一、肠出血性大肠埃希杆菌O157:H7溶血毒素的检测方法（论文文献综述）
王玥[1]（2020）在《适配体结合量子点技术同步检测金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157：H7的方法研究》文中研究指明据我国疾病爆发监测和数据报告表明,在2009年至2019年期间由食源性致病菌引发的食源性疾病多达3170起。处于致病率首位的便是金黄色葡萄球菌,虽致死率不高,却几乎能污染所有的食物,尤其是肉类制品,从而引起机体严重的肠毒性疾病。其次造成重大危害的菌是大肠埃希氏菌O157:H7,由大肠埃希氏菌O157:H7引发的疾病,每年可导致近6亿人次患病,是致使我国居民腹泻的主要粪源性疾病,严重危害人们的身体健康,同时这两种菌还易在食品加工生产、储存运输环节中造成污染,存在着巨大的隐患。因此开展同步检测两种食源性致病菌的方法学研究对未来食品安全的保障具有重大意义。本研究基于适配体结合量子点技术,建立一种同时针对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7两种食源性致病菌的快速高效、灵敏的检测方法。1. 利用荧光检测技术对4条同一菌种的适配体与其目标菌结合的亲和力进行分析,根据荧光光谱数据等计算解离常数,对应选取解离常数最小的一条适配体序列;对选中的两条适配体序列进行特异性检验。结合表面增强拉曼光谱技术确定适配体与其目标结合物具有较高的特异性,并且在重复性实验中结果良好。成功筛选出与目标菌结合、亲和力较好的两种适配体Apt S4、Apt E1为接下来的实验奠定基础;2. 选取超顺纳米磁珠与适配体进行共价结合形成标记物,对两种目标菌进行特异性分离、富集;选取不同发光原理的两种量子点（QD525、QD605）作为纳米荧光标记,结合量子点荧光标记技术构建“磁珠+目标菌+量子点”的“三明治结构”,通过荧光检测技术得出不同荧光强度进而实现对待检物的定性定量。对“三明治结构”其中两菌种适配体浓度、纳米磁珠捕获时间、磁性分离时间进行优化,确定了同步检测两种目标菌的最低检测限。结果证明所筛选得到的两条适配体Apt S4、Apt E1与目标菌的结合具有高特异性,可与磁珠进行偶联完成对两种目标菌同时分离、捕获。选取QD525、QD605两种不同发射波长的荧光标记物应用于检测当中,形成一个完整的“三明治结构”,对其优化结果表明:两种目标菌的适配体最适浓度为400nmol/L;最佳捕获条件为捕获时间45 min、磁分离时间2 min;利用该结构对两种菌进行同步分离检测得到:金黄色葡萄球菌的最低检测限为101CFU/g,线性方程为Y=28.51X+126.67（R2=0.973）;大肠埃希氏菌O157:H7的最低检测限均为102CFU/g,线性方程为Y=92.86X-64.67（R2=0.987）。其中Y为荧光强度数值,X为细菌菌落数的对数值,拟合度良好;3. 将本研究所开发的方法应用到食品样本中进行检测,选取市售无菌牛奶、生猪肉肉糜、生牛肉肉糜以及袋装黄豆酱作为样本进行加标回收率实验,将所得结果与传统平板计数法相比较。在牛奶样品中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7回收率分别为94.6%～102.8%和93.4%～100.4%;对于加标的猪、牛肉肉糜进行检测,食品样品中金黄色葡萄球菌的检测回收率分别在83.5%～90.6%和87.4%～93.4%之间,大肠埃希氏菌O157:H7回收率分别81.7%～90.6%和82.4%～91.3%。袋装黄豆酱中金黄色葡萄球菌回收率在92%～96.7%之间,大肠埃希氏菌O157:H7回收率在92.8%～98.9%之间。结果证明本研究所建立的方法能够实现同时对大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌两种食源性致病菌同步检测,该方法易操作且灵敏度高,在食品加工生产安全检测方面具有良好的应用前景。
丁浩[2]（2017）在《新疆部分地区牛源E.coli O157:H7的分离鉴定、毒力基因检测及药物敏感性试验》文中研究表明研究新疆部分地区健康牛群中E.coli O157:H7的分布情况,及分离菌株携带毒力基因的特点和对临床常用抗菌药的敏感性情况,并验证生产实践中免疫磁珠富集法对于牛源E.coli O157:H7分离结果的影响。1、从新疆伊犁、博乐、五家渠、昌吉和乌鲁木齐等地的10个牛场随机采集健康牛的肛拭子样本883份和胴体表面拭子48份,经EC肉汤增菌后,用免疫磁珠法富集,再用SMAC平板和MUG液体培养基进行筛选,最后用PCR和生化试验进行鉴定。2、对分离得到的牛源E.coli O157:H7菌株,用PCR法检测Stx1、Stx2、eaeA、Hly和Tccp等毒力基因,分析分离株毒力基因携带特点。3、对分离得到的牛源E.coli O157:H7菌株,采用K-B纸片法对17种兽医临床常用的抗革兰氏阴性杆菌药物进行敏感性检测。4、对从新疆伊犁、昌吉和五家渠采集的243份牛场源肛拭子、粪便、饲草料、饮水和胴体拭子样本,采用免疫磁珠法富集后和直接涂布SMAC平板的方法进行初步筛选,再进行后续E.coli O157:H7的分离鉴定,采用Fisher exact test statistic和McNemar’s Test进行统计学分析,评价生产实践中免疫磁珠富集法在牛源E.coli O157:H7分离过程中的作用。