一、鼠疫杆菌基因测序已完成（论文文献综述）
马彩红[1]（2021）在《鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及鸡5种病毒多重PCR诊断方法的初步建立》文中认为鸡传染性支气管炎（Infectious bronchitis,IB）、禽流感（Avian influenza,AI）、新城疫（Newcastle disease,ND）、鸡传染性法氏囊病（Infectious bursal disease,IBD）和鸡痘（Fowl pox,FP）是禽常见的重要病毒病。由于IBV有着较大的抗原性差异以及国内广泛的应用针对IBV不同血清型的疫苗,所以分离当地流行毒株并对其S1基因进行遗传进化分析,对于研究可持续的疫苗接种策略非常重要。IB、AI、ND、IBD及FP具有高度传染性,常发生混合感染或继发感染,建立一种简便、快速能同时检测5种病原的多重PCR诊断方法,有助于禽类疾病的预防和快速诊断。1.从乌鲁木齐市某鸡场无菌采集疑似IB鸡只的组织样品,进行病毒分离鉴定。通过分子生物学试验、血凝特性试验、鸡胚矮小化试验、新城疫病毒干扰试验、鸡胚半数感染量测定、致病性试验及部分理化特性试验表明,分离株在鸡胚上连传5代出现侏儒胚现象并且可以抑制NDV在鸡胚中的增殖,只有经过1%的胰酶处理之后才可对鸡红细胞起到凝集作用,经计算其EID50为10-4.58/0.1m L,为中等毒力毒株,攻毒组较正常组雏鸡气管内有大量粘液且肺脏肿大,表现为呼吸型毒株特征,对热、脂溶剂敏感,对1%胰蛋白酶有一定的耐受性,对酸的耐受性要差于对碱的耐受性。证实该病原为IBV毒株。2.将分离株S1基因测序结果与Genbank已发表参考株S1基因进行遗传进化分析,结果显示,该分离株与IBV/I0221/17/China株关系最近,二者单独形成一个分支,其与TC07-2株、GX-NN09032株、ck/CH/IBTZ株及CK/CH/GD/HY16株形成一个独立的发育进化群,均属于TC07-2/GVI-1型IBV;与国内常用的H120、H52、M41等疫苗株的同源性仅为59%～65%,其S蛋白裂解位点序列为HRRKR,将其命名为IBV/CK/CH/01/2020株。3.依据NCBI核酸数据库中IBV、AIV、NDV、IBDV及FPV基因序列,设计5对特异性引物,优化退火温度、反应循环数和引物浓度,进行特异性、敏感性试验,并进行临床检测。结果表明,建立的多重PCR方法对IBV、AIV、NDV、IBDV和FPV基因组DNA或c DNA均能有效扩增,对鹅细小病毒（GPV）、禽传染性喉气管炎病毒（ILTV）、禽4型副黏病毒（APMV-4）的核酸均无特异性扩增,特异性较强,对IBV、AIV、NDV、IBDV、FPV的重组质粒最低检测限分别为1×105拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×104拷贝/μL、1×104拷贝/μL,41份自然感染禽样品检测结果与单一PCR的检测的符合率为90.32%,表明所建立的多重PCR检测方法具有较好的特异性、敏感性和临床适用性。本研究主要了解乌鲁木齐某鸡场流行株的变异情况,为阐明IBV遗传变异规律提供实验数据;为鸡5种病毒病单独或混合感染的鉴别提供了一种操作简单、快速的多重PCR方法,对有效预防、控制和扑灭这些禽类病毒病提供技术支撑。
穆慧[2]（2021）在《中国小肠结肠炎耶尔森菌分布特征与旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的调查研究》文中指出第一部分 中国小肠结肠炎耶尔森菌分布特征目的通过对中国1980-2019年不同地区小肠结肠炎耶尔森菌的病原学与PFGE型别特征分析,为小肠结肠炎耶尔森菌病的防控提供依据。方法对中国不同区域、不同来源标本分离到的6847株小肠结肠炎耶尔森菌,进行血清型别、生化表型、毒力基因分布研究,对致病性菌株进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）型别聚类分析。结果1.本研究中分离到的6847株小肠结肠炎耶尔森菌主要来源于动物（88.36%,6050/6847）,其次是腹泻病人（6.44%,441/6847）、食品（4.76%,326/6847）及外环境（0.44%,30/6847）。在动物源菌株中,以猪源株占比最高（43.24%%,2616/6050）,其次为啮齿类（27.69%,1675/6050）。2.小肠结肠炎耶尔森菌中致病性菌株2047株、非致病菌4800株。致病性菌株仅存在O:3和O:9两种血清型,O:3占比88.96%（1821/2047）、O:9占比11.04%（226/2047）。18个省市自治区的致病株以O:3血清型为主,宁夏回族自治区以O:9血清型为主。非致病菌在调查的22个省份均有分布,血清型众多,普遍比致病株具有更多的阳性生化反应。3.致病株共有两种组合,其中Ⅰ型占92.67%（1897/2047）,携带ail、ystA、yadA和virF基因,Ⅱ型占7.33%（150/2047）,为丢失毒力质粒的致病菌。非致病株以携带ystB基因的Ⅲ型和所有毒力基因均不携带的Ⅳ型占比较高,分别占62.83%（3016/4800）、36.19%（1737/4800）。上述四种典型的基因型别（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）在所有调查的22个省份大多数省份有分布。此外,非致病株还存在仅携带ail基因（Ⅵ型）或同时携带ail和ystB基因（V型）的菌株分布于个别省份。4.1821株O:3致病株分为93个PFGE型别,分布19个省市自治区,其中K6GN11C30021、K6GN11C30012为优势带型分别占比46.35%、22.5%,75.38%的人源菌株与分离自当地的动物、食品菌株带型一致;226株O:9致病株共分为14个PFGE型别,分布于8个省市自治区,77.78%人源菌株与分离自当地的动物、食品菌株带型一致。结论1.我国小肠结肠炎耶尔森菌分布广泛、宿主众多,致病株仅有两个血清型,非致病株血清型众多,可能比致病株具有更强的生化代谢能力与环境适应力。2.非致病菌株普遍比致病性菌株具有更多的阳性生化反应,表明其可能具有更强的生化代谢能力与环境适应力。致病株中,O:3血清型与O:9血清型的主要生化编码亦不存在交叉,表明二者可能具有不同的生化分解能力与生态位。3.致病性菌株PFGE优势带型相对集中,地域分布广泛,多数人源菌株与分离自当地的动物、食品菌株带型一致,应警惕通过家畜家禽、食品及外环境等多种来源感染人的风险。第二部分 旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的调查研究目的了解鼠疫自然疫源地中旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的情况,为无形体病与鼠疫的防控提供科学依据。方法1.对采集到的旱獭标本检测嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因与groESL基因,对巢式序列进行测序比对;2.以嗜吞噬细胞无形体阳性的旱獭组织研磨液感染BALB/c小鼠及L929细胞,检测嗜吞噬细胞无形体16SrRNA基因与groESL基因并测序。结果1.从2019年至2020年在中国甘肃省肃北县喜马拉雅旱獭鼠疫自然疫源地共采集到212只旱獭,总阳性率为20.75%（44/212）,其中被捕获的活体旱獭的嗜吞噬细胞无形体阳性检出率为19.21%（29/151）,自毙旱獭检出率为24.59%（15/61）。分布于旱獭的心、肝、脾、肺、骨髓中。2.旱獭来源的嗜吞噬细胞无形体的16S rRNA基因序列、groEL核苷酸序列,GroEL氨基酸序列与嗜吞噬细胞无形体参考菌株HZ（CP000235.1）的同源性分别为99.52%（1463/1470）,94.07%（1173/1247）和99.52%（413/415）。3.旱獭组织中的嗜吞噬细胞无形体成功感染BALB/c小鼠及L929细胞,可从小鼠中及L929细胞再次检测到嗜吞噬细胞无形体。结论1.本研究首次发现旱獭携带嗜吞噬细胞无形体,具有较高的携带率,并分布于全身多个脏器。2.旱獭可能是嗜吞噬细胞无形体的储存宿主。
