在扫描电镜下观察,Sp Gel具有多孔的纳米纤维结构,平均纤维直径为66.67±10.60 nm。水凝胶流变学实验中,通过快速升高温度（从4℃到37℃）,实现了Sp Gel快速凝胶化的过程。CCK-8细胞相容性试验证实了Sp Gel具有良好的生物相容性,皮下移植实验表明Sp Gel是可降解材料。2.免疫荧光染色证实了hi PSCs（OCT4+）在Sp Gel包被培养皿上培养,可维持其细胞多能性。Sp Gel上的hi PSCs可以有效分化为i ECs（CD31+,v WF+）。流式细胞仪分析显示,通过定向诱导内皮分化,CD31+/CD144+双阳性的内皮细胞,比例由诱导分化前的0.05%增加到分化后的94.6%。q PCR表明i ECs低表达干细胞多能性标志物OCT4,高表达内皮细胞特异性标志物CD31、CD144、v WF和CDH5。扫描电镜观察到诱导的内皮细胞粘附在凝胶上,与细胞基质相互作用。Sp Gel上诱导的i ECs成管能力和HUVECs无明显差异。3.免疫荧光染色显示i CMs高表达心肌细胞标记蛋白,如α-actinin、c Tn T和MLC2V。q RT-PCR同样证实了i CMs高表达心肌细胞标志物MYL3、SLC8A1和TNNT2。电镜下观察i CMs,心肌纤维束排列紧密、整齐。相对于传统的Matrigel包被的诱导方法,Sp Gel上诱导的i CMs收缩幅度更大,搏动频率更高（约60次/分钟）,传统诱导方法心肌搏动频率约10次/分钟。透射电镜下观察,Sp Gel上诱导的i CMs可见明显的肌节、z线结构和缝隙连接,而传统的Matrigel诱导的i CM肌节紊乱,未见z线结构。4.伪彩处理的扫描电镜图像和H&E染色可见Sp Gel中i ECs/i CMs的形态和分布。共聚焦显微镜采集图片发现共培养体系中,i ECs（红色,hu CD31）和i CMs（绿色,α-actin）之间的细胞连接和相互作用。活/死细胞染色结果表明,H2O2处理2 h后,i ECs/i CMs在Sp Gel内的存活率显着提高（p<0.0001）。透射电镜下观察Sp Gel H2O2处理过的细胞,无Sp Gel组细胞结构破坏、空泡化和坏死。而Sp Gel组的细胞未出现严重的结构畸形,胞浆中可见自噬空泡。5.小动物荧光活体成像结果显示,Sp Gel负载i ECs/i CMs移植后第7天,Sp Gel联合注射组细胞滞留率显着提高（p=0.0014）。H&E染色和免疫荧光染色表明,移植后的第1天,Sp Gel-i ECs/i CMs的细胞滞留率大约是PBS-i EC/i CM组的3倍。移植后的第7天,Sp Gel-i ECs/i CMs的细胞滞留率大约是PBS-i EC/i CM组的7倍,表明Sp Gel可有效提高心梗区移植细胞的滞留率。4周后,对各组小鼠行超声心功能检测。Sp Gel-i ECs/i CMs治疗组的左心射血分数恢复最好,约54.53±2.09%,PBS-i EC/i CM组为46.88±1.73%。单独Sp Gel注射组为39.91±1.34%比PBS注射组（31.68±2.17%）稍高。免疫荧光染色表明Sp Gel-i ECs/i CMs治疗组动脉（α-SMA+）和毛细血管（CD31+）密度明显高于PBS组,证明Sp Gel联合i ECs/i CMs治疗可促进梗死区新生血管形成。6.成功构建了过表达CCL22的慢病毒载体,在体外转染hi PSCs实现CCL22基因过表达。q PCR分析证明CCL22在m RNA水平高表达。细胞免疫荧光染色证明CCL22在细胞水平的表达。ELISA验证CCL22可以以外分泌蛋白形式进行表达。Transwell趋化实验验证hi PSC-CCL22细胞培养上清对Treg的趋化作用。免疫荧光染色分别验证了hi PSC-CCL22向心肌细胞和内皮细胞高效分化。结论:我们制备了一种温敏性、纳米纤维状脾脏脱细胞基质水凝胶（Sp Gel）,可维持hi PSCs的培养并促进其分化。体内移植实验表明,Sp Gel负载i ECs/i CMs治疗可有效提高移植细胞的滞留率,促进心功能修复,抑制心肌纤维化,促进缺血区血管新生。此外,Sp Gel还可以作为3D打印类器官的生物相容性生物墨水。本研究表明Sp Gel可作为hi PSCs培养和分化的新平台,并为再生医学研究和临床应用提供一种可注射的细胞移植的载体。

