一、利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比（论文文献综述）
寇亚停[1]（2020）在《人乳头瘤病毒31亚型L1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的淘选》文中认为人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）是一类侵害粘膜和上皮组织的病毒,尤其是引发女性宫颈癌。宫颈癌是全球女性第二高发癌症,而95%以上的宫颈癌是由感染HPV引起。现已鉴定的HPV亚型有200多种,其中HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45等因具有较强的致病性为高危亚型。L1蛋白作为HPV的主要衣壳蛋白,是HPV感染或接种疫苗后诱发机体产生保护性免疫反应的主要病毒抗原。本研究以大肠杆菌表达的SUMO-31 L1重组蛋白为免疫原,通过细胞融合技术制备抗HPV31 L1蛋白单克隆抗体,并以该单克隆抗体为靶分子淘选HPV31L1蛋白的模拟表位。抗HPV31 L1蛋白单克隆抗体的制备及抗原模拟表位的淘选,有助于制备抗原检测试剂并且为丰富HPV31 L1蛋白表位图谱奠定基础。将实验室保存的重组表达菌BL21（DE3）（p E SUMO-31 L1）诱导表达,最适诱导表达条件是:IPTG终浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为10 h,诱导温度为16℃,SUMO-31 L1重组蛋白大部分以可溶形式表达,分子量约为72 k Da。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,重组蛋白具有与天然病毒类似的血凝活性。将SUMO-31 L1免疫Balb/c小鼠后,利用细胞融合技术,获得了能分泌抗HPV31 L1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C2。腹水抗体效价为1:2.56×105,亲和常数为1.2×109L/mol。间接免疫荧光实验说明2C2与293T细胞表达的HPV6、HPV16、HPV18、HPV31、HPV45、HPV52和HPV58亚型L1蛋白均可发生反应。间接ELISA实验说明2C2与HPV18、HPV45、HPV53和HPV58亚型L1蛋白发生交叉反应。以单克隆抗体2C2为靶分子,从噬菌体展示12肽库淘选抗原模拟表位。三轮有效淘选后,获得了14个阳性噬菌体株,其中10个被成功测序。利用Meg Align软件进行氨基酸序列比对,虽未发现有连续三个氨基酸与HPV31 L1序列同源,但是10条多肽间具有高度的同源性,优势序列为RVTVNTETAWWY。噬菌体间接竞争ELISA实验证实,该序列为HPV31 L1蛋白的模拟表位。本研究制备了抗HPV31 L1蛋白单克隆抗体2C2,以该单克隆抗体为靶分子,淘选到了HPV31 L1蛋白的一段模拟表位:RVTVNTETAWWY。
彭亚允[2]（2020）在《人乳头瘤病毒45亚型L1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的筛选》文中研究表明宫颈癌是世界上女性患者中常见的癌症之一,发病率和死亡率很高。该病是由高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）引起的。目前,在已发现的200多种HPV亚型中,HPV45属于高危型之一,与宫颈癌的发生密切相关。L1蛋白是组成HPV病毒衣壳的主要结构蛋白,可诱导机体产生中和性抗体。因此,抗HPV45 L1蛋白单克隆抗体（Monoclonal antibody,m Ab）的制备以及L1蛋白抗原表位的鉴定,对该病的预防与检测具有重要意义。本研究对SUMO-HPV45 L1蛋白进行诱导表达条件的优化,使用Ni-NTA亲和层析方法纯化L1蛋白,结果表明IPTG（Isopropylβ-D-thiogalactoside）终浓度为0.1 mmol/L,在16℃条件下诱导表达18 h时,目的蛋白可溶性表达效果最好,SDS-PAGE结果显示目的蛋白纯度可达90%以上,Western-blot结果表明目的蛋白可与抗His单抗发生特异性反应。将纯化的蛋白免疫两只小鼠,小鼠血清效价可达1:1.024×105以上。利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,筛选出4株抗HPV45 L1蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为2F5,3B7,3C11,3G11。选取效价最高的细胞株3C11,用体内诱生法大量制备腹水,并采用辛酸-硫酸铵法进行纯化。间接ELISA结果表明纯化后3C11抗体效价达1:2.56×105以上,亲和常数为1.4×109 L/mol,且该抗体与HPV18/31/53/58亚型均无交叉反应。以纯化后的3C11单克隆抗体为靶分子,使用噬菌体十二肽库进行淘选。挑取出12个可与单抗3C11呈现强阳性反应的克隆进行测序,利用DNASTAR软件分析,通过Dot-ELISA及间接竞争ELISA进行鉴定,结果表明“381VPNTYD386”为L1蛋白的线性表位。本研究成功制备了抗HPV45 L1蛋白的单克隆抗体,并筛选出了L1蛋白的线性表位“381VPNTYD386”,为HPV45 L1蛋白的免疫检测提供了便捷的技术手段,为进一步分析L1蛋白结构与功能关系打下了基础,对深入了解抗原-抗体之间的相互作用具有重要意义。
李相梅[3]（2020）在《HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法建立》文中研究说明人乳头瘤病毒（HPV）是已知最古老的病毒家族之一,能够导致上皮异常增生及宫颈癌和头颈部癌等多种癌症。HPV病毒颗粒具有保守的二十面体结构。研究表明,外源表达的HPV主要衣壳蛋白（L1）能够自发组装成病毒样颗粒（VLP）,其表面存在HPV的主要中和表位,具有高度的免疫原性,目前已上市或在研的HPV预防性疫苗均以HPV L1 VLP为其主要抗原成分。由于疫苗的高成本、高售价是限制其在发展中国家应用的主要因素,所以研发出价格低廉的高价次HPV预防性疫苗具有重要意义。此外,佐剂也是影响疫苗免疫效果的一个关键因素。因此,本论文拟通过对HPV6 L1蛋白原核表达条件进行优化以提高其可溶性表达量,并进行佐剂筛选以提高疫苗的免疫原性,为HPV VLP预防性疫苗的研发提供实验数据。本研究首先构建了原核表达质粒pET30a（+）-6L1,通过对诱导剂的使用量、诱导温度及共表达分子伴侣等三方面进行优化,确定最佳表达条件;之后选择Al（OH）3、AlPO4和Nano Al三种佐剂与HPV6 L1 VLP共同免疫,采用ELISA和中和试验进行免疫原性评价。结果显示:（1）适当降低蛋白合成速度能够增加目的蛋白可溶性表达量,当诱导剂IPTG使用终浓度为0.1mM、诱导温度为25℃时,HPV6 L1蛋白可溶性表达量更高;（2）分子伴侣TF对HPV6 L1蛋白可溶性表达的增强效果更佳;（3）四组疫苗均能提供较好的、较为持久的保护作用,其中Al（OH）3佐剂组中和抗体水平明显高于其他佐剂组。免疫原性评价是HPV疫苗临床研究中的重要内容,但传统的中和抗体检测方法操作繁琐。当前国内外通用的HPV假病毒中和抗体检测方法是使用携带EGFP的假病毒,这就导致在进行九价免疫血清检测时,需通过九次单独试验,操作复杂且耗时长。本研究是在原有的基础上,选择三种激发、发射波长互不干扰的荧光蛋白EGFP、mTagBFP2、mRFP,用不同型别的假病毒包裹不同颜色的荧光蛋白基因,制备三种单色荧光假病毒PsV6G、PsV16B、PsV52R。通过分别使用单色荧光和三色混合荧光假病毒检测HPV九价疫苗免疫小鼠血清的中和抗体水平,以验证三色混合荧光假病毒检测系统的准确性。结果显示:（1）单色荧光、三色混合荧光假病毒检测试验的板内变异系数（CV）小于10%,板间变异系数（CV）小于20%,说明试验重复性较好;（2）单色荧光与三色混合荧光假病毒检测中和抗体滴度值无统计学差异（P>0.05）,说明两种检测方法具有一致性,且三色混合荧光假病毒检测免疫血清不存在干扰现象。本研究的结果表明,三色混合荧光假病毒中和抗体检测方法能够应用于HPV九价免疫血清中和抗体的检测,这为一种基于荧光信号的高通量HPV假病毒中和抗体检测方法的建立提供了新思路,为高效、快速地检测HPV九价疫苗临床血清奠定了坚实基础。
胡仁建[4]（2020）在《HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备、表征及其诊断应用》文中指出背景与目的:宫颈癌是全球妇女癌症中仅次于乳腺癌居第四位的癌症,2018年全球宫颈癌发病人数57万例,死亡人数31.1万。宫颈的高危型人乳头瘤病毒（High risk human papillomavirus,HR-HPV）的持续性感染是导致宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia,CIN）和宫颈癌的直接病因,其中HPV16型的发病率最高,占53%。HPV16 E7蛋白是HPV致癌的关键分子,HPV16 E7蛋白只选择性表达在肿瘤细胞中,随着宫颈上皮内瘤变从CIN1到CIN3进展,HPV16 E7蛋白的表达向外层推进越明显且表达量越来越高,最终HPV16 E7蛋白出现在宫颈脱落细胞中。细胞学检查（如TCT）联合HR-HPV DNA检测,可以增加宫颈上皮内瘤变CIN3、宫颈原位腺癌和浸润性宫颈腺癌的检出率。目前,人乳头瘤病毒（HPV）的临床检测方法主要是基于PCR的方法,但是PCR法只能用于检测HPV DNA和HPV分型,但不能检测HPV E6、E7致癌蛋白,所以预测HPV阳性癌症如宫颈癌的准确率不高。本研究的目的是针对那些细胞学检测为阴性而HR-HPV的DNA检测阳性的妇女,补充检测HPV16 E7蛋白等,即制备抗HPV16 E7蛋白的单克隆抗体并建立在蛋白质水平检测HPV16 E7致癌蛋白的化学发光免疫分析方法等,HPV16 E7蛋白的存在提示宫颈有癌细胞的存在,这很可能在宫颈上皮内瘤CIN2、CIN3时期甚至CIN1时期就发现有癌细胞的存在,具有早期预警宫颈癌的作用。方法:本研究采用基因克隆技术制备HPV16 E7蛋白;用杂交瘤技术制备抗HPV16 E7蛋白的单克隆抗体;测定和分析抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的表征,如单抗的配对、单抗的氨基酸序列和亲和力测定、单抗的优势线性B细胞表位的鉴定和保守性分析等;探索抗HPV16 E7蛋白单抗在免疫化学、免疫荧光、Western Blot等方法中定性检测天然的HPV16 E7蛋白的有效性、特异性及初步诊断价值;探索两个新的抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体79A11和69E2（79A11作为捕获抗体,69E2作为检测抗体）被用于基于辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）标记检测抗体69E2和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）的常规双抗夹心ELISA法的检测系统,以及基于标记的链霉亲和素生物素（Labelled Streptavidin-Biotin,LSAB）加鲁米诺的化学发光免疫分析法的检测系统,在ng级水平定量检测宫颈内瘤病变CIN和宫颈癌等患者宫颈脱落细胞或组织中HPV16 E7致癌蛋白的诊断价值。