一、猪流感病毒的分离鉴定（论文文献综述）
解云辉,林树乾,黄中利,殷斌,杨世发,祝钰玮,闫振贵,吴家强,刘月月[1]（2021）在《清营口服液抑制H1N1猪流感病毒复制作用的研究》文中研究指明猪作为甲型流感病毒（H1N1）的"混合器",在"禽-猪-人"的种间传播中扮演着重要角色,H1N1可通过高突变率与基因重排不断产生新型病毒,使得目前疫苗免疫和以流感病毒蛋白作为靶标的药物研发相对滞后。中药因其多靶点、不易产生耐药性等特点被广泛关注。本试验研究了清营口服液对分离到的H1N1猪流感病毒（SIV）在体内外的综合抗病毒效果。通过检测小鼠灌服清营口服液后的精神状况、体重、肺脏病变及病毒载量等发现,清营口服液具有明显抑制H1N1 SIV的效果;利用MDCK细胞同样发现其对H1N1 SIV具有抑制作用,且吸附后期效果最好,抑制率高达96.8%;免疫荧光试验发现清营口服液能够抑制病毒NP蛋白的核输出。通过以上试验,初步明确了清营口服液对H1N1 SIV的抑制效果,可在临床使用中进行推广。
陈艳,王飞飞,杨焕良,乔传玲,陈化兰,张秀英[2]（2021）在《H3N2亚型猪流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定》文中提出为制备H3N2亚型猪流感病毒（SIV）血凝素（HA）蛋白的特异性单克隆抗体（MAb）并对其抗原表位进行鉴定,本研究采用RT-PCR方法扩增H3N2亚型SIV的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGs中,获得重组质粒pCAGGs-HA,以重组质粒pCAGGs-HA免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用血凝抑制（HI）试验和ELISA方法筛选出1株稳定分泌抗SIV HA1蛋白MAb的杂交瘤细胞株（3F8）,经ELISA检测结果显示其诱导小鼠产生的腹水效价为1.106;HI试验检测结果显示其效价为12 log2。利用噬菌体随机7肽库对纯化的抗H3N2亚型SIV HA1蛋白的MAb 3F8进行了4轮筛选,经DNA测序得到3个7肽序列,分别是"HPRRRRV"（E1）、"WPFHHHR"（E2）,"IERGRTS"（E3）,3个7肽序列经比对显示与H3N2 SIV HA1蛋白有部分同源区,为HA蛋白的模拟表位,分别位于HA1蛋白序列的157、158位（E1）、196、199、200位（E2）、276、279、282位（E3）,即位于流感病毒HA蛋白5个抗原位点中的B位点与C位点,且均位于HA1段上,与制备的抗HA1段蛋白的MAb鉴定结果一致。本研究制备了SIV H3N2亚型的HA蛋白MAb,并利用噬菌体短肽库技术获得该SIV HA模拟表位,为进一步设计具有广谱保护性的SIV表位疫苗提供了数据支持。
赵玉仲[3]（2021）在《2018-2020年猪流感病毒分离鉴定和猪流感血清学调查》文中进行了进一步梳理猪流感（Swine influenza,SI）是由猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）引起猪的一种急性、传染性呼吸道疾病,单纯感染SI时死亡率低,继发或混合感染其它病原体时,死亡率显着升高,给养猪业造成巨大的经济损失。SIV在世界的猪群中广泛流行。这些病毒在猪体内同时存在时,可能发生重排,改变其遗传特性和致病性,继而具备引发人类流感大流行的潜力。因此,及时对SIV进行监测,解析其遗传进化规律和流行情况,对SI的防控具有重要意义。本研究从山东省、河南省和湖北省养猪场以及生猪屠宰场采集鼻拭子样品5808份,肺脏、支气管等病料198份,总计6006份,通过SPF鸡胚尿囊腔接种进行病毒分离,总共分离出21株SIV,分离率0.35%,经过PCR鉴定,均为H1N1亚型SIV。对分离的21株病毒进行遗传进化分析,结果发现分离毒株分为两种基因型:19株病毒的PB2、PB1、PA、NP和M基因来自于2009甲型H1N1流感病毒（2009 pandemic H1N1 influenza virus,pdm/09 H1N1）谱系,HA和NA基因来自于欧亚类禽（Eurasian avian-likes H1N1,EA H1N1）SIV谱系,NS基因来自于经典H1N1（Classical swine H1N1,CS H1N1）SIV谱系。剩余两株病毒的八个基因全部来自于CS H1N1谱系。为了进一步了解SI的流行情况,本研究还对山东省、河南省、吉林省、辽宁省和山西省等不同省份的养猪场采集猪血清样本17865份,通过HI试验,使用EA H1N1、pdm/09 H1N1和H3N2 SIV抗原对血清样品进行检测,总血清阳性率为52.14%,其中EA H1N1、pdm/09 H1N1、H3N2、EA H1N1+pdm/09 H1N1、EA H1N1+H3N2、pdm/09H1N1+H3N2和EA H1N1+pdm/09 H1N1+H3N2 SIV检测到的总血清阳性率分别为28.89%、9.05%、0.07%、14.01%、0.07%、0.02%和0.04%。从以上数据可以看出,猪群中的血清阳性普遍存在,在单一亚型SIV感染中,EA H1N1的血清阳性率最高,在两种或三种亚型SIV混合感染中,EA H1N1+pdm/09 H1N1的血清阳性率最高。本研究对分离SIV进行遗传进化及关键氨基酸位点分析,同时对猪群中血清进行了检测,研究结果大大丰富了我国SI分子流行病学的内容,加深我们对SI流行现状的了解,从而为SI的防控提供理论依据。
解云辉[4]（2021）在《清营口服液抑制H1N1猪流感病毒复制作用的研究》文中指出猪流感（Swine Influenza,SI）是由猪流感病毒（Swine Influenza Virus,SIV）引起的一种免疫抑制性疾病,临床上可以导致发热、急性呼吸道症状,发病率极高,并且容易继发猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎等疾病,给养猪业带来了严重的经济损失。猪流感病毒作为病毒基因重组和新抗原亚型毒株产生的“混合器”,在整个流感病毒的生态分布和遗传进化中起着非常重要的作用。因此,为了全球畜牧业的稳定和发展、人类公共卫生的安全,加强对猪流感病毒的防控力度和监测手段有着非常重要的意义。当今用于防控猪流感的主要途径是对动物进行免疫接种和抗流感药物的使用,但由于流感病毒的特殊结构,其可通过高突变率与基因重排不断产生新的病毒亚型,使得目前疫苗免疫相对滞后。药物研发方面,主要包括M2离子通道阻滞剂和神经氨酸酶抑制剂,然而由于氨基酸的突变,耐药性越来越强。因此,迫切需要开发新的抗流感药物。本课题组对山东省的猪流感病毒进行监测时发现2020年的发病率和病死率均较往年有所升高,本人对泰安市某养猪场病死猪进行病毒的分离鉴定,明确其为H1N1 SIV感染,对该病毒进行分离纯化,并使用项目组自主研发的国家三类新兽药“清营口服液”对其进行体内外的综合抗病毒作用检测。清营口服液由清营汤改造,清营汤为清热剂,组方来自于我国中药古籍《温病条辨》,由犀牛角（水牛角代替）、生地黄、银花、连翘、玄参、丹参、麦冬、黄连、竹叶心组成,能够清热解毒,透热养阴,主治热入营分证,清营汤目前已被切实地用于临床治疗,在治疗乙型脑炎、流行性脑脊髓膜炎、败血症、肠伤寒或其他热性病证方面都有很好的效果,但在流感病毒的药效方面尚未有报道。因此,本课题采用上述分离到的猪流感病毒,利用小鼠（C57BL/6）和MDCK细胞作为模型,对清营口服液抑制猪流感病毒复制的效果进行了研究。主要包括以下方面:（1）体内实验:通过进行清营口服液最大剂量14天的小鼠灌胃药物实验,采血检测血常规和生化指标,判定该药物没有毒性;通过灌服清营口服液几天后,感染病毒,于感染后0、2、4、6天小鼠精神状况观察、体重测量、剖检后小鼠肺脏指数及HE染色等方法确定了清营口服液在小鼠体内对H1N1 SIV有明显的抑制效果。（2）体外实验:Reed Muench法计算了H1N1 SIV在MDCK细胞上的TCID50为10-3.66/100μL;利用q RT-PCR检测到清营口服液对H1N1 SIV有明显抑制作用,且吸附前期抑制效果最好,利用免疫荧光试验发现清营口服液能够有效抑制H1N1 SIV的NP蛋白核输出。同时检测了清营口服液对其他流感毒株（H9N2）的效果,同样发现该药物对H9N2具有很好的抑制作用。通过以上试验,初步明确了清营口服液对H1N1 SIV的抑制效果,可在临床使用中进行推广。