孔进姣[3]（2020）在《1950-2019年德宏州鼠疫分子流行病学研究》文中研究表明目的探究上世纪50年代以来德宏州鼠疫疫情的流行病学特征及其所分离鼠疫菌株的基因组流行病学特征,为鼠疫防治提供理论支撑。方法收集1950-2019年德宏州动物和人间鼠疫疫情资料、监测数据资料,进行描述性流行病学分析;将德宏州鼠疫菌菌株进行高通量测序测序,结合NCBI上已公布的368个鼠疫耶尔森氏菌全基因组序列进行系统发育分析,分析德宏州鼠疫菌的基因分型;把1.ORI2分支上的172株菌重新建立ML树,进行基因组进化种群结构研究;把1.ORI2分支内的三个主要种群单独建立ML树,并结合流行病学资料分析各亚群内及亚群间的传播模式。通过SNPs分析、INDEL分析、基因组获得缺失分析和BLSAT比对进行基因组变异分析,明确两个流行期间的基因差异,采用贝叶斯法构建BEAST树,推算祖先时间和菌株进化时间。结果（1）1950-2019年先后在德宏州5个县（市）的36个乡（镇）判定疫点数614个,发现1153例人间病例,死亡379例,从宿主及媒介体内分离出鼠疫菌1577株和418株。（2）德宏州鼠疫菌中存在1.ORI2、1.ORI3、1.IN2、2.ANT和2.MED 5种基因型,1.ORI2种群为优势种群（包括1.ORI2A、1.ORI2B、1.ORI2C三个亚群）,1.ORI2A亚群分布的主要是五十年代盈江县和陇川县菌株,1.ORI2B亚群主要分布的是八十年代陇川县和瑞丽市的菌株,1.ORI2C亚群分布的是九十年代盈江县的菌株。（3）1950-1955年（流行期1）的传播模式是陇川县→盈江县和梁河县,1982-2007年（流行期2）的传播模式是瑞丽市→陇川县、盈江县→梁河县和芒市。（4）五十年代优势种群为1.ORI2A,八十年代后被1.ORI2B所替代,九十年代后1.ORI2C又取代1.ORI2B成为本地的优势种群并在本地定植。（5）SNPs分析鉴定出179个位点,非编码区有67个,编码区有112个,编码区的位点中非同义突变位点77个,同义突变位点35个,其中5个SNPs发生在流行期1,12个SNPs发生在流行期2。（6）INDEL分析鉴定出125个位点,37个位于非编码区,88个位于编码区,编码区的88个位点位于64个基因上,有69个发生了移码突变,其中有3个发生于流行期1,5个发生于流行期2。（7）基因获得缺失分析发现与八十年代菌株相比较,五十年代菌株缺失了64个基因,九十年代菌株缺失了11个基因,64个基因中有58个位于pgm位点上。（8）BEAST分析推算出德宏鼠疫菌的祖先时间是1938年,1.ORI2A亚群的进化时间是1944年,1.ORI2B亚群的进化时间是1976年,1.ORI2C亚群的进化时间是1986年。结论德宏州鼠疫菌多种基因型并存,两次流行虽由不同的谱系导致,但均是近史流行期疫情的延续,两个流行期的菌株均在进化过程中发生了不同程度的变异。而产生这种变异的原因,可能是受到有益于适应性进化的选择压力的影响。由于本地鼠疫流行呈现长期性、顽固性、稳定性的特点,目前虽然处于静息期,但疫情暴发的不确定性仍然存在。
章文慧[4]（2020）在《肠道菌群移植治疗溃疡性结肠炎的临床研究》文中提出目的溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是发病机制尚未明确的慢性复发性肠道疾病,现阶段以药物治疗为主,但是部分患者药物治疗效果不佳且副作用较多,因此需要探索安全有效新的治疗方法。研究表明,肠道菌群失衡在UC的发生、发展中起关键作用,肠道菌群移植将健康志愿者粪便中的菌群转移至病人肠道内,从而改变其肠道内的菌群组成,可以达到治疗肠道疾病的目的。但肠道菌群移植治疗UC的有效性和安全性仍存在争议,作用机制亦尚未阐明。本研究的目的是评估肠道菌群移植治疗UC的临床疗效及安全性,并探讨肠道菌群紊乱在UC发病过程中的相关机制。方法2018年4月-2019年6月,筛选在安徽医科大学第一附属医院就诊、美沙拉嗪治疗无效或激素抵抗、依赖的UC患者15例,进行多供者肠道菌群移植治疗,隔天一次,共3次。肠道菌群移植治疗前及治疗后6周进行疾病活动度Mayo评分;比较血液C-反应蛋白、血沉、白介素6、白介素10、肿瘤坏死因子-α、粪便钙卫蛋白在治疗前后的变化;16Sr RNA测序,检测肠道菌群移植治疗前后肠道菌群的变化;治疗前后行肠镜检查,进行内镜Mayo评分。参照文献,肠道菌群移植的治疗应答定义为:Mayo总评分下降≥3分;治疗缓解定义为Mayo总评分≤2分且内镜下Mayo评分≤1分。结果13例患者完成肠道菌群移植治疗及随访,6周治疗应答率为61.5%;治疗缓解率为46.1%。与治疗前相比,治疗后患者Mayo评分显着降低（P<0.01）。血液C-反应蛋白、血沉、白介素6、白介素10、肿瘤坏死因子-α治疗前后均无显着变化,但粪便钙卫蛋白治疗后显着降低（P<0.01）。肠道菌群移植治疗后患者肠道菌群多样性显着增多,菌群组成明显改变,其中与肠道促炎相关的肠杆菌科中数种菌属的含量明显降低,与肠道抑炎相关的小杆菌含量明显增加;通过LEf SE、STAMP差异代谢通路分析表明,治疗前后的代谢通路组成存在显着差异,聚氨生物合成超级通路II明显升高、维生素K族合成通路明显降低、肠内菌共生抗原合成通路明显减少。患者治疗后Mayo内镜评分显着下降（P<0.01）。研究中未见严重不良反应。结论肠道菌群移植后,患者疾病活动性评分、内镜评分及粪便钙卫蛋白均显着下降,肠道菌群多样性显着增加。肠道菌群移植治疗对于美沙拉嗪治疗无效或激素抵抗、依赖的活动性UC患者安全、有效。
孔进姣,石丽媛,王鹏[5]（2019）在《单核苷酸多态性（SNP）分析在鼠疫菌基因分型中的应用》文中研究说明鼠疫是一种人兽共患的烈性传染病,历史上曾给人类带来了巨大灾难,但是随着全基因测序的完成,我们对鼠疫有了更全面的了解,这为我们探寻引起其发生发展的因素提供了平台。本文通过对SNP分析的特征、应用条件及其在耶尔森氏鼠疫菌方面的研究进展进行综述,为今后鼠疫的暴发流行的追踪溯源研究提供相关信息,也为鼠疫的监测及防控提供理论依据。
崔保峰[6]（2019）在《基于鞭毛蛋白载体的口蹄疫表位疫苗研究》文中指出口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种急性、高度传染性和可快速远距离传播给猪、牛、羊等主要畜种及其他家养或野生的偶蹄类动物的动物疫病。鉴于疫苗接种策略在预防和控制口蹄疫中的关键作用,研制更安全、有效的口蹄疫疫苗已成为当务之急。基因工程表位疫苗具有良好的安全性且可诱导体液和细胞免疫应答,是一种潜在的候选疫苗。细菌的鞭毛蛋白是Toll样受体5（TLR5）识别的病原体相关分子模式（PAMP）,能够激活天然先天免疫和适应性免疫应答。越来越多的研究表明,将鞭毛蛋白作为递呈目的抗原到的载体可显着提高了抗原的免疫原性和保护效力。这提示人们开发基于鞭毛蛋白载体的重组蛋白疫苗是一种有前景的替代途径。本研究将口蹄疫病毒的两个关键B细胞表位的串联重复（2×B1B2）和一个截短的vp1（Δvp1）蛋白以不同的模式分别融合到带有一个通用型外源性T细胞表位的鞭毛蛋白的C-末端构建了三个重组鞭毛融合蛋白。其中,Δvp1和2×B1B2分别与鞭毛蛋白的C端融合而产生FT（FlagellinTruncated VP1）和FME（Flagellin-Multiple Epitopes）,Δvp1取代FME中鞭毛蛋白的D3区而产生FTME（Flagellin-Truncated VP1-Multiple Epitopes）。