主要结果如下:1.HPV16 E7基因的克隆、鉴定和HPV16 E7蛋白的纯化以CaSki细胞中的总DNA为模板,PCR扩增HPV16 E7基因约322bp,重组质粒pET-28a（+）-HPV16 E7中的HPV16 E7蛋白氨基酸序列与CaSki细胞株中的HPV16 E7蛋白氨基酸在第28位氨基酸上不同（28F和28L）,与SiHa细胞株中的HPV16 E7蛋白的氨基酸序列完全一致。工程菌pET-28a（+）-HPV16 E7-Rosetta（DE3）pLysS表达的HPV16 E7蛋白的分子量大约为18 kDa,其表达量高、呈可溶性表达以及二级结构为ɑ螺旋,镍柱亲和层析联合DEAE柱纯化,获得纯度大于95%的HPV16 E7蛋白。2.抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备HPV16 E7蛋白免疫BALB/c小鼠的后腿足垫和腹腔5次,细胞融合前的免疫BALB/c小鼠血清的效价在1:1280001:256000。小鼠腹股沟淋巴结细胞和脾脏细胞分别与SP2/0-Ag14融合后的融合率均为100%。淋巴结细胞来源的效价高的单克隆抗体的亚型主要为IgG2a,包括69E2、69B10、54D5、54F4、54G5,其中的69A6为IgM;脾脏细胞来源的3株效价高的单克隆抗体亚型以IgM为主,以单抗79A11为代表。用二步法-辛酸-硫酸铵沉淀和Protein G纯化的IgG2a亚型的单抗69E2的纯度高达95%以上,69E2的抗体效价最高（0.19ng）;用四步法-硫酸铵沉淀加凝胶过滤层析加IgM柱加凝胶过滤层析纯化的IgM亚型单抗79A11的纯度高达95%以上,单抗79A11的效价较高,大约6.25ng。3.抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的表征8株单抗79A11,69E2,69A6,54D5,54F4,54G5,74F3和72E6通过Western blot方法与一个含有组氨酸标签的人c-Myc（HIS-c-Myc）反应,都没有出现曝光条带,排除这8株单抗与组氨酸标签反应的假阳性。这8株单抗配对56对,出现比较强的阳性信号的单抗对有4对:79A11与69E2、79A11与69A6、79A11与74F3、79A11与54D5。单抗79A11适合作为捕获抗体,单抗69E2、69A6、54D5、74F3适合做检测抗体。测定配对信号强的两对单抗共3个单抗79A11、69E2、69A6是3个新的互相不同的抗HPV16 E7蛋白的单抗,两个单抗79A11与69E2的重链和轻链氨基酸序列的差别都很大。单抗69E2与HPV16 E7蛋白之间的亲和力较高（5.60E-9M）,因为单抗79A11与HPV16 E7蛋白之间结合后被高盐洗脱下来,所以单抗79A11被认为与HPV16 E7蛋白之间没有特异性结合。3个单抗79A11、69E2和69A6的特异性表位均是外露、不连续和位置邻近的3个肽段HPV16 E749-66、HPV16 E773-85和HPV16 E791-97,都是构象性表位。3株单抗79A11、69E2和69A6的3个外露的特异性表位肽段HPV16 E749-66、HPV16 E773-85和HPV16 E791-97的氨基酸序列与从NCBI中下载的30株HPV16毒株中的HPV16 E7蛋白的氨基酸序列的同源性很高。关于3株单抗79A11、69E2和69A6的优势线性B细胞表位不同点有2个:第一是重叠肽的间接ELISA法结果显示单抗69E2与HPV16 E785-98的反应有较强的信号（p<0.01）,而2株单抗79A11和69A6与HPV16 E785-98的反应没有阳性的信号;第二是重叠肽在10μmol/L时的间接竞争ELISA的结果不同,3株单抗79A11、69E2和69A6抑制重叠肽HPV16 E749-66的抑制率依次为40.66%、94.28%和16.28%。这两个不同点提示这3株单抗的优势线性B细胞表位存在差异。4.抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用8株单抗79A11、69E2、69A6、54D5、54F4、54G5、74F3和72E6在低至7.8125 ng时与CaSki细胞进行免疫细胞化学反应,均出现棕黄色颗粒,而与HeLa细胞反应,不出现棕黄色颗粒;3株单抗79A11、69E2、69A6分别在0.895μg/片、5μg/片和1.84μg/片与HPV16阳性的宫颈癌组织进行免疫组织化学反应,都出现典型的棕黄色颗粒,与HPV18阳性的宫颈癌组织反应,都没有出现棕黄色颗粒;3株单抗79A11、69E2、69A6都在1μg/ml与CaSki细胞进行免疫荧光反应,均出现绿色荧光,而与HeLa细胞反应,不出现绿色荧光。3株单抗79A11、69E2和69A6与CaSki细胞的总蛋白进行Western Blot反应,在18kDa处出现典型的曝光条带,而与HeLa细胞的总蛋白反应,没有出现典型的曝光条带。5.单抗79A11和69E2在基于HRP-69E2和TMB的常规双抗夹心ELISA检测系统中定量检测HPV16 E7蛋白的诊断应用常规双抗夹心ELISA的优化条件为:捕获抗体79A11的最佳包被浓度是2μg/mL,检测抗体HRP-69E2的最佳工作浓度是1μg/mL,5%脱脂乳封闭2 h的本底低和信号强。双抗夹心ELISA结果显示当抗原HPV16 E7蛋白在ng级以等比等差法（0、25、50、100、200、400、600、800、1000 ng/孔）稀释时,制备的直线拟合的参考曲线的决定系数R2=0.9723。以抗原HPV16 E7蛋白在0和变异系数CV低于10%的低浓度25ng含量为横坐标,对应的OD值为纵坐标,获得计算检测限的方程为Y=0.01122*X+0.6896和决定系数R2值=0.9889,以信噪比S/N=3的高标准确定检测下限的OD450nm=3*0.6896=2.0688,检测限=（2.0688-0.6896）/0.01122=122.9234ng。因为变异系数小于20%,这个检测限也是定量限122.9234ng,所以需要探索灵敏度更高的检测系统。6.单抗79A11和69E2在基于LSAB加鲁米诺的化学发光免疫分析法检测系统中定量检测HPV16 E7蛋白的诊断应用化学发光免疫分析方法的优化条件如下:捕获抗体79A11的包被浓度是2 ug/mL,0.25%BSA封闭液封闭2 h,抗原HPV16 E7蛋白在ng级以等比等差法（0、25、50、100、200、400、600、800、1000 ng/孔）稀释与捕获抗体在37℃反应2 h,检测抗体Biotin-69E2和HRP-Streptavidin的工作浓度都为1 ug/mL,鲁米诺反应10 min等。以优化条件制备参考曲线,其直线拟合的回归方程为Y=53.35*X+10294,直线拟合和双对数拟合的决定系数R2依次为0.9666和0.956;以抗原HPV16 E7蛋白在0和低浓度25 ng的含量为横坐标,对应的相对光度（relative light units,RLU）值为纵坐标,获得计算检测限的回归方程Y=363.1*X+3441,R2=0.9823,信噪比S/N=3的RLU=3*3441=10324,检测限=（10324-3441）/363.1=18.9562ng。因为变异系数小于20%,这个检测限也是定量限18.9562ng,与常规双抗夹心ELISA法定量检测HPV16 E7癌蛋白的定量限122.9234 ng相比,灵敏度提高6.48倍。将标本的RLU值带入方程Y=53.35*X+10294,结果显示4个正常宫颈组织和4例HPV52阳性的宫颈癌组织的总蛋白20μg中的HPV16 E7蛋白含量都小于定量下限18.9562 ng;12例HPV16阳性的宫颈癌组织的总蛋白20μg中的HPV16 E7蛋白含量波动在102.1743438.2473 ng,与正常组织和HPV52阳性宫颈癌组织中的HPV16 E7蛋白含量相比有显着差异（p<0.01）。结论:本研究制备了分子量大约18 kDa、呈可溶性表达、二级结构为ɑ螺旋的HPV16 E7蛋白,获得两株新的不同的抗HPV16 E7蛋白的代表单抗79A11（IgM）和69E29（IgG2a）,单抗79A11和69E2的特异性表位都是构象性表位,分别位于HPV16 E7蛋白二聚体的两个单体上。单抗79A11和69E2在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中定性检测天然的HPV16 E7蛋白具有潜在诊断价值。单抗79A11和69E2被应用于基于LSAB-鲁米诺-双抗夹心ELISA的化学发光免疫分析法中,定量检测HPV16 E7蛋白的定量限为18.9562 ng,该化学发光免疫分析法检测12例HPV16阳性的宫颈癌组织中HPV16 E7蛋白的检出率在100%,表明单抗79A11和69E2在化学发光免疫分析法定量检测天然的HPV16 E7蛋白具有潜在的诊断价值。