宋祖晨[5]（2021）在《2013-2018年中国H3N2亚型猪流感病毒疫苗株的筛选及免疫原性研究》文中研究指明猪流感病毒（SIV）为正黏病毒科的A型流感病毒属成员,能够引起猪的急性、热性呼吸道疾病,传染性强。猪流感病毒虽然致死率低,但在流感病毒的遗传进化和生态分布中占据着重要地位。一方面,猪作为人流感病毒和禽流感病毒的共同易感宿主,不同来源的流感病毒可以在猪体内发生重排;另一方面,猪流感病毒还可以与人或禽细胞的表面受体结合,造成对人或禽的感染,在流感病毒的适应性进化中起着重要作用。因此,研制疫苗对猪流感进行防控不仅是养殖业的需要,还有着深远的公共卫生学意义。本实验室于2013～2018年在中国地区猪群中分离到9株H3N2猪流感病毒,对其表面基因进行遗传演化分析发现,9株分离病毒HA、NA之间的同源性较高,在进化关系上均属于近代人源谱系猪流感病毒。对9株病毒进行抗原性差异分析,所有病毒都可以发生交叉HI反应,但不同H3亚型病毒之间的抗原性具有一定的差异,其中A/swine/Guangxi/1659/2017（H3N2）具有较为广谱的抗原性。根据遗传进化分析和抗原性分析结果,本研究采用反向遗传技术,选取A/swine/Guangxi/1659/2017（H3N2）的表面基因作为H3N2亚型猪流感疫苗株表面基因的供体,以PR8病毒的内部基因为骨架,成功拯救出H3亚型重组流感病毒GX1659/PR8。对GX1659/PR8的表面基因测序,结果显示其基因序列和亲本病毒GX1659完全一致。用100 EID50剂量的GX1659和GX1659/PR8感染鸡胚,在不同时间测定鸡胚尿囊液的血凝效价和EID50,并绘制其生长曲线。结果显示,GX1659和GX1659/PR8分别在接种后60 h和48 h血凝效价达到峰值,GX1659/PR8效价滴度明显高于亲本病毒GX1659。可见与亲本病毒相比,重组病毒GX1659/PR8在鸡胚上的复制能力有较大的提升。基于GX1659/PR8毒株的以上特性,本研究进一步将GX1659/PR8作为种子毒株制备灭活疫苗,在小鼠和猪上评价其免疫原性和保护效力。结果显示,GX1659/PR8疫苗株能诱导小鼠和猪体内产生针对同源病毒的高滴度的HI抗体、NT抗体以及特异性IgG抗体。对小鼠二免后攻毒,通过鸡胚滴定法滴定小鼠脏器中病毒含量,结果表明该疫苗能显着的抑制同源病毒在动物机体内的复制;但是对于异源病毒,疫苗的保护效果并不理想,不能很好的抵御异源病毒的感染。本研究还进行了猪的主动免疫及免疫持续期实验,血凝抑制结果显示,该疫苗能对猪提供大于180天的持久保护。
张金燕[6]（2021）在《2019-2020年度扬州地区猪流感病毒分离鉴定及其单克隆抗体的研制》文中指出猪流感（Swineinfluenza,SI）主要在猪群中呈现地方性流行,猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）是重要病原,主要包括H1N1,H1N2和H3N2亚型。该病毒也易于在猪体内与其他亚型流感病毒重组,导致对人类的易感风险增强。中国拥有最复杂的SIV生态系统,包括经典谱系（Classic swine influenza,CS）、北美三元重组谱系（Northern american triple reassortant,TR）和欧亚类禽谱系（Eurasian avian-like,EA）,造成SIV流行和演化越来越复杂。因此,开展持续的SIV流行病学监测和演化分析、评估病毒毒力变化规律、积累诊断储备工具,对于预警和防控SI具有重要意义。本研究首先在2019-2020年度对扬州地区屠宰场猪只开展鼻拭子样品采集,并对SIV分离鉴定、全基因组测序和演化分析;其次,评估了 H1亚型SIV对小鼠的致病性;最后,研制了针对H1N1亚型SIV的单克隆抗体用于诊断技术储备。具体研究内容如下。1.2019-2020年度扬州地区猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析2019-2020年度在江苏省扬州地区某个屠宰场对屠宰猪只持续采样,共采集鼻拭子样品802份。通过SPF鸡胚接种法分离病毒,以血凝试验结合RT-PCR方法进行病毒亚型鉴定,最终共成功分离到2株H1亚型SIV,分离率为0.25%。其中1株为H1N1亚型,命名为 A/Swine/Jiangsu/1070/2019（JS1070）;另1株为 H1N2 亚型,命名为A/Swine/Jiangsu/1281/2019（JS1281）。HA基因遗传进化分析表明,两株SIV均属于EA谱系,HA基因的碱性裂解位点模式均为339PSIQSR↓ G347,符合低致病性的分子特征。NA基因分属不同谱系,JS1070属于EA谱系,JS1281属于TR谱系。2株病毒的内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因均属于CS谱系。2.猪流感分离株的生物学特性及小鼠致病性研究通过有限稀释法将病毒分离株进行纯化,随后对病毒株的生物学特性及对小鼠的致病性开展研究。JS1070病毒和JS1281病毒在鸡胚上的半数感染量（EID50）分别为7.7 lg/0.1 mL和 8.5 lg/0.1 mL,在 MDCK细胞上的半数感染量（TCID50）分别为 5.22 lg/0.1 mL和6.24 1g/0.1 mL,病毒最小致死剂量致死鸡胚所需的平均时间（MDT）分别为81 h和69 h。将JS1070和JS1281毒株以106 EID50滴鼻感染6周龄BALB/c小鼠,结果显示,JS1070病毒感染导致小鼠体重下降,最严重时接近10%,小鼠的存活率为66.7%;而JS1281体重下降高达22.3%,小鼠存活率为50%。病理组织切片结果显示,两株SIV均能引起肺部组织发生严重的病变;脏器病毒载量测定结果显示,两株病毒在心脏中的病毒载量仅在第3 d可检测到,但在肺脏中的病毒载量在感染后第9 d仍能检测到,而且JS1281在心脏和肺脏中的病毒载量均高于JS1070;感染组肺脏中的细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的表达水平与对照组相比均显着上调,其中JS1281诱导的细胞因子上调水平高于JS1070。上述结果表明,2株H1亚型SIV分离株均能导致小鼠致病,且JS1281株对小鼠的毒力强于JS1070株。3.H1N1亚型SIV单克隆抗体的研制选择H1N1亚型SIV JS1070分离株进行HA单克隆抗体的研制。病毒经蔗糖浓度梯度离心法纯化并用甲醛灭活后制备油乳灭活疫苗,经腹部皮下免疫6周龄BALB/c小鼠,三免后腹腔注射进行加强免疫,72 h后取其脾细胞制备杂交瘤细胞。通过血凝抑制（HI）法筛选阳性克隆,最终得到7株能稳定分泌抗体的单克隆抗体杂交瘤细胞,分别命名为1B7、3C10、3D6、3D7、4F11、5B6和5C11。HI结果显示,7株单抗均对H1N1亚型SIV JS1070株具有血凝抑制性（7～8 log2）。抗体亚类鉴定结果显示,1B7的亚类为IgG3、3D6和5C11的亚类为IgM,3D7的亚类为IgG2a,3C10、4F11和5B6的亚类为IgG1。HI和间接免疫荧光试验（IFA）结果显示,除了 3D6和5C11以外,其他5株单抗均与母本株JS1070具有反应性,与H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10的流感病毒无交叉反应,表明单抗特异性好;其中3C10单抗对猪源H1N2亚型毒株JS1281、禽源H1N1亚型毒株JY、人源H1N1亚型毒株PR8及CA09具有更好的交叉反应性,表明该单抗广谱性好;3C10单抗同时也具有更好的中和抗体特性和免疫印迹特性。综上所述,3C10单抗综合特性更好,可应用于后续H1亚型流感病毒的免疫学诊断方法的开发。
陈凯彪[7]（2021）在《H1和H3亚型猪流感病毒的双重荧光定量RT-PCR方法与遗传进化和生物学特性研究》文中进行了进一步梳理猪因其呼吸道上皮同时具有人（α-2,6）和禽（α-2,3）流感病毒受体,被认为是人和禽流感病毒间发生基因重配的重要场所。有研究表明,我国近10年来猪群中广泛流行的猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）为欧亚类禽H1N1（Eurasian avian-like H1N1,EAH1N1）、2009 大流行 H1N1（Pandemic 2009 H1N1,Pdm09H1N1）以及类人 H3N2（Human-like H3N2,HLH3N2）。并且,这三种不同进化谱系的SIV持续不断地在猪群中发生着基因片段的重组,产生了众多基因型。值得注意的是,刘金华等学者报道的基因4型（Genotype4,G4）EAH1N1不仅在猪群中获得了优势流行,还具有较强的跨宿主传播潜能,对养猪业和公共卫生安全均构成了严重威胁。本研究基于目前我国猪群中主要存在H1和H3亚型SIV的现状,建立了同时检测并区分两种亚型SIV的一步法双重荧光定量RT-PCR（Real-time reverse-transcriptive PCR,RT-qPCR）方法,并将其应用于 SIV 的流行病学调查与分离鉴定,且进一步对临床分离株的遗传进化与生物学特性进行了分析。研究结果将为SIV的快速检测提供技术支撑,并为深入了解SIV的流行动态及致病特性提供理论参考。1.H1和H3亚型猪流感病毒一步法双重RT-qPCR方法的建立与应用本章通过比对近10年在我国流行的SIV HA基因序列,设计了一对能够同时匹配EA H1N1和Pdm09 H1N1的引物探针组以及一对匹配HL H3N2的引物探针组,并在此基础上建立了一种基于TaqMan-MGB探针的一步法RT-qPCR方法。