然后,本研究对三个重组蛋白的免疫原性和保护效力进行了评价。研究结果显示:1.三个重组融合蛋白在大肠杆菌中均获得有效表达。其中,FT和FME可溶性表达,而FTME则以包涵体形式存在。2.利用镍亲和层析柱纯化获得了高纯度的目的蛋白。并利用快速稀释法成功对FTME的包涵体进行复性。3.经western blotting和间接ELISA鉴定,FT、FME和FTME均能被口蹄疫病毒特异性抗体所识别,证明其抗原表位暴露,且由于FTME的抗原表位密度最高而抗原性最好。4.去除内毒素后的纯化蛋白经TLR5生物活性测定,表明三个重组融合蛋白具有与天然的鞭毛蛋白类似的能够刺激RAW246.7/hTLR5细胞分泌细胞因子TNF-α的功能（p>0.05）而缺失TLR5受体的RAW246.7细胞和不具有TLR5刺激活性的VP1蛋白则不能。5.与对照组相比,FT,FME和FTME在BALB/c小鼠体内均能诱导明显的相似的FMDV特异性IgG反应,且FTME的效果最佳（P<0.05）。6.不同的免疫途径（皮下免疫和肌肉免疫）在BALB/c小鼠体内诱导了相似的抗体应答水平。7.重组蛋白与给定的佐剂（ISA-206,poly（I·C）,MPLA和CpG-ODN）之间的联合免疫没有发现存在协同作用。8.虽然弱于商业化的灭活疫苗,三个融合蛋白在豚鼠体内均能诱导明显增强的体液免疫和细胞免疫应答,并上调豚鼠体内某些细胞因子（包括TNF-α,IFN-γ和IL-12）的水平。更重要的是,接种30μg FTME蛋白的豚鼠能够为抵抗病毒攻击提供80%的免疫保护。综上所述,本研究结果表明,融合蛋白FTME可作为未来口蹄疫预防和控制的一种新型的有前景的候选疫苗。
冯婧[7]（2018）在《克罗诺杆菌基因组测序与比较基因组学分析》文中指出克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）是一种极具污染风险的食源性致病菌,经常污染婴儿配方乳粉（powdered infant formula,PIF）及加工环境,可导致婴幼儿感染脑膜炎、菌血症等疾病,并具有极高的致死率。克罗诺杆菌在自然界中分布的广泛性及较强的环境适应能力,使其成为污染PIF的主要原因。克罗诺杆菌属具有丰富的遗传多样性,其种群特征在具有普遍性的同时也具有特殊性,即不同生境下的克罗诺杆菌的种群结构及遗传物质存在差异。在先前的工作中,本团队对分离自我国PIF及其加工环境中的克罗诺杆菌进行了群体结构及环境耐受相关研究,结果表明分离菌株与世界其他地区相比具有独特的种群特征,且不同序列型（sequence type,ST）菌株的耐受能力差异明显。为了进一步探索克罗诺杆菌遗传特征与环境适应的机制,挖掘菌株功能基因以及该属种间和种内遗传特点,揭示其遗传进化规律。本研究选取15株分离自PIF及其加工环境中的不同ST菌株进行de novo测序,同时从NCBI中下载已完成完成图测序的12株克罗诺杆菌作为参考菌株,共27株菌株进行克罗诺杆菌属的比较基因组分析。本研究主要内容及结果如下:（1）采用Illumina HiSeq 2500测序平台对15株克罗诺杆菌的全基因组进行测定,并通过SOAP denovo拼接获得框架图序列。结果表明,克罗诺杆菌基因组大小范围在4.34-4.57Mb,平均GC含量为56.88%,编码DNA序列（coding DNA sequence,CDS）4042个,tRNA数量在70-87之间,参考菌株rRNA数量均为22,测序菌株数量不及5个。同时使用Mauve2.3.1软件分别对克罗诺杆菌属内七种标准菌株种间及阪崎克罗诺杆菌种内基因组进行共线性分析。结果发现,共有4411个局部共线块,克罗诺杆菌属种间并没有发生大规模插入、缺失、倒位等现象,而阪崎克罗诺杆菌种内共线性较差,出现大规模基因组重排事件。（2）利用Jspeceis软件基于blast运算分析27株克罗诺杆菌基因组的平均核苷酸一致性分析（average nucleotide identity,ANI）。结果发现测序菌株CE13、CE15、CE16、CE28、CE29、CE32、CE52、CE55、CE56、CE56、CE62、CE63、CE64、CE65、CE75与5株C.sakazakii参考菌株,CMa与3株C.malonaticus参考菌株之间的ANI值均大于97%,而与其他5个物种菌株的ANI值均小于95%,结果表明,测序菌株可分别归属于阪崎及丙二酸盐克罗诺杆菌两个物种。可见基于全基因组序列平均核苷酸一致性计算是一种准确且有效的菌种判定方式,可用于克罗诺杆菌属的鉴定。（3）根据PGAP聚类分析数据,采用PanGP软件绘制27株克罗诺杆菌基因组稀释曲线。结果发现其泛基因组属于开放型,表明菌株间在选择压力下遗传物质交流频繁,暗示其基因库多样性较高。同时随着基因组数量的增多,大量新基因不断被发现,进一步说明克罗诺杆菌基因组具有高度的可塑性。同时利用Roary软件通过比较基因组学的方法定义27个克罗诺杆菌的泛基因组,并通过COG数据库进行功能注释。结果发现,27株克罗诺杆菌基因组划分成11262个直系同源簇,其中特有基因占总基因簇的43%。三类基因在26类功能分类中均有富集,表明克罗诺杆菌各项功能是由整体遗传物质统筹调控的。（4）通过比较克罗诺杆菌属种间基因组发现阪崎克罗诺杆菌物种特有基因包括编码外源唾液酸吸收和利用基因簇nanKCATE、自转运蛋白icsA、毒素-抗毒素系统生物膜蛋白tabA、蛋白酶htpX、鸟苷环化酶dosC、肽链内切酶mepS、S菌毛黏附蛋白sfaS前体、DNA连接酶B ligB、亮氨酸特异性结合蛋白前体livK、HTH-型转录调节因子lutR和leuO等44个毒力相关基因及20个假定蛋白。ST1菌株包括亚碲酸盐抗性基因簇terBDZWXY、血管性血友病因子a型结构域蛋白等特异毒力基因区域及13个假定蛋白。ST4菌株特异基因包括毒力因子ypjF、原噬菌体cps-53整合酶及19个假定蛋白。而ST8菌株并未发现特异毒力因子。（5）采用BLASTP程序将27株克罗诺杆菌的蛋白序列分别比对抗性基因CARD数据库中的同源蛋白模型序列,获得抗生素抗性基因。结果发现27株克罗诺杆菌共包含134个抗生素本体（Antibiotic Resistance Ontology,ARO）,主要含有抗生素抗性基因、多重耐药基因簇、多重外排系统及其调控因子。聚类分析表明菌株所携带耐药基因没有明显差异,且进化距离较近物种更为贴近。（6）应用PhyML程序及Mega软件分别完成基于全基因组,16S rDNA及持家基因串联序列的系统发育树构建。结果表明克罗诺杆菌属目前已经分化为C.muytjensii-C.dublinensis以及C.muytjensii-C.turicensis-C.sakazakii-C.malonaticus两大分支。前者主要进化为更适应于环境与植物结合的生态位群体,后者主要在进化中获取与毒力及宿主适应性相关等附属基因,从而增加致病能力。（7）应用ClonalFrameML及CODEML程序确定27株克罗诺杆菌核心基因组的重组区域及进化选择方向。结果发现27株克罗诺杆菌的核心基因组中均有重组事件发生,且均经历纯化选择。同时应用ISFinder及IslandViewer软件对27株克罗诺杆菌基因组中IS及GI进行预测,结果表明大量IS的分布可能是在选择压力下通过转座而形成的,而部分菌株GI中T6SS基因簇与柠檬酸杆菌中cts1簇同源的现象也进一步证实克罗诺杆菌基因组中水平基因转移事件发生的事实,从而增加该物种的遗传多样性及较强的环境适应能力。通过本研究,从基因层面剖析克罗诺杆菌遗传进化特征,使基因研究服务于生产实际,为PIF及婴儿食品中克罗诺杆菌的监测、有效防控和诊断治疗提供理论基础及新思路。