朱俐[5]（2019）在《基于纳米材料质谱法对人乳头瘤状病毒分型及检测方法研究》文中进行了进一步梳理宫颈癌是全球女性中第四大常见的癌症,已有研究表明持续性感染高危型人乳头瘤状病毒（HPV）病毒是宫颈病变的必要条件。早期感染HPV不会产生任何症状,这是因为HPV L1蛋白是保护性抗原,可激发人自身的免疫系统而清除病毒,又因为HPV L1蛋白是晚期产生的蛋白,主要存在病毒复制期,所以检测HPV L1蛋白能反应患者的免疫状态和HPV DNA是否整合到宿主基因组,从而判断病情发展趋势以及是否能引起恶性病变。不同宫颈癌变的级别与HPV感染型别存在一定差异,人们常常根据患者携带病毒的量来辨别病情,预测宫颈恶性病变的风险,因此当已经确证持续感染HPV后,我们既要根据感染HPV的型别,又要根据患者携带病毒的量,来评判和预测与HPV病毒有关疾病的发展趋势,做到早预防早治疗,降低发病率和死亡率。综上HPV分型检测对早期宫颈癌的筛查起着重要作用,而检测HPV L1蛋白对宫颈疾病发展趋势的预测和HPV感染治疗的预后都具有很大的参考意义,二者结合起来对临床诊断更具实用价值。同时进行HPV分型和HPV L1蛋白检测可弥补彼此的缺点,临床上可极大降低漏诊误诊率,提高恶性病变诊断和预测的准确性,最大程度减少患者的损失。本论文基于纳米材料特性采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI TOF MS）建立高危HPV16、18分型检测方法及HPV16 L1蛋白检测方法,方法具有较高的灵敏度,并且分析速度快,经济高效,应用于临床样本的检测取得良好的结果。1.通过1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）偶联反应成功将精胺（SP）修饰到纳米金刚石（NDs）上。通过比较修饰后100 nm和5 nm两种纳米金刚石,发现5 nm的纳米金刚石具有更大的比表面积,修饰效果较好。SP-NDs由于表面覆有大量精胺,精胺在酸性条件显现多胺的特性可带正电,可以通过静电有效地吸引带负电荷的DNA磷酸骨架,研究发现SP-NDs对寡核苷酸具有优异的吸附效果（184 mg/g）,研究还发现SP-NDs不仅可以在稀溶液中提取和富集寡核苷酸,而且可以从复杂基体中,如十二烷基苯磺酸钠和尿素溶液中提取寡核苷酸,是寡核苷酸的优异固体吸附剂。2.聚合酶链式反应（PCR）产物直接用MALDITOF MS检测受限于两个方面,一是寡核苷酸的分子量太大MALDI检测不到,二是PCR缓冲溶液中含有酶和盐,抑制寡核苷酸的电离,需要复杂的除盐纯化过程。针对第一个问题,我们采用巢式PCR扩增嵌入内切酶位点,通过限制性内切酶酶切成短的寡核苷酸片段,每种HPV型别可酶切出六种不同小分子量的DNA片段,这不但能让MALDI检测到而且对检测结果的分析判断增加了可靠性。针对第二个问题,我们采用第一章合成的纳米材料SP-NDs提取酶切的HPV六种小分子量DNA片段,我们研究发现,SP-NDs不仅可以直接从PCR酶切产物中提取寡核苷酸,还可以从聚合酶链式反应-限制性片段质量多态性（PCR-RFMP）的酶消化产物中选择性地提取HPV特异性DNA片段,提取后的基因片段用MALDI TOF MS检测可区别HPV的型别,该方法成功地应用于临床样品分析并取得了良好的结果。SP-NDs作为固相吸附剂,用于MALDI分析前提取纯化寡核苷酸,替代电泳或液相色谱的纯化方法,避免了传统的纯化步骤,简化了分析过程且提高了灵敏度。基于PCR-RFMP方法,用SP-NDs富集、提取和分离寡核苷酸后,MALDI MS还能够分析DNA甲基化、单核苷酸多态性和其他病毒分型。3.基于金纳米颗粒（AuNPs）上的HPV16 L1核酸适配体（APTHPV16 L1）和质量标签（三聚氰胺）之间的非共价竞争吸附,建立了激光解吸电离质谱（LDI MS）检测HPV16 L1蛋白的新方法。在我们的设计中,APTHPV16 L1与三聚氰胺竞争占据AuNPs表面的非共价作用位点,当APTHPV16 L1存在时,会优先占据AuNPs表面的非共价作用位点,检测不到AuNPs表面存在三聚氰胺。随着HPV16 L1蛋白的加入,HPV16 L1蛋白与APTHPV16 L1之间存在特异性更强的相互作用,导致APTHPV16 L1从AuNPs的表面脱落,暴露出的反应位点被三聚氰胺所占据,经离心洗涤后采用LDI-TOF MS直接检测三聚氰胺信号,AuNPs表面三聚氰胺的质谱信号强弱反映了HPV16 L1蛋白含量的多少。采用内标法定量,HPV16 L1蛋白在2～80 ng/mL的范围内成线性关系,相关系数0.998,检出限（LOD=3SD空白/斜率）为58.8 pg/mL,该方法成功用于检测临床和疫苗样本中HPV16 L1蛋白,具有高灵敏度、高通量的优点,有望应用于宫颈癌的早期临床诊断和预后情况的判断。4.在高盐条件下氧化石墨烯（GO）吸附核酸适配体增强了 GO胶体溶液的稳定性,当溶液中加入目标物HPV16 L1蛋白后,核酸适配体与目标物特异性结合并从GO表面脱离,暴露的GO在高盐下聚集,导致230 nm处溶液吸光度发生变化。我们发现,吸光度与HPV16 L1蛋白浓度的对数成线性关系,以此建立了紫外吸光光度法定量检测HPV16 L1蛋白的方法。本方法耗时短,灵敏度高,试剂消耗少,具有较好特异性,方法回收率在87%～102%,检出限可达2 pg/mL,仅用简单的紫外分光光度计即可检测HPV16 L1蛋白浓度,其对临床样本的检测结果与用酶联免疫吸附测定（ELISA）以及第四章所述方法的检测结果完全一致。该研究的创新点是不用荧光标记的核酸适体,从而避免了荧光的漂白。我们根据GO本身的光学性质开发的灵敏、简单、快速、低成本的分析HPV16 L1蛋白方法,具有替代常规检测HPV16 L1蛋白方法的应用前景。
华春婷,孙思源,程浩,韩睿[6]（2019）在《基于人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的疫苗研究进展》文中提出人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）主要衣壳蛋白由晚期基因（late gene 1,L1）表达,可以自发组装成病毒样颗粒（virus like particle,VLP）且具有良好免疫原性而被用于HPV免疫致病机制及HPV疫苗的研究。然而,现有以L1为基础的疫苗存在一定局限性,如L1蛋白表达量低、纯化过程复杂使得疫苗产量较低；L1蛋白中和抗体为HPV型特异而不同型HPV的交叉保护率很低；此外,对已有的HPV感染清除作用不确定且不具有治疗HPV相关疾病的作用。本文将对HPV L1的结构、免疫原性与在免疫应答中的作用、包括L1为基础的HPV疫苗的发展现状与最新进展进行综述。
姚巧缤[7]（2019）在《人乳头瘤病毒16型的衣壳蛋白L2的颗粒组装和截短表达纯化及性质鉴定》文中指出人乳头瘤病毒（Human Papillomaviruses,HPV）属于乳头瘤病毒科、乳头瘤病毒属,是一类具有蛋白衣壳的双链DNA病毒。HPV病毒可分为200多个亚型,高危型HPV的感染将大大增加女性罹患宫颈癌的概率。宫颈癌号称女性第二大杀手,仅次于乳腺癌对女性的杀伤力。另外,HPV的感染也可能导致生殖器癌、口腔癌、咽喉癌,及生殖器疣等疾病的产生。L1蛋白HPV病毒上的主要衣壳蛋白,占HPV衣壳蛋白总比例的80%至90%,能自组装成类病毒颗粒,具有良好的免疫原性。现上市的HPV疫苗均以L1的类病毒颗粒为基础研制。但L1蛋白具有较强的型别特异性,对研发广谱的HPV疫苗造成了一定的困难。L2蛋白是HPV病毒上的次要衣壳蛋白,与病毒感染、入核、以及成熟后组装等过程有关。L2蛋白上含有HPV的广谱综合表位,且型别特异性较小,具有诱导机体产生交叉综合抗体、提供交叉保护的潜能。因此,解析L2蛋白的结构对更深入地研究HPV的感染机制以及研发HPV的广谱疫苗具有重要的意义。为了研究L2的结构与功能,本研究首先开展了在杆状系统中表达L1与L2相互作用的VLPs的工作。分别通过共感染与共表达路径进行表达,此时的L1与L2蛋白上均不含相互作用位点。经鉴定,两条路径表达的VLPs均由L1蛋白组成,未鉴定到L2蛋白的存在。通过细胞沉淀中的包涵体鉴定发现,L2蛋白存在于包涵体中。由此能够推论:L1、L2蛋白在昆虫细胞中同时表达后,未能有效相互作用。后续本研究在L1与L2上分别引入了半胱氨酸点突变,期望两个半胱氨酸位点能形成二硫键,增强相互作用。随后将蛋白L1-Q317C与L2-E338C同时表达,结果显示,在共感染路径表达的VLPs中,可检测到L2蛋白,但含量极少。本研究继续通过HPLC比较了不同VLPs的出峰时间并推论出,发现颗粒中L2的含量虽少,却能增大VLPs的直径。相互作用位点的引入是具有一定的效果。免疫原性评价的结果显示,此VLPs的免疫未能诱发小鼠体内产生高滴度的L2中和抗体。这可能与L2在HPV大部分的生命周期中均存在于五聚体内部、极少暴露中和位点有关。由于上述获得的VLPs并不均一,不利于冷冻电镜结构解析,本研究进行了L1与L2蛋白相互作用的五聚体的表达工作。经SDS-PAGE/WB/HPLC/TEM鉴定后,确认可在杆状系统中表达经175位与428位双点突变的16L1蛋白,且此蛋白具有自组装形成HPV-L1五聚体的能力。除了L2-E338C,我们根据本实验室其他课题方向的研究结果,在L2蛋白上引入了新的突变位点——T421C,以期能更好地加强L1与L2蛋白的相互作用。但从鉴定结果发现,旧相互作用位点与新相互作用位点的作用效果均不明显,共表达L1与L2形成的五聚体中不含L2蛋白。第三部分,本研究通过截短表达L2部分功能域蛋白。第一轮截短后,本研究首先通过Co柱对截短的L2蛋白进行了纯化。鉴定结果显示,洗脱样品中杂蛋白含量太高,难以用于结构解析及疫苗生产。本研究继续尝试第二轮的L2蛋白的截短,使用不同的载体和截短长度,最后用Co柱对其中六个截短蛋白进行了纯化。鉴定结果显示,L2-140-340蛋白具有最佳的纯化效果,洗脱样品中杂蛋白较少,L2含量很高,纯度较高,可能以三聚体或单体的形式存在。后续将继续研究该截短L2蛋白的生物性质和活性,获得均一的L2蛋白用于结晶和结构解析。
霍宇娟[8]（2019）在《HPV二价疫苗经鼻腔黏膜免疫的免疫学效果评估》文中指出目的经鼻腔黏膜免疫途径给予小鼠二价人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）疫苗,通过与皮下疫苗组比较,来评估鼻黏膜免疫途径的免疫效果。方法选用45只6-8周龄雌性BALB/c小鼠（18-20g）,随机分成3组,分别为鼻腔生理盐水对照组（A）、鼻腔疫苗实验组（B）、皮下疫苗实验组（C）。分别于0周,2周,4周对以上三组小鼠进行免疫,第六周处死小鼠并通过眼球取血的方式收集血清样本,ELISA法检测血清中特异性抗体Ig G含量;然后,无菌取脾制备脾细胞悬液,分离脾淋巴细胞进行培养,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的特异性增殖情况。最后,通过ELISA法分别检测HPV16 L1蛋白、HPV18 L1蛋白、HPV16/18 L1蛋白刺激后小鼠脾淋巴细胞培养上清中细胞因子IFN-γ、IL-4的释放。另外,收集肺灌洗液,鼻灌洗液以及阴道灌洗液,用ELISA法检测灌洗液中特异性s Ig A抗体的含量。结果ELISA法结果显示,用二价HPV疫苗滴鼻免疫BALB/c小鼠,三次免疫后,可有效诱导和增强黏膜免疫应答,小鼠鼻灌洗液中针对HPV16 L1蛋白、HPV18 L1蛋白的特异性s Ig A抗体明显增加,鼻腔疫苗组与对照组、皮下疫苗组相比差异均有统计学意义（P<0.05）;小鼠肺灌洗液中针对HPV16 L1蛋白的特异性s Ig A抗体明显增加,鼻腔疫苗组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）,鼻腔疫苗组与皮下疫苗组相比差异有统计学意义（P<0.05）。小鼠肺灌洗液中针对HPV18 L1蛋白的特异性s Ig A抗体明显增加,鼻腔疫苗组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.01）,鼻腔疫苗组与皮下疫苗组相比差异有统计学意义（P<0.001）;小鼠阴道灌洗液中针对HPV16 L1蛋白的特异性s Ig A抗体明显增加,鼻腔疫苗组与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）,小鼠阴道灌洗液中针对HPV18 L1蛋白的特异性s Ig A抗体明显增加,鼻腔疫苗组与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.01）。与鼻腔生理盐水组相比,鼻腔疫苗组小鼠血清中针对HPV16 L1蛋白的特异性Ig G抗体明显增加,且差异有统计学差异（P<0.05）,鼻腔疫苗组小鼠血清中针对HPV18 L1蛋白的特异性Ig G抗体明显增加,且差异有统计学差异（P<0.01）。MTT法显示,经HPV16 L1蛋白、HPV18 L1蛋白、HPV16/18 L1蛋白刺激后鼻腔疫苗组、皮下疫苗组的刺激指数明显增加,脾淋巴细胞增殖水平大大提高。经HPV16 L1蛋白、HPV18 L1蛋白、HPV16/18 L1蛋白共刺激后,鼻腔疫苗组、皮下疫苗组的脾细胞培养上清中IFN-γ释放均显着增加。结论二价HPV疫苗对小鼠进行鼻腔黏膜免疫后可以在血清中产生特异性Ig G抗体,有效诱导体液免疫应答。此外,还可以诱导鼻,肺,阴道等处的局部黏膜免疫应答,并产生特异性黏膜抗体s Ig A。因此鼻黏膜免疫途径可以在不久的将来可作为黏膜疫苗的接种方式之一。
