一、不同分化胆管癌间差异表达基因的研究（论文文献综述）
陈秦俊杰[1]（2021）在《环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌进展的机制研究》文中研究说明研究背景和目的肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是发病率仅次于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的一种高度恶性的肝脏恶性肿瘤,其特点是发病隐匿,侵袭性高,患者就诊时往往已处于疾病的中晚期阶段,此时绝大多数患者已经失去手术治疗的机会,故ICC患者整体预后极差。近几十年来,ICC的发病率在全球范围内逐渐升高,其常见的主要危险因素包括:肝内胆管结石、原发性硬化性胆管炎、肝血吸虫病、肝硬化、胆管囊肿、Caroli病、乙肝病毒感染、丙肝病毒感染、肥胖和吸烟等。ICC目前仍缺乏有效的治疗手段,手术切除是最有效的治疗方法,但由于ICC患者接受手术治疗的比例较低加之术后高复发率,导致ICC患者5年总体生存率低于10%。环状RNA（CircRNAs）是生物体内一类含量丰富、多样且保守的新型非编码RNA分子,它们是由前体m RNA通过直接的反向拼接或由外显子跳跃环化产生。目前绝大多数circRNAs被认为可以充当分子海绵,即通过吸附细胞内的mi RNAs来实现对下游基因的调控。另外,还有少部分circRNAs可以与RNA结合蛋白（RNA-binding protein,RBP）相互作用,从而改变下游基因的转录水平。甚至有极少一部分circRNAs可以作为蛋白质翻译的模板产生小分子多肽和蛋白。越来越多的研究表明circRNA分子在人类疾病中起着重要的调控作用,人们已经发现异常表达的circRNA分子与多种癌症的进展和预后都有着密切的关系。然而,目前鲜有研究详细地报道circRNA分子在ICC疾病的发生、发展过程中的作用和机制。鉴于此,本研究基于基因芯片测序技术寻找在ICC中发生显着性上调的circRNA分子,并通过一系列分子生物学实验技术探索circRNA分子在ICC发生、发展中的作用。方法1.病人的临床资料和组织样本本研究回归性收集了从2016年3月至2017年8月在上海东方肝胆外科医院接受肝脏切除手术的67例ICC患者的临床病理资料,同时也获取这67例患者术中的新鲜冰冻癌组织及其对应的邻近正常肝脏组织。2.寻找ICC中显着性高表达的环状RNA分子随机选取上述标本中的7对组织按照Arraystar公司的Human circRNA Array（v2版本）指南对癌与癌旁组织之间的circRNAs进行差异表达分析,并最终筛选出在ICC肿瘤中显着性高表达的目标分子,即circACTN4。3.探索circACTN4的表达水平与ICC患者预后的关系通过受试者工作特征曲线（Receiver operating characteristic curve,ROC）确定剩余60个ICC患者中circACTN4表达量的最佳临界值,并把这些患者分为circACTN4高和低表达两组。生存曲线分析采用Kaplan-Meier（KM）法和对数秩（log-rank）检验。Cox风险比例回归模型用于探索影响患者预后的危险因素。4.功能实验验证circACTN4对肝内胆管癌细胞的增殖和侵袭能力的影响通过CCK-8实验、克隆形成实验、Transwell实验以及内皮小管形成实验来测定circACTN4对肝内胆管癌细胞的增殖和侵袭能力的影响。通过向雄性BALB/c裸鼠（4-6周龄）皮下注射FRH0201细胞建立皮下成瘤模型,还通过向6周大的雄性BALB/c裸鼠的鼠尾静脉注射FRH0201细胞建立小鼠的肝内胆管癌肺转移模型,借此判断circACTN4在体内对胆管癌细胞增殖和转移能力的影响。5.CircACTN4过表达后进行测序寻找ICC中发生显着性变化的基因通过过表达质粒实现RBE细胞中circACTN4的高表达,然后通过过表达基因测序获得癌细胞中发生显着性差异表达的基因谱,随后通过GO和KEGG分析进一步缩小范围,寻找目标基因。最后通过q RT-PCR,Western blot实验以及Ch IRP（Chromatin isolation by RNA purification）实验等进一步探索上述显着性变化的目标基因与circACTN4的关系。6.CircACTN4与RBP互作在circACTN4的下拉实验（Pull down）中,我们将肝内胆管癌细胞裂解物与提前合成的生物素标记探针共同孵育,然后通过与链霉亲和素磁珠结合沉淀上述细胞裂解物中的相应蛋白。随后,我们对沉淀下来的蛋白质分别进行液相色谱-质谱（Liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS）/（Mass spectrometer,MS）质谱分析,以及后续的免疫共沉淀实验、RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）实验、RNA的凝胶迁移或电泳迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）等并最终筛选出目标RBP分子。7.寻找CircACTN4与RBP共同作用的下游基因通过Ch IP-seq技术寻找目标RBP结合的下游靶基因谱,然后将上述circACTN4过表达测序结果与Ch IP-seq测序的结果取交集获得CircACTN4与RBP共同作用的下游基因。8.CircACTN4充当mi RNA的分子海绵为了寻找能与circACTN4结合的mi RNA分子,我们通过使用Circular RNA interactome数据库（https://circinteractome.nia.nih.gov/index.html）,Starbase数据库（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）和Circbase数据库（http://circbase.org/）进行预测。随后经过RT-PCR,Western blot,RIP和荧光素酶报告基因实验,我们最终确定与circACTN4结合的mi RNA分子。结果1.根据circRNA基因芯片测序的结果,我们共获得202个在ICC癌组织中显着性上调（Fold change≥2.0,P value≤0.05）的circRNA分子。我们选取log2（Fold change）值最大的前7个circRNA分子,接着通过细胞的功能验证以及数据库的比对,最终确定hsa＿circ＿0050898作为我们的目标RNA分子,因为hsa＿circ＿0050898来源于其母基因ACTN4,因此我们命名它为circACTN4。2.ICC患者中,circACTN4的高表达是影响ICC患者预后的独立危险因素,KM曲线分析结果显示ICC患者中高表达的circACTN4与更差的总体生存（Overall survival,OS）和更高的术后肿瘤复发率均显着性相关。3.体外功能实验,如平板克隆实验、Transwell实验和小管形成实验的结果表明ICC细胞中circACTN4的高表达能够显着性增强肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭的能力。体内动物实验模型结果也发现敲降circACTN4的表达能够显着性地缩小皮下肿瘤的体积及小鼠肺组织转移癌灶的数目。4.CircACTN4的三次过表达测序结果发现在RBE细胞中共计103个基因出现显着性差异表达,这些基因的GO分析发现在分子功能中参与“转录因子活性、结合（Transcription factor activity,protein binding）”的基因数目和比例较高;另外,KEGG分析发现Hippo通路和Wnt通路相关的部分基因在circACTN4过表达后都出现明显的变化。我们对其中的FZD7基因十分感兴趣,并通过PCR和Western blot实验证实FZD7确实在circACTN4过表达后发生显着性上调。随后的Ch IRP实验证明circACTN4能够富集在FZD7上游启动子区域,说明circACTN4与FZD7的起始转录密切相关。5.下拉实验结果发现19种蛋白能够与circACTN4发生特异性结合,随后的蛋白质互作分析（Protein-protein interaction,PPI）发现YBX1因其高度中心性并且与其他基因直接互作而成为我们关注的焦点。随后的一系列细胞功能及组织样本验证最终确认circACTN4能够与YBX1蛋白互作。6.通过Ch IP-seq实验,我们发现YBX1可结合在上游启动子区域的靶基因数目为631个。随后,我们将Ch IP-seq实验结果和上述过表达测序的103个基因取交集最终只得到FZD7和LRP1。接着,通过Ch IP-q PCR实验再次确认在ICC细胞中,YBX1的下游靶基因是FZD7,因为YBX1可以在FZD7上游启动子区域被富集,且这一区域与circACTN4的结果一致。最终,通过一系列的实验我们证实circACTN4通过招募YBX1共同作用于下游的FZD7基因并促进其转录。7.CircACTN4过表达测序结果已经提示Hippo通路中YAP1基因在ICC中发生显着性上调。因此,我们想探索circACTN4作为分子海绵调控相关mi RNA分子及其相应的下游YAP1基因的可能性。于是我们进一步通过Starbase和Circbase数据库预测得到12个既能与circACTN4又能与YAP1相互作用的候选mi RNA分子。经过TCGA数据库和功能验证实验的筛选,我们最终发现只有mi R-424-5p可以同时和circACTN4以及YAP1发生结合。荧光素酶报告基因和RIP实验结果也证实circACTN4在ICC中可以通过吸附mi R-424-5p上调YAP1基因的表达。结论CircACTN4在ICC中显着性高表达并且与患者术后长期预后差密切相关。体内、外功能实验结果表明circACTN4能够促进癌细胞的增殖、转移和侵袭。机制研究发现circACTN4通过招募YBX1共同启动FZD7的转录,进而促进ICC的进展和恶化,另外,circACTN4还可以充当mi R-424-5p的分子海绵上调YAP1的表达,进而促进肿瘤的发展。我们的结果提示circACTN4可以作为ICC的一个潜在的预后指标和治疗靶点。