该方法具有良好的灵敏性,最低能够检测到5copie/μL的质粒标准品以及2.1 EID50/mL的病毒RNA。此外,通过同时使用RT-qPCR和鸡胚接种对人工感染SIV的小鼠肺脏进行检测,RT-qPCR方法与传统的病毒分离法具有97.9%（47/48）的符合率。并且,该双重RT-qPCR在进行批间和批内重复性试验时,变异系数（Coefficientofvariation,CV）均小于3%,提示其具有良好的重复性。进一步地,应用该RT-qPCR方法对2019-2020年秋冬季屠宰场来源的猪鼻拭样品进行检测,结果显示H1亚型SIV的阳性数总体要高于H3亚型,此结果与其他研究人员所报道的情况一致,表明该RT-qPCR方法在H1和H3亚型SIV的快速检测方面具有较好的应用前景。2.猪流感病毒的分离鉴定与遗传进化分析结合第一章中建立的RT-qPCR检测方法,从屠宰场所采集的598份鼻拭中成功分离出具有血凝活性的9株EAH1N1和4株HLH3N2病毒,并另从170份由猪场送检样品中分离获得1株EA H1N1病毒。接下来,基于这14株病毒的HA基因的测序结果,选取出其中的3株EAH1N1和2株HLH3N2亚型SIV进行全基因组测序与遗传进化分析。结果显示,这5株SIV均具有Pdm09 H1N1的PB2、PB1、PA、NP 和 M 基因以及三源重组（Triple reassortant,TR）SIV 的 NS基因,即它们的内部基因组成来源均与当前中国猪群中优势流行的G4 EAH1N1相 同。此 外,值 得注 意 的 是,EA H1N1 分 离 株A/swine/Huadong/11/2020（H 1N1）[HD 11]与 人 流 感 病 毒 株A/Shandong/00204/2021（H1N1）高度同源,两者的核苷酸一致性高达99.35%～99.89%,提示这两株H1N1可能具有共同祖先或两者间存在跨宿主传播。3.5株猪流感病毒的生物学特性研究进一步对第二章中已全基因测序的5株SIV进行了抗原差异性分析与受体结合能力、体外复制能力和对小鼠致病能力的测定。结果显示,3株G4 EAH1N1分离株之间及其与基因1型（Genotype 1,G1）、基因5型（Genotype 5,G5）之间和2株HL H3N2分离株之间及其与人源H3N2病毒间均不存在明显的抗原性变化,但部分EA H1N1毒株与Pdm09 H1N1存在一定的抗原性差异;5株SIV均呈现α-2,3和α-2,6双受体结合特性,其中HD11（H1N1）分离株明显偏嗜α-2,6受体;5株SIV在MDCK细胞上均复制良好,其中HD11（H1N1）在各取样时间点均具有相对最高的病毒滴度;106.0EID50攻毒剂量下的小鼠实验中,HD11（H1N1）与A/swine/Shandong/SG03（H1N1）这2个分离株表现出明显的致病性,分别导致100%和80%的小鼠死亡率,并在5株受试SIV中具有相对最高的组织病毒载量以及细胞炎性因子水平。进而提示,G4 EAH1N1跨宿主传播的潜能对公共卫生产生的威胁不容忽视,亟需加强监测。
张醒海[8]（2021）在《候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究》文中进行了进一步梳理流感病毒是目前最受关注的人畜共患病原体之一,广泛分布在自然环境、家禽及候鸟等自然宿主中,可感染包括人类在内的多种哺乳动物,对国家生物安全、产业经济有着重要影响。该病毒对人类健康的危害主要表现为引起季节性流感、流感大流行和人感染动物流感等。候鸟是H3N8、H9N2和H5N8等众多亚型禽流感病毒的储存库,且这些病毒持续在我国候鸟中流行传播。近年来它们又出现新的生物表型或基因特性,如水禽不仅呈现无症状携带流感病毒,也出现了感染甚至致死的现象;部分候鸟来源的病毒,可发生水禽-陆禽的传播;出现禽源H9N2、H5N8感染人的现象。这些亚型病毒在中国候鸟中的流行、进化及引发公共卫生风险等问题亟待解决。本研究以监测中国东部候鸟禽流感病毒流行动态为切入点,研究内容包括发现候鸟禽流感病毒的亚洲-北美地区跨洲际传播的证据,揭示候鸟禽流感病毒在自然宿主中的遗传变异规律,提供禽流感病毒家禽-野禽间跨物种感染的证据,评估候鸟源禽流感病毒在哺乳动物间的传播能力以及识别决定禽流感病毒跨物种感染人的分子特征。第一部分:中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查。在全球候鸟迁徙背景下,选取途经我国东部的东亚-澳大利亚候鸟迁徙路线上重要候鸟停歇与聚集地（湖南东洞庭湖、环渤海湾湿地、内蒙古图牧吉、上海崇明东滩）开展了2016-2019年为期四年的主动预警监测,分离跨洲际传播或新型重配候鸟源禽流感病毒株,并测定其全基因序列。监测过程中本研究共采集了来自96种不同鸟类的35604份样本,分离得到88株病毒,候鸟禽流感病毒携带率约为0.247%。亚型多样性分析表明分离毒株涵盖12种HA和9种NA组成的23种不同亚型。其中低致病性禽流感病毒H3、H6、H9亚型为优势流行毒株。病原学及血清学数据证明H9N2禽流感病毒在候鸟内广泛流行,H9N2禽流感病毒可以感染包括纵纹腹小鸮、红隼、苍鹰和雉鸡多种野生鸟类,在小型多宿主生态系统中H9N2可以发生有效的种间传播。自2020年10月底以来,H5N8病毒中国中东部候鸟中引发疫情。本研究证实了H5N8对大天鹅、尤鼻天鹅等候鸟的感染,确定2020 HPAIV H5N8为2.3.4.4b谱系。抗原性分析发现,由于抗原漂移,当前家禽H5疫苗株对2020年HPAIV H5N8病毒保护力下降,病毒传入家禽并大面积流行的风险极大,需要及时更新家禽候选疫苗株,并进一步加强监测和实施预防措施。第二部分:候鸟禽流感病毒遗传进化分析。本研究进而对禽流感病毒各基因片段在天然宿主中的进化速率及基因片段溯源分析:基于不同时间点分离的病毒之间遗传差异和时间分布,采用贝叶斯MCMC方法,估算各个基因片段进化变异的总体速率并推断其最近共同祖先（t MRCA）的年代。重点关注亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系:利用病原基因组序列信息构建系统发育树,结合候鸟迁徙数据,分析病毒基因片段转移的方向性,通过各基因片段的地理溯源来确定亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系,确定可能的病毒引入途径,解析候鸟在大陆之间和大陆内部的禽流感病毒流通过程中发挥的作用。系统发育分析揭示部分亚型AIVs基因片段存在洲际间的沟通与传播。遗传变异分析发现中国东部候鸟AIVs基因片段遗传多样性丰富、不同亚型及不同鸟种间出现基因节段流通与传播。H3N8亚型禽流感病毒在候鸟中广泛流行,且基因型十分丰富,分离到的8株H3N8禽流感病毒可以分为7个基因型。H13、H3N8亚型内部基因节段存在洲际间的沟通与传播。系统发生及基因型分析研究发现H9N2禽流感病毒存在由家禽向野禽溢出的现象。对2020 HPAIV H5N8进行各基因节段溯源,结合系统发生地理学及候鸟迁徙路线证明了2020年中国候鸟中流行的H5N8禽流感病毒为新型重配毒株,随候鸟迁徙由哈萨克斯坦及俄罗斯引入我国,明确了新型重排H5N8流感病毒各基因片段的进化地位和起源,揭示了H5N8禽流感病毒株在欧亚大陆内的洲内传播及非洲-欧亚大陆的洲际间传播的现象。第三部分:候鸟禽流感病毒公共卫生风险评估。在遗传变异分析的基础上,我们开展候鸟禽流感病毒新型重配病毒受体结合特性及其在非天然宿主中的致病与传播能力评估。针对首次出现感染人的2020 HPAIV H5N8高致病性禽流感病毒,采用哺乳动物模型评估其在不同宿主上的致病性及传播能力,评估其公共卫生风险;针对由家禽溢出到野鸟的H9N2亚型禽流感病毒,我们结合病毒基因组变异分析,受体结合偏好性与哺乳动物致病性及传播能力分析,系统评估其公共卫生风险;针对在候鸟中广泛流行的多个基因型的H3N8亚型禽流感病毒,我们评估其受体结合能力,利用小鼠、豚鼠、雪貂等动物模型检测其在哺乳动物致病性及传播能力,分析研判H3N8亚型人群间传播的潜在风险。生物学特性评估发现H5N8禽流感病毒在人际间传播的风险仍然很低,此判断基于H5N8禽流感病毒偏好与禽类受体结合,而且在豚鼠中不具备传播能力的研究数据。尽管近来首次出现2020 HPAIV H5N8禽流感病毒感染人的状况,本研究证实H5N8禽流感病毒尚不具备在人际间流行的潜力,提示其产生的公共卫生威胁有限。由家禽溢出到候鸟的H9N2毒株结合人样受体后,可以在豚鼠及雪貂模型间通过直接接触及呼吸道飞沫途径进行高效传播,这些结果强调了H9N2亚型禽流感病毒存在能够引发人际间流行的潜在的公共卫生风险。受体结合检测证实H3N8毒株普遍具有结合人样受体的能力,在豚鼠模型中具备高效的接触传播及呼吸道飞沫传播能力。候鸟H3N8亚型禽流感病毒具有感染人类并在人群中传播的潜在风险。第四部分:候鸟源H3N8禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究。在候鸟源H3N8禽流感病毒的哺乳间传播评估过程中,本研究发现T222毒株不能在雪貂模型中通过呼吸道飞沫传播,而T222豚鼠适应1代毒株可以经呼吸道飞沫传播。因此,我们选择传播能力差异明显但遗传背景相似的以上两株H3N8亚型禽流感病毒毒株,结合反向遗传学技术,构建了PB1-S524G突变质粒并拯救r T222-S524G突变体。采用体外聚合酶活性检测,我们证实PB1-S524G突变增强了病毒聚合酶活性。进一步利用小鼠、豚鼠和雪貂等动物模型,发掘决定H3N8亚型哺乳动物间传播的关键分子标记。本研究证实PB1-S524G突变可以赋予H3N8在雪貂间经呼吸道飞沫传播的能力。PB1-S524G突变增强了病毒体内外复制能力,提高病毒在小鼠及雪貂上呼吸道的病毒复制滴度,加剧了由病毒导致的雪貂肺脏的病理损伤。研究结果表明PB1-S524G是影响候鸟H3N8禽流感病毒在哺乳动物宿主上致病及传播能力的关键分子标记。以上研究结果提示我们应持续加强对候鸟禽流感病毒的监测及对公共卫生安全的威胁进行评估,进一步加强候鸟禽流感病毒跨物种传播的分子机制的研究,为禽流感防控提供理论依据。