杨与柔[9]（2019）在《人乳头瘤病毒39/68/70型交叉疫苗研究》文中指出持续感染高危型的人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus,HPV）能引发黏膜组织上皮恶性病变,是引起女性宫颈癌的主要诱因。流行病学调查研究显示,宫颈癌已成为危害女性健康的第四大癌症。在中国乃至全球范围内,宫颈癌病例均呈现逐年上升态势。HPV的结构蛋白包括主要结构蛋白L1和次要结构蛋白L2。L1蛋白可在体外表达并在一定的环境中组装成类病毒颗粒（virus like particles,VLPs）,其表面保留了与天然HPV病毒颗粒相似的结构。目前已上市的HPV预防性疫苗均基于VLPs形式研发,其能诱导机体产生中和抗体,有效抵抗HPV感染。由于HPV疫苗具有严格的型特异性,其免疫后难以产生高滴度的型交叉中和抗体。目前,默克公司生产的HPV九价疫苗只能预防7种高危型HPV感染,保护率为90%。而HPV型别众多,能引发恶性肿瘤的至少有15种。为了预防更多型别HPV的感染,需要在现有疫苗基础上引入更多型别的VLPs,但是,这会导致疫苗生产成本激增、生产工艺更加复杂以及带来疫苗安全隐患等问题。因此,使用较少型别的VLPs预防更多型别的HPV感染（“一防多”）是下一代HPV预防性疫苗研究的方向。基于上述问题,本研究分析HPV L1蛋白亲缘关系,采用近缘间HPV L1表位移植策略构建嵌合型HPV L1 VLPs,对其进行全面的性质鉴定及免疫评价工作,筛选能诱导高滴度交叉中和抗体的候选疫苗分子,探索嵌合VLPs疫苗实现“一防多”的可行性。根据IARC（International Agency for Research on Cancer）致癌性分类,HPV39、HPV68、HPV70分别属于1类致癌物、2A类致癌物和2B类致癌物。流行病学统计表明,有3%的宫颈癌病例是由HPV39、HPV68和HPV70这三个型别的感染引起的。在我国,HPV39、HPV68的感染率为3-5%,HPV70的感染率为1%左右。因此,为了扩大疫苗保护范围,本研究以亲缘关系较近的HPV39、HPV68、HPV70三个高危型别为研究对象构建型交叉疫苗候选分子。首先,构建HPV39、HPV68和HPV70三个型别VLPs和假病毒,并对HPV39、HPV68和HPV70 VLPs进行理化性质和免疫原性检测,结果显示其VLPs形态规则,为T=7的二十面体结构;免疫原性分析结果显示三个型别VLPs均能诱导高滴度的中和抗体,具有良好的免疫原性。进一步,将HPV39、HPV68和HPV70中亲缘关系较近的HPV39和HPV68两型作为骨架构建HPV39/68和HPV68/39嵌合分子并表达纯化,利用SDS-PAGE、TEM、HPLC和AUC等方法进行理化性质检测并免疫小鼠,免疫血清中和检测显示两型嵌合蛋白中H39-68FG VLPs和H68-39BC VLPs诱导产生针对HPV39和HPV68的中和抗体滴度与野生型相当。再以H39-68FG VLPs和H68-39BC VLPs为骨架,构建HPV39/68/70三型嵌合蛋白,使用相同的方法进行理化性质分析并免疫小鼠,并结合ED5o检测方法筛选出H39-68FG-70DE VLPs和H39-68FG-70HIVLPs两个能诱导高滴度三型交叉中和抗体的嵌合蛋白,其具有良好的热稳定性,可作为候选分子在后续疫苗研制中进一步评价。其次,利用HPV68 VLPs和HPV70 VLPs筛选的单克隆抗体对H39-68FG-70DE VLPs和H39-68FG-70HI VLPs进行表位分析。将HPV68和HPV70的型特异单抗与H39-68FG-70DE VLPs和H39-68FG-70HI VLPs进行ELISA检测,其中HPV68单抗9F4和HPV70单抗12B1 1与H39-68FG-70HI VLPs候选分子具有较高的结合活性,与野生型VLPs结果相当。这表明通过表面环区同源替换的方法能成功将HPV68和HPV70的表位移植至HPV39 L1 VLPs中,后续可进一步解析H39-68FG-70HI VLPs与9F4 Fab和12B11 Fab的免疫复合物结构,阐述其表位信息。综上,本研究通过HPV L1近缘表位替换构建了HPV39/68/70三型嵌合疫苗分子并在大肠杆菌中成功表达,其纯度高、颗粒形态规则且均一性好,利用小鼠免疫评价实验筛选出具有理想交叉保护效果的候选疫苗分子,实现了一种VLPs预防三种高危型别HPV的效果,为下一代HPV预防性疫苗研制奠定基础。
李智海[10]（2017）在《人乳头瘤病毒型特异性中和表位的结构与功能研究》文中研究表明高危型人乳头瘤病毒（Humanpapillomavirus,HPV）持续性感染被认为是引起黏膜组织上皮细胞病变,继而导致女性宫颈癌、阴道癌和男性阴茎癌等癌症疾病发生的最主要原因。其中,宫颈癌是目前最常见的妇科恶性肿瘤之一,全球每年有超过50万女性被诊断出患有宫颈癌。在中国,每年也约有10万例宫颈癌新增病例。HPV是一种无包膜的双链DNA病毒,其病毒衣壳由主要衣壳蛋白（L1）和次要衣壳蛋白（L2）组成。在体外,72个L1五聚体可以自组装形成T=7的病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）。研究表明,HPVL1-VLPs诱导机体产生的中和抗体能够对HPV病毒感染过程中的不同环节进行干预从而有效抵御HPV病毒的感染。但是,由于目前还缺乏高分辨率的HPV中和抗体免疫复合物结构信息,难以有针对性地对抗体中和表位展开相关功能研究,从而限制了我们从分子水平上去理解病毒的感染机制以及HPV抗体抵抗病毒感染的中和模式。HPV主要衣壳蛋白L1的表位高度使得由L1形成的VLP疫苗免疫产生的抗体具有高度型特异性,难以提供型交叉保护。而HPV的流行病学研究结果表明,能够引发恶性肿瘤发生的HPV型别多达15种。目前最新上市的HPV九价疫苗也只能提供针对7个高危型别HPV感染的保护,且该疫苗采用的是野生型HPV病毒样颗粒（VLP）,剂量已达270μg,难以进一步增加HPV型别以扩大保护范围。因此,有必要深入展开HPV型特异性特征的结构研究,找到能够打破HPV严格型特异性的关键所在,从而为新型广谱HPV疫苗的分子设计提供新的思路。针对以上科学问题,本研究从不同型别HPV单抗盘中筛选出具有代表性的型特异性中和抗体,利用结构生物学手段解析高分辨率HPV免疫复合物的空间结构,精确定位多个型特异性中和表位的位置所在,从分子水平上阐释型特异性中和抗体的中和模式。并且基于该表位信息展开病毒学功能研究,为揭示HPV基础病毒学过程以及HPV型特异性奠定理论基础。首先,我们从HPV58和HPV59型单抗盘中选择了两株具有高中和效价的型特异性抗体HPV58.A12A3和HPV59.28F10。通过分别对抗体与VLP以及五聚体抗原的ELISA反应活性进行比较,发现了抗体A12A3对于五聚体与VLPs之间存在的微弱构象差异较为敏感;而抗体28F10的抗原表位在VLPs和五聚体上未产生明显变化。另外,对抗体不同的功能分子（IgG和Fab）中和能力的检测结果发现,两个抗体的IgG中和效价均显着高于其Fab分子。通过对两种颗粒免疫复合物分子VLP:IgG和VLP:Fab进行电镜观察,发现两个抗体的IgG分子具有交联抗原颗粒的能力,解释了两个抗体IgG分子中和能力强于Fab分子的现象。其次,利用X-射线晶体学技术成功解析了 HPV58 pentamer、HPV58 pentamer:A12A3 Fab 和 HPV59 pentamer:28F10 Fab 三个样品高分辨率晶体结构,分辨率分别为:2.0A,3.5A和3.4A。结构表明抗体A12A3和28F10是两种在结合HPV模式上具有显着差异的HPV中和抗体:A12A3以一个Fab结合在抗原五聚体中央孔洞上,而28F10则为5个Fab片段结合在抗原五聚体的每个L1单体上。进一步的表位分析结果表明,两个抗体识别的抗原表位均只有6～7个氨基酸,其中A12A3抗体识别的是抗原五聚体上相邻两个L1单体上的DE loop（Q165a,D154b,R161b,Q165b,S168b和N170b）,而 28F10 与抗原的结合则完全通过 L1 单体上 FG loop 介导（M267,G268,Q270,E273,Y276,K278,D281和R283）。接着利用低温电镜技术解析了两个抗体的VLPs颗粒复合物结构,分辨率分别为9.5 A和8.4 A（FSC=0.143）,证实了两个抗体结合五聚体的方式与其结合病毒颗粒中作用方式一致。然后,基于两个复合物晶体结构中抗原抗体相互作用界面上的抗原位点,制备了多个五聚体形式和VLPs颗粒形式的定点突变体。通过ELISA结合实验以及SPR技术对两个型别各突变抗原与A12A3和28F10的反应活性分别进行了考察,结果表明HPV58L1位点R161对于抗体A12A3识别HPV58抗原具有关键作用;而HPV59L1位点E273和R283则对于HPV59抗原与抗体28F10的结合扮演重要角色。最后,我们构建HPV58和HPV59多个定点突变型假病毒,以考察了两个型特异性中和表位是否参与了病毒感染的过程。病毒感染实验结果充分说明,HPV58L1蛋白序列位点D154,S168和N170对于HPV58病毒感染细胞过程具有关键的作用;而HPV59L1蛋白的FG loop上的6个位点（E273A,Y276A,R283A,M267,Q270和K278）均能显着影响HPV59病毒感染宿主细胞的能力。进一步地,我们借助在进化关系上距离HPV58和HPV59最近的型别——HPV33和HPV18,将抗体识别的差异位点分别对应地同源置换至HPV33和HPV18L1的对应位点上（H33-K161R,H33-A168S,H33-T168N 和 H33-KAT,以及H18-T270Q,H18-Q273E,H18-G281D 和 H18-TQG）,然后在 VLPs 和假病毒水平上分别验证异型突变体与对应抗体的反应活性。结果发现,三点共突变后均能够较大程度地提高与A12A3或者28F10的抗体结合活性。因此,我们认为,这几个位点对于其型特异性确立起到了十分关键的作用。综上所述,本研究利用结构生物学技术、生物化学、分子及细胞生物学手段,从空间结构上对HPV型特异性中和表位进行了研究,阐释了 HPV型特异性抗体中和病毒感染的分子机制。同时,基于对表位信息的功能研究,证实了两株抗体的中和表位参与了病毒的感染过程以及进化过程中型特异性的产生,从而为实现型交叉保护的HPV疫苗分子设计以及以抗病毒中和位点为靶标的治疗药物研发奠定了理论基础。