李宁娟[8]（2018）在《采用蛋白质组学结合高通量测序技术分离和鉴定抗CD47纳米抗体》文中指出CD47属于免疫球蛋白超家族成员之一,在多种肿瘤细胞表面高表达,CD47通过结合巨噬细胞表面的SIRPα并发出“别吃我”信号从而促使肿瘤细胞逃避巨噬细胞吞噬作用。同时,CD47在活化T淋巴细胞中高表达,其能与血小板反应蛋白1（TEP 1）结合,抑制T淋巴细胞的增殖与活化,进而影响T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。因此抗CD47单克隆抗体可以作为肿瘤免疫治疗中的一种新疗法。而纳米抗体是一种源于骆驼可变区的单域抗体,它是目前分子量最小且具有完全抗原结合功能的单域抗体,因此其在药物开发中具有巨大的潜力同时可以作为研究症断的高亲和试剂。本实验利用高通量测序技术和质谱技术联用获得抗CD47骆驼纳米抗体并检测抗体的亲和力,探索蛋白组学技术和基因组学技术在发现和鉴定过程中的价值。本研究内容主要包括以下三个方面:1骆驼免疫抗体库的高通量测序分析以及纳米抗体数据库的建立首先诱导表达以及纯化BL21-pET30a-CD47的原核重组蛋白CD47并免疫新疆双峰驼六次,通过间接ELISA方法测定第五次和第六次免疫血清中抗CD47抗体的滴度,分离全血中外周淋巴细胞,提取总RNA,反转录成cDNA,通过巢式PCR扩增骆驼VHH基因,并将扩增的VHH基因进行高通量测序,使用AbMining ToolBox分析高通量测序数据,利用Python去除数据库中的终止密码子并建立抗CD47纳米抗体氨基酸数据库。间接ELISA测定第六次免疫血清抗CD47抗体滴度为1:384 000,说明抗原CD47在骆驼体内激起了免疫反应,以cDNA为模板通过巢式PCR成功扩增VHH基因,利用高通量测序平台Illumina HiSeq共获得1 054 550条原始基因序列,去除接头序列和低质量序列后共获得序列945 061条,其中有效读长的核苷酸序列主要分布在300-350 nt,碱基质量大于20占总序列的97.67%,碱基质量大于30占总序列的95.58%。获得抗CD47纳米抗体氨基酸数据库为9.19×105。经AbMining ToolBox分析高通量测序数据,得到160 485条特异性的CDR3序列,其氨基酸长度主要分布8-35,分析CDR3肽段等电点的主要分布,其中pI 8-9和4-5分别占22.72%和20.1%。2骆驼免疫血清中抗CD47特异性抗体的制备和鉴定首先利用ProteinA对骆驼血清中IgG进行亲和纯化,并通过间接ELISA和Western Blot测定IgG与原核重组蛋白CD47的结合活性,之后将CD47蛋白与CNBr琼脂糖树脂偶联来捕获抗CD47特异性抗体,并测定CD47-CNBr偶联效率,最后通过ELISA和Western Blot检测抗CD47特异性抗体与原核CD47抗原的结合活性,除此之外分别验证血清,IgG和抗CD47特异性抗体与真核CD47和EC9706细胞的结合活性,从而为后续质谱鉴定获得一株能用于治疗的抗体提供实验基础。实验结果显示,利用ProteinA从血清中纯化的IgG经间接ELISA和Western Blot测定表明,当IgG稀释1:256 000仍然与原核表达的CD47蛋白仍具有良好的结合活性。经15%SDS-PAGE显示CD47蛋白成功偶联于CNBr琼脂糖树脂并测定偶联效率为67.8%,间接ELISA筛选纯化抗CD47特异性抗体的洗脱液为pH 2.4的Gly-HCl,利用该洗脱液成功从CD47-CNBr琼脂糖树脂免疫亲和纯化出抗CD47特异性抗体。经间接ELISA和Western Blot验证抗CD47特异性抗体与原核CD47具有高结合活性和特异性。通过ELISA验证血清,IgG和抗CD47特异性抗体与真核CD47的结合情况显示,血清、Ig G与真核CD47蛋白和EC9706细胞有结合活性,相反,抗CD47特异性抗体与真核CD47和细胞无结合。3重链抗体的质谱分析以及抗CD47纳米抗体制备和鉴定首先对ProteinA免疫亲和层析分离的IgG经15%SDS-PAGE分离并切下其亚型重链抗体IgG2和IgG3再进行LC MS/MS鉴定,利用Mascot检索软件将质谱数据与骆驼纳米抗体氨基酸数据库匹配,并将匹配得分最高的3条序列克隆表达,利用间接ELISA测序其与原核CD47蛋白结合,从中挑选结合活性最高的抗CD47纳米抗体并验证该纳米抗体与真核CD47的结合,同时将噬菌体展示技术筛选获得的高亲和力抗体序列分别与质谱数据和高通量数据进行匹配。实验结果显示,3个重组质粒经诱导表达,其中除VHH-410994蛋白不表达外,其余2个蛋白VHH-437310、VHH-737446均表达,其大小在20 kD左右。经间接ELISA表明VHH-737446与原核CD47具有结合活性但与真核CD47不结合。噬菌体展示技术筛选获得的抗体序列仅能与高通量数据库成功匹配获得6个序列且在数据库中低频出现。
王怡婷[9]（2016）在《从喜马拉雅旱獭分离的变形梭杆菌、鹑鸡肠球菌特征初步分析》文中认为喜马拉雅旱獭（Marmota himalayana）主要分布在青藏高原地区,是我国鼠疫杆菌的主要宿主之一。我们从青海省玉树地区采集的喜马拉雅早獭肠内容物样本中,低氧培养分离获得1株变形梭杆菌（Fusobacterium varium）WYT-7、3株鹑鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）HT1、HT20-15及HT34-7菌株,并完成变形梭杆菌WYT-7菌株的全基因组测序和基本基因组分析。基因组数据分析表明,WYT-7菌株携带多个与毒力基因同源的基因,包括梭杆菌属粘附相关蛋白FadA（Fusobacterium adhesin A）等。核心基因（core gene）进化分析表明,WYT-7 菌株在进化中与F.variumATCC27725亲缘关系最近,并与溃疡梭杆菌（Fulcerans）位于同一分群。此外,预测分析表明WYT-7菌株携带16个基因组岛,15个位于染色体,1个位于质粒。从喜马拉雅旱獭分离的3株鹑鸡肠球菌,肠球菌常见毒力基因检测均为阴性,包括聚合物因子基因（asal）、肠球菌表面蛋白基因（esp）、透明质酸酶基因（hyl）、明胶酶基因（gelE）及细胞溶血素基因（cylA）;对15种检测的抗菌药物均不耐药,包括青霉素G、氨苄西林、万古霉素、四环素、红霉素等。鉴于鹑鸡肠球菌可引起院内感染,包括败血症、化脓性感染等,我们的研究提示,动物源性的鹑鸡肠球菌可能在进化过程中获得了抗菌药物耐药性基因以及毒力基因等,从而产生了对人致病的能力。
徐晓阳[10]（2016）在《布鲁氏菌胞内生存相关sRNA的筛选及非编码小RNA BSR0441功能的初步研究》文中提出布鲁氏菌病（Brucellosis,简称布病）是由布鲁氏菌感染引起的一种危害严重的人兽共患传染病。在世界各地广泛流行,给人类健康和畜牧业发展带来严重危害。动物感染后出现流产或不育,对畜牧业带来巨大损失；人感染主要由于食用或接触了患病动物或畜产品污染所致,感染后表现为关节炎,心内膜炎和脑膜炎等。布鲁氏菌为革兰氏阴性菌、胞内寄生菌,主要寄生于单核细胞（常为巨噬细胞）内,在细胞内生存和复制是其主要毒力特征。细菌非编码小RNA （small non-coding RNA, sRNA）是近年来在细菌中发现的一类RNA调控子,它们在应对环境变化的基因表达调控中扮演重要角色,是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调控子。作用方式主要是通过碱基互补配对与靶标基因mRNA结合,影响mRNA的稳定性和翻译,进而在转录水平上调控基因表达。本研究中,我们通过单链特异性深度测序筛选了布鲁氏菌中的大量sRNA。选取30个与胞内生存相关的sRNA进行验证,并利用RT-PCR验证体外模拟细胞内环境刺激条件它们的转录情况。