冀楠^[4]（2021）在《益气活血方联合骨髓间充质干细胞干预心肌梗死后心室重构的实验研究》文中认为背景:急性心肌梗死（Acute Myocardial infarction,AMI）发生后,左心室大小、结构、功能改变,造成心室重构。心室重构（Ventricμlar remodeling,VR）是AMI向心力衰竭发展的主要病程。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）可通过旁分泌、归巢、转化等方式缓解AMI后心肌损伤,改善心室重构。但由于AMI后内环境改变,造成BMSCs迁移效率低下。团队前期研究发现,益气活血方可改善AMI后炎性环境,改善AMI大鼠心肌损伤。但益气活血方是否可以促进BMSCs向AMI大鼠梗死部位迁移,发挥更好的心肌保护作用,值得深入研究。目的:探讨益气活血方联合骨髓间充质干细胞对心肌梗死后心室重构的干预作用,以mi RNA-210/BNIP3为切入点,从自噬-凋亡途径研究益气活血方联合干细胞对心室重构的可能的作用机制。方法:1、从SD大鼠骨髓中提取BMSCs,显微镜下观察细胞形态,流式检测细胞表面标志物。采用LAD结扎的方法建立大鼠心肌梗死模型,分为假手术组、模型组、益气活血方组、骨髓间充质干细胞组、益气活血方联合骨髓间充质干细胞组。造模2小时,心电图检测心肌缺血情况。药物干预4周后,心脏超声评价大鼠心脏结构和功能,TTC染色评价大鼠心肌梗死面积,HE染色观察大鼠心肌炎性细胞浸润情况、Masson染色观察心肌纤维组织病理改变。2、使用CM-DIL染料对BMSCs细胞膜标记染色。造模后隔天尾静脉移植入大鼠体内。干预4周后取材,运用免疫荧光检测BMSCs向梗死部位富集情况,免疫组化检测心肌组织中SDF-1/CXCR4蛋白的表达水平。3、TUNEL检测大鼠心肌细胞凋亡情况。Western Blot检测造模后各组大鼠自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62表达情况,凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达情况,目的蛋白BNIP3表达情况。RT-q PCR检测mi R-210、BNIP3 mRNA表达情况。结果:1、与假手术组相比,模型组大鼠的LVESD、LVEDD增加（P<0.01）,LVEF、LVFS降低（P<0.01）,提示模型组大鼠左室扩大,心功能下降,心脏结构改变;与模型组相比,益气活血方组、益气活血方联合骨髓间充质干细胞组的LVEDD、LVESD减小（P<0.05or P<0.01）,LVEF、LVFS升高（P<0.05 or P<0.01）,提示此两组可减轻心肌梗死所致的大鼠心脏损伤,减轻大鼠心脏结构改变;与模型组比较,骨髓间充质干细胞组的LVESD减小（P<0.01）,LVFS、LVEF升高,LVEDD减小,但差异无统计学意义（P>0.05）。与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组与骨髓间充质干细胞组LVESD、LVEDD增加（P<0.05 or P<0.01）,LVEF、LVFS降低（P<0.05 or P<0.01）。提示益气活血方联合骨髓间充质干细胞组对梗死心肌的保护作用最为显着。TTC染色结果显示:与假手术组相比,模型组梗死面积显着增加（P<0.01）。与模型组相比,各给药组梗死面积减少（P<0.05 or P<0.01）。与益气活血联合骨髓间充质干细胞组相比,其余两给药组梗死面积增大（P<0.05 or P<0.01）。HE染色结果显示:假手术组大鼠心肌细胞形态正常,细胞核结构清晰,居于中央,肌丝着色均匀,排列整齐规则,呈正常心肌细胞形态;与假手术组比较,模型组大鼠病变程度严重,心肌细胞形态不规则,排列紊乱,细胞核深染,炎性细胞浸润增多;与模型组比较,各给药组大鼠梗死范围缩小,心肌结构改变减轻,肌丝排列较规则,炎性细胞浸润和水肿减少。Masson染色结果显示:假手术组心肌细胞排列整齐,极少纤维组织沉积;模型组病变最为严重,染色显示在心肌梗死边缘区心肌细胞肥大,纤维组织沉积严重,排列紊乱,可见大面积蓝色纤维化;与模型组比较,各给药组显示胶原纤维沉积减少,心肌排列整齐。2、AMI大鼠造模后隔天经尾静脉移植BMSCs,荧光显微镜下观察其迁移情况,可见心肌组织中橙红色荧光,BMSCs向心肌梗死部位富集。免疫组化结果显示:与骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方联合骨髓间充质干细胞组SDF-1蛋白表达增加（P<0.05）,CXCR4表达无统计学差异。3、TUNEL染色显示假手术组未见明显阳性细胞核染色,阳性细胞核染色多见于模型组。与模型组相比,给药组阳性细胞核染色数量明显减少。凋亡相关蛋白WB检测显示:与假手术组比较,模型组大鼠心肌Bax蛋白表达上调（P<0.01）,Bcl-2蛋白表达下调（P<0.01）,Caspase-3表达上调（P<0.01）,提示凋亡激活;与模型组比较,各给药组可下调Bax蛋白表达（P<0.01）,益气活血方组和益气活血方联合骨髓间充质干细胞组可下调Caspase-3蛋白表达（P<0.01）,上调Bcl-2蛋白表达（P<0.05）,骨髓间充质干细胞组Bcl-2蛋白表达有上调趋势,Caspase-3蛋白表达有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组和骨髓间充质干细胞组Bax、Caspase-3蛋白表达上调,（P<0.01 or P<0.05）,Bcl-2表达下调（P>0.05）,提示益气活血方联合骨髓间充质干细胞组抑制凋亡效应最显着。自噬相关蛋白WB检测显示:与假手术组比较,模型组大鼠心肌P62蛋白表达上调（P<0.05）,LC3B、Beclin-1蛋白表达下调,（P<0.01 or P<0.05）提示自噬激活;与模型组比较,各给药组可下调P62蛋白表达（P<0.01）,上调Beclin-1蛋白表达（P<0.01）,益气活血方组和益气活血方联合骨髓间充质干细胞组可上调LC3B蛋白表达（P<0.01 or P<0.05）,骨髓间充质干细胞组LC3B蛋白表达有上调趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组和骨髓间充质干细胞组P62蛋白表达上调（P<0.01 or P<0.05）,LC3B、Beclin-1表达下调（P<0.01 or P<0.05）,提示益气活血方联合骨髓间充质干细胞组诱导自噬效应最显着。BNIP3蛋白WB检测显示:与假手术组比较,模型组大鼠心肌BNIP3蛋白表达上调（P<0.01）;与模型组比较,各给药组可下调BNIP3蛋白表达（P<0.01 or P<0.05）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比,益气活血方组和骨髓间充质干细胞组BNIP3蛋白表达上调（P<0.01）。mi R-210与BNIP3 Mrna PCR检测结果显示,与假手术组比较:模型组大鼠心肌mi R-210表达下调（P<0.01）,BNIP3 mRNA表达水平上调（P<0.01）;与模型组比较:益气活血方组和益气活血方联合骨髓间充质干细胞组可上调mi R-210表达（P<0.01 or P<0.05）,骨髓间充质干细胞组mi R-210表达有下降趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）,各给药组可下调BNIP3 mRNA表达情况（P<0.01）;与益气活血方联合骨髓间充质干细胞组相比:益气活血方组和骨髓间充质干细胞组mi R-210表达下降,（P<0.01）,骨髓间充质干细胞组BNIP3 mRNA表达水平上升（P>0.01）,益气活血方组BNIP3 mRNA有上升趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。提示益气活血方可能通过mi R-210/BNIP3通路发挥作用,且益气活血方联合骨髓间充质干细胞效用最为显着。结论:1、益气活血方联合骨髓间充质干细胞能够提高心梗后射血分数,改善大鼠的心脏结构,减轻心脏损伤。2、益气活血方通过干预SDF-1/CXCR4轴增加BMSCs向梗死区富集效率。3、益气活血方联合骨髓间充质干细胞可能通过调控mi RNA-210/BNIP3轴,影响心肌细胞自噬-凋亡,发挥抑制VR机制。