结果显示:1、从931份样本中共分离得到16株E.coli O157:H7,检出率1.72%,其中伊犁地区11株、乌鲁木齐5株,检出率分别为3.93%、1.48%,博乐、昌吉和五家渠的样本中均未检出;从883份肛拭子和48份胴体拭子样本中分别检出14株、2株E.coli O157:H7,检出率分别为1.59%、4.17%。2、16株牛源E.coli O157:H7分离株志贺毒素基因的携带率为81.3%,其中stx1、stx2及stx1和stx2携带率分别为12.5%、25.0%和43.7%。eaeA、Hly、Tccp基因携带率分别为100%、87.5%、75.0%。3、16株E.coli O157:H7分离株对妥布霉素敏感性最高,达到100%,其次是头孢西丁、头孢吡肟、氧氟沙星、氨曲南、头孢他啶达到93.8%;而对麦迪霉素耐药性最高,耐药率达到了100%;4、免疫磁珠法从243份样品中分离到8株E.coli O157:H7,而普通方法只检出了其中的4株,虽然统计学差异不显着（P≧0.05）,但在本试验中免疫磁珠法确实提高了E.coli O157:H7检出数。由以上结果可以得出结论:E.coli O157:H7存在于新疆部分地区健康牛群中,但分离率不高;牛胴体拭子中检出了E.coli O157:H7,且多数分离株同时携带多种毒力基因,推测其对人类有较强的潜在致病性;分离的16株菌对兽医临床常用抗生素有耐药情况存在,但总体耐药水平不高;虽然本实验中,免疫磁珠法和常规法相比差异不显着,但却明显增加了分离菌的数量,故依然推荐在开展E.coli O157:H7的病原检测时使用免疫磁珠富集法。
杨振波[3]（2017）在《东莞屠宰猪及屠宰环境病原性大肠杆菌分离鉴定与致病性研究》文中指出大肠杆菌病是一种常见的、由病原性大肠杆菌引起的人畜共患病,可导致动物和人腹泻、败血症、肺炎、心内膜炎、尿道感染等症状。为了解东莞屠宰生猪病原性大肠杆菌病感染流行情况及其菌株致病性状况,采集了来自东莞市32个镇（街）屠宰场猪肝480份、屠场气溶胶152份、污水90份、用具拭子93份,经细菌培养、分离、革兰氏染色、镜检、生化鉴定、血清型鉴定,并选出其中6株病原性大肠杆菌进行小白鼠致病性试验。本试验还对大肠杆菌O157:H7进行了荧光PCR检测和酶联免疫荧光分析法检测,并与分离鉴定结果进行对比分析,各试验结果如下。从815份样品中共分离到161株病原性大肠杆菌,阳性率为19.75%,其中猪肝分离到119株,阳性率为24.79%;环境样本分离到42株,阳性率为12.54%,环境样品阳性率由高到低依次为:污水16.67%,器具15.05%,空气8.55%。在161株病原性大肠杆菌中,肠出血性大肠杆菌88株,肠道致病性大肠杆菌43株,肠产毒性大肠杆菌22株,肠侵袭性大肠杆菌8株,阳性分离率分别为10.80%,5.28%,2.70%,0.98%。对分离到的猪病原性大肠杆菌O抗原血清型鉴定结果表明:O抗原血清型类型达15种之多,其中以O157、O9、O138、O8为主要流行血清型,分别占所鉴定分离菌株的54.66%、11.80%、8.07%、5.59%。在分离的161株猪病原性大肠杆菌选出6株进行小白鼠致病性试验,用1 mL注射器将配置好浓度为3×108 CFU/ml注入小白鼠腹腔,注射后小白鼠在8 h内均出现典型症状和死亡,7 d内死亡数2只（及2只以上）,有2、5号菌株,为强致病性大肠杆菌;7 d内死亡数在1只的1、4、6号菌株,为中致病性大肠杆菌;有明显症状,但没有死亡数的3号菌株,为低致病性大肠杆菌;对照组小白鼠没有明显症状。用荧光PCR方法对大肠杆菌O157:H7进行流行病学调查,阳性检出数为126份,阳性检出率为15.46%,其中猪肝阳性检出数为102份,阳性检出率为21.25%;环境样品检出数为24份,阳性检出率为7.16%。用该方法在猪体内或屠场环境中检出的阳性率均高于细菌分离鉴定。用酶联免疫荧光法对采集样品进行大肠杆菌O157:H7检测,阳性检出数为118份,阳性检出率为14.48%,其中猪肝阳性检出数为97份,阳性检出率为20.21%;环境样本阳性检出数为21份,阳性检出率为6.27%。阳性检出率高于分离鉴定结果,低于荧光PCR结果。结果表明,东莞屠宰猪群存在不同程度的猪病原性大肠杆菌的感染,且屠宰周围环境如屠宰用具、空气、污水等大肠杆菌污染普遍存在。分离的6株大肠杆菌均具致病性,且致病性强弱各有不同,其中2号菌株为肠出血性大肠杆菌O157:H7,具有很强的致病性,能否引起多种动物发病,值得进一步研究。荧光PCR、酶联免疫荧光试验和普通分离鉴定检测大肠杆菌O157:H7的敏感性依次为:荧光PCR、酶联免疫荧光法、普通分离鉴定。控制大肠杆菌在猪群发生和流行,需采取科学管理、定期监测、加强屠宰检疫、做好个人防护等综合性措施。
连欢[4]（2017）在《EHEC O157:H7部分蛋白的原核表达纯化及免疫学特性研究》文中提出目的:肠出血性大肠杆菌O157:H7（EHEC O157:H7）是全球食源性疾病的主要病原之一,自从1982年被报道作为一种肠道致病菌以来,已经在我国以及世界范围内引起多次暴发流行,散发病例更是经常见诸各种临床杂志和报道。EHEC O157:H7感染对人类健康和食品行业都带来了明显的经济损失。由于尚未有预防或者特殊的治疗方式,了解EHEC O157:H7如何感染宿主及其致病方式对于避免EHEC O157:H7的暴发和改进治疗方式将有重要意义,对有针对性地开发治疗创新药物、设计治疗方案、研制有效疫苗、制定预防控制措施具有重要的理论指导作用。大肠杆菌引起感染主要取决于其毒力因子,目前研究报道较多的有紧密黏附素（Intimin）及紧密黏附素受体（Tir）和III型分泌系统效应蛋白。