对其中一个涉及布鲁氏菌毒力相关的sRNA即BSR0441进行研究,并对BSR0441的靶基因进行了预测和验证,分析了BSR0441在布鲁氏菌胞内生存中的作用。首先,标准培养条件下体外培养布鲁氏菌16M株,提取总RNA，纯化mRNA后利用dUTP第二链标记方法制备cDNA文库,PCR扩增后进行单链特异性测序,以16M基因组序列为参照对测序得到的reads进行比对,分析鉴定所有的sRNA。结果表明,reads在基因组上的覆盖度良好,总共识别了1321个sRNA,长度在100到600 nt间。这些sRNA在布鲁氏菌染色体中的分布不同,同时它们的转录水平也存在差异。RT-PCR结果显示,预测的sRNA在体外条件下都存在转录,且与布鲁氏菌胞内生存相关。运用TargetRNA2预测sRNA的靶基因,BSR0441的靶基因主要为布鲁氏菌毒力相关的转录调控因子。为了验证测序结果的正确性,首先利用Northern blot确认BSR0441在布鲁氏菌中存在转录。qRT-PCR分析BSR0441在布鲁氏菌体外不同生长期及感染情况下的转录,结果显示其在布鲁氏菌不同生长期和小鼠感染期间都存在转录。为进一步探讨BSR0441在布鲁氏菌胞内生存和毒力中的作用,构建了BSR0441的突变株（16M-△BSR0441）和过表达株（16M-BSR0441），并对野生株（16M）、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的相关表型进行研究。生长曲线结果表明,BSR0441对布鲁氏菌的生长速度影响较小。在模拟巨噬细胞内环境的多种体外刺激条件下的生存能力结果表明,BSR0441缺失或过表达后在各种刺激条件的存活率降低、抵抗压力的能力下降,尤其在热应激和酸刺激下胞内存活率明显下降。巨噬细胞侵染试验结果表明,BSR0441缺失与过表达使布鲁氏菌在细胞感染期间的存活能力下降。小鼠毒力试验结果显示,感染中后期突变株的数量较野生株明显减少,表明BSR0441参与调控布鲁氏菌在体内的生存和繁殖。为进一步了解BSR0441在布鲁氏菌中的作用,我们对其靶基因进行了预测,并采用qRT-PCR分析16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441对5个靶基因的转录水平的影响。结果表明,在巨噬细胞和小鼠感染期间BSR0441的缺失与过表达影响了其靶基因的转录,且该sRNA同时调控多个靶基因。
二、鼠疫杆菌基因测序已完成（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鼠疫杆菌基因测序已完成（论文提纲范文）
（1）鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及鸡5种病毒多重PCR诊断方法的初步建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 鸡传染性支气管炎病毒 |
| 1.2 禽流感病毒 |
| 1.3 新城疫病毒 |
| 1.4 传染性法氏囊病病毒 |
| 1.5 鸡痘病毒 |
| 1.6 多重PCR技术 |
| 1.7 研究目的与意义 |
| 第2章 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 鸡5种病毒多重PCR方法的初步建立与应用 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）中国小肠结肠炎耶尔森菌分布特征与旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的调查研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 中国小肠结肠炎耶尔森菌分布特征 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 菌株来源 |
| 1.2 实验仪器及试剂 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 生化鉴定 |
| 2.2 生物分型 |
| 2.3 血清分型 |
| 2.4 毒力基因检测 |
| 2.5 脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型 |
| 结果 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 实验菌株分布情况 |
| 3.1.1 实验菌株宿主来源分布 |
| 3.1.2 菌株分离年代情况 |
| 3.1.3 地域分布特征 |
| 3.2 生物血清型分布 |
| 3.3 毒力基因分布 |
| 3.4 基因序列分析 |
| 3.5 生化反应 |
| 3.6 PFGE分型结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的调查研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 实验试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 鼠疫耶尔森菌分离与鉴定、通用16S rRNA基因克隆与测序 |
| 2.2 旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的筛选 |
| 2.3 BALB/c小鼠再感染及克隆测序 |
| 2.4 细胞培养与测序 |
| 结果 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 嗜吞噬细胞无形体在旱獭中的发现 |
| 3.2 旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的检出情况 |
| 3.3 嗜吞噬细胞无形体感染BALB/c小鼠 |
| 3.4 嗜吞噬细胞无形体感染L929 细胞 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 小肠结肠炎耶尔森菌致病机制研究 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员会组成 |
（3）1950-2019年德宏州鼠疫分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 鼠疫流行概述 |
| 1.2 鼠疫菌基因组概述 |
| 1.3 鼠疫基因组分型研究概述 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 流行病学分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 资料来源 |
| 2.1.2 研究方法 |
| 2.1.3 疫情判定标准 |
| 2.1.4 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 动物疫情分析 |
| 2.2.2 人间疫情分析 |
| 2.2.3 宿主分析 |
| 2.2.4 媒介分析 |
| 2.2.5 血清学分析 |
| 2.2.6 近十年鼠疫疫情 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 基因组学分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂及实验设备 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 基因组测序 |