杨燊^[5]（2021）在《冠脉内间充质干细胞移植对急性心肌梗死后左室功能影响的Meta分析》文中进行了进一步梳理背景:在以往多种临床试验中,已经研究了几种用于辅助治疗急性心肌梗死的基于间充质干细胞的疗法,但是其临床获益仍然存在争议。这项荟萃分析旨在评估间充质干细胞冠脉内移植对急性心肌梗死患者左室功能的影响。目的:系统评价间充质干细胞冠脉内移植对急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）患者直接经皮冠状动脉介入治疗（primary percutaneous coroary intervention,PPCI）术后左室功能的影响,并为今后的临床治疗提供高质量证据。方法:计算机检索Pubmed、The Cochrane Library、EMbase等外文数据库,中国知网、维普数据库、万方数据库等中文数据库,查询有关间充质干细胞冠脉内移植治疗急性心肌梗死患者的随机对照试验,检索时间为建库至2020年10月。经过两名系统评价员根据文献纳入与排除标准筛选文献,并提取资料中的相关重要信息,采用Rev Man 5.3软件评价纳入文献的偏倚风险并进行Meta分析。结果:根据纳入及排除标准最终纳入9篇随机对照试验,合计455名急性心肌梗死患者,通过meta分析提示:与常规治疗药物相比,急性心肌梗死患者在接受间充质干细胞移植后左室射血分数有明显改善（MD=6.12%,95%CI:3.25-9.00,P<0.0001）,但在预防及逆转左室重构方面无统计学差别（左室舒张末期容积MD=-4.35ml,95%CI,-13.88-5.17%,P=0.37,左室收缩末期容积MD=-4.65ml,95%CI,-12.25-2.94%,P=0.23）。通过亚组分析可以发现这个获益可以持续至少12个月（其中3个月MD=8.09%,95%CI,0.44-15.74%,P=0.04;6个月MD=4.08%,95%CI,1.8-6.36%,P=0.0004;12个月MD=2.45%,95%CI,0.79-4.11%,P=0.004）。且对于左室射血分数<50%的急性心肌梗死患者临床获益更大（低LVEF基线组MD=7.97%,95%CI,1.77-14.17%,P=0.01,高LVEF基线组MD=2.71%,95%CI,-0.36-5.77%,P=0.08）。当移植的间充质干细胞数量大于107时对于左室射血分数的改善更有获益（MD=7.41%,95%CI,1.22-13.59%,P=0.02）。结论:间充质干细胞冠脉内移植可以显着改善急性心肌梗死患者左室射血分数。但是在左室重构方面,尚无足够证据证明间充质干细胞能够逆转左室重构。

冯雨菲,何贵新,胡梦弦,郑国坤,肖婷,玉黎燕,申永艳,陈天宇,秦伟彬^[6]（2021）在《干细胞移植及中医药干预治疗心肌梗死的研究新进展》文中进行了进一步梳理随着经济社会的快速发展,生活方式的改变以及人口老龄化的愈加严重,心肌梗死的发病率和病死率呈现明显的上升趋势,已然成为全世界范围内重大公共卫生问题。相较于其他治疗手段,干细胞移植作为修复梗死心肌的治疗思路越来越受到重视,其主要通过分化心肌细胞、促进血管新生和旁分泌功能三个方面来发挥修复作用,进而达到治疗效果。而中医药具有疗效确切、毒副作用小、多靶点、多环节、多通路的特点,在干细胞的增殖分化、迁移归巢等方面均起到积极作用。通过对干细胞移植治疗心肌梗死种类、机制、输注方式以及中医药干预等方面进行阐述,为相关研究提供参考。