包旦奇[9]（2021）在《糖基化与泛素化修饰对流感病毒NA蛋白与病毒生物学特性的影响与分子机制研究》文中提出糖基化修饰和泛素化修饰是宿主两种重要的蛋白翻译后修饰方式,其对蛋白的功能、折叠、胞内定位与运输、蛋白降解等都发挥重要的作用。病毒作为一种严格寄生于宿主细胞的生物,其蛋白的翻译过程也会发生糖基化与泛素化修饰,糖基化与泛素化修饰是如何影响流感病毒蛋白功能与病毒生物学特性的以及相关的分子机制尚不完全清楚。本研究围绕流感病毒NA蛋白的糖基化修饰与泛素化修饰的生物意义、以及病毒感染宿主细胞对宿主蛋白的泛素化修饰水平的影响等方面开展研究,以揭示蛋白糖基化修饰和泛素化修饰对流感病毒生物学特性的影响与分子机制。N型糖基化修饰（NLG）在真核细胞中广泛发生,流感病毒的表面蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）都是高度糖基化修饰的蛋白质。研究表明,HA蛋白的N型糖基化可影响流感病毒的抗原性、免疫逃逸、宿主适应性和致病力等诸多方面。NA蛋白虽然在流感病毒的生命周期中发挥多种功能,特别是在病毒复制的后期,然而N型糖基化对NA蛋白的功能以及流感病毒生物学特性的影响尚不清楚。在本研究中,我们发现A/WSN/1933 H1N1病毒的NA蛋白存在3个糖基化修饰位点（44、72、219）。衣霉素处理抑制N型糖基化修饰的发生或将这三个N型糖基化位点缺失后会显着抑制NA蛋白的出芽能力,这说明N型糖基化修饰对于NA蛋白的出芽能力至关重要。对三个N型糖基化修饰位点分别缺失后,并成功拯救突变病毒。进一步研究结果显示219位点的糖基化修饰缺失后,突变病毒的出芽能力、在细胞上的复制水平都显着下降。致病性试验结果也显示,219位点的糖基化修饰缺失病毒对小鼠的致病性显着降低,不能致死小鼠,说明219位点的糖基化修饰对NA蛋白的出芽能力、体外复制能力、以及小鼠的致病性都发挥重要作用。为了进一步探索其潜在分子机制,我们检测了N型糖基化缺失的NA蛋白过表达后细胞中未折叠蛋白反应激活情况（UPR）,结果显示N型糖基化缺失的NA蛋白堆积于内质网（ER）中,导致UPR相关蛋白BIP、p-e IF2α上调,而XBP1下调,这说明N型糖基化缺失的NA蛋白堆积在ER中并引发UPR,导致NA蛋白不能在胞内正常运输与出芽,从而影响了病毒的复制能力与致病性。除糖基化修饰外,流感病毒蛋白也存在泛素化修饰,而且其对病毒蛋白功能与流感病毒复制发挥重要作用。已有的流感病毒蛋白泛素化修饰的研究多集中于病毒的内部蛋白,包括聚合酶蛋白、NP蛋白、M1蛋白以及NS1蛋白,然而至今并无表面蛋白NA上存在泛素化修饰的相关报道。在本研究中,我们首次发现流感病毒的NA蛋白也存在泛素化修饰。进一步研究结果显示NA蛋白发生的泛素化修饰的种类以K63泛素化修饰为主。为了进一步确定泛素化修饰的位点,通过构建截短以及点突变的NA蛋白,利用免疫共沉淀手段验证了NA蛋白的6位赖氨酸为其泛素化修饰位点之一,并验证K6位点的泛素化修饰类型为K63泛素化修饰。对此泛素化修饰位点进行K6R突变缺失后,成功拯救突变病毒。体外实验结果显示K6R突变缺失泛素化修饰后,突变病毒的复制水平比野生病毒下降1000倍,而且小鼠实验结果也显示NA-K6R突变病毒的致病性显着降低,且不能致死小鼠,说明此位点的泛素化修饰对病毒的复制与致病性至关重要。为了进一步找到泛素化修饰NA蛋白的宿主E3酶,利用pull-down的方法鉴定了一个与NA蛋白互作的宿主E3酶:HUWE1,利用si RNA干扰的方法验证了HUWE1为泛素化修饰NA蛋白的E3泛素连接酶。综上所述,流感病毒NA蛋白K6位点存在K63型泛素化修饰,其在流感病毒的复制过程中发挥重要作用。泛素化修饰不仅直接发生于病毒蛋白以调节其功能,也会对病毒复制关键的宿主因子进行泛素化修饰调控,影响宿主免疫应答、蛋白质量控制以及抗病毒信号通路,进而在流感病毒复制周期多个环节产生重要影响。为了进一步研究流感病毒感染与宿主蛋白泛素化修饰之间的相互作用,通过泛素化蛋白质组学的手段分别研究了流感病毒感染U937和A549细胞后宿主蛋白泛素化水平的变化情况。在病毒感染后,U937细胞中共18个蛋白的泛素化修饰水平显着上调,42个蛋白的泛素化修饰水平显着下调,52个无泛素化修饰蛋白出现泛素化修饰,57个蛋白存在泛素化修饰完全消失。流感病毒感染A549细胞后43个蛋白泛素化修饰水平显着上调,19个蛋白泛素化修饰水平显着下调,121个无泛素化修饰蛋白出现泛素化修饰,39个蛋白泛素化修饰完全消失,所有发生变化的宿主蛋白都与细胞多个重要的细胞通路有关,如Influenza A、JAK-STAT signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway等。根据此结果,我们挑选三个泛素化水平显着变化的蛋白进行验证。结果表明,流感病毒感染后会引起RFC2和AMPKG1的泛素化水平显着上调,而下调RO60蛋白的泛素化修饰水平,与泛素化组学结果一致。RO60是一种Y RNA结合蛋白,目前没有RO60蛋白与流感病毒相关的研究报道,因此我们研究了RO60蛋白泛素化修饰与流感病毒之间的关系。结果发现过表达RO60蛋白能够在感染早期抑制流感病毒的复制,但这种抑制随着病毒感染时间的增加而逐渐消失。之后我们发现RO60蛋白的抗流感病毒功能受其自身泛素化修饰水平调控,利用泛素化质谱分析显示RO60的泛素化位点位于342K,对其点突变后,突变的RO60不再抑制流感病毒的复制,这说明只有泛素化修饰的RO60才能有效抑制流感病毒的复制,而病毒感染过程中病毒特异下调了RO60泛素化水平从而减弱其抑制流感病毒的能力,有利病毒复制。在本研究中,我们深入研究了流感病毒NA蛋白糖基化修饰与泛素化修饰对蛋白功能与病毒生物学特性的影响与分子机制,以及流感病毒感染后宿主蛋白泛素化水平变化,进一步了解了流感病毒复制过程中的关键环节以及与宿主的相互作用,为抗流感病毒药物与疫苗研究提供新的思路与理论基础。
吴颖[10]（2021）在《H3亚型犬流感病毒的分离鉴定及其荧光定量RT-PCR方法的建立》文中研究说明犬流感是由犬流感病毒（Canine Influenza Virus,CIV）引起的一种犬的接触性呼吸道传染病,患犬主要表现为发热、咳嗽、流涕等呼吸道症状。目前,犬群中主要流行H3N2和H3N8亚型CIV。犬作为伴侣动物与人类接触密切,流感病毒很有可能通过犬传染给人。因此,加强对犬流感的监测并建立一种快速诊断犬流感的检测方法具有重要的公共卫生学意义。本研究首先对2018-2020年自黑龙江省、江苏省、浙江省、河北省、云南省和宁夏回族自治区的部分地区采集的3758份犬鼻拭子进行鸡胚接种,成功分离到4株H3N2亚型CIV,对分离的病毒进行系统的遗传演化分析、受体结合特性分析和抗原性分析。病毒遗传演化分析结果表明,各分离毒株与早期韩国和中国H3N2亚型CIV位于同一分支,并与2016年后国内H3N2亚型CIV形成独立分支。4株病毒各基因片段核苷酸同源性均在98%以上,且各毒株NA基因头部均出现2个氨基酸缺失。抗原性分析结果显示,本研究各病毒阳性血清之间具有良好的交叉反应,且与3株H3N2亚型禽流感病毒的阳性血清均出现交叉血凝现象,但是与H3N2亚型猪流感病毒和WHO推荐的H3N2亚型人流感疫苗株的阳性血清均不反应。受体结合特性分析结果显示,4株H3N2亚型CIV可以同时结合α-2,6唾液酸受体和α-2,3唾液酸受体,但仍以结合α-2,3唾液酸受体为主。鉴于部分犬感染CIV后症状不明显或排毒量较少,从而对CIV的临床诊断造成困难。本研究根据国内外各亚型CIV的M基因和H3亚型CIV的HA基因核苷酸序列,设计并合成特异性引物和探针。通过优化反应体系和条件,分别建立了通用型和H3亚型CIV荧光定量PCR检测方法。建立的两种方法特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便。不仅可以对病毒进行定性分析,还能通过建立标准曲线对病毒进行定量分析。敏感性结果显示,两种方法对质粒标准品的检测限度分别为150copies/μL和19copies/μL;重复性试验结果显示,两种方法的变异系数均小于2%。本研究建立的两种方法与病毒分离结果相比,符合率均在95%以上。综上所述,本研究对分离到的4株H3N2亚型CIV进行了系统的遗传演化分析,并建立了快速检测通用型和H3亚型CIV的荧光定量PCR方法,对有效控制CIV在犬群中的流行,预防人类流感的大流行具有重要意义。