李风伟[2]（2021）在《长链非编两RNA MNX1-AS1在肝内胆管癌中的功能及机制研究》文中进行了进一步梳理一、研究背景及目的肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA）是原发性肝脏恶性肿瘤的一种,约占所有肝脏肿瘤的10-15%,一般认为iCCA起源于肝内的胆管上皮细胞。在临床上,iCCA患者早期无明显症状,术后生存差,因此结合多个维度的数据建立精准的iCCA预后预测模型,基于预后模型对iCCA病人进行精细化管理,有望进一步提高iCCA患者群体的术后生存。已有大量研究证明了lnc RNA MNX1-AS1在多种肿瘤中的促癌作用,然而MNX1-AS1在iCCA中的作用尚无研究报道。MNX1是参与多种恶性肿瘤发生发展的转录因子,已有文献表明MNX1-AS1和MNX1的表达呈高度正相关关系。然而MNX1-AS1和MNX1在iCCA中的相关性也未见研究证实。本课题拟采用生物信息学的分析手段,研究MNX1-AS1和MNX1在iCCA组织中表达的相关性,并采用完整的体内体外实验阐明MNX1-AS1在iCCA发生发展中的生物学功能。目前的研究表明,MNX1-AS1在不同肿瘤中的促癌机制存在差异。已有研究表明MNX1-AS1可以发挥“分子海绵”的作用,在细胞质中竞争性结合micro RNA,进而间接参与肿瘤进展的调控。还有一些研究表明,MNX1-AS1也可以调控肿瘤经典信号转导通路发挥促癌作用,另外一项关于胃癌的研究表明,MNX1-AS1可以通过招募polycomb repressive complex 2入核与BTG2启动子区域结合抑制BTG2的转录,最终促进胃癌的进展。我们前期研究也证明,在iCCA细胞中MNX1-AS1主要定位于细胞核中。根据我们前期的研究基础结合已有的文献报道,我们拟对iCCA中MNX1-AS1在细胞核中的作用机制做较为深入的探讨。二、研究方法1.基于iCCA癌组织和癌旁组织的转录组测序数据,通过R语言DESeq2包进行差异表达lnc RNA（DElnc RNA）的筛选。2.结合生存数据,通过单因素COX回归筛选对iCCA患者预后有显着影响的DElncRNA。3.通过LASSO回归进一步压缩对iCCA患者预后有显着影响DElnc RNA的数量,并根据建立的LASSO回归公式,计算每个患者的lnc RNA相关风险分数（Risk Score）。4.下载公共数据库中的iCCA转录组数据,对建立的lnc RNA相关风险分数进行外部验证。5.结合建立的lnc RNA相关风险分数和临床数据,筛选影响iCCA患者预后的因素（采用COX回归的方法）。6.基于已经建立的多因素COX回归建立预测iCCA患者预后的Nomogram列线图。7.利用iCCA转录组测序数据和公共数据库中的转录组数据,验证MNX1-AS1和MNX1的表达是否存在相关性,并利用成对iCCA组织的q RT-PCR实验进行验证。8.qRT-PCR验证多个胆管癌细胞系中MNX1-AS1的表达量,并进行荧光原位杂交实验,确定MNX1-AS1在细胞中的定位。9.在iCCA细胞系中分别构建iCCA的稳定低表达和过表达细胞株进行细胞实验。验证MNX1-AS1对胆管癌细胞增殖、侵袭转移等表型的影响。10.构建裸鼠皮下移植瘤模型和肺转移模型验证MNX1-AS1的表达对iCCA肿瘤生长和转移能力的影响。11.通过Western blotting实验证明MNX1-AS1的表达是否能够调控MNX1蛋白的表达。12.通过公共数据库预测能与MNX1上游启动子区域结合的转录因子,并通过Ch IP实验对预测结果进行验证,筛选出与MNX1上游启动子区域结合的转录因子。13.通过公共数据库预测上述步骤筛选出的转录因子是否可能与MNX1-AS1结合,并预测结合位点。14.通过转录因子的RIP实验验证筛选出的转录因子是否与MNX1-AS1存在结合关系。15.利用小干扰RNA在iCCA细胞系中分别干扰上述转录因子的表达,再利用蛋白质免疫印迹实验验证MNX1蛋白的表达,以证明筛选出的转录因子对MNX1表达的调控作用。16.进行MNX1的Ch IP实验和Ch IP-seq对MNX1结合的基因进行全面的检测。17.利用GO和KEGG富集分析方法,初步判断MNX1可能参与调控的下游肿瘤信号通路。18.利用GO和KEGG富集分析的结果,确定MNX1影响的下游肿瘤信号通路中的关键基因,再次利用Ch IP实验验证MNX1是否能够与关键基因的上游启动子区域结合。19.利用已经建立的MNX1过表达和低表达细胞株,通过蛋白免疫印迹实验验证MNX1对肿瘤信号通路的关键基因和通路中其他关键基因表达的影响。三、研究结果本课题的第一部分是对iCCA转录组测序数据的生物信息学分析。我们利用iCCA癌和癌旁组织的转录组测序数据,共筛选出1253个DElnc RNA。然后结合iCCA患者的生存数据,共筛选出22个对iCCA患者预后有显着影响的DElnc RNA。进一步通过LASSO回归压缩对iCCA患者预后有显着影响DElnc RNA的数量至3个,并计算了每一个样本的lnc RNA相关风险分数。公共数据的验证结果表明我们建立的lnc RNA相关风险分数稳定性良好。最后通过COX回归筛选出8个危险因素:多发肿瘤、lnc RNA相关风险分数、中性粒细胞淋巴细胞比例、肿瘤直径、癌胚抗原、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、糖蛋白199。最后建立多因素COX回归模型,并建立预测iCCA患者预后的Nomogram列线图。本课题的第二部分是lncRNA MNX1-AS1促进肝内胆管癌发展和转移的功能研究。我们首先根据转录组测序数据的分析证明MNX1-AS1和MNX1的表达呈高度正相关关系。成对iCCA组织的q RT-PCR再次证明两者表达量的高度正相关关系。FISH实验证明MNX1-AS1主要定位于细胞核中。细胞实验方面,通过慢病毒转染在FRH0201细胞系中构建了MNX1-AS1稳定低表达细胞株,通过质粒转染在RBE细胞中构建MNX1-AS1高表达细胞株。细胞功能实验证明,MNX1-AS1过表达后,RBE细胞的增殖能力和侵袭转移能力显着增强,并能显着增强HUVEC的血管形成能力。敲低MNX1-AS1表达的FRH0201细胞中则产生相反的效果。动物实验方面,裸鼠皮下移植瘤模型和肺转移模型证明敲低MNX1-AS1的表达后,可以显着抑制iCCA肿瘤的生长和转移。本课题的第三部分是lnc RNA MNX1-AS1促进肝内胆管癌增殖和转移的机制研究。我们首先通过Western blotting实验证明,MNX1-AS1可以正向调控MNX1蛋白的表达。然后通过数据库预测能够与MNX1上游启动子区域结合的转录因子。接着用Ch IP实验证明,只有c-Myc和MAZ能够与MNX1上游启动子区域结合。然后再通过RIP实验证明c-Myc和MAZ确实能够与MNX1-AS1结合,进一步利用小干扰RNA在iCCA细胞系中分别干扰转录因子c-Myc或MAZ的表达,蛋白质免疫印迹实验证明,干扰c-Myc或MAZ的表达后,MNX1蛋白的表达量显着下降。接着进行了MNX1的Ch IP实验和Ch IP-seq。Ch IP-seq结果的GO和KEGG富集分析表明MNX1可能通过Ajuba基因参与了Hippo通路的调控。MNX1的Ch IP实验证明,MNX1能够与Ajuba基因的上游启动子区域结合。Western blotting实验证明在RBE细胞系中构建的MNX1-AS1过表达或者MNX1过表达细胞中,Ajuba基因的表达明显增强,Hippo信号通路中的MST1、MST2、p-Mob、p-Last1、p-YAP1的表达显着减弱,最终导致YAP1的表达显着增强;在FRH0201细胞系中构建的MNX1-AS1低表达或者MNX1低表达细胞中的实验得到了相反的结果。综上,我们的实验证明MNX1可以上调Ajuba基因的表达,进而抑制Hippo通路,最终导致YAP1过表达发挥促癌作用。四、结论本研究首先利用iCCA转录组测序数据和公共数据,筛选出对iCCA预后有显着影响的lnc RNA,进一步通过LASSO回归建立了lnc RNA相关风险分数,外部数据集验证结果表明,我们基于差异表达lnc RNA建立的lnc RNA相关风险分数稳定性良好。再结合临床变量建立了预测iCCA患者预后的Nomogram列线图,该列线图为本课题研究成果在临床的应用奠定了基础。接着我们通过分析转录组测序数据和iCCA组织的q RT-PCR结果发现,lnc RNA MNX1-AS1和MNX1的表达呈高度正相关关系。在功能研究方面,我们首先通过细胞功能实验证明了在iCCA细胞中MNX1-AS1具有促进iCCA细胞增殖、转移侵袭和HUVEC血管形成的促癌作用。我们进一步构建裸鼠皮下移植瘤模型和肺转移模型证实MNX1-AS1在裸鼠体内也具有促进iCCA肿瘤生长和转移的促癌作用。机制方面,我们证明MNX1-AS1可以通过招募转录因子cMyc和MAZ结合到MNX1基因的上游启动子区域,正向调控MNX1蛋白的表达。MNX1蛋白通过Ajuba基因抑制Hippo通路,最终导致YAP1入核增加,发挥促癌作用。MNX1-AS1/c-Myc&MAZ/MNX1/Ajuba/Hippo信号通路是iCCA的潜在治疗靶点。
达子健[3]（2021）在《生物信息学结合定量蛋白组学筛选胆管癌预后标志物的研究》文中研究表明背景及目的:胆管癌是一种起源于胆道上皮细胞且侵袭性极强的常见胆道恶性肿瘤。由于早期临床症状不明显导致诊断困难,所以胆管癌病人预后并不理想。近几十年来,胆管癌的许多生物标志物被广泛应用,但由于均存在其自身限制,这些生物标志物仍不足以充分了解胆管癌的机制,优化治疗策略。我们需要更有效的方法筛选出更有临床价值的生物标志物。本研究的目的是通过生物信息学分析探寻与胆管癌患者预后相关的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,以及应用同位素标记相对和绝对定量技术（isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ）来探寻胆管癌组织与非癌组织之间的差异表达蛋白（differentially expressed proteins,DEPs）,并进一步整合多组学数据分析来筛选出胆管癌的潜在标志物。方法:通过在基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）进行检索,我们选取并获得了GSE32225数据集,通过使用R语言对该数据集进行差异分析,我们获得了在癌和正常组织之间存在差异表达的基因,通过进一步使用癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）对这些DEGs与胆管癌患者生存时间之间的联系进行了生存分析,并进一步使用该数据库验证了从GSE32225数据集中所得的与胆管癌患者预后相关的DEGs表达的准确性。通过使用iTRAQ技术鉴定并筛选胆管癌组织和非肿瘤组织之间的DEPs。通过将与预后相关的DEGs和DEPs数据进行整合分析,我们获得了候选蛋白载脂蛋白F（Apolipoprotein F,APOF）、整合素αV（Integrin subunit alpha V,ITGAV）和钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶（Calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase,CASK）,使用免疫组化方法检测这些候选蛋白在胆管癌组织中的表达,进一步使用组织芯片分析了CASK表达与胆管癌患者临床病理特征及预后之间的联系。结果:通过R语言软件进行差异表达分析,我们一共鉴定出了875个DEGs,通过进行生存分析,其中10个DEGs与胆管癌患者预后显着相关。通过iTRAQ技术一共鉴定出了487个DEPs。综合多组学数据分析显示,与非肿瘤组织相比,胆管癌组织中CASK、ITGAV和APOF在m RNA和蛋白水平的表达均存在差异。CASK在84例胆管癌患者中有38例（45%）在细胞质和细胞核中均呈现阳性表达。生存分析显示与CASK阴性表达的患者相比,CASK阳性表达的患者较CASK阴性表达的患者拥有更长的总生存期和无复发生存期。单因素回归分析显示组织学分级（P=0.019）,临床分期（P=0.002）,血管侵犯（P=0.001）以及CASK阴性表达（P=0.012）是胆管癌患者总生存期差的独立危险因素;组织学分级（P=0.017）,临床分期（P=0.035）以及CASK阴性表达（P=0.006）是胆管癌患者无复发生存率的独立危险因素。多因素回归分析显示:CASK阴性表达（P=0.027）是胆管癌患者预后不良的独立危险因素;组织学分级（P=0.036）,临床分期（P=0.035）,CASK阴性表达（P=0.014）是胆管癌患者复发的独立危险因素。结论:总之,我们的研究揭示了CASK可能是一个肿瘤抑制因子,其阴性表达是胆管癌患者预后不良的独立危险因素,可以作为有临床价值的预后标志物,可能为胆管癌的治疗提供新的靶点。并且为高效准确的筛选胆管癌生物标志物找到了一种较为可靠的方法,可能为深入研究胆管癌的发病机制提供一个全面系统的视角。