郭文静^[7]（2021）在《心包腔注射脂肪源性干细胞对大鼠心力衰竭的影响》文中研究表明背景干细胞移植治疗心肌损伤是目前研究的热点之一。心脏干细胞移植有多种途径,包括直接心肌注射、导管介入注射、静脉注射、冠脉注射等。这些方法的共同缺陷是植入的细胞数量少,或者对心肌有创。探讨长期有效的细胞移植途径是目前渴望解决的关键问题。心包腔具备细胞向心肌迁移的解剖学基础,向心包腔注入的干细胞是否可以起到缓释治疗效果,尚缺乏试验研究。目的探讨脂肪源性干细胞（adipose derived stem cells,ADSCs）经心包腔注入后对大鼠心力衰竭（heart failure,HF）的治疗作用,为进一步应用干细胞治疗心肌损伤提供新的途径。方法1.选择4-6周SD大鼠,酒精浸泡,取其腹股沟皮下脂肪组织,分离纯化、培养ADSCs。利用免疫组织化学染色及免疫荧光染色技术对其进行干细胞鉴定,所选表面标志物为CD29、CD44、CD73、CD45。2.选用6-8周雄性SD大鼠40只,常规饲养一周后,分为治疗组、HF组和假手术组。HF组、治疗组各15只大鼠,经腹腔注射盐酸阿霉素构建HF模型;假手术组10只大鼠,同样的方法注射生理盐水。小动物超声分别检测三组SD大鼠心功能,左室射血分数（LVEF）<50%为造模成功。本次造模死亡率约为30%。3.将鉴定后的ADSCs经心包腔注射入治疗组大鼠心包腔内;小动物活体成像检测移植细胞的所在部位,组织切片观察细胞是否透过心外膜进入心脏组织。4.分别取三组大鼠心脏的新鲜组织,提取蛋白和冰冻切片;分别用Western-Blotting和免疫组织化学染色技术检测假手术组、HF组和治疗组各标本的BNP、α-SMA和CRP的表达情况。结果1.免疫组织化学显色结果显示,腹股沟脂肪组织提取的ADSCs表达CD29、CD44和CD73,不表达CD45。免疫荧光单标结果与免疫组织化学结果一致,免疫双标显示,CD44和CD73在ADSCs中共表达。2.冰冻切片镜下观察发现:心包腔注射ADSCs后4天注射的细胞在心外膜下密集分布,5天以后开始在心肌组织中散在分布。小动物活体成像结果显示,经心包注射的细胞在心脏部位广泛分布,其荧光强度在10天之内一直维持较高水平,10天以后荧光强度逐渐减弱。3.Western-blotting结果显示,假手术组大鼠心肌组织中仅含有少量的BNP,HF组大鼠心肌细胞中含有大量BNP,治疗组BNP含量则有所下降（P<0.05）。α-SMA含量与BNP含量大致相同,且同样在治疗组中相对较少（P<0.05）。CRP在假手术组含有较少,HF组较多,治疗组中含量最多（P<0.05）。免疫组织化学结果与Western-blotting结果一致。结论经心包腔注射脂肪源性干细胞能够穿透心外膜,向心肌内迁移,对HF具有一定的治疗作用。

李记泉^[8]（2020）在《针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究》文中研究指明目的:本文以急性心肌缺血（Acute Myocardial Ischemia,AMI）大鼠为研究对象,以针刺联合骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs）静脉移植为干预手段,旨在探讨针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。材料与方法:1.BM-MSCs的分离、培养、传代、鉴定和标记:健康雄性SD大鼠3只（SPF级,4周龄,体重150-160g）,采用7%水合氯醛（5 m L/kg）腹腔注射麻醉,浸泡于75%酒精消毒5min,无菌条件下取胫骨、股骨,PBS缓冲液冲洗出骨髓制成单细胞悬液,离心后接种于培养瓶,放置于培养箱中采用全骨髓贴壁法培养,及时更换培养基,待细胞铺满培养瓶底部并融合成单层时,用0.25%胰蛋白酶消化后,按1:2传代培养,显微镜观察细胞形态变化,取第三代细胞采用流式细胞仪检测细胞表面标记（CD29、CD73、CD90、CD44、CD45）,并取第三代细胞Brd U标记后采用荧光显微镜观察阳性细胞标记率。2.AMI大鼠模型的制备:60只健康雄性SD大鼠,腹腔注射7%水合氯醛（5 m L/kg）麻醉,通过结扎冠状动脉左前降支复制AMI大鼠模型,将存活的大鼠随机分为模型组、干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组,每组10只;同时另有15只大鼠仅在相同部位穿刺手术缝合线而不结扎,随机挑选术后存活大鼠10只作为假手术组。3.针刺联合BM-MSCs静脉移植干预AMI大鼠:造模结束后1小时,干细胞组、针刺联合干细胞组大鼠经尾静脉注射0.5ml的BM-MSCs（2×106个/ml）,同时其余各组注射同等剂量的生理盐水。对针刺组、针刺联合干细胞组大鼠采取电针双侧内关、心俞穴,刺入皮下深度2-3mm,疏密波,频率2Hz,强度2m A左右,以局部肌肉出现轻度震颤收缩为度,留针30min,24h治疗一次,共治疗10次;其他各组不针刺,但在同时同地以同样方式进行抓取和固定。期间观察各组大鼠体重、毛发、体态、饮食、二便、运动等一般情况。治疗结束后检测各组大鼠心电图、心脏超声,随即处死各组大鼠,取腹主动脉全血,分离出血清备用;同时快速取出心脏,生理盐水冲洗干净,每组随机挑选1个心脏样本,在缺血区域切薄片5片,用于大鼠心肌缺血面积的测定,其他心脏样本—80℃超低温冰箱冻存备用。本文分两个部分讨论针刺联合BM-MSCs静脉移植改善大鼠急性心肌缺血作用情况,并从炎症反应、细胞凋亡及生长因子变化三个方面探讨了针刺联合BM-MSCs静脉改善大鼠急性心肌缺血的相关分子生物学机制。（1）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI作用研究观察BM-MSCs传代培养时的形态学特征与变化,分析BM-MSCs的鉴定和标记结果,采集大鼠心电图和心脏超声数据并分析,采用氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色法测定AMI后各组大鼠的心肌缺血面积。（2）针刺联合BM-MSCs移植改善大鼠AMI相关分子机制研究苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining,HE）染色法检测AMI后各组大鼠心肌细胞形态和炎症浸润情况;蛋白质印迹法（Western Blot,WB）技术检测大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、NF-κB、VEGF、b-FGF、TGF-β蛋白的相对表达量;酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）技术检测大鼠心肌TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10蛋白的相对表达量。结果:1.与假手术组比较,模型组大鼠LVDd、LVDs明显升高（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠LVDd、LVDs、LVEF、LVFS无明显差异（P>0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠LVDd、LVDs明显降低（P<0.01）,而LVEF、LVFS明显升高（P<0.01）。2.假手术组大鼠未见心肌缺血;与假手术组比较,模型组大鼠心肌缺血面积明显升高（P<0.01）,缺血区面积占左心室总面积的18.39%;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌缺血面积比例无明显变化,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积比例均明显降低（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌缺血面积明显高于针刺组、干细胞组（P<0.01）。3.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01或P<0.05）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中NF-κB、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8相对表达量明显降低（P<0.01）。4.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中IL-10相对表达量明显升高（P<0.01）。5.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显降低（P<0.01）;针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bax、Caspase-3相对表达量明显低于针刺组、干细胞组（P<0.01）。6.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量无明显变化（P>0.05）,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中Bcl-2相对表达量明显升高（P<0.01）。7.与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与模型组比较,干细胞组、针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与干细胞组比较,针刺组、针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）;与针刺组比较,针刺联合干细胞组大鼠心肌组织中VEGF、b-FGF、TGF-β相对表达量明显升高（P<0.01）。结论:1.针刺联合BM-MSCs移植能够显着改善AMI大鼠心电图和心脏超声变化,降低AMI大鼠左心室心肌缺血面积,提高AMI大鼠心脏功能,为临床治疗本病提供了新思路。2.针刺联合BM-MSCs移植能够通过下调AMI大鼠NF-κB表达,降低炎症因子TNF-a、IL-1、IL-6、IL-8水平,以及上调抑炎因子IL-10水平,减轻AMI后过度表达的炎症反应,从而减轻心肌细胞坏死;通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达,从而减少AMI后心肌细胞凋亡;通过调节细胞生长因子VEGF、b-FGF、TGF-β表达,诱导内皮细胞形成,从而改善心肌供血。