二、猪流感病毒的分离鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、猪流感病毒的分离鉴定（论文提纲范文）
（1）清营口服液抑制H1N1猪流感病毒复制作用的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 药物 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 细胞与毒株 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 病毒分离鉴定及纯化 |
| 1.2.2 体内抗病毒试验 |
| (1)中药制剂反复给药急性毒性试验: |
| (2)流感病毒半数感染量(ID50)测定: |
| (3)小鼠感染模型建立及给药: |
| (4)肺指数测定: |
| (5)肺组织切片观察: |
| (6)肺组织病毒载量测定: |
| 1.2.3 体外抗病毒试验 |
| (1)病毒毒力检测: |
| (2)供试品细胞毒性检测: |
| (3)清营口服液对H1N1 SIV的抑制作用: |
| (4)细胞病毒载量测定: |
| (5)免疫荧光试验: |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 猪流感病毒的分离与鉴定 |
| 2.2 体内抗病毒试验结果 |
| 2.2.1 清营口服液对小鼠的毒性作用 |
| 2.2.2 半数感染量(ID50) |
| 2.2.3 小鼠感染给药后体重比 |
| 2.2.4 小鼠感染给药后肺指数 |
| 2.2.5 各组病毒载量的变化 |
| 2.2.6 小鼠肺组织病理检查 |
| 2.3 体外抗病毒试验结果 |
| 2.3.1 H1N1 SIV对MDCK细胞的TCID50测定 |
| 2.3.2 细胞给药最大安全浓度测定 |
| 2.3.3 药物对H1N1 SIV的抑制作用 |
| 2.3.4 药物对H1N1猪流感病毒核蛋白的抑制作用 |
| 3 讨论与结论 |
（2）H3N2亚型猪流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、菌种、质粒及实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 病毒RNA的提取及重组质粒构建 |
| 1.5 HA基因体外表达及检测 |
| 1.6 MAb的制备及其特性分析 |
| 1.7 噬菌体展示随机肽库鉴定抗原表位 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒pCAGGs-HA的构建与鉴定 |
| 2.2 HA蛋白在293T细胞中表达的IFA和western blot检测 |
| 2.3 杂交瘤细胞的制备筛选及特性鉴定 |
| 2.4 HA抗原表位鉴定结果 |
| 3 讨论 |
（3）2018-2020年猪流感病毒分离鉴定和猪流感血清学调查（论文提纲范文）
| 符号及缩略词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 SI的流行概况 |
| 1.1.1 经典H1N1 SIV |
| 1.1.2 类禽H1N1 SIV |
| 1.1.3 类人SIV |
| 1.1.4 2009 甲型H1N1 流感病毒 |
| 1.2 SI的公共卫生学 |
| 1.2.1 SIV对人的感染 |
| 1.3 流感病毒蛋白的结构与功能 |
| 1.3.1 血凝素(hemagglutinin,HA) |
| 1.3.2 神经氨酸酶(Neuraminidase,NA) |
| 1.3.3 聚合酶蛋白(Polymerase) |
| 1.3.4 核蛋白(Nucleoprotein,NP) |
| 1.3.5 基质蛋白(Matrix Protein,M) |
| 1.3.6 非结构蛋白(Nonstructural protein,NS) |
| 1.4 猪流感病毒的感染周期 |
| 1.5 SIV的抗原变异 |
| 1.6 H1N1 SIV基因型划分 |
| 1.7 猪流感的临床症状及病理变化 |
| 1.8 猪流感的诊断与防治 |
| 1.9 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 主要试剂及引物 |
| 2.3 溶液配制 |
| 2.4 方法 |
| 2.4.1 样品的采集及处理 |
| 2.4.2 病毒的分离与纯化 |
| 2.4.2.1 病毒的分离 |
| 2.4.2.2 病毒的有限稀释克隆纯化 |
| 2.4.2.3 病毒RNA的提取及反转录 |
| 2.4.2.4 病毒鉴定、基因片段的PCR扩增及测序 |
| 2.4.2.5 序列的拼接与分析 |
| 2.4.3 血凝(HA)试验 |
| 2.4.4 血凝抑制(HI)试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的分离及亚型鉴定 |
| 3.2 病毒信息 |
| 3.3 病毒扩增结果 |
| 3.4 病毒遗传进化分析 |
| 3.4.1 表面蛋白基因 |
| 3.4.2 内部蛋白基因 |
| 3.5 病毒关键性氨基酸位点分析 |
| 3.6 病毒的基因型 |
| 3.7 血清检测结果 |
| 3.7.1 不同省份猪SIV抗体检测结果 |
| 3.7.2 不同生长阶段猪SIV抗体检测结果 |
| 3.7.3 不同年份猪SIV抗体检测结果 |
| 4.讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
（4）清营口服液抑制H1N1猪流感病毒复制作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 猪流感的概述 |
| 1.2 猪流感的历史和流行现状 |
| 1.2.1 H1N1 猪流感引发的几次流行 |
| 1.2.2 猪流感的流行现状 |
| 1.3 猪流感的诊断 |
| 1.3.1 临床症状 |
| 1.3.2 病理变化 |
| 1.3.3 实验室诊断 |
| 1.4 猪流感的生物学特征 |
| 1.4.1 流感病毒结构 |
| 1.4.2 流感病毒的基因组及其功能 |
| 1.5 猪流感的防治 |
| 1.6 清营口服液的来源及用法 |
| 1.7 本研究的背景及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 药物 |
| 2.1.2 试验动物 |
| 2.1.3 细胞与毒株 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 病毒分离鉴定 |
| 2.2.2 病毒的分离纯化 |
| 2.2.3 血凝试验 |
| 2.2.4 体内抗病毒试验 |
| 2.2.5 体外抗病毒试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪流感病毒的分离鉴定 |
| 3.1.1 病例来源 |
| 3.1.2 临床症状 |
| 3.1.3 剖检病变 |
| 3.1.4 PCR扩增常见高热性疾病 |
| 3.1.5 病毒的分离纯化 |
| 3.2 体内抗病毒试验 |
| 3.2.1 清营口服液对小鼠的毒性作用 |
| 3.2.2 半数感染量(ID_(50)) |
| 3.2.3 小鼠感染给药后体重比 |
| 3.2.4 小鼠感染给药后肺指数 |
| 3.2.5 小鼠肺组织病理检查 |
| 3.2.6 各组病毒载量的变化 |
| 3.3 体外抗病毒试验 |
| 3.3.1 H1N1 SIV对 MDCK细胞的TCID_(50)测定 |
| 3.3.2 细胞给药药物最大安全浓度测定 |
| 3.3.3 药物对H1N1 SIV的抑制作用 |
| 3.3.4 药物对H1N1 猪流感病毒核蛋白的抑制作用 |
| 3.3.5 对其他亚型流感病毒的抑制效果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（5）2013-2018年中国H3N2亚型猪流感病毒疫苗株的筛选及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪流感病毒概述 |
| 1.2 H3N2 亚型猪流感的流行病学 |