EHEC O157:H7通过III型分泌系统将其毒力蛋白转运至宿主细胞内,与宿主细胞发生作用,介导宿主肌动蛋白聚集,引起粘附与擦拭（A/E）损伤。但是此过程中具体的信号转导通路至今尚不清楚。了解引起粘膜擦拭损伤相关的蛋白,对阐明EHEC O157:H7的致病机制有重要的意义。本研究的目的是对预测的EHEC O157:H7 III型分泌系统的分泌蛋白进行逐级筛选鉴定,对筛选出的Z2322、Z2340等7个蛋白基因进行克隆表达及纯化,并进行动物实验,分析成功表达纯化的Z2322、Z2340等5个蛋白在小鼠体内产生的体液免疫和细胞免疫应答,进一步明确其刺激小鼠产生的免疫应答类型（Th1/Th2）,为研究Z2322、Z2340等5个蛋白在EHEC O157:H7的致病机制中的作用以及为新型疫苗的研制奠定基础。方法:以EHEC O157:H7 EDL933菌株基因组为基础,用LipoP等七个在线预测软件预测Z2322、Z2340等7个蛋白是否含有信号肽、是否可能为内膜蛋白或者外膜蛋白、预测其亚细胞定位并分析其核苷酸序列的保守性。以EHEC O157:H7 EDL933菌株基因组为模板对Z2322、Z2340等7个蛋白的基因片段进行PCR扩增,同时引入酶切位点BamHI和Xho I,目的基因双酶切后的回收产物分别与pET-22b（+）等四个表达载体相连,转化到E.Coli BL21（DE3）中,在IPTG的诱导下表达融合蛋白,并对融合蛋白的表达形式进行鉴定。将成功表达的蛋白用Ni亲和柱进行纯化并制备鼠抗蛋白血清,采用ELISA方法检测蛋白的免疫原性。将免疫的小鼠分别在21、28、35、42天尾静脉采血收集血清,ELISA检测IgG抗体及其亚型（IgG1、IgG2a、IgG3）的效价,分析其刺激小鼠产生的免疫应答类型（Th1/Th2）。将免疫后的小鼠用EHEC O157:H7 EDL933株进行攻毒,检测蛋白对小鼠的保护性。在攻毒后每日采集小鼠粪便检测其活菌排菌量,确定蛋白对细菌定植的影响。结果:1.通过LipoP、Lipo、SignalP 4.1软件预测,Z2322、Z2340、Z2354、Z2691、Z3074、Z3322和Z3955蛋白不存在信号肽。经预测软件TmHmm和Bomp分析,这些蛋白不存在α-螺旋和β-桶状结构。亚细胞定位软件PSORTb 3.0.2和CELLO v.2.5分析发现,这些蛋白可能分泌至细胞外,且通过BLAST比对发现这些蛋白核苷酸序列保守性较高。2.成功克隆Z2322、Z2340等七个预测蛋白基因片段并构建出重组质粒,经IPTG诱导,成功表达出E.coli BL21-pET-28a-Z2691、E.coli BL21-pET-30a-Z2322等10个重组蛋白。其中E.coli BL21-pET-28a-Z2691等5个蛋白在上清中表达,为可溶性蛋白;E.coli BL21-pET-30a-Z2322等5个蛋白以包涵体的形式表达在沉淀中。3.用不同的方法分别纯化可溶性蛋白和包涵体蛋白,经SDS-PAGE分析蛋白分子量大小与预期一致。ELISA方法检测Z2322、Z2340、Z2691、Z3322和Z3955抗血清的效价,Z2340、Z2691和Z3955为62500EU,Z2322为12500EU,Z3322为2500EU。Z2322、Z2340、Z2691、Z3322能刺激小鼠机体产生的以Th2型免疫占优势的免疫应答,Z3955能刺激机体产生以Th1型免疫占优势的免疫应答。4.免疫保护性实验显示,Z2340、Z2691和Z3955、Z2322能降低小鼠死亡率对其产生较好的保护作用,Z3322能延长小鼠的存活时间,对其产生一定的保护作用。这与ELISA方法检测各蛋白刺激小鼠产生的抗血清效价结果一致。活菌排菌量实验结果显示,Z2322、Z2340、Z2691、Z3955蛋白免疫组分别在攻毒后第6d、7d、9d、9d后检测不到O157:H7活菌,Z3322蛋白免疫组活菌排菌量少于对照组,说明Z2322、Z2340、Z2691、Z3955能缩短EHEC O157:H7在小鼠体内的存活时间,减少食物链的污染,Z3322缩短EHEC O157:H7在小鼠体内的存活时间的作用则不明显。
王琼,唐俊妮,汤承,陈娟,刘骥,陈炼红[5]（2015）在《一种采用微波炉加热快速提取细菌DNA用于PCR扩增的方法》文中研究指明利用微波加热原理,探索一种快速、简单、高效提取细菌DNA用于常规PCR快速检测的方法.在微波炉额定功率800 W条件下分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、副溶血弧菌、沙门氏菌以及志贺氏菌6种常见食源性病原菌进行微波处理,离心取上清,获取细菌DNA,将样本DNA进行PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳进行验证.并进一步采用微波加热方法针对6种病原菌最低检出浓度和混合提取6种病原菌DNA的PCR检测进行分析.6种病原菌在微波炉中加热40-130 s的上清DNA样本均能用于常规PCR扩增.针对检出浓度的分析表明,副溶血弧菌的最低检出浓度为103cfu/ml,金黄色葡萄球菌为104cfu/ml,肠出血性大肠杆菌为105cfu/ml,肠炎沙门氏菌和福氏志贺氏菌的最低检出浓度为106cfu/ml,针对单核细胞增生李斯特氏杆菌的的最低检出浓度为107cfu/ml.进行6种混合菌微波共提取时,其中5种病原菌的特异性基因都能扩出,并且条带很亮.该微波提取方法具有快速,简单,高效的特点,能满足大部分食源性病原菌的常规PCR检测需求,大大节约了时间和成本,具有广泛的适用性,为细菌快速分子检测提供了简便手段.