高龙[4]（2021）在《GRP78在胆管癌中的表达及与预后关系的研究》文中进行了进一步梳理目的探讨GRP78在胆管癌中的表达情况及其预后价值。方法收集接受手术治疗的胆管癌患者临床组织标本,利用i TRAQ技术对胆管癌组织进行差异蛋白组学分析,差异1.2倍及以上被认为存在表达差异,最终筛选出差异蛋白GRP78进行后续实验。应用q RT-PCR和western blot技术验证GRP78在胆管癌癌组织和癌旁组织中的表达情况,通过分析胆管癌组织芯片的免疫组织化学染色结果来评估GRP78和胆管癌预后之间的相关性。结果i TRAQ技术共筛选出147个差异蛋白,其中热休克蛋白70家族成员HSPA5（GRP78）、HSPA8（HSC70）和HSPA9（GRP75）差异显着,通过免疫组织化学技术对比三者在胆管癌组织中的表达水平和文献查阅结果,最终选取HSPA5（GRP78）进行进一步的研究。验证GRP78在胆管癌组织中的表达情况,western blot结果示GRP78蛋白在8例胆管癌癌组织中表达量均较高,在癌旁组织中表达水平均较低,并且在其中4例癌旁组织中表达量尤其低。q RT-PCR结果示GRP78 m RNA在8例胆管癌癌组织中的平均相对表达量为2.90,显着高于癌旁组织平均相对表达量0.89,两者相差3.26倍（t=4.834,p<0.001）。对包含60例胆管癌患者的组织芯片进行免疫组织化学分析,结果发现GRP78高表达患者中位总生存时间仅为6.83个月,明显低于GRP78低表达患者12.01个月的中位总生存时间,并且GRP78高表达患者的无病生存时间（3.74个月）亦明显低于GRP78低表达患者（11.70个月）,结合Kaplan-Meier生存曲线结果发现GRP78高表达患者不仅总生存率较低,而且很容易出现术后复发情况。GRP78蛋白和患者各临床特征之间无明显相关性,P>0.05。单因素cox分析指出GRP78高表达、肿瘤直径≥5cm、肝内胆管癌、血管侵犯阳性以及高TNM分期等与胆管癌患者生存时间以及无病生存时间密切相关（P均<0.05）,之后进行多因素cox分析,发现GRP78高表达和肝内胆管癌以及肿瘤直径≥5cm皆是胆管癌患者术后复发的独立危险因素（P均<0.05）,并且GRP78高表达是总生存时间的独立危险因素（P<0.05）。结论GRP78在胆管癌中呈异常高表达状态,并且GRP78高表达和胆管癌患者预后不良密切相关,是一个潜在的胆管癌预后指标和治疗靶标。
米宁宁[5]（2021）在《基于TCGA数据库胆管癌ceRNA网络的构建与分析》文中指出背景与目的:胆管癌（cholangiocarcinoma,CCA）是一组高度异质性的胆道恶性肿瘤,可发生于胆道系统的任何部位,近年来CCA的发病率在全球范围内呈增长趋势。由于疾病早期缺乏典型的临床症状和临床指标,大多数CCA患者在明确诊断时已经失去最佳手术时机。因此,探究胆管癌发生发展过程中的分子生物学机制,筛选和验证胆管癌新的诊断及预后标记物具有重要意义。近年来发现竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）机制在肿瘤的发病过程中起着重要作用,本研究利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库的胆管癌数据分析差异表达基因,借助相关数据库构建ceRNA网络并筛选关键通路。收集胆管癌患者的组织样品,通过基础实验对结果进行初步验证。方法:通过R软件下载TCGA数据库中胆管癌患者的测序数据和临床数据,分析胆管癌组织和正常组织中的差异表达基因,使用Mi Rcode数据库和Starbase数据库分别预测lncRNA-miRNA,miRNA-mRNA间的靶向结合关系,通过设定超几何检验和pearson检验的条件来筛选符合ceRNA网络调控关系的lncRNA-miRNA-mRNA轴并使用Cytoscape软件可视化。利用R软件的“cluster Profiler”包完成网络中差异mRNA的功能富集分析。为了进一步探究网络中的差异mRNA、lncRNA和miRNA与胆管癌患者预后的关系,使用R软件的“survival”包进行生存分析。综合生物信息学分析结果筛选胆管癌关键的ceRNA调控通路,收集胆管癌患者的组织样品对调控通路中的RNAs进行实时定量PCR实验,验证三者在CCA中的表达水平,并且通过Western Blot、免疫组化实验在蛋白层面验证了靶基因的表达,最后,利用胆管癌芯片数据分析了靶基因的表达水平与CCA患者预后之间的关系。结果:从TCGA数据库下载得到36例胆管癌样本和9例正常样本,通过差异分析得到1573个差异表达mRNA,109个差异表达lnc RNA和37个差异表达miRNA。借助相关在线数据库构建了胆管癌ceRNA调控网络,该网络由143个mRNA、62个lncRNA和19个miRNA组成。对网络中mRNAs的功能富集分析结果提示差异基因主要富集在与肿瘤和免疫相关的通路上。生存分析结果表明LOXL1-AS1、CCNJL、ERLIN1、MLLT3、SCRN1、SLC9A3R2与胆管癌患者的预后密切相关。通过对生物信息学分析的结果进行综合分析,我们最终确定了胆管癌关键的ceRNA调控通路LOXL1-AS1-miR-148a-3p-TGFB2并进行初步验证。qRT-PCR结果显示LOXL1-AS1和TGFB2表达正相关,在胆管癌组织中均为高表达,mi R-148a-3p为低表达,Western Blot和免疫组化表明靶基因TGFB2在蛋白水平也呈高表达,生存分析和Cox分析显示TGFB2表达水平和CCA患者的预后显着相关（p<0.05）,可以作为CCA预后的独立危险因素。结论:本研究下载TCGA数据库中胆管癌的测序数据和临床数据,使用R语言对数据进行分析,筛选得到差异表达的mRNA、lncRNA和miRNA,借助在线数据库预测这些差异RNAs间的相互作用关系并构建网络,最终筛选出基于lncRNA的LOXL1-AS1-mi R-148a-3p-TGFB2关键调控通路,初步验证了三者的表达水平,证明靶基因TGFB2高表达与胆管癌患者不良预后相关,为胆管癌的后续研究提供了新的思路。
钱建新[6]（2020）在《核糖体蛋白RPL34在肝门部胆管癌中表达的临床意义和作用机制研究》文中研究表明根据解剖位置胆管癌分为三类:肝内（intrahepatic cholangiocarcinoma,iCCA）、肝门部（perihilar cholangiocarcinoma,pCCA）以及远端胆管癌（distal cholangiocarcinoma,dCCA）,其中肝门部胆管癌是最常见类型,占比超过60%。虽然位置不同,各类胆管癌发生的相关风险因素比较类似:原发性硬化性胆管炎（PSC）、胆道内的结石和寄生虫所导致的肝脏疾病。淋巴结浸润和边缘肿瘤细胞是否残留是决定术后预后的最重要因素。根治性手术切除的肝门部胆管癌5年生存率在10%到40%之间,然而,即使是R0切除,其复发率高达50～70%,高侵袭性和高复发性是pCCA两大病理特性。对于肝门部胆管癌发生发展分子机制的探寻以及胆管癌预后预测、治疗靶点筛选等一直是其临床研究重点。核糖体是细胞活动中极为重要的细胞器,负责将“RNA翻译成蛋白质”这一生物合成过程。此外,核糖体蛋白（ribosomal proteins,RPs）可调控细胞周期和细胞生长,促进肿瘤发生和发展。RPL34隶属于核糖体蛋白RPL34E家族成员。RPL34既往主要集中于非人类标本如昆虫和植物中进行研究。近年来,大量数据表明RPL34在不同类型恶性肿瘤如非小细胞肺癌、胃癌、食管癌、前列腺癌等中表达异常,其主要功能是通过调控细胞周期,促进细胞增殖。这些发现提示RPL34可能参与胆管癌发生发展。然而RPL34及功能在肝门部胆管癌中的研究少见报道。本实验拟研究RPL34在肝门部胆管癌中的表达,并分析其与临床病理参数和复发预后之间的相关性。进一步通过细胞学和动物实验探寻其在肝门部胆管癌中功能作用,最后利用高通量筛选寻找RPL34调控或者相关的靶基因。通过本课题的一系列研究,探索RPL34及其靶基因是否能够成为一种预测pCCA复发及预后的有效标志物,以及其能否成为pCCA潜在的临床治疗研究靶点。第一部分肝门部胆管癌病理特征与核糖体蛋白表达分析及其临床意义目的:检测核糖体蛋白在人pCCA中的表达谱系,并统计分析其与临床病理参数以及复发和预后的相关性,初步探寻核糖体蛋白在人pCCA发生发展中的潜在意义。方法:收集肝门部胆管癌以及部分癌旁非肿瘤性样本,首先从形态学观察肝门部胆管癌的病理特征;其次收集新鲜肝门部胆管癌样本,RT-PCR检测RPs家族成员在肿瘤样本中的表达谱系情况;然后采用组织芯片（tissue microarray,TMA）技术结合免疫组化（immunohistochemistry,IHC）技术,从蛋白水平针对RPL34蛋白检测其在pCCA细胞和癌旁非肿瘤组织中的表达;进而总结分析统计染色结果,并与临床病理信息、复发以及总生存时间相关联,探寻RPL34在人肝门部胆管癌中的表达和临床价值。结果:（1）肝门部胆管癌的临床病理学分析:肿瘤细胞呈不规则腺管样排列,可见筛状结构,浸润性生长。肿瘤细胞核异型明显,可见核仁,核分裂像或病理性核分裂像多见。间质可见明显的促结缔组织反应。根据肿瘤间质比（tumor-stroma ratio,TSR）=50%的最佳截断值,将患者分为“stroma-rich,间质丰富”和“stroma-poor,间质贫乏”,本研究中85例（70.2%）患者为间质贫乏,36例（29.8%）患者为间质丰富。TSR低（间质丰富）的肝门部胆管癌患者更加易于发生淋巴结转移和疾病进展迅速。TSR高（间质贫乏）的患者中位无复发生存期为1.5年,TSR低的患者中位无复发生存期为0.5年,P=0.073。TSR高的患者中位生存期为1.7年,TSR低的患者中位生存期为1.0年,P=0.028。神经侵犯（perineural invasion,PNI）是肝门部胆管细胞癌的另一个显着的病理特征。本研究中94例（77.7%）组织样本中存在神经侵犯,27例（22.3%）患者组织样本中未见明显的神经侵犯,PNI更常见于伴有淋巴结转移和晚期肝门部胆管癌患者。（2）RPs家族成员在肝门部胆管癌中表达均出现不同程度的上调,提示该家族主要成员在肝门部胆管癌发生中可能起重要的作用。其中RPSA（P=0.0266）、RPS2（P=0.0309）、RPL34（P=0.0034）、RPL37（P=0.0584）、RPP0（P=0.0345）在肿瘤组织中的表达要明显高于癌旁非肿瘤组织中的表达,RPL34最为显着。（3）在pCCA癌旁非肿瘤上皮细胞中RPL34不表达或呈微弱表达,pCCA肿瘤组织中RPL34染色定位于细胞浆和细胞核,呈棕黄色或深褐色。