李勇^[9]（2019）在《骨髓间充质干细胞分泌外泌体中miRNA-301调节心肌自噬对心肌梗死的保护作用》文中研究表明急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）是威胁人类健康的常见疾病,尽管急诊冠状动脉介入和溶栓等治疗手段在一定程度上可减轻最初的心肌损伤,但无法逆转心肌梗死后大量心肌细胞坏死和损失的问题。心肌梗死后心肌细胞坏死是导致心室重构及心力衰竭的主要原因,进一步影响患者预后,因此,需要我们寻求更为理想的治疗方法以减少心肌细胞死亡或促进心肌细胞修复。许多动物模型研究表明以间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）为代表的干细胞治疗在心肌梗死治疗中显示出一定的作用,因为MSCs具有旁分泌功能及分化潜能。虽然已有研究证实MSCs治疗心肌梗死能减少心肌梗死面积、改善心功能,但也有学者提出,MSCs临床应用尚不成熟,主要表现为:MSCs分化为心肌细胞需要特殊微环境及体内外细胞因子诱导,尚无很好办法使MSCs有效分化为心肌细胞;干细胞移植存在成活率、分化率低和归巢量少等问题;安全性仍不明确,存在致瘤风险;异体移植仍然遥远;急性期药物溶栓和急诊冠状动脉介入是主要治疗手段,将MSCs移植于心脏也不符合实际,MSCs对急性期治疗效果仍不明确。因此,亟需新的治疗手段解决这些问题。MSCs具有旁分泌功能,其有益作用很大程度上是由旁分泌介导的,其中外泌体（exosomes）被认为是干细胞发挥主要作用的旁分泌因子之一。外泌体是一种由细胞通过胞吐作用分泌至胞外的膜性囊泡状小体,含有丰富的细胞因子、蛋白质、磷脂以及核糖核酸（RNA）。外泌体作为细胞之间信号传递的载体,广泛参与心血管疾病的病理和生理调节。外泌体及其所含有的微小RNA（microRNA,miRNA,miR-）在细胞间物质及信息的传递中起着非常重要的作用,尤其是从干细胞到心血管细胞传递过程中。外泌体及其miRNA也是心肌细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、血小板和炎性细胞的重要调控因子,在动脉粥样硬化的发生和发展过程中起着重要作用。外泌体还具有抗炎、抗凋亡、抗免疫增生、抗纤维化和促血管形成等有益作用。干细胞分泌的外泌体所具有的以上特性和功能为我们治疗心肌梗死提供了一种新的方法,国内外大量研究发现干细胞来源的外泌体可促进心肌梗死后心肌细胞保护、改善心功能,同时促进血管生成,外泌体所含有的miRNA在上述作用中扮演着非常重要角色,但其确切机制并不十分清楚。急性心肌梗死导致大量心肌细胞死亡,而心肌细胞坏死在心肌梗死后心室重构和心功能不全发生和发展过程中起着十分重要的作用,心肌细胞存活对心肌梗死患者预后至关重要。心肌梗死后心肌细胞死亡过程包括细胞凋亡、坏死和自噬。自噬（autophagy）是细胞内高度保守的自我消化,是一种广泛存在的正常生理过程和防御反应,对维持心肌细胞内稳态非常重要,异常的自噬可导致心脏疾病的发展。自噬与许多心脏疾病状态有关,如心肌梗死、心脏肥大、心肌病、心脏纤维化和心力衰竭。miRNA是自噬重要的调控因子之一,miRNA可通过调控某些自噬相关基因（autophagy related gene,ATG）及其调节因子影响自噬水平,在心肌梗死及心肌缺血再灌注损伤中发挥着重要作用。miRNA作用于相关靶分子抑制心肌细胞死亡,在心肌梗死后细胞纤维化、缺血性心律失常、血管重塑等病理过程中起着重要作用。在心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤中miRNA可通过促进或抑制目的基因抑制心肌细胞凋亡、缩小心肌梗死面积。miRNA-301属于miR-130/301家族,有关miRNA-301文献报道大多与肿瘤相关,在多种肿瘤性疾病中过表达,如肝癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌等,影响肿瘤发生及预后。近来发现其在心肌细胞也有表达,广泛参与调控多种生物学和病理过程,如细胞分化、炎症反应和细胞凋亡。有研究表明急性心肌梗死后梗死周围组织和心肌细胞miRNA-301表达下调,但其表达在心肌梗死中的作用以及通过外源性转染方法是否对心肌梗死起到保护作用尚不十分清楚,本研究主要探讨骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs,BMSCs）分泌外泌体中miRNA-301对心肌梗死的保护作用及其可能机制。第一部分 miRNA-301在骨髓间充质干细胞分泌外泌体中的表达研究目的:分离大鼠骨髓间充质干细胞外泌体,将miRNA-301转染至外泌体,观察miRNA-301在骨髓间充质干细胞分泌外泌体中的表达情况,为后续研究提供实验数据。方法:提取、培养大鼠骨髓间充质干细胞,通过流式细胞技术鉴定骨髓间充质干细胞;然后分离外泌体,透射电镜下观察外泌体形态,应用Western blot检测外泌体表面蛋白标志物;骨髓间充质干细胞培养传至第3代,取融合度50%左右细胞,分为四组:空白对照组（无转染细胞）、miR-301mimics组（转染miR-301 mimics）、NM组（转染无关序列mimics）和miR-301抑制剂组（转染miR-301抑制剂）,通过实时定量PCR（RT-PCR）技术检测miRNA-301的表达。结果:初次接种后,骨髓间充质干细胞悬浮于培养液中,呈大小不一的圆形,24h后部分细胞贴壁伸展,72h后可见细胞呈片状聚集,形态有梭形、多角形,第7天可见大的克隆团形成。1:2传代后细胞生长迅速,P3代以梭形细胞为主,呈极性生长,细胞形态趋于稳定。流式细胞技术鉴定细胞表面抗原CD90、CD44、CD45的阳性率分别为99.8%、99.3%、0.4%,完全符合BMSCs的基本特征标志,原代培养的BMSCs具有纯度高,均一性强的特性。透射电镜下观察到BMSCs外泌体呈圆形或椭圆形,直径约60-160nm,有完整胞膜结构,内含低密度物质。Western blot结果显示,BMSCs分泌外泌体显着表达特异性外泌体表面蛋白CD9、CD63和CD81。