李乐[6]（2014）在《致病微生物新型检测方法及预防体系应用研究》文中研究说明目的：致病微生物作为医学诊断以及食品卫生检测领域最为重要的检测指标之一,一直被全世界微生物专家所关注。寻找一种快速、简便的微生物检测技术以及设计一种适用于整个食品生产过程的预警体系成为控制致病微生物感染和食品污染的重要手段之一。蛋白质和核酸是微生物体中最重要的两类生物分子,依靠抗体或者痕量核酸,借助不同荧光激发染料或传感技术已经成为当今世界致病微生物检测方法研究的探索前沿。本研究皆在依据其最新技术,开发一系列新型致病微生物快速检测方法以及预防应用体系,以降低最终致病微生物的感染和对食品的污染。方法：（1）借助纳米金颗粒对于荧光染料具有的淬灭特性,依靠核酸适配体对于目标特异分子高特异性的亲和能力,通过溶血性链球菌单链DNA核酸适体,既可以与菌体蛋白特异结合又能与互补寡聚核苷酸形成双链的特点,引入实际样品到反应体系后荧光信号由淬灭变为激发,通过判断荧光信号强度来实现对溶血性链球菌的检测。（2）借助缺失DNA位点的独特分子信标和互补核苷酸序列设计,巧妙利用DNA茎环结构和互补核昔酸序列杂交互补金黄色葡萄球菌特异DNA序列的特点,通过核苷酸结构构相改变,迫使ATMND（2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶）染料离开缺失位点被重新激发荧光,通过检测荧光信号强度来判断金黄色葡萄球菌的存在。（3）通过自主免疫大肠埃希氏菌0157：H7菌体抗原、建立杂交瘤细胞株,依靠血清凝集实验以及酶联免疫抗体鉴定效价等手段,自主免疫并获得大肠埃希氏菌0157：H7单克隆抗体。（4）研发一种基于抗原抗体特异性的酶联免疫反应快速检测大肠埃希氏菌0157：H7的电化学生物免疫传感方法。方法采用双抗夹心酶联免疫反应体系,结合碱性磷酸酶等催化银单质特性,依托玻璃作为芯片基底的微间隙插指电极阵列传感器件,根据生物传感器电化学相关信号强度的变化,实现对大肠埃希氏菌0157：H7的分析。（5）依靠食品加工企业微生物危害分析与关键控制点原理,对容易造成微生物污染的酱肉类企业进行风险干预,再通过微生物危害性控制点进行评估,找出加工过程微生物污染关键控制点环节,建立相关微生物污染预防体系,运用传统细菌培养方法以及自主开发无标记染料分子信标探针技术等检测手段,综合降低微生物污染的可能。结果：（1）借助核酸适配体对于溶血性链球菌高特异性的亲和能力,其方法检测该菌线性范围为4.9102-4.9107CFU/mL,最低检出限理论值为33CFU/mL。（2）依靠无标记染料结合基因缺失位点设计分子信标序列探针与互补核苷酸序列探针,当金黄色葡萄球菌的特异性序列出现后,其荧光强度数值迅速增强,而没有金黄色葡萄球菌的目标序列存在时荧光强度变化不明显。荧光强度的变化可以直接反应出细菌的存在与否。（3）通过对大肠埃希氏菌0157：H7菌体抗原进行小鼠免疫,得到效价稳定、质量可靠的大肠埃希氏菌0157：H7单克隆抗体,其免疫小鼠后腹水效价达到1：104。（4）微阵列间隙插指电极表面在碱性磷酸酶的催化作用下,出现沉积的单质银颗粒,从而改变导电性状,结果显示当大肠埃希氏菌0157：H7浓度为1103CFU/mL、1105CFU/mL、1108CFU/mL时线性关系良好,同时,本方法对于其他对照革兰阳性和革兰阴性菌具有明显的非特异性。该器件完全可达到国家相关准则对于微生物“检出或未检出”的检测要求。（5）微生物预防与控制体系在该企业进行初步应用后,微生物出厂检验合格率的差异具有显着性意义,且金黄色葡萄球菌检出时间由72小时缩短到24-48小时左右。结论：借助核酸和蛋白质的痕量分析检测方法在临床诊断、卫生检验与食品监督领域拥有巨大的应用前景。由于基因探针系列方法判断致病微生物的存在是通过荧光分光光度计进行分析,同时,该实验方法所需的试剂价廉且易获得,核酸适体序列也易合成,对人员操作技能的要求也不高,故检测体系通用性很强,本实验原理适用于不同种类的微生物检测。同时,操作简单、反应迅速、特异性高、灵敏度强、试剂携带方便、检测方法具有广阔的应用前景和市场需求。本研究中所开发的玻璃基底微阵列间隙插指电极芯片较传统硅材料芯片价格低廉,对实验操作技能的要求也不高,完全可以在不久的将来取代现有包括临床检验以及食品安全领域类似ELISA原理方法的所有检测项目。再者,本论文中制备出的大肠埃希氏菌0157：H7抗体效价高、质量稳定,为开展免疫学相关检测方法研究奠定了基础。最后,本研究通过对食品加工企业进行微生物污染评估,并结合自主致病菌快速检测方法,实现了新的预防体系对食品加工企业微生物污染的警示与控制,完全可以尝试在该类其他企业进行推广。
李丁玲[7]（2012）在《多重PCR检测食源性致病菌的研究》文中提出民以食为天,食以安为先。近年来,食品安全突发事件频率高是食品安全问题的一个显着特点。其中食品中污染致病菌是引发食源性疾病的主要因素,加强食品检验力度是解决食品安全问题的最有效的途径。国内检测食品中致病菌主要采用传统的培养方法和PCR方法,传统的培养方法操作繁琐,一般需4 d～7 d。PCR检测方法针对某一种或一类病原菌,但是一旦检测的方向有误就会造成时间和药品浪费。多重PCR弥补了普通PCR的缺点,该方法作为一种可同时检测多种致病菌的方法发展十分迅速。本研究建立了单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌及肠出血性大肠杆菌O157:H7的多重PCR快速检测技术。首先根据单增李斯特氏菌溶血素基因（hlyA）、金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因（nuc）和肠出血性大肠杆菌O157抗原特异基因（rfbE）基因序列,利用Primer5.0设计引物,进行多重PCR反应。将其反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,应用琼脂糖凝胶系统观察结果。并将多重PCR扩增产物进行DNA测序,登陆Genebank将测序结果进行网上blast同源性对比,从而证实三对引物的特异性。本研究选取大量阳性菌株和非阳性干扰菌株进行性特异性验证,结果设计的单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌及肠出血性大肠杆菌引物均能扩增出439 bp、230 bp、151 bp的目的片段,其他菌株均为阴性。还进一步将三种菌株DNA进行随机组合进行多重PCR反应检测其反应的特异性,结果显示均能扩增出特异性目的片段。由此可知,多重PCR检测方法特异性强,可用于同时检测三种致病菌的一种或几种。本研究对多重PCR反应体系进行了优化,试验过程中对镁离子和引物的添加量、dNTPs的添加量、Taq酶的添加量、退火温度和退火时间进行优化。最终确定了多重PCR反应的最佳反应体系和最佳反应条件,该反应体系为:总反应体系50μL。包括5μL 10×PCR buffer,3.5μL Mg2（+25 mM）,5.5μL dNTP s,0.6μL（5 U/μL）Taq酶,单增李斯特氏菌10μmol/L上下游引物量均为2μL、金黄色葡萄球菌10μmol/L上下游引物量均为2.2μL、肠出血性大肠10μmol/L上下游引物量均为1.8μL,模板各2μL,灭菌水补足至50μL。最佳反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min—55.4℃45 s—72℃1 min进行33个循环,最后72℃延伸5 min。本研究对三种食源性致病菌纯菌培养物单菌检测灵敏度均为101 CFU /mL;同时检测三种食源性致病菌的灵敏度均为102 CFU /mL。该研究还对人工污染的乳品、肉及肉制品中三种致病菌进行检测,确定其检出限均为103 CFU /mL。对实际样品进行检测,将多重PCR方法与国标进行比较,确定多重PCR方法对三种致病菌（单增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠杆菌）的敏感性均为100%、特异性分别为:95.6%、92.3%、92.8%;符合率分别为96.7%、93.3%、96.7%。并且在6 h内可完成检测。结果表明本研究建立的多重PCR检测方法简单快速、特异性强、灵敏度高具有很好的应用前景。