RPL34在pCCA肿瘤组织中表达率为77.7%（94/121）。（4）pCCA肿瘤细胞中RPL34表达与肿瘤细胞分化不良和淋巴结转移高度相关。主要表现为:肿瘤细胞的分化程度越低,RPL34表达越高;低分化组的阳性率（82%）要显着高于中、高分化组（30%）（P=0.001）。RPL34表达与淋巴结的转移率呈正相关（淋巴结转移阳性组vs淋巴结转移阴性组为84.6%vs 69.6%,P=0.049）。RPL34阳性与患者年龄、性别、肿瘤体积以及临床分期均没有统计学关联（P>0.05）。（5）单因素分析显示,边缘阳性（P=0.024）、区域淋巴结（P=0.015）、晚期（P=0.023）与pCCA肿瘤复发相关。与RPL34阴性表达的患者相比,RPL34阳性的患者中位无复发生存期更短（1.46年vs 3.73年,P<0.001）。在Cox模型中,RPL34表达是肿瘤复发的独立预测因素。单因素生存分析表明肝门部胆管癌患者的不良预后与手术切缘阳性（P=0.013）、T分期（P=0.019）、淋巴结转移（P=0.001）、TSR（P=0.028）、TNM分期（P=0.003）以及组织分化程度（P=0.025）呈正相关。与RPL34阴性表达的患者相比,RPL34阳性的患者中位生存期更短（1.70年vs 3.63年,P<0.001）。在多因素模型中,RPL34表达和TSR是肝门部胆管癌的独立预后预测因子。结论:肝门部胆管癌具有显着异常的TSR和PNI,两者均与pCCA的淋巴结转移和疾病进展迅速相关。RPs在pCCA中泛化表达,提示核糖体生物发生在肝门部胆管癌发生发展中起到重要作用。RPL34在pCCA中高表达,其表达与疾病进展和淋巴结转移相关,RPL34的高表达患者更加易于复发,并伴随不良转归。本研究结果提示了RPL34在肝门部胆管癌中具有促癌的作用。第二部分核糖体蛋白RPL34对肝门部胆管癌细胞侵袭生长的影响目的:为探索RPL34在肝门部胆管癌中的促癌作用及机制,观察其对癌细胞增殖、侵袭和体内成瘤及转移能力的影响。方法:合成RPL34-shRNA,包装慢病毒颗粒,靶向肝门部胆管癌细胞内源性RPL34,Western blotting检测RPL34的表达,CCK8法观察其对pCCA细胞增殖的影响,Transwell检测RPL34-sh RNA对pCCA细胞侵袭能力的改变,裸鼠成瘤实验观察RPL34-shRNA对pCCA细胞体内成瘤和转移能力的影响。结果:慢病毒载体携带shRNA成功对RPL34基因进行敲减,内源性RPL34的下降表达能够抑制肝门部胆管癌细胞的生长和迁移能力,同时也能够降低肿瘤细胞的体内成瘤能力以及向肝脏转移能力。结论:在肝门部胆管癌中RPL34可能起到促癌基因的功能,其促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长,主要通过增强pCCA细胞转移和增殖能力。第三部分核糖体蛋白RPL34促肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用机制目的:应用基因芯片检测RPL34-shRNA感染敲减RPL34的肝门部胆管癌细胞QBC939与对照胆管癌细胞的基因表达差异,初步探寻RPL34促进肿瘤侵袭生长的分子机制。方法:（1）Western blotting检测RPL34-shRNA感染后部分EMT相关指标和代谢相关指标的表达;（2）收集感染空白对照的肝门部胆管癌细胞和感染RPL34-sh RNA的肝门部胆管癌细胞,Trizol保存,送至基因检测平台;（3）利用Affymetrix?人类基因组U219微阵列检测感染RPL34-shRNA后基因表达的改变情况。Gene ontology和KEGG通路分析确定基因敲减后影响的信号通路和/或基因;（4）选择部分关键基因,进行Western blotting验证、利用TMA+IHC进行临床验证和统计分析;（5）构建了全长BCAS2（breast carcinoma amplified sequence 2）的质粒,并在RPL34敲减细胞中过表达BCAS2,采用CCK8检测细胞增殖、Transwell检测侵袭能力的改变。结果:（1）RPL34敲减后引起E-cadherin的表达上调,提示RPL34可能通过影响EMT促进肝门部胆管癌细胞的侵袭。而代谢相关指标未发生明显变化。（2）基因芯片结果显示160个基因在敲减内源性RPL34后发生显着改变。功能分类显示排名前八位的信号通路分别是:钾离子跨膜运输、核小体组装、心脏传导、细胞蛋白质代谢过程、蛋白质分解代谢、非同源端接双链修复、通过端粒酶端粒维持和信使RNA剪接等。前5位下调差异基因包括:SETD2（SET domain containing 2）（Fold change=-2.20,P=0.043）、COA6（cytochrome c oxidase assembly factor 6）（Fold change=-2.05,P=0.035）、TSEN15（tRNA splicing endonuclease subunit 15）（Fold change=-1.94,P=0.011）、BCAS2（breast carcinoma amplified sequence 2）（Fold change=-1.94,P=0.039）和HNRNPLL（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-like）（Fold change=-1.92,P=0.00029）。经过生物信息学分析,发现BCAS2和HNRNPLL两个基因与肿瘤相关。（3）RPL34调控蛋白BCAS2定位于细胞核和细胞浆,在非肿瘤上皮中呈弱表达,在肿瘤组织中呈强表达,肿瘤中的表达率为76.0%（92/121）。其表达与肿瘤分化呈正相关。与BCAS2阴性的患者相比,BCAS2阳性的患者中位无复发生存期更短（1.69年vs3.14年,P=0.012）。（4）敲减RPL34后肝门部胆管癌细胞的侵袭生长能力下降,当过表达BCAS2后,癌细胞的侵袭生长能力有所恢复。提示BCAS2能够部分逆转RPL34敲减所致的异常生物学行为。结论:本部分研究从机制上初步揭示了RPL34促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的潜在机制:RPL34可能通过EMT促进肿瘤侵袭生长;RPL34敲减后基因分析结果提示RPL34通过影响细胞核的翻译、转录、剪切和组装等功能,增强肝门部胆管癌细胞侵袭生长能力;基因芯片筛选出的RPL34相关蛋白BCAS2在肝门部胆管癌中异常表达,其阳性表达与肝门部胆管癌的恶性生物学行为和不良预后密切相关,过表达BCAS2后能够逆转敲减RPL34所致的细胞侵袭生长能力的下降,提示RPL34可能通过BCAS2发挥促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用。总结RPL34在肝门部胆管癌中显着高表达,具有促肝门部胆管细胞侵袭生长作用。基因芯片检测、生物信息分析和蛋白免疫印迹验证提示RPL34可能通过EMT以及多种信号传导通路促进肝门部胆管癌的侵袭生长。高通量筛选所发现相关蛋白BCAS2在肝门部胆管癌中异常表达,过表达BCAS2后能够逆转敲减RPL34所致的细胞增殖能力和侵袭能力的下降,提示BCAS2是RPL34可能的下游分子。RPL34有望成为一种预测肝门部胆管癌复发和预后的肿瘤标志物,靶向RPL34介导的信号通路可能成为pCCA潜在的治疗策略。
谢之豪[7]（2020）在《NAFLD对肝内胆管癌肝切除预后的影响及SULT2B1b表达与肿瘤侵袭的相关性和机制》文中研究表明第一部分非酒精性脂肪性肝病对肝内胆管癌肝切除预后的影响研究背景与目的:肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）是发病率仅次于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的第二种原发性肝癌,近十年来该病在全世界范围内的发病率显着上升。非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）已成为ICC的主要危险因素之一。本研究旨在评价NAFLD对ICC肝切除预后的影响。研究方法:本研究收集2003年至2011年在海军军医大学东方肝胆外科医院接受肝切除治疗的ICC病人的临床病理资料。根据纳入和排除标准将1045例病人纳入本研究,其中214例伴有NAFLD,831例不伴有NAFLD。本研究纳入的病人均行肿瘤根治性切除,且术后病理诊断为ICC。本研究的终点为至复发时间（time to recurrence,TTR）,肿瘤特异性生存（cancer-specific survival,CSS）以及总体生存（overall survival,OS）。根据Kaplan-Meier方法估算病人术后复发率、CSS率和OS率,Log-Rank检验方法进行组间差异比较。选取单因素分析有统计学意义的变量进入COX等比例风险回归模型筛选影响复发、CSS和OS的独立危险因素。采用倾向性评分匹配（propensity score matching,PSM）降低两组之间基线资料差异相关的选择性偏倚,采用第八版AJCC/TNM分期系统对ICC进行临床分期。结果:与非NAFLD相关ICC（Non-NAFLD-ICC）病人相比较,NAFLD相关ICC（NAFLD-ICC）病人的超重和患有2型糖尿病的比例更高（64.0%vs.21.7%,P<0.01;15.9%vs.4.0%,P<0.01）,伴肝硬化的比例更低（7.0%vs.25.2%,P<0.01）。NAFLDICC病人术后并发症的发生率较Non-NAFLD-ICC病人更高（28.5%vs.18.5%,P=0.001）。伴或不伴有NAFLD的ICC病人的5年复发率、CSS率和OS率均无显着性差异（88.5%vs.83.4%,P=0.100;24.4%vs.29.3%,P=0.200;20.4%vs.28.2%,P=0.100）。根据AJCC/TNM分期进行分层分析显示:在I/II期病人中,NAFLD-ICC病人的5年复发率显着高于Non-NAFLD-ICC病人（86.1%vs.80.1%,P=0.030）,5年CSS率和OS率均显着低于Non-NAFLD-ICC病人（23.3%vs.35.1%,P=0.030;20.5%vs.33.5%,P=0.020）。经1:1 PSM配对后,AJCC/TNM分期I/II期NAFLD-ICC和Non-NAFLD-ICC组均为135例病人。NAFLD-ICC病人仍然获得较差的远期预后（5年复发率:86.3%vs.75.9%,P=0.040;5年CSS率:23.3%vs.38.5%,P=0.040;5年OS率:21.2%vs.35.8%,P=0.040）。多因素分析显示,肿瘤分期为I/II期时,NAFLD是影响术后复发、CSS和OS的独立危险因素（风险比[hazard ratio,HR]:1.56,95%置信区间[confidence interval,CI]:1.17-2.08;1.43,1.05-1.95;1.44,1.06-1.95）。结论:伴或不伴有NAFLD的ICC病人,其肝切除术后5年复发率、CSS率和OS率均无显着性差异。对于AJCC/TNM分期I/II期的病人,NAFLD-ICC的远期预后较Non-NAFLD-ICC更差。