| 1.3 猪流感的诊断 |
| 1.3.1 病毒的分离与繁殖 |
| 1.3.2 血清学诊断 |
| 1.3.3 分子生物学诊断技术 |
| 1.4 猪流感疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 全病毒灭活疫苗 |
| 1.4.2 减毒活疫苗 |
| 1.4.3 DNA疫苗 |
| 1.4.4 亚单位疫苗 |
| 1.4.5 通用疫苗 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 H3 亚型猪流感病毒的部分生物学特性分析及疫苗株的筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒株 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂及仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒纯化 |
| 2.2.2 病毒RNA提取、反转录 |
| 2.2.3 PCR扩增及目的片段的回收 |
| 2.2.4 基因组序列测定与分析 |
| 2.2.5 抗原性差异分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 HA基因的分析 |
| 2.3.2 NA基因的分析 |
| 2.3.3 抗原性差异分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 重组H3N2亚型猪流感疫苗株的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株与质粒 |
| 3.1.2 菌种、细胞和鸡胚 |
| 3.1.3 主要试剂及仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组质粒的构建 |
| 3.2.3 重组病毒的拯救 |
| 3.2.4 重组病毒 GX1659/PR8 和亲本病毒 GX1659 生长曲线的测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 猪流感病毒GX1659 表面基因HA和 NA扩增结果 |
| 3.3.2 重组病毒表面基因重组质粒的构建 |
| 3.3.3 重组H3N2 流感病毒GX1659/PR8 的拯救 |
| 3.3.4 重组H3N2 亚型猪流感病毒GX1659/PR8 的鉴定 |
| 3.3.5 GX1659/PR8和GX1659 在鸡胚上的生长曲线 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 疫苗的免疫效力评估 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 攻毒毒株和疫苗株 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 主要试剂及仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 以小鼠为模型对疫苗的免疫效力评估试验 |
| 4.2.2 以猪为模型对疫苗的免疫效力评估试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 以小鼠为模型对疫苗的免疫效力评估结果 |
| 4.3.2 以猪为模型对疫苗的免疫效力评估结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）2019-2020年度扬州地区猪流感病毒分离鉴定及其单克隆抗体的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 综述：猪流感病毒及检测方法研究进展 |
| 1 猪流感病毒的分子生物学特性 |
| 2 猪流感的流行情况 |
| 3 猪流感病毒检测方法的研究进展 |
| 4 单克隆抗体技术在SIV检测中的优点及应用 |
| 5 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第一章 2019-2020年度扬州地区猪流感病毒的分离鉴定及遗传进化分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪流感分离株的生物学特性及小鼠致病性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 H1N1亚型SIV单克隆抗体的研制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）H1和H3亚型猪流感病毒的双重荧光定量RT-PCR方法与遗传进化和生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 猪流感病毒流行病学及其检测方法研究进展 |
| 1 猪流感病毒流行病学 |
| 2 猪流感病毒检测方法的研究进展 |
| 第一章 H1和H3亚型猪流感病毒一步法双重RT-qPCR方法的建立与应用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 猪流感病毒的分离鉴定与遗传进化分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 5株猪流感病毒的生物学特性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（8）候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 流感病毒病原学 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感病毒病原生态学特点 |
| 第二章 流感病毒受体 |
| 2.1 流感病毒受体概述 |
| 2.2 唾液酸的结构及种类 |
| 2.3 不同动物唾液酸受体的异质性 |
| 2.4 不同物种间流感病毒唾液酸受体的分布 |
| 2.5 病毒结合不同唾液酸受体的分子机制 |
| 2.6 流感病毒唾液酸受体研究方法 |
| 第三章 禽流感病毒跨种传播 |
| 3.1 禽流感病毒跨种传播的发生 |
| 3.2 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因突变 |
| 3.3 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因重组 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验用鸡胚和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 样品采集 |
| 1.1.5 禽流感病毒分离 |
| 1.1.6 禽流感病毒RNA的提取 |
| 1.1.7 禽流感病毒高通量测序 |
| 1.1.8 候鸟禽流感病毒抗体检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 样品采集及毒株分离情况 |
| 1.2.2 候鸟AIVs亚型多样性和宿主特异性 |
| 1.2.3 H9N2 禽流感病毒在候鸟中流行的血清学调查 |
| 1.2.4 2020 年候鸟H5N8 禽流感病毒检测及抗原性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 中国东部候鸟禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 候鸟源禽流感病毒基因组收集及比对 |
| 2.1.3 系统发生分析 |
| 2.1.4 进化动力学的空间系统发育重建 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 候鸟源禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.2 候鸟源H9N2 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.3 候鸟源H3N8 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.4 候鸟源H13 亚型禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.5 候鸟源H5N8 禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 中国东部候鸟禽流感病毒分离株受体结合特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 红细胞法检测禽流感病毒受体 |