程海卫[8]（2012）在《动物源肠出血性大肠杆菌O157：H7分子流行病学分析》文中进行了进一步梳理大肠杆菌O157:H7是一种重要的肠道致病菌，是肠出血性大肠杆菌（EnterohemorrhagicEscherichia coli, EHEC）的一个主要菌型。近年来，屡屡在国内肉制品中检测到大肠杆菌O157感染。它可导致人急性食物中毒，是国家规定必检的病原菌。该菌在世界各地都有不同规模的暴发流行，其感染具有潜在的暴发流行趋势、强烈的致病性、致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点，目前已成为全球性的公共卫生问题，所以对该菌进行有效的防控研究成为当前亟需解决的问题。为了更好掌握该菌在动物群体中的感染情况及其流行菌株的分子特征，为控制其在人畜中的流行提供参考依据，作者进行了以下研究。1.基于大肠杆菌O157:H7参考菌株的rfbE、fliC、eaeA三个基因建立三重PCR检测方法，了解大肠杆菌O157:H7在本地区的流行情况。对三重PCR反应体系的退火温度、退火时间、引物浓度、Mg2+浓度和PCR循环次数进行优化，并对该方法的敏感性、特异性进行了评价。用该方法对动物粪便样品进行检测，结果表明本方法具有极高的特异性，敏感性可达到103cfu/mL，并从临床样品中分离鉴定到大肠杆菌O157:H7菌株。本研究成功建立了大肠杆菌O157:H7三重PCR检测方法，并可应用于临床样品检测，为大肠杆菌O157:H7的分子流行病学调查提供了一种新的检测方法。2.利用常规细菌分离鉴定方法对来自河南省各地市以及甘肃、广西、四川等地的2067份样品进行了大肠杆菌O157:H7的分离鉴定。从这些粪样中分离到6株O157:H7菌株，3株O157:H?菌株，并综合血清学方法、生化反应、分子生物学方法对分离株进行了鉴定。由常规细菌分离方法分离到的大肠杆菌O157菌株与血清学方法、生化反应、PCR鉴定结果相一致，属于大肠杆菌O157菌株。虽然从样品中分离到的O157菌株阳性率很低，而目前大肠杆菌O157也没有出现大的爆发，但是在临床样品中毕竟有该菌的存在，说明目前该菌仍然存在潜在的暴发危险，仍然需要加强对该菌的监控和预警。3.为了更好地了解大肠杆菌O157各分离株之间的系统发育关系，并进一步确定大肠杆菌O157分离株的进化地位及其溯源。本研究以大肠杆菌O157:H7分离株和O157:H?分离株为研究对象，根据GenBank上登录的相关序列，针对大肠杆菌的三个管家基因16S rRNA、gyrB、recA以及两个志贺毒素基因stx1、stx2设计引物，进行PCR扩增、克隆、序列测定，并且通过构建进化树来进行系统演化分析。结果表明，大肠杆菌O157分离株与阳性参考菌株在基于三个管家基因所建立的进化树上种系发育关系非常接近；对毒力基因分析发现，2株O157:H?菌株不含stx2基因，1株O157:H?菌株不含stx基因；通过进化树进行溯源分析，可推测出各分离株的大致起源，本研究为大肠杆菌O157分子流行病学研究和快速溯源提供了参考。4.根据Genbank公布的大肠杆菌O157:H7rfbE和fliC基因序列设计两对引物，并对荧光定量PCR反应条件进行优化，建立检测大肠杆菌O157:H7的双重实时荧光定量PCR反应体系，并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。应用该二重实时荧光定量PCR对所有大肠杆菌O157:H7菌株的检测结果均为阳性，对沙门菌、志贺菌、枸橼酸杆菌、巴氏杆菌、肠球菌、链球菌1型、链球菌2型等菌株则为阴性；该方法检测的灵敏度可达2.95×100copies/μL，比普通PCR的灵敏度高103倍；定量检测的批内与批间变异系数均小于2%；本研究建立的荧光定量PCR方法为大肠杆菌O157:H7的临床诊断，以及食品安全检测提供了新的鉴定方法，同时也为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。5.应用多位点可变数量串联重复序列分析技术（MLVA）对大肠杆菌O157:H7进行了分子流行病学分析，初步研究了大肠杆菌O157:H7分离株的基因型，并对MLVA分型方法进行了评价。本研究采用核酸提取、PCR和琼脂糖凝胶电泳等技术，结合BioNumerics（Version5.0）软件，利用上述方法对O157:H7分离株进行基因分型。基于分离菌株6个VNTR位点的重复次数聚类分析结果表明，其分型图谱上呈现一定的多态性。本研究所分离到的大肠杆菌O157:H7菌株的基因型具有良好的多态性，而且MLVA方法分型鉴定能力强，便于网络化和各实验室间进行对比，并且在分子溯源和流行病学调查中可发挥重大作用。
叶青[9]（2012）在《EHEC O157：H7的分离、鉴定及对小鼠致病性》文中提出肠出血性大肠杆菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli, EHEC）0157:H7是一种重要的动物源性致病菌,易引起婴幼儿及老人腹泻、出血性结肠炎（HC）、血栓形成性血小板减少性紫癜（TTP）及溶血性尿毒综合征（HUS）等严重并发症,部分HUS病例可致死亡。该菌长期驻留于牛、羊、猪、鸡等家畜家禽的肠道中,牛是主要的贮存宿主。该菌造成幼龄动物腹泻,并污染畜禽产品及水源和农作物等,给农牧业带来巨大的损失,也对人们的健康构成巨大威胁。1.大肠杆菌0157：H7的检测和分离从南京各个地区采集新鲜样品420份,其中粪便样品350份,蔬菜50份,肉类10份,牛奶10份,增菌后,免疫磁珠富集,涂布筛选性培养基,菌株在改良山梨醇-麦康凯培养基（CT-SMAC）培养后菌落呈圆形、表面湿润、半透明样,挑取可疑菌落进行rfbE/fliC二重PCR,同时用0157和H7诊断血清做玻片凝集试验进行鉴定。结果成功分离到5株出血性大肠杆菌0157：H7。所采集样品的肠出血性大肠杆菌0157：H7检出率分别为8%、2%、0%、2%、2%。革兰氏染色为阴性杆菌,并且有1株迟缓性发酵山梨醇麦康凯培养基。2.大肠杆菌0157：H7分离株的鉴定设计毒力因子stx1、stx2、eae、hlyA和tccp相应引物,针对已分离的0157：H7菌株进行PCR鉴定,并进行生化试验和药敏试验。毒力基因检测显示：其中4株毒力因子表型为stx1-stx2+eae+hlyA+tccp+,另有一株表现型为stx1+stx2+eae+hlyA+tccp+,各菌tccp基因均为阳性,但携带的重复片段数量有差异。不同牛场的分离菌株的耐药性差异较大,其中6≠}对氨苄青霉素、卡那霉素、先锋V、链霉素有强的耐药性。3.大肠杆菌0157：H7分离株的小鼠致病性通过灌胃攻毒方式研究血性大肠杆菌0157：H7对BALB/C小鼠致病性：选用八周龄小鼠,用链霉素处理小鼠,再分别以1×1010CFU同剂量口服接种经PBS洗涤的五株0157：H7分离株全菌,对感染后小鼠的临床症状和存活情况进行观察,结果显示：小鼠感染各分离菌后体内排菌时间分别为7、9、13、13、15d,存活率分别为40%、50%、60%、20%、50%。本研究为动物感染模型的构建打下了基础。
梁兆铭,张永慧[10]（2011）在《肠出血性大肠埃希菌及其引起暴发的研究》文中提出大肠埃希菌属人肠道正常菌群。少数大肠埃希菌可使人致病,称致泻性大肠埃希菌。肠出血性大肠埃希菌（EHEC）是其中常见的一类,是重要的食源性疾病致病菌,常见血清型包括O157等。自1982年在美国引起首次暴发后,EHEC便在世界各国陆续引起暴发。此文针对EHEC的病原学特征、历年暴发及实验室鉴定等方面进行综述。
二、肠出血性大肠埃希杆菌O157:H7溶血毒素的检测方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肠出血性大肠埃希杆菌O157:H7溶血毒素的检测方法（论文提纲范文）
（1）适配体结合量子点技术同步检测金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157：H7的方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 大肠埃希氏菌O157:H7 |