对照组和NM组之间miRNA-301的表达水平无明显差异（P>0.05）,与对照组和NM组相比,miR-301mimics组miRNA-301的表达水平明显升高（P<0.05）。而miR-301抑制剂组低于对照组,明显低于NM组和miRNA-301mimics组（P<0.05）。结论:骨髓间充质干细胞分泌外泌体中的miRNA-301经转染后呈现高表达,为后续研究提供了良好的基础平台。第二部分 miRNA-301对大鼠心肌梗死面积及心功能影响研究目的:制作大鼠心肌梗死模型,局部注射间充质干细胞外泌体或转染miR-301和miR-301抑制剂的外泌体,4周后通过实时定量PCR（RT-PCR）技术检测各组miRNA-301的表达。应用Masson三染色评估心肌梗死面积。高分辨率超声仪测定各组大鼠左室收缩期末内径和左室舒张期末内径,计算左室射血分数和短轴缩短率,探讨miRNA-301对心肌梗死面积及心功能的影响。方法:构建大鼠心肌梗死模型,分别于梗死周边（心肌苍白和鲜红交界）区域注射磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer saline,PBS）、间充质干细胞外泌体、转染miR-301和miR-301抑制剂的间充质干细胞外泌体,随机分为5组:假手术组（n=6）、模型组（注射PBS,n=6）、BMSC-Exos组（注射间充质干细胞外泌体,n=6）、BMSC-miR-301-Exos组（注射转染miR-301的外泌体,n=6）和miR-301抑制剂组（注射转染miR-301抑制剂的外泌体,n=6）。4周后通过实时定量PCR（RT-PCR）技术检测各组miRNA-301的表达。心肌梗死后4周,采用10g/L戊巴比妥钠（50mg/Kg）腹腔注射麻醉大鼠,取仰卧位,使用Vevo770高分辨率动物超声影像系统,RMV704探头,频率为40 MHz,取左室乳头肌水平二维左室短轴切面,记录左室收缩期末径（left ventricular end-systolic diameter,LVESD）及左室舒张期末径（left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD）,由超声心动图电脑自动计算左室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）和左室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening,LVFS）,取连续3个心动周期的平均值。取心肌梗死后4周的心肌组织切片进行Masson染色评价心肌梗死面积,应用Image-Pro Plus（Media Cybernetics Inc.美国）软件分析每个心脏切片的梗死区域以及整个左心室面积。结果:心肌梗死4周后,BMSCs-Exos组和BMSC-miR-301-Exos组miRNA-301表达水平均高于模型组,BMSC-miR-301-Exos组其表达水平升高最明显,三组之间有统计学差异（P<0.05）,而miR-301抑制剂组miRNA-301表达水平明显低于BMSCs-Exos组和BMSC-miR-301-Exos组,也低于模型组（P<0.05）。超声心动图结果显示,与模型组比,无论是BMSC-Exos组还是BMSC-miR-301-Exos组的LVEF、LVFS均明显升高,LVESD和LVEDD均明显下降,BMSC-miR-301-Exos组变化最显着,差异具有统计学意义（P<0.05）。与BMSC-Exos和BMSC-miR-301-Exos组比较,miR-301抑制剂组LVEF和LVFS均明显降低,LVESD和LVEDD均明显升高（P<0.05）。Masson三染色结果显示,与Model组比较,BMSC-Exos组和BMSC-miR-301-Exos组大鼠的心肌梗死面积均减少,BMSC-miR-301-Exos组最显着,并且心梗区域的瘢痕组织明显增厚,局部膨出减少（P<0.05）。miR-301抑制剂组心肌梗死面积明显高于BMSC-Exos组和BMSC-miR-301-Exos组,心肌梗死区域疤痕组织也明显减少（P<0.05）。结论:BMSCs分泌外泌体中的miRNA-301能改善大鼠心肌梗死后心功能和减少心肌梗死面积,通过外源性转染miRNA-301后BMSCs分泌的外泌体改善对心肌梗死心功能和心肌梗死面积作用更明显,为体外转染miR-301治疗心肌梗死可能提供了新的途径和方法。第三部分 BMSCs分泌外泌体中的miRNA-301通过抑制心肌自噬保护心肌梗死目的:通过透射电镜下观察假手术组、模型组、BMSC-Exos组、BMSC-miR-301-Exos组和miR-301抑制剂组大鼠心肌自噬小体变化和Western blot检测各组大鼠自噬标记蛋白LC3II/LC3I和P62水平,探讨miRNA-301抑制心肌梗死可能的机制。方法:取各组大鼠心肌梗死周边区域心肌组织,制作心肌组织切片,提取蛋白,然后应用Western blot检测各组大鼠自噬标记蛋白LC3-II/LC3-I比值和P62蛋白水平,透射电镜观察各组大鼠模型中心肌自噬小体变化。结果:与模型组比较,BMSCs-Exos组大鼠中LC3-II/LC3-I的比值降低（P<0.05）,P62水平上调（P<0.05）。与BMSCs-Exos组相比,BMSCs-miR-301-Exos组大鼠中LC3-II/LC3-I的比值明显下降（P<0.05）,P62水平也明显上调（P<0.05）。BMSCs-miR-301抑制剂组LC3-II/LC3-I高于模型组和BMSCs-miR-301-Exos组,而P62水平明显低于两组,组间差异均具有统计学差异（P<0.05）。透射电镜下观察各组大鼠模型中心肌自噬小体的变化,结果显示,与模型组相比,BMSCs-Exos组大鼠梗死周边区心肌组织中自噬体数量减少,与BMSCs-Exos组相比,BMSCs-miR-301-Exos组大鼠梗死周边区心肌组织中自噬体数量明显减少,而BMSCs-miR301抑制剂组自噬小体数量明显增多（P<0.05）（见Fig.B）。结论:BMSCs分泌外泌体中的miRNA-301可能通过抑制心肌自噬对心肌梗死起到保护作用。