二、利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比（论文提纲范文）
（1）人乳头瘤病毒31亚型L1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的淘选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 HPV的研究进展 |
| 1.1.1 HPV的分类 |
| 1.1.2 HPV的流行病学 |
| 1.1.3 HPV的基因组结构及功能 |
| 1.1.4 HPV的感染及致病机理 |
| 1.1.5 HPV的检测方法 |
| 1.2 HPV疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 HPV预防性疫苗 |
| 1.2.2 HPV治疗性疫苗 |
| 1.3 HPVL1蛋白单克隆抗体的研究及应用 |
| 1.4 抗原表位的研究方法及HPVL1蛋白表位的研究进展 |
| 1.4.1 抗原表位的研究方法 |
| 1.4.2 HPVL1蛋白表位的研究进展 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 2 HPV31重组L1蛋白原核表达及纯化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 主要试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SUMO-31L1蛋白的表达 |
| 2.2.2 SDS-PAGE及 Western-blot初步鉴定SUMO-31 L1 蛋白的表达 |
| 2.2.3 SUMO-31L1蛋白表达条件的优化 |
| 2.2.4 SUMO-31L1蛋白的纯化 |
| 2.2.5 SDS-PAGE及 Western-blot鉴定纯化后的SUMO-31 L1 蛋白 |
| 2.2.6 SUMO-31L1蛋白的血凝实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 SUMO-31L1蛋白表达的初步鉴定 |
| 2.3.2 IPTG浓度对SUMO-31 L1 蛋白表达的影响 |
| 2.3.3 表达时间对SUMO-31L1蛋白表达的影响 |
| 2.3.4 不同诱导温度对SUMO-31L1蛋白表达的影响 |
| 2.3.5 SDS-PAGE及 Western-blot鉴定纯化后的SUMO-31 L1 蛋白 |
| 2.3.6 SUMO-31L1蛋白的血凝实验 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 抗HPV31L1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞与动物 |
| 3.1.2 主要试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 动物免疫 |
| 3.2.2 免疫小鼠血清抗体效价的测定 |
| 3.2.3 饲养细胞的制备 |
| 3.2.4 小鼠骨髓瘤细胞的制备 |
| 3.2.5 小鼠脾细胞的制备 |
| 3.2.6 细胞融合 |
| 3.2.7 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞株的亚克隆 |
| 3.2.9 阳性杂交瘤细胞株的冻存及复苏 |
| 3.2.10 抗HPV31L1蛋白单克隆抗体腹水的制备 |
| 3.2.11 单克隆抗体的纯化 |
| 3.2.12 单克隆抗体浓度与纯度的测定 |
| 3.2.13 单克隆抗体效价的测定 |
| 3.2.14 单克隆抗体亲和力的测定 |
| 3.2.15 单克隆抗体的交叉反应性的鉴定 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 免疫小鼠血清抗体效价的测定 |
| 3.3.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.3.3 单克隆抗体浓度与纯度的测定 |
| 3.3.4 单克隆抗体效价的测定 |
| 3.3.5 单克隆抗体亲和力的测定 |
| 3.3.6 单克隆抗体的交叉反应性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 HPV31L1蛋白模拟表位的淘选 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要试剂及耗材 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂及培养基的配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 第一轮亲和淘选 |
| 4.2.2 第一轮淘选噬菌体的扩增及纯化 |
| 4.2.3 洗脱产物及扩增产物的滴度测定 |
| 4.2.4 第二、三轮噬菌体的亲和淘选 |
| 4.2.5 噬菌斑的扩增及纯化 |
| 4.2.6 间接ELISA筛选阳性噬菌体株 |
| 4.2.7 阳性噬菌体株测序 |
| 4.2.8 序列分析 |
| 4.2.9 间接竞争ELISA鉴定噬菌体株 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 噬菌体的富集 |
| 4.3.2 间接ELISA筛选阳性噬菌体株 |
| 4.3.3 阳性噬菌体株的DNA测序及分析 |
| 4.3.4 间接竞争ELISA鉴定噬菌体株 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写词汇表 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（2）人乳头瘤病毒45亚型L1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 HPV研究进展 |
| 1.1.1 HPV的发现 |
| 1.1.2 HPV的分子生物学特征及分类 |
| 1.1.3 HPV基因组结构特征 |
| 1.1.4 HPV流行病学研究 |
| 1.1.5 HPV的致病机制研究 |
| 1.2 HPV筛查及疫苗的研究进展 |
| 1.2.1 HPV的筛查 |
| 1.2.2 HPV疫苗的研究 |
| 1.3 噬菌体展示技术简介 |
| 1.4 噬菌体展示技术的应用 |
| 1.4.1 抗原表位的研究 |
| 1.4.2 新型疫苗的研究 |
| 1.5 研究的目的及意义 |
| 1.6 本研究的主要内容 |
| 2 SUMO-HPV45 L1 蛋白的表达纯化及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 主要耗材及试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 常用试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 SUMO-HPV45 L1 蛋白的初步表达及鉴定 |
| 2.2.2 SUMO-HPV45 L1 蛋白诱导表达条件的优化 |
| 2.2.3 SUMO-HPV45 L1 蛋白的纯化及鉴定 |
| 2.2.4 血凝实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 SUMO-HPV45 L1 蛋白初步表达及鉴定结果 |
| 2.3.2 L1蛋白诱导表达条件优化结果 |
| 2.3.3 L1蛋白纯化及鉴定结果 |
| 2.3.4 血凝实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 L1蛋白的表达 |
| 2.4.2 L1蛋白的纯化 |
| 2.5 小结 |
| 3 抗HPV45L1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要耗材及试剂 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.1.3 常用试剂配制 |
| 3.1.4 动物及细胞 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 免疫小鼠 |
| 3.2.2 间接ELISA法测小鼠血清效价 |
| 3.2.3 骨髓瘤细胞的培养 |
| 3.2.4 饲养细胞的制备 |
| 3.2.5 脾细胞的制备 |
| 3.2.6 细胞融合 |
| 3.2.7 杂交瘤细胞阳性孔的筛选 |
| 3.2.8 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 3.2.9 单克隆抗体的大量制备及腹水的纯化 |
| 3.3 单抗的鉴定 |
| 3.3.1 单抗浓度及纯度的测定 |
| 3.3.2 单抗效价的测定 |
| 3.3.3 单抗亲和力的测定 |
| 3.3.4 间接免疫荧光实验(IFA)鉴定单抗3C11 |
| 3.3.5 单抗交叉反应性的测定 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 阳性杂交瘤细胞株筛选及效价测定结果 |
| 3.4.2 单抗浓度及纯度测定结果 |
| 3.4.3 单抗效价测定结果 |
| 3.4.4 单抗亲和力测定结果 |
| 3.4.5 间接免疫荧光实验结果 |
| 3.4.6 单抗交叉反应性鉴定结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 影响细胞融合的因素 |
| 3.5.2 筛选阳性杂交瘤细胞株 |
| 3.5.3 单抗的制备 |
| 3.6 小结 |
| 4 HPV45L1蛋白抗原表位的筛选 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要耗材及试剂 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 常用试剂配置 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 第一轮淘选噬菌体 |
| 4.2.2 第一轮淘选噬菌体的扩增与纯化 |
| 4.2.3 洗脱产物与扩增产物的滴度测定 |
| 4.2.4 第二、三轮生物淘选 |
| 4.2.5 噬菌斑的扩增与纯化 |
| 4.2.6 间接ELISA鉴定噬菌体克隆 |
| 4.2.7 对阳性噬菌体克隆进行测序 |
| 4.2.8 多肽的合成及抗原表位的鉴定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 三轮噬菌体淘选结果 |