| 3.1.5 糖芯片法检测禽流感病毒受体 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 候鸟禽流感病毒红细胞法受体测定 |
| 3.2.2 候鸟禽流感病毒糖芯片法受体测定 |
| 3.2.3 候鸟禽流感病毒结合聚糖结构分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 候鸟禽流感病毒在哺乳动物间跨种传播能力评估 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用毒株 |
| 4.1.2 实验用动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 小鼠致病性实验 |
| 4.1.6 豚鼠间传播实验 |
| 4.1.7 雪貂间呼吸道飞沫传播实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.2 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.3 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒雪貂间传播 |
| 4.2.4 候鸟H5N8 禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.5 候鸟H5N8 禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.6 候鸟H3 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.7 候鸟T222 分离株及豚鼠适应一代毒株雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 候鸟源H3N8 禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验用毒株、细胞及载体 |
| 5.1.2 实验用动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株RNA提取 |
| 5.1.6 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株c DNA制备 |
| 5.1.7 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株全基因组及载体扩增 |
| 5.1.8 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株感染性克隆的构建 |
| 5.1.9 候鸟源H3N8 禽流感病毒及其突变株的体外拯救 |
| 5.1.10 流感病毒聚合酶活性检测 |
| 5.1.11 病毒滴定和复制动力学测定 |
| 5.1.12 动物实验 |
| 5.1.13 雪貂适应1 代毒株测序 |
| 5.1.14 雪貂适应1 代毒及受体结合能力检测 |
| 5.1.15 病理及组化 |
| 5.1.16 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 T222 毒株及T222-G1 毒株氨基酸差异比对 |
| 5.2.2 rT222-wild及 rT222-S524G突变株拯救 |
| 5.2.3 rT222-wild及 rT222-S524G豚鼠间传播 |
| 5.2.4 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 5.2.5 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间传播变异分析 |
| 5.2.6 雪貂适应1 代毒株受体结合检测 |
| 5.2.7 PB1-S524G增强了病毒聚合酶活性 |
| 5.2.8 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体外复制能力 |
| 5.2.9 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体内复制能力 |
| 5.2.10 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒对小鼠的致病性 |
| 5.2.11 PB1-S524G增加了H3N8 禽流感病毒对雪貂的致病性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）糖基化与泛素化修饰对流感病毒NA蛋白与病毒生物学特性的影响与分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 A型流感病毒 |
| 1.1.1 A型流感病毒概述 |
| 1.1.2 A型流感病毒的结构 |
| 1.1.3 A型流感病毒的感染和复制 |
| 1.1.4 A型流感病毒的出芽模型 |
| 1.1.5 A型流感病毒的抗原变异 |
| 1.2 糖基化修饰与流感病毒 |
| 1.2.1 糖基化修饰概述 |
| 1.2.2 糖基化修饰的研究方法 |
| 1.2.3 A型流感病毒HA和 NA蛋白N型糖基化的进化动力学 |
| 1.2.4 糖基化修饰对A型流感病毒抗原性的影响 |
| 1.2.5 糖基化修饰对A型流感病毒致病性的影响 |
| 1.2.6 糖基化修饰对A型流感病毒神经毒性的影响 |
| 1.2.7 糖基化修饰对A型流感病毒宿主适应性的影响 |
| 1.2.8 基于A型流感病毒糖基化修饰的疫苗设计研发 |
| 1.3 泛素化修饰与流感病毒 |
| 1.3.1 泛素化修饰概述 |
| 1.3.2 泛素化修饰对免疫应答的影响 |
| 1.3.3 泛素化修饰与疾病 |
| 1.3.4 E3 泛素连接酶 |
| 1.3.5 线性泛素化 |
| 1.3.6 内质网相关降解通路(ERAD) |
| 1.3.7 选择性自噬 |
| 1.3.8 A型流感病毒蛋白的泛素化修饰 |
| 1.4 RO60 蛋白 |
| 1.4.1 RO60 蛋白概述 |
| 1.4.2 RO60 蛋白的结构 |
| 1.4.3 Y RNA |
| 1.4.4 RO60 蛋白功能 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 N型糖基化修饰对流感病毒及NA蛋白的影响 |
| 2.1 .材料与方法 |
| 2.1.1 细胞和病毒 |
| 2.1.2 质粒构建 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 质粒转染细胞 |
| 2.1.6 免疫印迹实验 |
| 2.1.7 病毒出芽实验 |
| 2.1.8 Native gel电泳实验 |
| 2.1.9 间接免疫荧光实验 |
| 2.1.10 NA酶活性实验 |
| 2.1.11 NA反向遗传病毒拯救 |
| 2.1.12 NA流感病毒生长曲线测定 |
| 2.1.13 NA流感病毒感染小鼠实验 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 衣霉素抑制NA蛋白在细胞中的出芽能力 |
| 2.2.2 NA蛋白的N型糖基化修饰显着影响其出芽能力 |
| 2.2.3 反向遗传技术拯救NA糖基化修饰单点突变病毒 |
| 2.2.4 NA蛋白的N型糖基化影响流感病毒的出芽能力 |
| 2.2.5 NA蛋白糖基化修饰影响流感病毒体外复制水平 |
| 2.2.6 NA蛋白糖基化修饰影响流感病毒对小鼠的致病性 |
| 2.2.7 NA糖基化修饰缺失使NA蛋白在内质网沉积并引起UPR |
| 2.2.8 糖基化修饰不影响NA蛋白四聚化 |
| 2.2.9 糖基化修饰影响NA蛋白酶活性 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 NA蛋白泛素化修饰对流感病毒复制与致病性的影响 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 实验仪器和相关试剂 |
| 3.1.2 细胞、病毒和质粒 |
| 3.1.3 质粒构建 |
| 3.1.4 质粒转染细胞 |
| 3.1.5 免疫印迹实验 |
| 3.1.6 免疫共沉淀实验 |
| 3.1.7 RNAi细胞干扰试验 |
| 3.1.8 反向遗传病毒拯救 |
| 3.1.9 流感病毒生长曲线测定 |
| 3.1.10 流感病毒感染小鼠实验 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 糖基化位点的缺失导致WSN病毒NA蛋白泛素化降解 |
| 3.2.2 NA蛋白存在泛素化修饰 |
| 3.2.3 鉴定NA蛋白泛素化修饰类型 |
| 3.2.4 NA蛋白泛素化位点鉴定 |