施盛^[10]（2018）在《Shh基因过表达的间充质干细胞在心肌梗死治疗中的疗效探究》文中研究表明背景:间充质干细胞（MSCs）是一类具有自我更新能力的细胞,在一定的诱导条件下它能够分化为脂肪细胞、成骨细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等多种细胞类型的多能干细胞,并能分泌多种生长因子诱导血管生成。这使得间充质干细胞在再生医学方面得到了广泛的关注。目前,利用干细胞移植技术治疗缺血性疾病是一个快速发展的领域,其安全性和有效性已经被不同的研究证实。MSCs治疗缺血性心肌病其原理是通过移植或动员干细胞进入缺血性的心肌组织,增加梗死区域心肌样细胞数量及毛细血管数量,逆转心脏重构,进而改善心功能。虽然MSCs向心肌细胞分化能力还存有争议,但MSCs向内皮细胞、平滑肌细胞或血管周细胞的分化能力已得到证实。血管生成能力的增强有助于增加血管数量,从而改善心脏功能。MSCs移植可以通过刺激血管生成来促进心肌的修复,是一种有前景的缺血性心脏病治疗的细胞类型。Hedgehog（Hh）蛋白是一种在胚胎发育过程中具有重要作用的成形素,它们控制着胚胎发育过程中不同的组织和器官的发育模式。VEGF信号通路是调节血管发育和内皮细胞分化的重要信号通路之一,VEGF诱导MSCs向内皮细胞分化的确切调控机制还未明确。Shh与多种血管生成因子相关,能促进VEGF的表达,参与血管的新生,对急性及慢性心肌缺血模型和缺血再灌注损伤模型有明显的治疗作用。Shh可以通过激活血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素促进血管生成,因此Shh可能是血管生成的关键调控分子之一,因此也被认为是增强血管生成较有前景的治疗分子。第一部分过表达Shh基因的大鼠BMSCs的构建目的:从大鼠中分离骨髓间充质干细胞,并利用慢病毒系统构建Shh过表达的MSCs细胞株。方法:首先从幼龄大鼠中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）,取传至第三代的细胞,流式细胞技术对表面相关标记分子进行检测。然后利用PCR扩增技术成功的克隆出了Shh基因,并利用慢病毒系统将Shh基因在BMSCs细胞中稳定过表达。结果:检测结果显示,CD90、CD29抗原在细胞表面高表达,MHC II和CD11b/c在细胞表面不表达,表明我们分离培养的细胞为骨髓间充质干细胞。RT-q PCR检测发现,MSCs中Shh m RNA的表达水平上调,且Shh m RNA表达水平在转染后3天和7天中增加了约3000倍和5000倍。结论:成功的从大鼠骨髓中分离出间充质干细胞,并成功的构建过表达Shh基因的MSCs细胞株。第二部分Shh基因促进BMSCs向内皮细胞分化能力的研究目的:体外实验验证过表达Shh基因后,对于MSC向内皮细胞分化的影响。方法:利用RT-q PCR分别检测Shh转染3天和7天后MSCs细胞中,促血管生成分子Ptch1、IGF1、HGF、Ang-1以及VEGF-A的表达水平,并在分别使用管样形成实验、Transwell迁移实验和体内胶栓实验,检测了MSCShh管样形成能力、细胞的迁移能力和向内皮细胞分化的能力。结果:过表达Shh后,MSCs细胞中促血管生成分子表达水平上调,MSCShh的管样形成能力、迁移能力和向内皮细胞分化的能力显着高于MSCNC对照组。而且转染后7天的MSCShh细胞的成管长度和节点数量以及向内皮细胞分化能力明显高于转染后3天的细胞。结论:过表达Shh基因后,MSCs中促血管生成生长因子的表达增加,体外迁移能力、成管能力增强以及血管新生的能力增强。第三部分过表达Shh基因的BMSCs治疗大鼠心肌梗死的疗效探究目的:大鼠心梗模型中验证过表达Shh基因后,MSC对心梗的修复效果。方法:将Shh过表达前后的MSC细胞,移植到大鼠心梗模型中。心超检测心功能的恢复情况,Masson染色观察纤维化心梗后的纤维化面积。结果:MSCNC以及MSCShh均能够修复心梗后的心功能,且向较于MSCNC组,MSCShh组的修复效果更加明显。结论:过表达Shh基因后,MSC细胞能更有效地减少梗死区域面积,改善心功能。第四部分Shh基因促进BMSCs的内皮细胞分化能力的机制探讨目的:进一步的研究探讨,过表达Shh基因的MSCs细胞向内皮分化的具体机制。方法:将MSCNC和MSCShh的进行高通量测序,并对测序结果进行初步分析,找出差异表达的基因,筛选靶基因。利用si RNA技术,将靶基因沉默后分别验证MSCNC细胞的成管能力和心梗修复的能力。结果:结果发现MSCShh中,VEGF-D等与血管生成相关的基因的表达远高于在MSCNC中的表达。特别是在过表达Shh后VEGF-D的表达水平明显上调,提示Shh分子可能通过促进VEGF-D的表达进而促进血管新生。并进一步分别在细胞水平和动物水平上对此进行验证。用si RNA抑制VEGF-D的表达后,MSCShh的成管能力下降,体内实验发现其心梗后的修复效果受到抑制。结论:Shh基因可以通过Shh/VEGF-D信号轴促进骨髓间充质干细胞的向内皮分化。