第二部分SULT2B1b基因在NAFLD-ICC中的表达及其验证研究背景与目的:前期研究发现在早期ICC中,NAFLD-ICC较Non-NAFLD-ICC的远期预后更差。本研究利用二代基因测序方法检测NAFLD-ICC与Non-NAFLDICC的差异表达基因,探索参与NAFLD-ICC发生和发展的相关基因,及其在ICC分子分型中的潜在作用。研究方法:对43例行根治性肝切除的ICC肿瘤组织及配对的癌旁肝组织行转录组二代基因测序。通过生物信息学分析比对鉴定表达差异基因,进行GO、KEGG信号通路富集及文献回顾筛选出其中与NAFLD相关基因,并根据差异基因表达水平行术后生存分析。在筛选发现羟基类固醇硫酸转移酶（hydroxysteroid Sulfotransferases）2B1b（SULT2B1b）基因与NAFLD-ICC发生和发展具有相关性并且影响预后的基础上,进一步对105例ICC病人的肿瘤组织石蜡切片行免疫组化染色,验证SULT2B1b蛋白表达水平与NAFLD-ICC预后的相关性。结果:转录组测序发现多个差异表达信号分子。通过对基因表达水平,表达水平与预后的相关性,以及所处信号通路分析,筛选出SULT2B1b基因。该基因在NAFLDICC肿瘤组织中的表达水平显着高于Non-NAFLD-ICC肿瘤组织,同时也显着高于正常肝组织,并且SULT2B1b基因高表达组的术后远期预后显着差于低表达组。免疫组化染色发现,SULT2B1b蛋白高表达的病人,其术后复发率显着高于低表达的病人,OS也显着差于后者。多因素COX比例回归风险模型证实NAFLD-ICC肿瘤组织中SULT2B1b蛋白高表达和较晚的AJCC/TNM分期均为ICC病人术后复发和OS的独立危险因素。结论:SULT2B1b基因及其编码蛋白在NAFLD-ICC肿瘤组织中高表达,且其高表达与ICC术后较差的远期预后具有显着的相关性。第三部分SULT2B1b基因在ICC细胞中的功能研究研究背景与目的:前期临床研究发现在早期ICC中NAFLD-ICC的远期预后差于Non-NAFLD-ICC;转录组测序等研究发现SULT2B1b基因及其编码蛋白在NAFLD-ICC肿瘤组织中高表达,其高表达是ICC不良预后的独立危险因素。本部分研究旨在探讨SULT2B1b在ICC中的生物学功能。研究方法:通过q RT-PCR检测3种ICC细胞系中SULT2B1b基因m RNA的表达水平,采用瞬转干扰RNA（si RNA）方法对SULT2B1b基因高表达细胞系QBC939行该基因敲减,通过CCK-8实验测定SULT2B1b基因敲减对ICC细胞增殖能力影响;通过构建慢病毒感染实现对ICC细胞系SULT2B1b基因的稳定敲减,利用慢病毒稳转ICC细胞建立ICC裸鼠皮下成瘤模型,通过在体动物实验验证SULT2B1b基因表达与ICC细胞增殖能力的相关性。根据细胞划痕及Transwell小室侵袭实验验证SULT2B1b基因敲减对ICC细胞迁移及侵袭能力的影响。通过流式细胞术检测SULT2B1b基因敲减对ICC细胞周期及凋亡的影响。结果:si RNA干扰后QBC939细胞SULT2B1b蛋白表达下调;CCK-8细胞增殖实验表明干扰SULT2B1b表达可抑制ICC细胞的增殖;裸鼠皮下ICC成瘤模型证实SULT2B1b基因敲减降低ICC的增殖能力。划痕实验表明干扰SULT2B1b可抑制ICC细胞的迁移,Transwell小室侵袭实验表明干扰SULT2B1b可显着减弱ICC细胞的侵袭能力。流式细胞分析结果显示干扰SULT2B1b基因表达可使ICC细胞出现G2/M期阻滞,对细胞凋亡无明显影响。结论:干扰SULT2B1b基因表达可显着抑制ICC细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
季鸿翔[8]（2020）在《APOBEC3A/B启动子单核苷酸多态性对胆道系统癌症发生风险影响及机制的研究》文中认为研究背景和目的胆道系统肿瘤（Bile tract cancer BTC）,是指发生于胆道上皮的恶性肿瘤,包括胆管癌（Cholangiocarcinoma CCA）和胆囊癌（Gallbladder cancer GBC）。胆管癌约占消化系统肿瘤的3%,按照解剖位置不同,可进一步分为肝内胆管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma ICC）、肝门部胆管癌（Perihilar cholangiocarcinoma p CC）和远端胆管癌（Distal cholangiocarcinoma d CC）,后两者按第三版《国际肿瘤分类》应归于肝外胆管癌（Extrahepatic Cholangiocarcinoma ECC）范畴[1];胆囊癌则是消化系统第6位常见肿瘤[6]。虽属同一系统,但上述肿瘤在致病诱因、易患人群、发生率、病死率方面均存在显着差别:从致病诱因来看,泰国等沿海地区以寄生虫感染（肝吸虫）为主要诱因,而我国以胆道结石及其导致的慢性炎症为主要病因,欧美国家则主要以原发性硬化性胆管炎（PSC）为主要致病危险因素[2-6]。从发生率上来看,东南亚地区是胆管癌显着高发地区,而欧美地区发生率相对较低;胆囊癌在拉丁美洲显着高发,其中智利为全球发病率最高,而亚洲地区如韩国、泰国、中国为次高发地区,欧美地区发病率较低。从易患人群的角度来看,亚洲种族属于胆道系统肿瘤易患人群,即使在美洲,亚裔和拉美裔人群胆管癌发生率也高于纯美裔和非裔人群,且致死率在非裔人群中最低。不仅如此,男女性别间发生率也存在差异[8-11]。由此可见,胆道系统肿瘤的发生不仅受到解剖结构、组织差异的影响,而且存在着显着的地理、人种、性别等遗传背景差异。胆道系统癌症的预后亦差异较大且普遍不佳,共同特点是起病隐匿,早期诊断困难,一级预防十分重要。目前的肿瘤机制研究,绝大多数聚焦于基因改变的影响,着力于发现基因变化与肿瘤发生、进展之间的关系。但不可忽略的是,肿瘤的发生与地理、环境、人群特征存在着复杂而紧密的内在关系,基因水平的变化机制也与这些影响因素密不可分。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism SNP）是基因水平单个核酸变异导致的DNA序列多样化的改变,是哺乳动物可遗传变异最常见的一种,主要表现为单个碱基发生转换（C>T,互补G>A）或颠换（C>A,互补G>T）,它广泛存在于人类基因组中且具有很好的遗传稳定性,当SNP落于致病基因的附近或内部时,对基因功能产生影响,进而参与疾病的发生和发展。这些特点使SNP可以很好的作为群体遗传背景下,关键致病基因研究的结合点。载脂蛋白B m RNA催化样蛋白（apolioprotein B m RNA-editing enzyme catalytic polypeptide,APOBEC）是存在于人类和其他灵长类动物体内的一种蛋白酶类,其编码基因位于人第22号染色体。APOBEC家族中有11个成员:APOBEC1、APOBEC2、7个APOBEC3亚家族成员（APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3DE、APOBEC3H、APOBEC3F、APOBEC3G）以及活化诱导脱氨酶（activation induced cytidine deaminase,AID）[40]。其在细胞内主要作用于单链DNA（Single strand DNA,ss DNA）或RNA,其中APOBEC3亚家族的主要生理功能是以高效的核酸编辑活性在逆转录过程中引入高频突变,正常情况下主要在人体固有和获得性免疫反应中发挥作用,可以抵抗逆转录病毒、抑制内源性逆转录以及破坏外源性DNA[39,41]。但当其功能导致的高频突变在体内错误发生时,APOBEC就成为了细胞基因异常突变的主要来源,并且数量巨大。已有研究表明APOBEC家族在乳腺癌、膀胱癌、结肠癌的发生中起到十分关键的作用,尤其是当其致突变作用发生于关键的致癌或抑癌相关基因时[46]。目前,在胆道系统癌症中APOBEC相关研究尚为数不多。综上所述,本研究选择了APOBEC家族中目前较为确定的肿瘤相关分子APOBEC3A/3B,并以其启动子区SNP改变为背景,着力探究在我国汉族人群的遗传背景下,胆道系统癌症的发生与APOBEC3A/3B功能间的内在联系,并进一步对这些联系的机制进行探索,企图发现调控的关键分子,以期为该系统癌症的发生机制和早期筛查手段提供新线索。研究方法本研究首先利用Ensembl数据库和Haploview 4.2对APOBEC3A/3B启动子区域进行分析,选择和确定待研究的3个SNP位点,并明确位点特征及相互关系。然后按纳入标准收集待研究人群临床资料及外周血样本3231例,其中1240例健康人、735例胆管癌患者、453例胆囊癌患者、803例胆道炎症患者,其中女性1315例、男性1916例。采集的临床信息包括:年龄、性别、民族、临床诊断、乙肝五项;其中胆道系统疾病患者另采集AFP、CEA、CA19-9肿瘤标志物水平。血液样本用于进行SNP检测分型,之后以临床诊断、基本信息、临床检验资料和对应SNP分型数据建立研究数据库,并进行APOBEC3A/3B启动子区SNP改变对胆道癌症发生风险影响作用的统计学分析。随后,构建APOBEC3A/3B不同等位基因型启动子质粒,分别利用正常胆管上皮细胞（HIBEpic）、胆管癌细胞（RBE）、胆囊癌细胞（GBC-SD）进行转染,采用双荧光素酶检测的方法观察其在不同细胞内的启动转录活性。利用APOBEC3A/3B过表达质粒转染细胞,采用流式细胞技术观察在过表达状态下APOBEC3A/3B对细胞状态的影响,运用Western Blot技术验证过表达转染效力。探索TCGA数据库,发掘APOBEC3A/3B在胆管癌肿瘤中的表达水平与细胞内基因突变水平的相关关系,印证其影响细胞状态的能力。运用PROMO转录因子在线预测网站,预测可能与APOBEC3B启动子区发生结合的转录因子,si RNA（small interference RNA）敲除技术及双荧光素酶检测技术筛选对其可能具有调控作用的关键转录因子,si RNA与启动子质粒共转染观察转录因子敲除后APOBEC3B不同类型启动子的启动转录活性变化,分析转录因子调控作用下启动子活性的细胞类型间差异,RT-q PCR技术定量关键转录因子组织间表达水平的不同,最终以上述研究结果解释本研究中APOBEC3A/3B启动子区SNP与胆道癌症发生关系的状态。统计方法主要采用t检验或方差分析（数据符合正态分布时）、秩和检验（数据不符合正态分布时）,χ2检验（分类变量）,logistic回归。研究中考虑年龄、性别在胆系疾病组和健康对照组数据之间存在分布差异,因此在分析时纳入年龄、性别因素进行校正,最终获得AORs（校正后优势比）和95%置信区间（CI）。所有的统计学检验均为双尾检验,当P<0.05时认为差异具有统计学意义。所用统计软件为SPSS23.0。研究结果（一）SNP位点确定:本研究中按照APOBEC3A,APOBEC3B和基因转录调控的关系最终确定3个SNP位点:（1）APOBEC3A rs12157810（-525bp,APOBEC3A启动子区域,A>C）（2）APOBEC3B rs2267401（-338bp,APOBEC3B启动子区域,T>G）（3）APOBEC3A rs12628403（+4340bp,APOBEC3A,内含子4区,A>C,APOBEC3B缺失型“代理”位点）。