| 1.1 大肠埃希氏菌O157:H7特点及危害 |
| 1.2 大肠埃希氏菌O157:H7研究现状 |
| 2 金黄色葡萄球菌特点及危害 |
| 2.1 金黄色葡萄球菌特点及危害 |
| 2.2 金黄色葡萄球菌研究现状 |
| 3 常见食源性致病菌检测方法及其研究进展 |
| 3.1 传统微生物平板检验法 |
| 3.2 分子生物学检测方法 |
| 3.3 免疫学检测法 |
| 3.4 生物传感器 |
| 4 适配体 |
| 4.1 适配体简介 |
| 4.2 适配体技术应用进展 |
| 5 基于适配体检测技术的常用手段 |
| 5.1 表面增强拉曼光谱技术简述 |
| 5.2 表面增强拉曼光谱技术应用进展 |
| 5.3 荧光检测技术简述及应用 |
| 5.4 流式分析技术简述及应用 |
| 6 量子点 |
| 6.1 量子点简介 |
| 6.2 基于量子点检测技术应用进展 |
| 7 研究目的与意义 |
| 8 创新点 |
| 第二章 目标菌最佳适配体筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂及主要溶剂 |
| 1.3 实验主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 数据整理与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 金黄色葡萄球菌适配体亲和力分析结果 |
| 2.2 大肠埃希氏菌O157:H7适配体亲和力分析结果 |
| 2.3 适配体特异性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 第三章 建立同步检测两种目标菌的“三明治结构” |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂及主要溶剂 |
| 1.3 实验主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 数据整理与分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 适配体功能化磁珠制备及结构表征 |
| 2.2 量子点显微成像及其功能化表征 |
| 2.3 “三明治结构”表征 |
| 2.4 对“三明治结构”捕获条件优化 |
| 2.5 同步检测两种目标菌并确定其最低检测限 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 食品样品加标回收实验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验试剂及主要溶剂 |
| 1.3 实验主要仪器 |
| 1.4 实验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牛奶样品中金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌O157:H7加标回收实验 |
| 2.2 生猪肉肉糜样品中金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌O157:H7加标回收实验 |
| 2.3 生牛肉肉糜样品中金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌O157:H7加标回收实验 |
| 2.4 袋装袋装黄豆酱中金黄色葡萄球菌及大肠埃希氏菌O157:H7加标回收实验 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）新疆部分地区牛源E.coli O157:H7的分离鉴定、毒力基因检测及药物敏感性试验（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 E.coli O157:H7的概况 |
| 1.2 E.coli O157:H7毒力基因及致病机制 |
| 1.3 E.coli O157:H7耐药现状 |
| 1.4 E.coli O157:H7的检测技术 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第2章 新疆部分地区牛源E.coli O157:H7分离鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 牛源E.coli O157:H7分离株毒力基因携带特点分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 牛源E.coli O157:H7分离株药物敏感性试验 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 免疫磁珠富集法对牛源E.coli O157:H7分离鉴定的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 谢辞 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（3）东莞屠宰猪及屠宰环境病原性大肠杆菌分离鉴定与致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 猪大肠杆菌病的流行病学与临床症状 |
| 1.1.1 病原性 |
| 1.1.2 易感性 |
| 1.1.3 季节性 |
| 1.1.4 传播途径 |
| 1.1.5 临床症状 |
| 1.1.6 病理变化 |
| 1.2 毒力因子研究 |
| 1.2.1 黏附素 |
| 1.2.2 内毒素 |
| 1.2.3 肠毒素 |
| 1.3 大肠杆菌检测技术 |
| 1.3.1 临床诊断 |
| 1.3.2 分离培养法 |
| 1.3.3 免疫血清学技术 |
| 1.3.4 分子生物学技术 |
| 1.4 大肠杆菌病的防治 |
| 1.4.1 加强生产管理 |
| 1.4.2 做好预防控制 |
| 1.4.3 及时发现和治疗 |
| 1.5 猪大肠杆菌的流行及致病性情况 |
| 1.5.1 国外大肠杆菌病的流行情况 |
| 1.5.2 我国猪大肠杆菌病的流行情况 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 采集方法 |
| 2.1.3 检测试剂 |
| 2.1.4 实验动物及耗材 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌分离与鉴定 |
| 2.2.2 细菌生化鉴定 |
| 2.2.3 大肠杆菌O抗原血清型鉴定 |
| 2.2.4 大肠杆菌O_(157):H_7荧光PCR检测 |
| 2.2.5 大肠杆菌O_(157)酶联免疫分析系统检测 |
| 2.2.6 致病性试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌落形态及镜检特征 |
| 3.2 生化鉴定结果 |
| 3.3 病原性大肠杆菌分离与鉴定结果 |
| 3.4 血清型鉴定 |
| 3.5 荧光PCR检测结果 |
| 3.6 酶联免疫分析系统检测 |
| 3.7 致病性试验 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 猪病原性大肠杆菌分离鉴定结果分析 |
| 4.1.2 猪大肠杆菌致病性分析 |
| 4.1.3 大肠杆菌O_(157):H_7检测结果分析 |
| 4.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（4）EHEC O157:H7部分蛋白的原核表达纯化及免疫学特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 EHEC O157: H7概述 |
| 1.2 EHEC O157: H7毒力相关因子 |