二、干细胞的生长分化特性及移植治疗急性心肌梗死的研究进展（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、干细胞的生长分化特性及移植治疗急性心肌梗死的研究进展（论文提纲范文）

（1）缺血性心衰心脏m1A甲基化谱（论文提纲范文）

（2）活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究（论文提纲范文）

（3）负载hiPSC-CM和hiPSC-EC的三维纳米纤维SpGel对心梗的治疗（论文提纲范文）

（4）益气活血方联合骨髓间充质干细胞干预心肌梗死后心室重构的实验研究（论文提纲范文）

（5）冠脉内间充质干细胞移植对急性心肌梗死后左室功能影响的Meta分析（论文提纲范文）

（6）干细胞移植及中医药干预治疗心肌梗死的研究新进展（论文提纲范文）

（7）心包腔注射脂肪源性干细胞对大鼠心力衰竭的影响（论文提纲范文）

（8）针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究（论文提纲范文）

（9）骨髓间充质干细胞分泌外泌体中miRNA-301调节心肌自噬对心肌梗死的保护作用（论文提纲范文）

（10）Shh基因过表达的间充质干细胞在心肌梗死治疗中的疗效探究（论文提纲范文）

四、干细胞的生长分化特性及移植治疗急性心肌梗死的研究进展（论文参考文献）

• [1]缺血性心衰心脏m1A甲基化谱[D]. 孙维兴. 遵义医科大学, 2021(01)
• [2]活血温通方联合BMSCs移植改善心梗后缺血缺氧微环境的机制研究[D]. 王擎擎. 中国中医科学院, 2021(02)
• [3]负载hiPSC-CM和hiPSC-EC的三维纳米纤维SpGel对心梗的治疗[D]. 官格. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
• [4]益气活血方联合骨髓间充质干细胞干预心肌梗死后心室重构的实验研究[D]. 冀楠. 天津中医药大学, 2021(01)
• [5]冠脉内间充质干细胞移植对急性心肌梗死后左室功能影响的Meta分析[D]. 杨燊. 福建医科大学, 2021(02)
• [6]干细胞移植及中医药干预治疗心肌梗死的研究新进展[J]. 冯雨菲,何贵新,胡梦弦,郑国坤,肖婷,玉黎燕,申永艳,陈天宇,秦伟彬. 中华中医药学刊, 2021(03)
• [7]心包腔注射脂肪源性干细胞对大鼠心力衰竭的影响[D]. 郭文静. 新乡医学院, 2021(01)
• [8]针刺联合骨髓间充质干细胞移植改善大鼠急性心肌缺血研究[D]. 李记泉. 辽宁中医药大学, 2020(01)
• [9]骨髓间充质干细胞分泌外泌体中miRNA-301调节心肌自噬对心肌梗死的保护作用[D]. 李勇. 河北医科大学, 2019(01)
• [10]Shh基因过表达的间充质干细胞在心肌梗死治疗中的疗效探究[D]. 施盛. 苏州大学, 2018(06)

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