| 3.2.5 NA蛋白K6 位点的泛素化类型 |
| 3.2.6 WSN NA蛋白K6R突变病毒拯救 |
| 3.2.7 NA蛋白K6 泛素化修饰对病毒体外复制和致病性的影响 |
| 3.2.8 泛素化修饰NA蛋白的E3 酶鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 流感病毒感染导致宿主蛋白泛素化修饰组学变化研究 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 实验仪器和相关试剂 |
| 4.1.2 细胞、病毒和质粒 |
| 4.1.3 质粒构建 |
| 4.1.4 质粒转染细胞 |
| 4.1.5 RNA提取与反转录 |
| 4.1.6 YRNA体外转录 |
| 4.1.7 双荧光素酶报告基因检测 |
| 4.1.8 免疫印迹实验 |
| 4.1.9 免疫共沉淀实验 |
| 4.1.10 过表达泛素化蛋白对流感病毒复制的影响 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 U937 细胞感染流感病毒后泛素化修饰组学分析 |
| 4.2.2 A549 细胞感染流感病毒后泛素化修饰组学分析 |
| 4.2.3 流感感染引起RFC2、AMPKG1和RO60 蛋白的泛素化水平变化 |
| 4.2.4 过表达RO60 蛋白对流感病毒复制的影响 |
| 4.2.5 过表达RO60 蛋白对RIG-I信号通路的影响 |
| 4.2.6 泛素化修饰影响RO60 蛋白对流感病毒的抑制作用 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）H3亚型犬流感病毒的分离鉴定及其荧光定量RT-PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 A型流感病毒基本特征 |
| 1.2 A型流感病毒的抗原变异 |
| 1.2.1 抗原漂移 |
| 1.2.2 抗原转移 |
| 1.3 流感病毒的受体结合特性 |
| 1.3.1 HA蛋白受体结合位点 |
| 1.3.2 HA蛋白的受体结合特异性 |
| 1.4 犬流感病毒的流行病学 |
| 1.4.1 CIV概述 |
| 1.4.2 H3N8亚型CIV |
| 1.4.3 H3N2亚型CIV |
| 1.4.4 H5N1亚型CIV |
| 1.4.5 H5N2亚型CIV |
| 1.4.6 H1N1亚型CIV |
| 1.4.7 H3N1亚型CIV |
| 1.4.8 H9N2亚型CIV |
| 1.4.9 H6N1亚型CIV |
| 1.4.10 CIV的发病机理 |
| 1.5 犬流感病毒的诊断 |
| 1.5.1 病毒的分离培养 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 RT-LAMP检测 |
| 1.5.4 RT-PCR试验 |
| 1.5.5 荧光定量RT-PCR |
| 1.5.6 SYBR GreenⅠ荧光染料法 |
| 1.5.7 Taq Man探针法 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 犬流感病毒的分离鉴定及遗传演化分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 鸡胚 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.1 病料的采集与接种 |
| 2.2.2 病毒的鉴定 |
| 2.2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.2.4 病毒RNA反转录与PCR |
| 2.2.5 病毒全基因组序列测定 |
| 2.2.6 病毒遗传演化分析 |
| 2.2.7 抗原性分析 |
| 2.2.8 受体结合特性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 犬流感病毒的分离鉴定 |
| 2.3.2 病毒核苷酸同源性比较 |
| 2.3.3 HA基因遗传演化分析 |
| 2.3.4 NA基因遗传演化分析 |
| 2.3.5 PB2基因遗传演化分析 |
| 2.3.6 PB1基因遗传演化分析 |
| 2.3.7 PA基因遗传演化分析 |
| 2.3.8 NP基因遗传演化分析 |
| 2.3.9 M基因遗传演化分析 |
| 2.3.10 NS基因遗传演化分析 |
| 2.3.11 抗原性分析 |
| 2.3.12 受体结合特性 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 通用型犬流感病毒荧光定量PCR诊断方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 毒株和核酸样品 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 引物和探针的设计合成 |
| 3.1.4 重组质粒标准品的制备 |
| 3.1.5 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 3.1.6 特异性试验 |
| 3.1.7 敏感性试验 |
| 3.1.8 重复性试验 |
| 3.1.9 临床样品检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组质粒标准品的构建与鉴定结果 |
| 3.2.2 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 3.2.3 特异性试验结果 |
| 3.2.4 敏感性试验结果 |
| 3.2.5 重复性试验结果 |
| 3.2.6 临床样品检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 H3 亚型犬流感病毒荧光定量PCR诊断方法的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株和核酸样品 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 引物和探针的设计合成 |
| 4.1.4 重组质粒标准品的制备 |
| 4.1.5 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 4.1.6 特异性试验 |
| 4.1.7 敏感性试验 |
| 4.1.8 重复性试验 |
| 4.1.9 临床样品检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 重组质粒标准品的构建与鉴定结果 |
| 4.2.2 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 4.2.3 特异性试验结果 |
| 4.2.4 敏感性试验结果 |
| 4.2.5 重复性试验结果 |
| 4.2.6 临床样品检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、猪流感病毒的分离鉴定（论文参考文献）
- [1]清营口服液抑制H1N1猪流感病毒复制作用的研究[J]. 解云辉,林树乾,黄中利,殷斌,杨世发,祝钰玮,闫振贵,吴家强,刘月月. 山东农业科学, 2021
- [2]H3N2亚型猪流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[J]. 陈艳,王飞飞,杨焕良,乔传玲,陈化兰,张秀英. 中国预防兽医学报, 2021(06)
- [3]2018-2020年猪流感病毒分离鉴定和猪流感血清学调查[D]. 赵玉仲. 山东农业大学, 2021(01)
- [4]清营口服液抑制H1N1猪流感病毒复制作用的研究[D]. 解云辉. 山东农业大学, 2021
- [5]2013-2018年中国H3N2亚型猪流感病毒疫苗株的筛选及免疫原性研究[D]. 宋祖晨. 中国农业科学院, 2021(09)
- [6]2019-2020年度扬州地区猪流感病毒分离鉴定及其单克隆抗体的研制[D]. 张金燕. 扬州大学, 2021
- [7]H1和H3亚型猪流感病毒的双重荧光定量RT-PCR方法与遗传进化和生物学特性研究[D]. 陈凯彪. 扬州大学, 2021
- [8]候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究[D]. 张醒海. 吉林大学, 2021
- [9]糖基化与泛素化修饰对流感病毒NA蛋白与病毒生物学特性的影响与分子机制研究[D]. 包旦奇. 中国农业科学院, 2021(01)
- [10]H3亚型犬流感病毒的分离鉴定及其荧光定量RT-PCR方法的建立[D]. 吴颖. 中国农业科学院, 2021(09)