| 1.3 感染EHEC O157：H7的宿主免疫应答反应 |
| 第2章 引言 |
| 第3章 EHEC O157:H7部分蛋白的生物信息学预测 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 EHEC O157：H7部分蛋白的克隆、表达及纯化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 EHEC O157：H7部分蛋白的免疫原性分析 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 EHEC O157：H7部分蛋白对小鼠的免疫保护性试验 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.3 试验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）一种采用微波炉加热快速提取细菌DNA用于PCR扩增的方法（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1.1菌株 |
| 1.2主要试剂与设备 |
| 1.3方法 |
| 1.3.1细菌培养与计数 |
| 1.3.2引物 |
| 1.3.3微波加热时间探索 |
| 1.3.4采用微波加热方法针对6种病原菌最低检出浓度的探索 |
| 1.3.6采用微波方法对提取的DNA进行PCR扩增验证 |
| 2结果与分析 |
| 2.1针对6种病原细菌原始培养浓度的计数结果 |
| 2.2不同加热时间对DNA提取效果的分析 |
| 2.3针对6种病原菌最低检出浓度的分析 |
| 2.4采用微波加热提取6种病原菌混合DNA的PCR验证 |
| 3讨论与结论 |
（6）致病微生物新型检测方法及预防体系应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 致病菌与食品安全 |
| 1.2 食源性致病菌危害 |
| 1.3 常见食源性致病菌 |
| 1.3.1 致病性大肠埃希氏菌 |
| 1.3.2 溶血性链球菌 |
| 1.3.3 沙门氏菌 |
| 1.3.4 志贺氏菌 |
| 1.3.5 金黄色葡萄球菌 |
| 1.3.6 单核细胞增生李斯特菌 |
| 1.3.7 副溶血性弧菌 |
| 1.3.8 霍乱弧菌 |
| 1.4 常见致病微生物检测方法 |
| 1.4.1 人工生化培养法 |
| 1.4.2 聚合酶链式反应扩增 |
| 1.4.3 实时荧光定量基因扩增技术 |
| 1.4.4 酶联免疫法 |
| 1.4.5 芯片技术 |
| 1.5 本研究论文的工作内容 |
| 2 基于纳米金淬灭荧光结合核酸适体特异序列检测溶血性链球菌 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.4 结果与讨论 |
| 3 基于无标记染料结合基因探针检测金黄色葡萄球菌 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料与方法 |
| 3.2.2 荧光强度测定方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 分子信标序列实验 |
| 3.3.2 互补单链核苷酸序列实验 |
| 4 大肠埃希氏菌O157:H7单克隆抗体制备 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 杂交瘤细胞株的建立 |
| 4.3.2 单克隆抗体的特性鉴定结果 |
| 4.3.3 mcAb的亚类鉴定 |
| 4.3.4 交叉凝集验证试验 |
| 5 微间隙阵列传感芯片在大肠埃希氏菌O157：H7检测中的初步探索 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验设备与仪器 |
| 5.2.2 试剂与菌种 |
| 5.2.3 光刻微阵列传感免疫芯片的制备 |
| 5.2.4 传感器的电学检测 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 微间隙芯片传感分析原理及不同浓度大肠埃希氏菌0157: H7检测 |
| 5.3.2 微间隙芯片传感器检测对照微生物结果及分析 |
| 6 HACCP体系结合自主分子信标探针在湖南肉品企业微生物污染预防中的应用 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 研究对象 |
| 6.2.2 方法 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 原材料采购与验收 |
| 6.3.2 原材料的解冻、清洗 |
| 6.3.3 原材料肉分割 |
| 6.3.4 卤煮和肉品加工 |
| 6.3.5 冷却 |
| 6.3.6 包装成品验收 |
| 6.3.7 确立一旦发生关键限值偏差时,及时纠正措施 |
| 6.3.8 HACCP记录与实施 |
| 6.3.9 HACCP体系实施前、后产品微生物合格与否比较 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要的研究成果目录 |
| 致谢 |
（7）多重PCR检测食源性致病菌的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 立题背景及意义 |
| 1.2 三种食源性致病菌的简介 |
| 1.2.1 肠出血性大肠杆菌 |
| 1.2.2 金黄色葡萄球菌 |
| 1.2.3 单增李斯特氏菌 |
| 1.3 食源性致病菌检测的研究现状 |
| 1.3.1 传统分离鉴定方法 |
| 1.3.2 免疫学检测方法 |
| 1.3.3 分子生物学检测方法 |
| 1.4 多重PCR 技术 |
| 1.4.1 多重PCR 法的概述 |
| 1.4.2 多重PCR 法的特点 |
| 1.4.3 多重PCR 法的引物设计 |
| 1.4.4 多重PCR 法产物的检测方法 |
| 1.4.5 多重PCR 法的应用 |
| 1.5 研究过程中存在的一些问题 |
| 1.6 研究内容及其优越性 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料与仪器 |
| 2.1.1 试验菌株 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 主要培养基 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 菌种的培养 |
| 2.2.2 菌体DNA 模板的提取 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 多重PCR 反应体系 |
| 2.2.5 多重PCR 主要操作程序 |
| 2.3 多重PCR 反应条件优化 |
| 2.3.1 镁离子和引物添加量的优化 |
| 2.3.2 dNTP 的添加量和Taq 酶的添加量的优化 |
| 2.3.3 退火温度的优化 |
| 2.3.4 退火时间的优化 |
| 2.4 多重PCR 特异性 |
| 2.5 多重PCR 扩增产物的分析 |
| 2.5.1 多重PCR 产物凝胶成像分析 |
| 2.5.2 多重PCR 产物测序 |
| 2.6 多重PCR 的灵敏度检测 |
| 2.6.1 多重PCR 检测单一致病菌的灵敏度检测 |
| 2.6.2 多重PCR 同时检测三种致病菌的灵敏度检测 |
| 2.7 人工污染肉中三种致病菌的检出限 |
| 2.7.1 人工污染乳品中三种致病菌的检出限 |
| 2.7.2 人工污染肉及肉制品中三种致病菌的检出限 |
| 2.8 乳品、肉及肉制品中三种致病菌DNA 提取方法比较 |
| 2.9 多重PCR 方法与国标方法实际样品检测对比试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 多重PCR 反应条件的优化 |