| 4.3.2 间接ELISA鉴定阳性克隆结果 |
| 4.3.3 阳性噬菌体克隆测序结果 |
| 4.3.4 抗原表位的鉴定结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 去污剂、靶分子的浓度及淘选轮数 |
| 4.4.2 L1蛋白表位的序列分析 |
| 4.5 小结 |
| 5 实验结论 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩写词汇表 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（3）HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章:前言 |
| 1.1 人乳头瘤病毒简介 |
| 1.1.1 人乳头瘤病毒的结构 |
| 1.1.2 人乳头瘤病毒的分类与型别 |
| 1.1.3 人乳头瘤病毒流行病学 |
| 1.1.4 人乳头瘤病毒预防性疫苗研究进展及接种情况 |
| 1.2 分子伴侣 |
| 1.3 佐剂 |
| 1.4 人乳头瘤病毒血清学检测方法研究 |
| 1.4.1 酶联免疫吸附试验 |
| 1.4.2 竞争性Luminex免疫试验 |
| 1.4.3 基于HPV假病毒的体外中和试验 |
| 1.5 本课题的研究意义及实验设计 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 实验思路与设计 |
| 第二章:HPV6 L1 蛋白可溶性表达条件优化及佐剂筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 构建原核表达质粒p ET30a(+)-6L1 |
| 2.2.2 HPV6 L1 蛋白可溶性表达条件的优化、纯化及结构表征 |
| 2.2.3 HPV6 L1 蛋白与不同铝佐剂吸附率的测定 |
| 2.2.4 免疫方案 |
| 2.2.5 免疫原性评价 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 原核表达质粒p ET30a(+)-6L1 的构建、鉴定 |
| 2.3.2 HPV6 L1 蛋白可溶性表达条件的优化 |
| 2.3.3 HPV6 L1 蛋白结构表征 |
| 2.3.4 HPV6 L1 蛋白与不同铝佐剂吸附率的测定 |
| 2.3.5 免疫原性评价 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章:三色混合荧光假病毒中和抗体检测方法的初步建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 相关引物设计 |
| 3.1.2 质粒、菌株、细胞、蛋白 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 主要溶液的配制 |
| 3.1.6 实验动物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 免疫血清制备 |
| 3.2.2 报告质粒的构建、鉴定及扩增 |
| 3.2.3 假病毒的制备、滴度测定 |
| 3.2.4 中和抗体检测方法的初步建立 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 报告质粒的构建、鉴定 |
| 3.3.2 假病毒的滴度测定 |
| 3.3.3 靶细胞的选择 |
| 3.3.4 单色荧光、三色混合荧光假病毒接种量的选择及重复性测定 |
| 3.3.5 三色混合荧光假病毒中和抗体检测方法的评价 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备、表征及其诊断应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 基于人乳头瘤病毒的免疫诊断和免疫疗法用于HPV诱发癌症的研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 基于HPV的免疫诊断 |
| 1.2.1 检测肿瘤组织和细胞中的HPV蛋白抗原 |
| 1.2.2 检测患者唾液或阴道冲洗液中的抗HPV蛋白抗体 |
| 1.2.3 检测患者血清中抗HPV抗体 |
| 1.3 基于HPV的免疫治疗 |
| 1.3.1 用于治疗的天然抗HPV蛋白单克隆抗体 |
| 1.3.2 用于治疗的基于HPV蛋白mAb的放射免疫疗法 |
| 1.3.3 用于治疗的亲和毒素 |
| 1.3.4 用于治疗的HPV细胞内单链抗体(scFvs) |
| 1.3.5 用于治疗的HPV纳米抗体 |
| 1.3.6 治疗性疫苗接种 |
| 1.4 结论和展望 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景及目的意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.2.1 HPV16E7蛋白的制备 |
| 2.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备 |
| 2.2.3 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征 |
| 2.2.4 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用 |
| 2.2.5 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在常规双抗夹心ELISA中定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用 |
| 2.2.6 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在化学发光免疫分析方法中定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用 |
| 2.3 技术总路线 |
| 第3章 HPV16 E7 基因的克隆、表达及HPV16 E7 蛋白的纯化 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 重组质粒p ET-28a(+)-HPV16 E7 的构建 |
| 3.2.2 HPV16E7蛋白的诱导表达 |
| 3.2.3 HPV16E7蛋白的表达形式和镍柱纯化 |
| 3.2.4 HPV16 E7 蛋白的DEAE柱纯化及其二级结构的测定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 HPV16E7基因的克隆、鉴定 |
| 3.3.2 HPV16E7蛋白的表达和纯化 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备和纯化 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立 |
| 4.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的制备、收集和保存 |
| 4.2.3 二步法纯化Ig G2a亚型的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体单抗69E2 |
| 4.2.4 二步法-辛酸-硫酸铵沉淀加Protein A的方案纯化Ig M亚型单抗69A6 |
| 4.2.5 四步法-硫酸铵沉淀+凝胶过滤层析+IgM柱+凝胶过滤层析的方案纯化Ig M亚型单抗79A11 |
| 4.2.6 间接ELISA测定纯化后的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的效价 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立 |
| 4.3.2 阳性克隆杂交瘤细胞株的筛选方法的建立 |
| 4.3.3 饲养层细胞的制备 |
| 4.3.4 细胞融合 |
| 4.3.5 杂交瘤细胞株的HAT选择性培养 |
| 4.3.6 阳性克隆的筛选 |
| 4.3.7 克隆化 |
| 4.3.8 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的制备 |
| 4.3.9 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的保存 |
| 4.3.10 Ig G2a和 Ig M亚型的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的纯化 |
| 4.3.11 ELISA检测纯化后的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的效价 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 8株HPV16E7蛋白单克隆抗体的配对 |
| 5.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的亚型和氨基酸序列测定 |
| 5.2.3 2株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11和69E2 的亲和力测定 |
| 5.2.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的表位鉴定 |
| 5.2.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的特异性表位的保守性分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 8株HPV16E7蛋白单克隆抗体的配对 |
| 5.3.2 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的核苷酸序列的测定和氨基酸序列的预测 |
| 5.3.3 2株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11和69E2 的亲和力测定 |
| 5.3.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的表位比较 |
| 5.3.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2、69A6 的特异性表位的保守性分析 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 HPV16 E7 蛋白单抗在免疫组化、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 8株HPV16 E7 单克隆抗体与HIS-c-Myc蛋白的Western Blot反应 |