其中APOBEC3A rs12628403作为APOBEC3B rs2267401缺失型“代理”位点,在200例抽样验证样本中“代理”符合率97.5%。（二）APOBEC3A/3B启动子SNP与胆系疾病发生关系的分析:SNP背景下APOBEC3A/3B对胆道癌症的发生风险影响体现出了解剖、组织和性别上的差异,APOBEC3A rs12157810的C等位基因型主要发挥着降低胆管癌和胆囊癌发生风险的作用,而APOBEC3B rs2267401 G等位基因型在胆管癌内体现出一定降低发生风险的作用,却显着的增加胆囊癌发生风险,呈相反趋势。（三）APOBEC3A/3B启动子在细胞内活性的差异:在正常胆管上皮细胞、胆管癌细胞和胆囊癌细胞中APOBEC3A rs12157810 C等位基因型的启动子启动转录活性均强于A型;在正常胆管上皮细胞、胆管癌细胞中APOBEC3B rs2267401 G等位基因型启动子活性弱于T型,而在胆囊癌细胞中G等位基因型启动子活性显着强于T型,呈相反状态,与流行病研究结果相印证。（四）APOBEC3A/3B过表达对细胞的影响:APOBEC3A过表达显着促进293T细胞的凋亡（凋亡率:293T APOBEC3A 22.48%vs 293T-Vector 10.54%p<0.05）,APOBEC3B过表达未见显着促凋亡作用。（五）APOBEC3A/3B与突变的相关性（TCGA）:在胆管癌中APOBEC3A与突变显着相关（r2=0.39）,且表达量显着较APOBEC3B为低（p<0.05,3B≈10倍3A）,说明APOBEC3A具有高效的致突变能力。（六）APOBEC3B启动子相关转录因子预测、筛选与调控关系:筛选后得到目标转录因子TFAP2A,并在细胞内发现其对APOBEC3B G等位基因型启动子活性具有明显抑制作用,且其在胆管癌内高表达,在胆囊癌内低表达,从而导致调控水平细胞间差异。研究结论1.APOBEC3A/3B启动子区SNP导致的启动转录活性变化与胆道肿瘤发生风险相关,APOBEC3A/3B不同等位基因型启动子活性的差异,对胆道癌症发生风险产生影响,并体现出了解剖结构、组织类别和性别、易患人群之间的不同,外周血APOBEC3A/3B的SNP检测分型可为胆道癌症早期筛查预防提供有效线索。2.APOBEC3A高效的致突变效力可能促进肿瘤细胞突变过载而发生凋亡,其对胆道癌症发生风险呈现降低作用。3.APOBEC3B对胆道肿瘤的发生风险影响在胆管癌和胆囊癌之间呈现相反趋势,此差异的产生与其启动子活性在组织间的差异有关。4.转录因子TFAP2A抑制性调控水平在细胞间的差别是导致APOBEC3B启动子活性差异的重要原因,TFAP2A在胆管癌细胞和胆囊癌细胞内表达水平不同,因此产生的调控强度不同是主要机制。
刘小梯[9]（2020）在《Aurora-B激酶磷酸化CENP-U调控胆管癌细胞增殖的机制研究》文中研究指明第一章Aurora-B、CENP-U在肝内胆管癌的表达和临床病理关系目的检测Aurora-B、CENP-U在肝内胆管癌组织中的表达,明确Aurora-B、CENP-U与肝内胆管癌临床病理相关因素关系,并了解两者表达相关性。方法检测40例肝内胆管癌组织及癌旁组织Aurora-B、CENP-U表达情况。分别分析Aurora-B、CENP-U与肝内胆管癌临床病理因素的关系,Spearman相关分析法分析二者之间的关系。结果1.Aurora-B、CENP-U在肝内胆管癌组织中的表达显着高于癌旁组织（P<0.05）。2.Aurora-B表达强度与肝内胆管细胞癌分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移和临床分期密切相关（P=0.024,0.012,0.026,0.024）。3.CENP-U表达强度与肝内胆管细胞癌肿瘤大小、淋巴结转移和临床分期密切相关（P=0.037,0.048,0.013）。4.肝内胆管癌中Aurora-B和CENP-U表达水平呈正相关（r=0.647,P<0.0001）。结论Aurora-B与CENP-U作为有丝分裂的重要分子,二者在肝内胆管癌组织中呈高表达且表达水平存在明显相关性;其表达水平与肝内胆管细胞癌的临床分期密切相关,Aurora-B与CENP-U可能共同参与肝内胆管细胞癌发生发展。第二章Aurora-B调控CENP-U影响肝内胆管癌细胞增殖的机制研究目的探讨Aurora-B/CENP-U信号通路在胆管细胞癌增殖中的作用及机制。方法通过构建Aurora-B-Sh RNA质粒,使用lipo2000转入QBC939细胞,建立沉默Aurora-B的胆管癌细胞株QBC939,采用qPCR验证Aurora-B基因的敲低效率,WB检测CENP-U总蛋白及磷酸化CENP-U蛋白（P-CENP-U蛋白）表达。构建CENP-U磷酸化位点（Ser349和Ser350）的组成失活型突变的慢病毒载体,感染胆管癌细胞株QBC939,获得CENP-U组成失活型突变体的胆管癌细胞株QBC939,WB检测p-CENP-U表达水平,CCK8及克隆形成试验检测胆管癌QBC939细胞增殖情况。结果1.沉默Aurora-B的胆管癌细胞QBC939 CENP-U总蛋白及P-CENP-U蛋白表达下降。2.CENP-U磷酸化位点（Ser349和Ser350）的组成失活型突变的慢病毒载体,感染胆管癌细胞QBC939后,胆管癌细胞QBC939增殖能力下降。结论Aurora-B激酶可能通过磷酸化调控CENP-U表达,从而影响肝内胆管癌细胞增殖。
邱博[10]（2020）在《Sprouty4通过阻断FGFR-ERK通路及阻断细胞周期预示着肝门胆管癌的良好预后》文中指出研究背景胆管癌（Cholangiocarcinoma,CCA）是一种起源于胆道的恶性肿瘤。胆管癌占所有胃肠道肿瘤的3%。在全球范围内,肝脏及胆道的恶性肿瘤占癌症相关死亡的13%;其中10%-20%属于胆管癌。胆管癌患者的平均诊断年龄为50岁。胆管癌的全球发病率差异很大。在过去的30年里,胆管癌的发病率正在逐渐的上升,特别是在东亚和东南亚,胆管癌的发病率正在不断攀升。在胆管癌中,根据肿瘤的解剖位置,胆管癌可进一步分为肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）、肝 门 部 胆 管 癌（perihilar cholangiocarcinoma,PHCC）和远端胆管癌（distal cholangiocarcinoma,DCC）。三种不同类型的胆管癌的危险因素、分子发病机制、生物学特点、临床特点和治疗策略各不相同。肝内胆管癌位于肝脏的实质内。二级胆管是肝内胆管癌与肝门胆管癌分界点,胆囊管与肝总管的交汇处是肝门部胆管癌与远端胆管癌的解剖学边界。由于胆管癌的解剖位置特殊,临床症状出现较晚,胆管癌的诊断对于临床工作者来说是一项很大的挑战。正因如此,胆管癌的患者通常诊断较晚,而且预后较差。肝门部胆管癌是胆管癌中最常见的类型,占了所有胆管癌的50%以上。唯一可能治愈胆管癌的方法就是根治性手术切除。但对于肝门部胆管癌来说,由于第一肝门的解剖比较复杂,根治性手术是非常困难的。尽管手术技术和辅助治疗有了显着的改善,但肝门部胆管癌的预后仍然很差（大多数研究中5年生存率<30%）。以第二代测序为代表的技术革命为肿瘤治疗的分子特征和治疗策略提供了更多的方案。这对于胆道的恶性肿瘤,包括胆管癌尤其重要,因为超过65%的胆道恶性肿瘤患者在诊断时已经丧失了获得根治性手术切除的机会。综合遗传分析的新证据揭示了胆管癌的几种突变,如成纤维细胞生长因子受体（FGFR）融合重排和异柠檬酸脱氢酶（IDH）-1和异柠檬酸脱氢酶（IDH）-2突变。尽管肝门部胆管癌的发病率在三种类型的胆管癌中最高,但对其分子模式和特点的研究却落后于肝内胆管癌。自2007年以来,第七届美国癌症/国际癌症控制联盟（AJCC/UICC）已将肝门胆管癌和远端胆管癌定义为不同类型的肝外胆管癌,但迄今为止,还没有研究将肝门部胆管癌作为一种单独的癌症类型进行全面的遗传分析。在所有胆管癌中,Kirsten ras肉瘤病毒致癌基因同源突变（KRAS）和FGFR2融合是已经明确的体细胞遗传改变。KRAS突变预示着较差的总生存率,一些证据表明FGFR2融合在胆管癌的肿瘤发生和发展中起到不可忽视的作用。FGFR2是一种酪氨酸激酶受体,它主要了参与细胞增殖等过程,这种作用主要通过激活包括Ras/Raf/MEK/MAPK和PI3K/AKT信号通路的多种下游通路。RAS参与了 FGFR2介导的信号通路,其常见的下游信号通路是MEK/MAPK通路。KRAS突变和FGFR2融合均可以刺激MEK/MAPK通路,这种异位激活最终导致肿瘤细胞的过度增殖。细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）是大家熟知的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）之一,是KRAS和FGFR2的主要下游效应因子。研究者们普遍认为RAS激活可以启动补偿反馈机制,从而减弱信号输出。Sprouty（SPRY）家族包括SPRY1-4,是Ras/Raf/MEK/MAPK信号通路中最重要的负调控因子。SPRY可以通过从不同的水平调节FGFR/Ras/Raf/MEK/MAPK通路来抑制ERK的磷酸化。据报道,SPRY的功能障碍会导致多种癌症的进展,包括胃癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌。然而新的证据表明,SPRY家族成员的表达是肿瘤特异性的,并不是所有的SPRY家族成员都参与了不同类型癌症的进展和预后。比如说SPRY2是人类上皮性卵巢癌的独立预后生物标志物,而SPRY4没有这种作用。此外,SPRY4的缺失增强了急性髓性细胞白血病中的RAS信号,而SPRY家族中的其他成员没有这种作用。在我们之前的研究中,我们证明了不同的SPRY家族成员在肝内胆管癌中有不同的表达情况,SPRY2可以通过拮抗FGFR2信号来抑制肝内胆管癌的进展。然而,SPRY家族在肝门胆管癌中的表达、功能及临床意义还是一个谜。在我们的研究中,我们研究了不同SPRY家族成员在肝内胆管癌,肝门部胆管癌和远端胆管癌中的表达,来确定在肝门胆管癌细胞中影响Ras/Raf/MEK/MAPK信号反馈的关键效应因子,并通过分析临床病理因素与生存时间的相关性来评估其临床意义。通过体内外实验,我们进一步评价了 SPRY4在肝门胆管癌进展中的抑瘤作用,并探讨了 SPRY4抑制肝门胆管癌进展的潜在机制。第一部分Sprouty家族在胆管癌内的表达情况及临床意义目的:肝门部胆管癌是一种预后很差的消化系统恶性肿瘤。根据解剖位置,我们将胆管癌分为肝内胆管癌,肝门部胆管癌及远端胆管癌。肝门部胆管癌（PHCC）是胆管癌（CCA）三种亚型中最常见的类型。在我们之前的研究中,我们探究了肝内胆管癌（ICC）中SPRY的表达情况,但SPRY家族成员在肝门部胆管癌中的表达及临床意义尚不清楚。在本部分的研究中心,我们将探究SPRY家族成员在不同类型的胆管癌中的表达,研究SPRY家族成员与胆管癌患者临床病理特征和预后的关系。方法:我们首先收集了 2007年至2018年在山东大学齐鲁医院因肝门部胆管癌接受手术治疗的424例患者的信息。进一步选择142例接受根治性手术切除的患者作为本次研究的队列。收集胆管癌患者的癌组织及相邻的正常组织,通过qRT-PCR检测SPRY家族成员（SPRY1-4）在不同类型胆管癌（肝内胆管癌、肝门部胆管癌、远端胆管癌）及相应邻近组织中的表达。