| 3.1.1 镁离子添加量和引物添加量的优化 |
| 3.1.2 Taq 酶添加量和dNTP 添加量的优化 |
| 3.1.3 退火温度的优化 |
| 3.1.4 退火时间的优化 |
| 3.2 特异性的研究 |
| 3.2.1 多重PCR 引物特异性的研究 |
| 3.2.2 多重PCR 反应特异性的研究 |
| 3.3 多重PCR 扩增产物的分析 |
| 3.3.1 多重PCR 扩增产物的电泳分析 |
| 3.3.2 多重PCR 扩增产物测序结果 |
| 3.4 多重PCR 灵敏度的研究 |
| 3.4.1 多重PCR 检测单一致病菌的灵敏度 |
| 3.4.2 多重PCR 同时检测三种致病菌的灵敏度 |
| 3.5 人工污染样品，确定检出限 |
| 3.6 乳品、肉及肉制品中三种致病菌DNA 提取方法比较结果 |
| 3.7 多重PCR 与国标方法实际样品检测对比试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 多重PCR 引物的确定 |
| 4.2 多重PCR 反应条件的优化 |
| 4.2.1 镁离子（Mg~(2+)）和引物添加量的优化 |
| 4.2.2 Taq 酶和dNTP 添加量的优化 |
| 4.2.3 退火温度的优化 |
| 4.3 特异性分析 |
| 4.4 灵敏度分析 |
| 4.5 多重PCR 的污染防控 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）动物源肠出血性大肠杆菌O157：H7分子流行病学分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 缩略词 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 肠出血性大肠杆菌(EHEC) O1 57:H7 概况 |
| 2 肠出血性大肠杆菌 O157:H7 检测方法研究进展 |
| 3 肠出血性大肠杆菌 O157:H7 的分子流行病学研究概况 |
| 4 展望 |
| 引言 |
| 试验研究 |
| 试验一 大肠杆菌 O157:H7 多重 PCR 检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 试验二 我国部分地区动物源大肠杆菌 O157:H7 流行病学调查 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 试验三 动物源肠出血性大肠杆菌 O157:H7 种系发育分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 试验四 大肠杆菌 O157:H7 双重 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 PCR 检测方法的建立和初步应用 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 试验五 多位点可变数目串联重复序列分析对肠出血性大肠杆菌 O157:H7 分型的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附录 |
（9）EHEC O157：H7的分离、鉴定及对小鼠致病性（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 病原学 |
| 3 流行病学 |
| 3.1 传染源 |
| 3.2 传播途径 |
| 3.3 易感人群 |
| 4 临床症状与病理变化 |
| 5 致病机理 |
| 6 毒力因子及黏附因子 |
| 6.1 志贺毒素 |
| 6.2 Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP) |
| 6.3 溶血素(haemolysins hlys) |
| 6.4 紧密素(intimin) |
| 7 检测技术和研究进展 |
| 7.1 常规鉴定方法 |
| 7.2 免疫学检测方法 |
| 7.3 分子生物学检测 |
| 8 防治策略 |
| 8.1 多糖结合疫苗 |
| 8.2 亚单位疫苗 |
| 8.3 转基因植物疫苗 |
| 8.4 细菌ghost疫苗 |
| 8.5 减毒活菌苗 |
| 8.6 重组载体活菌苗 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 大肠杆菌O157:H7的检测和分离 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品和菌株 |
| 1.2 培养基及试剂 |
| 1.3 仪器和试剂 |
| 1.4 引物的设计与合成 |
| 1.5 样品检测与细菌分离 |
| 1.6 二重PCR鉴定O157:H7 |
| 1.7 血清学鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 培养特性 |
| 2.2 细菌形态学观察 |
| 2.3 阳性EHEC O157:H7的鉴定 |
| 2.4 出血性大肠杆菌O157:H7的分离 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第二章 大肠杆菌O157:H7分离株的鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品和菌株 |
| 1.2 仪器及试剂 |
| 1.3 引物的设计与合成 |
| 1.4 毒力因子的鉴定 |
| 1.5 临床阳性样品的生化试验和药敏试验 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第三章 大肠杆菌O157:H7分离株的小鼠致病性 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 试剂及实验动物 |
| 1.3 菌液制备 |
| 1.3.1 实验动物分组及预处理 |
| 1.3.2 细菌计数 |
| 1.3.3 动物分组和处理 |
| 1.4 粪便收集处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 临床症状 |
| 2.2 小鼠存活率 |
| 2.3 攻毒后排菌情况检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 常用试剂配制 |
| 致谢 |
四、肠出血性大肠埃希杆菌O157:H7溶血毒素的检测方法（论文参考文献）
- [1]适配体结合量子点技术同步检测金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157：H7的方法研究[D]. 王玥. 吉林农业大学, 2020(02)
- [2]新疆部分地区牛源E.coli O157:H7的分离鉴定、毒力基因检测及药物敏感性试验[D]. 丁浩. 新疆农业大学, 2017(02)
- [3]东莞屠宰猪及屠宰环境病原性大肠杆菌分离鉴定与致病性研究[D]. 杨振波. 华南农业大学, 2017(08)
- [4]EHEC O157:H7部分蛋白的原核表达纯化及免疫学特性研究[D]. 连欢. 西南大学, 2017(02)
- [5]一种采用微波炉加热快速提取细菌DNA用于PCR扩增的方法[J]. 王琼,唐俊妮,汤承,陈娟,刘骥,陈炼红. 西南民族大学学报(自然科学版), 2015(02)
- [6]致病微生物新型检测方法及预防体系应用研究[D]. 李乐. 中南大学, 2014(02)
- [7]多重PCR检测食源性致病菌的研究[D]. 李丁玲. 河北农业大学, 2012(08)
- [8]动物源肠出血性大肠杆菌O157：H7分子流行病学分析[D]. 程海卫. 河南农业大学, 2012(06)
- [9]EHEC O157：H7的分离、鉴定及对小鼠致病性[D]. 叶青. 南京农业大学, 2012(01)
- [10]肠出血性大肠埃希菌及其引起暴发的研究[J]. 梁兆铭,张永慧. 国际流行病学传染病学杂志, 2011(05)