| 6.2.2 8株HPV16E7单克隆抗体在免疫细胞化学中的诊断应用 |
| 6.2.3 3株HPV16 E7 单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫组织化学中的诊断应用 |
| 6.2.4 3株HPV16 E7 单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在间接免疫荧光中的诊断应用 |
| 6.2.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6与Ca Ski和HeLa细胞的总蛋白的Western Blot反应 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 8株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体与HIS-c-Myc蛋白的Weastern Blot反应 |
| 6.3.2 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫细胞化学中的诊断应用 |
| 6.3.3 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫组织化学中的诊断应用 |
| 6.3.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在间接免疫荧光中的诊断应用 |
| 6.3.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6在Western Blot中的诊断应用 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 定量检测HPV16 E7 蛋白的常规双抗夹心ELISA法的建立 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 间接ELISA检测捕获抗体79A11 和检测抗体69E2 的效价 |
| 7.2.2 直接ELISA检测偶联物HRP-69E2 的抗体效价 |
| 7.2.3 封闭条件的优化 |
| 7.2.4 双抗夹心ELISA的棋盘实验 |
| 7.2.5 抗原HPV16E7蛋白与捕获抗体79A11反应时间的优化 |
| 7.2.6 抗原HPV16 E7 蛋白在ng~μg级以3 倍稀释法稀释时的线性关系 |
| 7.2.7 抗原HPV16 E7 蛋白在ng级以等比等差法稀释时的线性关系和定量限 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 单抗在化学发光免疫分析方法中定量检测HPV16E7蛋白的诊断应用 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 间接ELISA测定单抗79A11和69E2 的抗体效价 |
| 8.2.2 直接ELISA测定检测抗体偶联物Biotin-69E2 的抗体效价 |
| 8.2.3 化学发光免疫分析方法的原理 |
| 8.2.4 捕获抗体79A11 和检测抗体Biotin-69E2 的最适工作浓度优化 |
| 8.2.5 抗原HPV16E7蛋白与捕获抗体反应的时间优化 |
| 8.2.6 封闭条件的优化 |
| 8.2.7 抗原HPV16 E7 蛋白在ng级以等比等差法稀释 |
| 8.2.8 抗原HPV16 E7 蛋白在μg级以等比等差法稀释 |
| 8.2.9 抗原在ng~μg级以3倍法稀释 |
| 8.2.10 制备参考曲线和检测临床标本 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第9章 全文总结 |
| 9.1 HPV16E7蛋白的制备 |
| 9.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备 |
| 9.3 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征 |
| 9.4 3株单抗79A11、69E2和69A6 定性检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用 |
| 9.5 2株单抗79A11和69E2 定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用 |
| 论文创新点 |
| 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表文章及课题参研情况 |
| 致谢 |
（5）基于纳米材料质谱法对人乳头瘤状病毒分型及检测方法研究（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 人乳头瘤状病毒(HPV)概述 |
| 1.1.1 人乳头瘤状病毒（HPV)结构 |
| 1.1.2 人乳头瘤状病毒（HPV)基因组与功能 |
| 1.1.3 HPV病毒分型 |
| 1.1.4 HPV与肿瘤的关系 |
| 1.1.5 HPV的致病机理 |
| 1.1.6 HPV病毒载量与宫颈癌的关系 |
| 1.1.7 HPV分型检测的意义 |
| 1.1.8 HPV L1蛋白检测的意义 |
| 1.1.9 HPV分型联合HPV L1蛋白检测的意义 |
| 1.1.10 HPV检测方法 |
| 1.1.10.1 细胞学检查 |
| 1.1.10.2 杂交捕获二代分析（HC2) |
| 1.1.10.3 基于聚合酶链式反应(PCR)的检测方法 |
| 1.1.10.4 基因芯片技术 |
| 1.2 基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI TOF MS) |
| 1.2.1 MALDI TOF MS基本原理 |
| 1.2.2 MALDI电离机理 |
| 1.2.3 MALDI TOF MS的应用 |
| 1.2.3.1 多肽与蛋白质分析 |
| 1.2.3.2 多磷酸化肽分析检测 |
| 1.2.3.3 寡核苷酸分析检测 |
| 1.2.3.4 MALDI定量分析 |
| 1.2.3.5 MALDI TOF MS对HPV检测 |
| 1.3 本论文研究的目的、意义和主要内容 |
| 1.3.1 本论文研究目的和意义 |
| 1.3.2 本论文研究内容 |
| 第二章 高效富集寡核苷酸纳米材料的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 精胺修饰纳米金刚石的制备 |
| 2.2.3 红外光谱和红外成像的表征 |
| 2.2.4 SP-NDs对寡核苷酸的吸附效果 |
| 2.2.5 SP-NDs富集稀溶液及复杂基质中的寡核苷酸 |
| 2.2.6 MADLI TOF MS分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 SP-NDs的表征 |
| 2.3.2 SP-NDs对寡核苷酸的吸附 |
| 2.3.3 MALDI TOF MS分析稀溶液寡核苷酸 |
| 2.3.4 MALDI TOF MS分析复杂基体中的寡核苷酸 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于纳米材料高效富集质谱法对HPV病毒分型研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 HPV通用引物PCR扩增 |
| 3.2.3 巢式PCR-RFLP方法 |
| 3.2.4 临床样品DNA提取 |
| 3.2.5 MALDI TOF MS检测酶切产物 |
| 3.2.6 试剂盒检测临床样本 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 HPV限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFMP) |
| 3.3.2 MALDI TOF MS对HPV分型检测 |
| 3.3.3 临床样品验证结果 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于纳米金非共价键竞争吸附质谱法定量检测HPV16 L1蛋白 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 纳米金的合成 |
| 4.2.3 纳米金表征 |
| 4.2.4 纳米金聚集盐的浓度 |
| 4.2.5 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合 |
| 4.2.5.1 溶液配制 |
| 4.2.5.2 pH值的影响 |
| 4.2.5.3 盐的影响 |
| 4.2.5.4 吸附时间 |
| 4.2.5.5 AuNPs与核酸适配体比例 |
| 4.2.5.6 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物稳定性 |
| 4.2.5.7 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物的表征 |
| 4.2.7 Mass Tag的筛选 |
| 4.2.7.1 确定Mass tag与AuNPs的亲和力 |
| 4.2.7.2 Mass Tag和HPV16 L1核酸适配体竞争吸附 |
| 4.2.8 HPV16 L1蛋白的检测 |
| 4.2.9 HPV16 L1蛋白的检测特异性 |
| 4.2.10 样本检测 |
| 4.2.10.1 标准曲线的建立 |
| 4.2.10.2 样本前处理和检测 |
| 4.2.11 方法学验证 |
| 4.2.11.1 方法重现性 |
| 4.2.11.2 方法回收率 |
| 4.2.12 酶联免疫(ELISA)试剂盒检测样本 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 纳米金的表征 |
| 4.3.2 纳米金聚集盐的浓度 |
| 4.3.3 AuNPs吸附Aptamer条件 |
| 4.3.3.1 pH的影响 |
| 4.3.3.2 盐的影响 |
| 4.3.3.3 吸附时间的影响 |
| 4.3.3.4 AuNPs与核酸适配体比例 |
| 4.3.3.5 AuNPs-APT_(HPV16 L1)稳定性研究 |
| 4.3.4 HPV16 L1核酸适配体与AuNPs结合物的表征 |
| 4.3.5 质量标签(Tag)的筛选 |
| 4.3.6 MALDI TOF MS条件 |
| 4.3.6.1 检测模式 |
| 4.3.6.2 基质的选择 |
| 4.3.7 HPV16 L1蛋白的检测 |
| 4.3.8 方法分析表现 |
| 4.3.9 实际样品的定量分析 |