应用免疫组织化学方法检测142例肝门部胆管癌患者SPRY家族的表达情况。采用Kaplan-Meier法绘制了患者的生存曲线,采用log-rank检验比较患者生存率的差异。采用单因素和多因素分析,研究SPRY4与肝门部胆管癌患者临床病理情况的关系,探究SPRY4的临床意义。结果:在肝内胆管癌中,肿瘤组织中SPRY2的mRNA水平明显低于对应的癌旁组织。而在肝门部胆管癌中,SPRY2的表达在肿瘤组织和对应的相邻组织间无明显差异。在肝门部胆管癌中SPRY1、SPRY3、SPRY4在肿瘤组织中的表达明显低于对应的相邻组织。我们还应用免疫组化的方法检测了 142例肝门部胆管癌患者肿瘤组织中SPRY1-4的表达情况,并根据SPRY1-4的评分将其分为不同的亚组。所有SPRY家族成员均在细胞质中表达,其中SPRY1和SPRY4在肝门部胆管癌中的表达相对高于SPRY2和SPRY3。在4个SPRY家族成员中,SPRY4是唯一的肝门部胆管癌预后良好的标志（P=0.006）。SPRY4的高表达预示着更长的生存期。在我们本部分的研究中,除了 SPRY4的表达情况外,患者的年龄大于65（P=0.013）、淋巴结转移的阳性（P=0.025）、远处转移的阳性（P<0.001）、TNM分期为晚期（P<0.001）均与低生存率显着相关。SPRY4的高表达预示着肝门部胆管癌患者的肿瘤体积更小（P=0.007）、淋巴浸润为阴性（P=0.031）和TNM分期更早（P=0.002）。结论:SPRY4是SPRY家族4个成员中唯一与肝门部胆管癌预后相关的成员,SPRY4的高表达是判断肝门部胆管癌预后良好的独立的生物学标志物。第二部分Sprouty4的表达通过阻断FGFR-ERK通路及阻断细胞周期预示着肝门胆管癌的良好预后目的:在前一部分中,我们发现SPRY4的高表达是判断肝门部胆管癌预后良好的独立的生物学标志物,但是机制尚未明确。SPRY家族被认为是ERK激活的负性调节因子,我们推测SPRY4可能通过抑制ERK的激活来影响细胞的功能从而影响肝门部胆管癌患者的预后。在这一部分中,我们的目的是探究肝门部胆管癌中SPRY4和FGFR家族之间的相关性。探讨SPRY4在肝门部胆管癌中的作用,以及SPRY4预示肝门部胆管癌预后良好的机制。方法:用免疫组化法检测肝门部胆管癌中FGFR1-4的表达,分为低表达和高表达。我们进一步检测SPRY4和FGFR家族之间的相关性。通过体内实验及体外实验探究SPRY4在FGFR介导的肝门部胆管癌细胞增殖和迁移中的作用。免疫蛋白印迹法检测8对新鲜肝门部胆管癌组织及对应的邻近正常组织中SPRY4的表达。在肝内胆管癌细胞系RBE、HCCC-9810、肝门部胆管癌细胞系FRH0201、QBC939中检测SPRY4表达含量。在QBC939细胞系中,应用shRNAs沉默SPRY4,在FRH0201中,用携带LV5-SPRY4的慢病毒过表达SPRY4。应用QBC939细胞系评估SPRY4对增殖和迁移的影响。建立具有SPRY4敲除的稳定的QBC939细胞和具有SPRY4过表达的稳定的FRH0201细胞,并注射到裸鼠皮下,成功成瘤。我们进一步研究了在FGFR和ERK抑制剂存在的情况下,SPRY4对FGFR诱导的ERK磷酸化和细胞周期的影响及其机制。结果:FGFR2和FGFR4的高表达提示肝门部胆管癌的预后较差。在肝门部胆管癌中,SPRY4的表达与FGFR2的表达密切相关,其表达可由FGFR2异位激活引起。肝内胆管癌细胞系RBE、HCCC-9810、肝门部胆管癌细胞系FRH0201、QBC939均可检测到SPRY4的表达,其中以QBC939细胞表达最为显着。CCK-8和集落形成实验均显示,SPRY4敲低显着促进了 QBC939细胞的增殖,而SPRY4的过表达促进了 FRH0201细胞的增殖。穿孔实验和划痕实验也获得了类似的结果,表明SPRY4在QBC939细胞的迁移中也发挥了重要作用。通过体外和体内实验,我们发现SPRY4通过抑制ERK磷酸化来抑制FGFR介导的增殖和迁移。SPRY4基因敲除可降低G1期细胞的百分比,并促进S期和G2/M期细胞的百分比,这种作用是通过增加cyclin D1的表达来实现的,这种作用也需要FGFR介导的ERK磷酸化来完成。结论:肝门部胆管癌中FGFR2异位激活可诱导SPRY4表达。SPRY4通过抑制ERK磷酸化,在G1期阻滞细胞周期,抑制FGFR介导的增殖和迁移。SPRY4有希望成为肝门部胆管癌的潜在的治疗靶点。
二、不同分化胆管癌间差异表达基因的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同分化胆管癌间差异表达基因的研究（论文提纲范文）
（1）环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、CircACTN4在ICC组织中显着性高表达 |
| 二、CircACTN4 的表达与临床预后的关系 |
| 三、CircACTN4 对胆管癌细胞表型的影响 |
| 四、CircACTN4 调控FZD7 的表达 |
| 五、CircACTN4与YBX1 相互作用 |
| 六、CircACTN4 招募YBX1 共同激活FZD7 的转录 |
| 七、CircACTN4 充当miR-424-5p的分子海绵 |
| 八、CircACTN4 参与Wnt和 Hippo信号通路的调节 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 环状RNA分子的研究进展及其与疾病的联系 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（2）长链非编两RNA MNX1-AS1在肝内胆管癌中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 基于lnc RNA测序数据和临床数据建立预测肝内胆管癌预后的列线图 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 lnc RNA MNX1-AS1 促进肝内胆管癌发展和转移的功能研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 lnc RNA MNX1-AS1 促进肝内胆管癌发展和转移的机制研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 胆管癌进展过程中的分子机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（3）生物信息学结合定量蛋白组学筛选胆管癌预后标志物的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词全称对照表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 组织样本和实验材料 |
| 2.1.1 患者的选择和临床样本的收集 |
| 2.1.2 主要生化试剂和抗体 |
| 2.1.3 实验主要仪器 |
| 2.2 胆管癌数据的获取和预处理 |
| 2.3 差异表达基因的鉴定 |
| 2.4 功能与通路分析 |
| 2.5 生存分析和表达验证 |
| 2.6 样品制备和蛋白质定量 |
| 2.7 蛋白质消化和iTRAQ标记 |
| 2.7.1 蛋白质提取和定量 |
| 2.7.2 蛋白标记 |
| 2.7.3 LC-MS/MS分析 |
| 2.7.4 蛋白质鉴定与综合分析 |
| 2.8 组织微阵列(TMA)的制作 |
| 2.9 免疫组织化学(IHC)染色 |
| 2.10 免疫组化结果染色评分 |
| 2.11 数据分析 |
| 第三章 实验结果与结论 |
| 3.1 胆管癌中DEGs的鉴定 |
| 3.2 功能富集分析 |
| 3.3 DEGs 的生存分析和验证 |
| 3.4 差异表达蛋白(DEPs)与差异表达基因(DEGs)数据整合分析 |
| 3.5 ITGAV 和 APOF 在胆总管囊肿和胆管癌组织中的表达情况 |
| 3.6 CASK在 TMA中的表达情况 |
| 3.7 CASK表达与胆管癌患者临床病理特征之间的关系 |
| 3.8 CASK表达与胆管癌患者总生存期之间的关系 |
| 3.9 CASK表达与胆管癌患者无复发生存期之间的关系 |
| 3.10 实验结论 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 不足与展望 |
| 5.1 不足 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 综述:CASK与肿瘤关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（4）GRP78在胆管癌中的表达及与预后关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 组织标本 |
| 2.1.2 生物信息学验证 |
| 2.2 同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ) |
| 2.2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2.2 实验流程 |
| 2.2.3 数据分析 |
| 2.3 胆管癌组织微阵列(tissue microarray,TMA) |
| 2.3.1 实验仪器及试剂 |
| 2.3.2 实验流程 |
| 2.4 免疫组织化学染色 |
| 2.4.1 实验仪器及试剂 |
| 2.4.2 实验流程 |
| 2.4.3 结果分析 |
| 2.5 实时定量PCR(q RT-PCR) |
| 2.5.1 实验仪器及试剂 |
| 2.5.2 实验流程 |
| 2.6 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting) |
| 2.6.1 实验仪器及试剂配制 |
| 2.6.2 实验流程 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 胆管癌癌组织和癌旁组织间的差异表达蛋白 |
| 3.2 GRP78在胆管癌组织中的表达 |
| 3.3 GRP78蛋白表达与胆管癌患者预后的关系 |
| 3.4 单因素和多因素cox分析-GRP78蛋白及临床特征与生存时间的关系 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）基于TCGA数据库胆管癌ceRNA网络的构建与分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 胆管癌简介 |
| 1.2 ceRNA概述 |
| 1.2.1 lncRNA |
| 1.2.2 miRNA |
| 1.2.3 ceRNA在胆管癌中的研究 |
| 1.3 TCGA数据库 |
| 第二章 胆管癌转录组的差异分析和ceRNA网络构建 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 TCGA数据下载和分析 |
| 2.1.2 ceRNA网络的构建 |
| 2.1.3 ceRNA网络可视化 |