| 3.1.5 测序数据的分析 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 基因组DNA提取 |
| 3.2.2 基于SNPs的德宏州鼠疫菌株的基因分型 |
| 3.2.3 1.ORI2分支内的172株菌种群多样性分析 |
| 3.2.4 1.ORI2A、1.ORI2B和1.ORI2C亚群内的传播模式分析 |
| 3.2.5 1.ORI2分支上的四个亚群的时空分布特征分析 |
| 3.2.6 SNPs注释 |
| 3.2.7 INDEL分析 |
| 3.2.8 基因大片段获得缺失分析 |
| 3.2.9 祖先时间和种群分化时间 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 单核苷酸多态性 (SNP) 分析在鼠疫菌基因分型中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（4）肠道菌群移植治疗溃疡性结肠炎的临床研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料、方法及研究对象 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 主要材料与试剂 |
| 2.4 标准肠道菌群的制备 |
| 2.5 研究方法 |
| 2.6 术后随访 |
| 2.7 观察指标 |
| 2.8 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 临床症状 |
| 3.2 粪便、血液炎症指标和细胞因子变化 |
| 3.3 内镜及病理组织学改变 |
| 3.4 肠道菌群分析 |
| 3.5 不良反应 |
| 4 讨论 |
| 5 研究的局限性及展望 |
| 6 结论 |
| 7 参考文献 |
| 附录 个人简历 |
| 致谢 |
| 综述 粪菌移植治疗溃疡性结肠炎的临床研究进展 |
| 参考文献 |
（5）单核苷酸多态性（SNP）分析在鼠疫菌基因分型中的应用（论文提纲范文）
| 1 SNP分析概述 |
| 2 SNP分析的特征 |
| 3 SNP分析方法 |
| 4 SNP分析在鼠疫菌中的应用 |
| 5 鼠疫菌突变位点分析 |
| 6 中国鼠疫菌的SNP分析现状 |
（6）基于鞭毛蛋白载体的口蹄疫表位疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 选题的目的和意义 |
| 1.2 研究思路和主要内容 |
| 1.3 风险评估及规避方案 |
| 1.4 递呈抗原表位的载体在口蹄疫表位疫苗中的应用 |
| 1.4.1 前言 |
| 1.4.2 构建口蹄疫表位疫苗的关键抗原表位 |
| 1.4.3 免疫刺激复合物作为递呈口蹄疫抗原表位的载体 |
| 1.4.4 脂质体作为递呈口蹄疫抗原表位的载体 |
| 1.4.5 纳米颗粒作为递呈口蹄疫抗原表位的载体 |
| 1.4.6 载体蛋白作为递呈口蹄疫抗原表位的载体 |
| 1.4.7 病毒活载体作为递呈口蹄疫抗原表位的载体 |
| 1.4.8 细菌活载体作为递呈口蹄疫抗原表位的载体 |
| 1.4.9 小结 |
| 1.5 鞭毛蛋白作为一种疫苗佐剂的研究进展 |
| 1.5.0 前言 |
| 1.5.1 鞭毛蛋白的结构特征 |
| 1.5.2 鞭毛蛋白介导的免疫反应 |
| 1.5.3 鞭毛蛋白作为佐剂与疫苗抗原混合免疫 |
| 1.5.4 在活细菌株中鞭毛蛋白与外源抗原的嵌合表达或共展示 |
| 1.5.5 鞭毛蛋白和抗原结合的重组融合蛋白 |
| 1.5.6 鞭毛蛋白作为免疫增强剂结合于纳米颗粒 |
| 1.5.7 鞭毛蛋白作为抗肿瘤免疫佐剂 |
| 1.5.8 TLR激动剂的联合递送 |
| 1.5.9 基于鞭毛蛋白载体的候选疫苗的临床研究 |
| 1.5.10 小结 |
| 第二章 Flgellin-FMDV重组融合蛋白的构建与表达 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 质粒和菌株 |
| 2.1.2 试验试剂及耗材 |
| 2.1.3 试验仪器和设备 |
| 2.1.4 Flgellin-FMDV重组融合基因的构建 |
| 2.1.5 Flgellin-FMDV重组质粒的提取 |
| 2.1.6 Flgellin-FMDV重组质粒的转化 |
| 2.1.7 Flgellin-FMDV重组融合基因的表达 |
| 2.1.7.1 Flgellin-FMDV重组融合蛋白的小量表达 |
| 2.1.7.2 Flgellin-FMDV重组融合蛋白的大量表达 |
| 2.1.8 重组融合蛋白的纯化 |
| 2.1.8.1 可溶性重组融合蛋白的纯化 |
| 2.1.8.2 重组融合蛋白包涵体的纯化 |
| 2.1.8.3 重组融合蛋白包涵体蛋白的复性 |
| 2.1.9 重组融合蛋白内毒素的去除 |
| 2.1.10 重组融合蛋白内毒素的测定 |
| 2.1.11 SDS-PAGE |
| 2.1.12 Western blotting分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Flgellin-FMDV重组融合基因的构建 |
| 2.2.2 Flgellin-FMDV重组融合基因的酶切鉴定 |
| 2.2.3 Flgellin-FMDV重组融合蛋白的表达和纯化 |
| 2.2.4 Flgellin-FMDV重组融合蛋白蛋白浓度的测定 |
| 2.2.5 Flgellin-FMDV重组融合蛋白的残余内毒素含量的测定 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 重组融合蛋白的功能鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 质粒和细胞 |
| 3.1.2 试验试剂及耗材 |
| 3.1.3 试验仪器和设备 |
| 3.1.4 口蹄疫O型液相阻断ELISA(LPB-ELISA) |
| 3.1.5 双抗夹心ELISA法分析重组蛋白的抗原性 |
| 3.1.6 hTLR5 质粒转染RAW264.7 细胞 |
| 3.1.7 重组融合蛋白的TLR5 特异性生物测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组融合蛋白的抗原性 |
| 3.2.2 重组融合蛋白的TLR5 生物活性 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 重组融合蛋白的免疫原性及保护效力 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 病毒、细胞与实验动物 |
| 4.1.2 试验试剂及耗材 |
| 4.1.3 试验仪器和设备 |
| 4.1.4 小鼠免疫 |
| 4.1.5 豚鼠免疫和攻毒保护试验 |
| 4.1.6 豚鼠的GPID50测定 |
| 4.1.7 血清抗体的ELISA检测 |
| 4.1.8 病毒中和试验 |
| 4.1.9 淋巴细胞增殖试验 |
| 4.1.10 细胞因子水平检测 |
| 4.1.11 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 鞭毛蛋白-FMDV融合蛋白诱导小鼠产生高水平FMDV特异性IgG反应 |
| 4.2.2 FTME融合蛋白通过肌肉和皮下途径诱导了类似强度的抗体反应 |
| 4.2.3 FTME与其它指定佐剂之间没有观察到协同作用 |
| 4.2.4 鞭毛蛋白-FMDV融合蛋白在豚鼠体内的免疫原性 |
| 4.2.5 鞭毛蛋白-FMDV蛋白诱导豚鼠细胞因子水平和细胞免疫应答 |
| 4.2.6 豚鼠测毒试验 |
| 4.2.7 重组融合蛋白对豚鼠攻毒的保护效力 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）克罗诺杆菌基因组测序与比较基因组学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 微生物基因组学 |
| 1.1.1 微生物基因组学的研究背景 |
| 1.1.2 微生物基因组测序技术的发展 |
| 1.1.3 微生物比较基因组学的研究进展 |
| 1.2 克罗诺杆菌的研究进展 |
| 1.2.1 克罗诺杆菌命名与分类 |
| 1.2.2 克罗诺杆菌特性研究进展 |
| 1.2.3 克罗诺杆菌基因组学研究进展 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究意义 |
| 1.4 研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料与仪器 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 基因组提取及鉴定 |
| 2.2.2 克罗诺杆菌基因组文库制备及高通量测序 |
| 2.2.3 克罗诺杆菌分类及比较基因组分析 |
| 2.2.4 克罗诺杆菌基因组进化分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 克罗诺杆菌DNA提取和质量检测 |
| 3.1.1 克罗诺杆菌DNA提取 |
| 3.1.2 克罗诺杆菌DAN鉴定 |
| 3.2 克罗诺杆菌基因组测序信息及基本特征 |
| 3.3 克罗诺杆菌平均核苷酸一致性分析 |
| 3.4 克罗诺杆菌比较基因组分析 |
| 3.4.1 克罗诺杆菌基因组共线性分析 |
| 3.4.2 克罗诺杆菌泛基因组分析 |
| 3.4.3 蛋白质直系同源聚类分析 |
| 3.4.4 阪崎克罗诺杆菌种内特有基因的比较 |
| 3.4.5 克罗诺杆菌抗生素抗性基因比较 |
| 3.5 克罗诺杆菌基因组进化 |
| 3.5.1 系统发育树分析 |
| 3.5.2 重组与选择压力分析 |
| 3.5.3 可移动元件预测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 克罗诺杆菌属基因组特征 |
| 4.2 克罗诺杆菌属分类及系统发育分析 |
| 4.3 阪崎克罗诺杆菌特有基因 |
| 4.4 克罗诺杆菌属抗生素抗性基因 |
| 4.5 克罗诺杆菌进化分析 |
| 4.6 研究展望 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）采用蛋白质组学结合高通量测序技术分离和鉴定抗CD47纳米抗体（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 1.抗体以及骆驼纳米抗体 |
| 2.B细胞抗体库以及高通量测序技术 |
| 3.血清抗体库以及质谱技术 |
| 4.质谱技术和高通量测序技术在抗体发现和抗体制备中的应用 |
| 5.蛋白组学和高通量测序技术在疾病中运用 |
| 展望 |
| 第二部分 骆驼免疫抗体库高通量测序分析以及纳米抗体数据库的建立 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 菌种 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试验引物 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 抗原CD47的大量诱导表达以及纯化 |
| 2.2 WesternBlot检测抗原CD47表达 |
| 2.3 新疆双峰驼的抗原免疫 |
| 2.4 间接ELISA检测骆驼血清中抗CD47抗体滴度 |
| 2.5 新疆双峰驼全血中外周淋巴细胞的分离 |
| 2.6 新疆双峰驼外周淋巴细胞总RNA的提取以及反转录 |
| 2.7 巢式PCR扩增VHH基因片段 |
| 2.8 VHH序列的NGS测序以及NGS氨基酸数据库的建立 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 抗原CD47的纯化以及WesternBlot鉴定 |
| 3.2 抗原CD47免疫新疆双峰驼血清效价测定 |
| 3.3 骆驼外周淋巴细胞RNA的提取以及VHH片段的获得 |
| 3.4 NGS原始数据的处理 |
| 3.5 VHH抗体库NGS测定以及CDR3序列以及等电点分析 |
| 3.6 抗CD47纳米抗体氨基酸数据库的建立 |
| 4.讨论 |
| 第三部分 骆驼免疫血清中抗CD47特异性抗体的制备和鉴定 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验主要试剂 |
| 1.2 主要溶液的配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 利用ProteinA纯化骆驼血清中IgG的纯化 |
| 2.2 CD47免疫和柱制备 |
| 2.3 CD47-IgG的免疫亲和纯化 |
| 2.4 间接ELISA筛选抗CD47特异性抗体洗脱液 |
| 2.5 ELISA和WesternBlot鉴定抗CD47-IgG结合活性 |
| 2.6 ELISA检测免疫血清,免疫IgG和抗CD47-IgG与真核CD47结合活性 |
| 2.7 细胞ELISA检测免疫血清,免疫IgG和抗CD47-IgG与EC9706结合活性 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 骆驼血清IgG的纯化以及ELISA检测与原核CD47结合活性 |
| 3.2 免疫亲和层析柱的偶联 |
| 3.3 抗CD47特异性抗体洗脱液的筛选 |
| 3.4 抗CD47特异性抗体的纯化 |
| 3.5 ELISA和WesternBlot检测抗CD47特异性抗体与原核CD47结合活性 |
| 3.6 血清、IgG以及抗特异性CD47多克隆抗与真核CD47结合性检测 |
| 3.7 血清、IgG以及抗特异性CD47多克隆抗体与EC9706结合性检测 |
| 4.讨论 |
| 第四部分 骆驼重链抗体的质谱分析以及抗CD47纳米抗体制备和鉴定 |
| 引言 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 样品制备 |
| 2.2 胶内酶解 |
| 2.3 质谱分析 |
| 2.3.1 毛细管高效液相色谱 |
| 2.3.2 质谱鉴定 |
| 2.4 数据分析 |
| 2.5 纳米抗体克隆表达,纯化 |
| 2.6 ELISA鉴定抗CD47纳米抗体结合活性 |
| 2.7 噬菌体展示技术筛选的阳性克隆与高通量测序和质谱数据的相关分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 LCMS/MS数据分析 |
| 3.2 VHH纳米抗体克隆表达,纯化以及鉴定 |
| 3.3 重组纳米抗体与原核CD47结合活性鉴定 |
| 3.4 重组纳米抗体VHH-737446与真核CD47结合活性鉴定 |
| 3.5 噬菌体筛选的阳性克隆序列与NGS数据库和质谱分析结果的序列比对 |
| 4.讨论 |
| 第五部分 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词 |
| 参与课题及发表文章 |
| 致谢 |