| 2.1.4 ceRNA网络中差异表达基因的功能富集分析 |
| 2.1.5 ceRNA网络预后分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 胆管癌中差异表达的RNAs |
| 2.2.2 胆管癌ceRNA调控网络的构建 |
| 2.2.3 ceRNA网络中mRNAs的功能富集分析 |
| 2.2.4 ceRNA网络节点的预后分析 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 基于lncRNA构建的LOXL1-AS1-miR-148a-3p-TGFB2调控通路的初步验证 |
| 3.1 临床标本采集和处理 |
| 3.2 实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR) |
| 3.2.1 实验主要仪器及试剂 |
| 3.2.2 总RNA提取与纯化 |
| 3.2.3 lncRNA、miRNA、mRNA qRT-PCR引物设计与合成 |
| 3.2.4 RNA逆转录成cDNA |
| 3.2.5 实时定量PCR |
| 3.3 蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB) |
| 3.3.1 实验主要仪器及试剂见下表 |
| 3.3.2 溶液配制 |
| 3.3.3 实验步骤 |
| 3.4 免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC) |
| 3.4.1 实验主要仪器及试剂见下表 |
| 3.4.2 实验步骤 |
| 3.4.3 IHC实验结果分析 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 lncRNA LOXL1-AS1在胆管癌患者组织中的表达水平 |
| 3.5.2 miR-148a-3p在胆管癌患者组织中的表达水平 |
| 3.5.3 TGFB2在胆管癌患者组织中的表达差异 |
| 3.5.4 Western blot检测TGFB2蛋白表达情况 |
| 3.5.5 免疫组化结果 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）核糖体蛋白RPL34在肝门部胆管癌中表达的临床意义和作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 肝门部胆管细胞癌病理特征与核糖体蛋白表达分析及其临床意义 |
| 一、肝门部胆管细胞癌的临床病理学分析 |
| 二、核糖体蛋白家族成员在肝门部胆管癌中的表达谱系 |
| 三、RPL34在肝门部胆管癌中的表达及其临床意义 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 核糖体蛋白RPL34对肝门部胆管癌细胞侵袭生长的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果分析 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 核糖体蛋白RPL34促进肝门部胆管癌细胞侵袭生长的作用机制 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果分析 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 肝门部胆管癌发生发展的分子生物学基础进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（7）NAFLD对肝内胆管癌肝切除预后的影响及SULT2B1b表达与肿瘤侵袭的相关性和机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 非酒精性脂肪性肝病对肝内胆管癌肝切除预后的影响 |
| 一、引言 |
| 二、病人和方法 |
| 三、研究结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 SULT2B1b基因在NAFLD-ICC中的表达及验证 |
| 一、引言 |
| 二、NAFLD-ICC组织转录组测序发现SULT2B1b基因高表达及验证 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 SULT2B1b基因在ICC细胞中的功能研究 |
| 一、引言 |
| 二、SULT2B1b基因表达水平与ICC细胞增殖的相关性 |
| (一)材料方法 |
| (二)结果 |
| 三、SULT2B1b基因与ICC细胞迁移、侵袭能力的关系 |
| (一)材料方法 |
| (二)结果 |
| 四、SULT2B1b基因与ICC细胞凋亡能力关系 |
| (一)材料方法 |
| (二)结果 |
| 五、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 文献综述 肝内胆管癌的靶向治疗进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）APOBEC3A/B启动子单核苷酸多态性对胆道系统癌症发生风险影响及机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 APOBEC3A/B启动子单核苷酸多态性与胆系疾病发生风险的流行病学研究 |
| 第一章 资料与方法 |
| 一、APOBEC3A/B SNP位点的选择 |
| 二、研究对象人群临床资料收集和外周血样本的获取 |
| 三、样本SNP的检测与分型 |
| 四、APOBEC3A/B启动子SNP影响胆系疾病发生风险的统计分析 |
| 第二章 研究结果 |
| 一、APOBEC3A/B SNP位点的选择与确定 |
| 二、研究人群临床基本信息 |
| 三、研究人群血液样本SNP检测与分型结果 |
| 四、APOBEC3A/B启动子SNP对胆系疾病发生风险影响的分析结果 |
| 第二部分 APOBEC3A rs12157810 SNP对胆道癌症发生风险影响的机制探究 |
| 第一章 资料与方法 |
| 一、APOBEC3A启动子SNP致其活性差异的研究 |
| 二、APOBEC3A过表达对细胞生存的影响 |
| 三、APOBEC3A肿瘤内表达水平的探索(TCGA) |
| 第二章 研究结果 |
| 一、APOBEC3A C/A型启动子在胆管上皮细胞、胆管癌细胞、胆囊癌细胞中的活性差异 |
| 二、APOBEC3A在293T细胞中过表达对细胞生存的影响 |
| 三、TCGA数据库探索 |
| 第三部分 APOBEC3B rs2267401 SNP对胆道癌症发生风险影响的机制探究 |
| 第一章 资料与方法 |
| 一、APOBEC3B启动子SNP致其活性差异的研究 |
| 二、APOBEC3B过表达对细胞生存的影响 |
| 三、APOBEC3B G/T型启动子在胆管癌、胆囊癌中活性差异机制的探究. |
| 第二章 研究结果 |
| 一、APOBEC3B G/T型启动子在胆管上皮细胞、胆管癌细胞、胆囊癌细胞中的活性差异 |
| 二、APOBEC3B在293T细胞中过表达对细胞生存的影响 |
| 三、APOBEC3B G/T型启动子在胆管癌、胆囊癌中活性差异的调控机制 |
| 讨论 |
| 研究结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 综述 转录因子AP-2家族在肿瘤内作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参与科研情况说明 |
| 致谢 |
（9）Aurora-B激酶磷酸化CENP-U调控胆管癌细胞增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 AURORA-B、CENP-U在肝内胆管癌的表达和临床病理关系 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 AURORA-B激酶磷酸化CENP-U影响肝内胆管癌细胞的增殖 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表(ABBREVIATION) |
| 附录：本人攻读硕士学位期间发表的学术论文情况 |
| 致谢 |
（10）Sprouty4通过阻断FGFR-ERK通路及阻断细胞周期预示着肝门胆管癌的良好预后（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 Sprouty家族在胆管癌内的表达情况及临床意义 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附表附图 |
| 第二部分 Sprouty4的表达通过阻断FGFR-ERK通路及阻断细胞周期预示着肝门胆管癌的良好预后 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附表附图 |
| 综述 SPRY在恶性肿痛中的研究综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
四、不同分化胆管癌间差异表达基因的研究（论文参考文献）
- [1]环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌进展的机制研究[D]. 陈秦俊杰. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]长链非编两RNA MNX1-AS1在肝内胆管癌中的功能及机制研究[D]. 李风伟. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [3]生物信息学结合定量蛋白组学筛选胆管癌预后标志物的研究[D]. 达子健. 兰州大学, 2021(12)
- [4]GRP78在胆管癌中的表达及与预后关系的研究[D]. 高龙. 兰州大学, 2021(12)
- [5]基于TCGA数据库胆管癌ceRNA网络的构建与分析[D]. 米宁宁. 兰州大学, 2021(12)
- [6]核糖体蛋白RPL34在肝门部胆管癌中表达的临床意义和作用机制研究[D]. 钱建新. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [7]NAFLD对肝内胆管癌肝切除预后的影响及SULT2B1b表达与肿瘤侵袭的相关性和机制[D]. 谢之豪. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [8]APOBEC3A/B启动子单核苷酸多态性对胆道系统癌症发生风险影响及机制的研究[D]. 季鸿翔. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [9]Aurora-B激酶磷酸化CENP-U调控胆管癌细胞增殖的机制研究[D]. 刘小梯. 湖南师范大学, 2020(01)
- [10]Sprouty4通过阻断FGFR-ERK通路及阻断细胞周期预示着肝门胆管癌的良好预后[D]. 邱博. 山东大学, 2020(10)