（9）从喜马拉雅旱獭分离的变形梭杆菌、鹑鸡肠球菌特征初步分析（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 论文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（10）布鲁氏菌胞内生存相关sRNA的筛选及非编码小RNA BSR0441功能的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 布鲁氏菌病的危害及其病原学特征 |
| 2 布鲁氏菌的致病机理 |
| 3 细菌sRNA的分类和功能 |
| 4 细菌sRNA的筛选、鉴定及靶基因的预测 |
| 4.1 细菌sRNA的筛选与鉴定方法 |
| 4.2 sRNA靶基因的生物信息学预测 |
| 5 布鲁氏菌sRNA的研究现状 |
| 6 本研究的目的意义 |
| 第二章 布鲁氏菌胞内生存相关sRNA的筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株及培养基 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 布鲁氏菌sRNA的筛选 |
| 2.2 不同刺激条件下布鲁氏菌sRNA的RT-PCR鉴定 |
| 2.2.1 提取不同体外刺激条件下16M总RNA |
| 2.2.2 Dnase Ⅰ处理 |
| 2.2.3 cDNA第一链的合成 |
| 2.2.4 RT-PCR鉴定 |
| 2.3 布鲁氏菌sRNA靶基因的预测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 布鲁氏菌sRNA的筛选 |
| 3.1.1 16M转录组的测序数据分析 |
| 3.1.2 候选sRNA的特征 |
| 3.2 体外刺激条件下16M sRNA的RT-PCR鉴定 |
| 3.3 布鲁氏菌sRNA(Candidate_1069)靶基因的预测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 布鲁氏菌sRNA的筛选 |
| 4.2 布鲁氏菌sRNA的RT-PCR验证 |
| 4.3 布鲁氏菌sRNA(Candidae_1069)靶基因的预测 |
| 第三章 布鲁氏菌非编码小RNA BSR0441功能的初步研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、细胞系、载体及培养基 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试验仪器 |
| 1.5 引物 |
| 2 方法 |
| 2.1 BSR0441的Northern Blot验证 |
| 2.1.1 DIG-BSR0441探针的制备 |
| 2.1.2 Northern Blot验证 |
| 2.2 BSR0441在体外以及体内的转录分析 |
| 2.2.1 BSR0441在体外不同生长时期的转录 |
| 2.2.2 BSR0441在细胞内的转录 |
| 2.2.3 BSR0441在小鼠体内的转录 |
| 2.3 BSR0441突变株和过表达株的构建 |
| 2.3.1 BSR0441突变株的构建 |
| 2.3.2 BSR0441过表达株的构建 |
| 2.3.3 BSR0441突变株和过表达株的RT-PCR验证 |
| 2.4 BSR0441突变株和过表达株的表型分析 |
| 2.4.1 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的生长曲线测定 |
| 2.4.2 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的体外应激试验 |
| 2.4.3 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的细胞侵染试验 |
| 2.4.4 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的小鼠毒力试验 |
| 2.5 BSR0441重要靶基因的qRT-PCR分析 |
| 2.5.1 细胞内靶标基因的qRT-PCR |
| 2.5.2 小鼠体内靶标基因的qRT-PCR |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 BSR0441的Northern Blot验证 |
| 3.2 BSR0441的转录分析 |
| 3.2.1 BSR0441在体外不同生长时期的转录 |
| 3.2.2 BSR0441在细胞内的转录 |
| 3.2.3 BSR0441在小鼠体内的转录 |
| 3.3 BSR0441突变株和过表达株的构建 |
| 3.3.1 BSR0441突变株的构建与鉴定 |
| 3.3.2 BSR0441过表达株的构建与鉴定 |
| 3.3.3 BSR0441突变株和过表达株的RT-PCR验证 |
| 3.4 BSR0441突变株和过表达株的表型分析 |
| 3.4.1 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的生长曲线 |
| 3.4.2 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的体外应激试验 |
| 3.4.3 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的细胞侵染试验 |
| 3.4.4 16M、16M-△BSR0441和16M-BSR0441的小鼠毒力试验 |
| 3.5 BSR0441重要靶基因的qRT-PCR分析 |
| 3.5.1 感染细胞期间BSR0441对靶标基因的作用 |
| 3.5.2 体内感染情况下BSR0441对靶标基因的作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 BSR0441的验证 |
| 4.2 BSR0441突变株和过表达株的构建 |
| 4.3 BSR0441相关毒力表型分析 |
| 4.4 BSR0441对其靶基因的调控作用 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
四、鼠疫杆菌基因测序已完成（论文参考文献）
- [1]鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及鸡5种病毒多重PCR诊断方法的初步建立[D]. 马彩红. 新疆农业大学, 2021
- [2]中国小肠结肠炎耶尔森菌分布特征与旱獭携带嗜吞噬细胞无形体的调查研究[D]. 穆慧. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [3]1950-2019年德宏州鼠疫分子流行病学研究[D]. 孔进姣. 大理大学, 2020(05)
- [4]肠道菌群移植治疗溃疡性结肠炎的临床研究[D]. 章文慧. 安徽医科大学, 2020(02)
- [5]单核苷酸多态性（SNP）分析在鼠疫菌基因分型中的应用[J]. 孔进姣,石丽媛,王鹏. 中国人兽共患病学报, 2019(11)
- [6]基于鞭毛蛋白载体的口蹄疫表位疫苗研究[D]. 崔保峰. 中国农业科学院, 2019(08)
- [7]克罗诺杆菌基因组测序与比较基因组学分析[D]. 冯婧. 东北农业大学, 2018(02)
- [8]采用蛋白质组学结合高通量测序技术分离和鉴定抗CD47纳米抗体[D]. 李宁娟. 新疆大学, 2018(12)
- [9]从喜马拉雅旱獭分离的变形梭杆菌、鹑鸡肠球菌特征初步分析[D]. 王怡婷. 中国疾病预防控制中心, 2016(06)
- [10]布鲁氏菌胞内生存相关sRNA的筛选及非编码小RNA BSR0441功能的初步研究[D]. 徐晓阳. 四川农业大学, 2016(04)