| 4.3.10 ELISA实验验证 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 基于氧化石墨烯和核酸适配体竞争吸附检测HPV 16 L1蛋白 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与仪器 |
| 5.2.2 离心时间 |
| 5.2.3 氯化钠浓度 |
| 5.2.4 HPV16 L1核酸适配体浓度 |
| 5.2.5 HPV16 L1蛋白检测 |
| 5.2.6 临床样本检测 |
| 5.2.7 特异性实验 |
| 5.2.8 基于核酸适配体与GO检测体系Zeta电势和颗粒尺寸分布研究 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 离心时间的影响 |
| 5.3.2 氯化钠浓度的影响 |
| 5.3.3 HPV16 L1核酸适配体的浓度 |
| 5.3.4 HPV 16 L1蛋白检测 |
| 5.3.5 实际临床样本检测 |
| 5.3.6 回收率 |
| 5.3.7 特异性实验 |
| 5.3.8 GO/HPV 16 L1核酸适配体检测体系颗粒尺寸的分布研究 |
| 5.3.9 HPV 16 L1核酸适配体和GO检测体系Zeta电势分布 |
| 5.3.10 与第四章所建立的方法比较 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究成果及发表的学术论文 |
| 作者和导师简介 |
| 附件 |
（7）人乳头瘤病毒16型的衣壳蛋白L2的颗粒组装和截短表达纯化及性质鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词(Abbreviations) |
| 第一章 前言 |
| 1.1 人乳头瘤病毒(HPV)概述 |
| 1.1.1 HPV流行病学 |
| 1.1.2 HPV分子生物学 |
| 1.1.3 HPV衣壳蛋白L1与L2研究进展 |
| 1.1.4 HPV的疫苗研究进展 |
| 1.2 蛋白表达系统 |
| 1.2.1 蛋白表达系统简介 |
| 1.2.2 杆状病毒中基因的表达 |
| 1.2.3 杆状病毒-昆虫细胞表达系统 |
| 1.3 本研究的意义、思路及目的 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 主要设备 |
| 2.2 所购试剂与材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 细胞株 |
| 2.2.3 质粒与转染试剂 |
| 2.2.4 培养基 |
| 2.2.5 酶及单克隆抗体 |
| 2.2.6 实验动物 |
| 2.2.7 其它试剂 |
| 2.2.8 其它材料 |
| 2.3 配置培养基及试剂 |
| 2.3.1 配置培养基 |
| 2.3.2 配置试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 分子克隆相关 |
| 2.4.2 昆虫细胞的培养 |
| 2.4.3 杆状病毒的生产 |
| 2.4.4 外源基因的表达 |
| 2.4.5 VLPs的制备 |
| 2.4.6 五聚体的制备 |
| 2.4.7 单独L2蛋白的纯化 |
| 2.4.8 性质鉴定与分析 |
| 第三章 结果部分 |
| 3.1 L1与L2相互作用的VLPs的制备 |
| 3.1.1 选用相应的载体表达L1蛋白与L2蛋白 |
| 3.1.2 表达不含L1与L2相互作用位点的VLPs |
| 3.1.3 表达含有L1与L2相互作用位点的VLPs |
| 3.1.4 第一部分小结 |
| 3.2 L1与L2相互作用的五聚体的制备 |
| 3.2.1 杆状系统表达单独HPV-16L1的五聚体 |
| 3.2.2 在HPV-16L2上引入新的相互作用位点 |
| 3.2.3 L1与L2相互作用的五聚体的纯化与验证 |
| 3.2.4 第二部分小结 |
| 3.3 L2蛋白的截短表达 |
| 3.3.1 第一轮L2蛋白的截短表达纯化 |
| 3.3.2 第二轮L2蛋白的截短表达纯化 |
| 3.3.3 第三部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 L1蛋白与L2蛋白的相互作用位点 |
| 4.2 L2蛋白的广谱中和表位 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
（8）HPV二价疫苗经鼻腔黏膜免疫的免疫学效果评估（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）人乳头瘤病毒39/68/70型交叉疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1 HPV简介 |
| 1.1 HPV基因组及编码蛋白 |
| 1.2 HPV分型 |
| 1.3 HPV感染及流行病学 |
| 2 HPV衣壳蛋白结构研究进展 |
| 2.1 HPV五聚体晶体结构研究进展 |
| 2.2 HPV VLPs冷冻电镜三维结构研究进展 |
| 3 HPV衣壳蛋白中和表位研究进展 |
| 3.1 HPV抗原表位研究方法 |
| 3.2 HPV L1表位研究进展 |
| 3.3 HPV L2表位研究进展 |
| 3.4 基于中和表位的HPV型交叉疫苗研究进展 |
| 4 HPV预防性疫苗研究进展 |
| 4.1 已上市HPV疫苗 |
| 4.2 其他HPV疫苗 |
| 4.3 现有预防性疫苗存在的问题 |
| 5 研究目的与意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 基因、菌株和质粒 |
| 1.3 单抗、实验动物和酶 |
| 1.4 细胞培养常用试剂 |
| 1.5 其他耗材和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 常见溶液及培养基的配置 |
| 2.2 分子克隆相关生物学实验方法 |
| 2.3 表达纯化和性质鉴定 |
| 2.4 细胞培养相关实验 |
| 2.5 病毒制备及相关实验方法 |
| 2.6 抗体性质相关研究方法 |
| 2.7 结构解析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分: HPV39型、HPV68型、HPV70型类病毒颗粒疫苗研制 |
| 1 HPV39型、HPV68型、HPV70型类病毒颗粒制备 |
| 1.1 HPV39型、HPV68型、HPV70型表达载体构建 |
| 1.2 HPV39型、HPV68型、HPV70型病毒样颗粒表达鉴定 |
| 1.3 HPV39型、HPV68型、HPV70型类病毒颗粒纯化与组装 |
| 2 HPV39型、HPV68型、HPV70型类病毒颗粒的性质研究 |
| 2.1 HPV39型、HPV68型、HPV70型类病毒颗粒理化性质研究 |
| 2.2 HPV39型、HPV68型、HPV70型类病毒颗粒免疫原性研究 |
| 3 第一部分小结 |
| 第二部分: HPV39/68两型型变叉疫苗研究 |
| 1 HPV39/HPV68/HPV70亲缘关系分析对比 |
| 2 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒制备 |
| 2.1 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒表达载体构建 |
| 2.2 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒表达鉴定 |
| 2.3 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒纯化与组装 |
| 3 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒的性质研究 |
| 3.1 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒理化性质研究 |
| 3.2 HPV39/68两型嵌合类病毒颗粒免疫原性研究 |
| 4 第二部分小结 |
| 第三部分: HPV39/68/70三型型交叉疫苗研究 |
| 1 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒制备 |
| 1.1 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒表达载体构建 |
| 1.2 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒表达鉴定 |
| 1.3 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒纯化与组装 |
| 2 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒的性质研究 |
| 2.1 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒理化性质研究 |
| 2.2 HPV39/68/70三型嵌合类病毒颗粒免疫原性研究 |
| 2.3 HPV39/68/70三型候选分子热稳定性评估 |
| 2.4 HPV39/68/70三型候选分子抗原性分析 |
| 3 第三部分小结 |
| 第四部分 :H39-68FG-70DE与H39-68FG-70HI三型候选交叉疫苗分子中和表位研究 |
| 1 HPV39/68/70型特异中和抗体性质研究 |
| 1.1 HPV68型、HPV70型中和抗体筛选 |
| 1.2 HPV68型、HPV70型中和抗体的性质鉴定 |
| 2 H39-68FG-70DE与H39-68FG-70HI三型候选型交叉疫苗分子表位分析 |
| 2.1 HPV68与HPV70型特异中和抗体的筛选 |
| 2.2 基于HPV39/68/70型特异中和抗体单抗盘分析三型候选型交叉疫苗分子中和表位 |
| 3 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 1 型交叉疫苗在HPV疫苗中的应用前景 |
| 2 型交叉疫苗免疫评价 |
| 3 型交叉免疫机制 |
| 4 HPV结构研究 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 在校期间科研成果 |
| 致谢 |
（10）人乳头瘤病毒型特异性中和表位的结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 1. HPV生物学与分子生物学 |
| 1.1 乳头瘤病毒科(Papillomaviridae) |
| 1.2 HPV基因组结构 |
| 1.3 HPV功能蛋白——早期蛋白 |
| 1.4 HPV结构蛋白——晚期蛋白 |
| 1.5 HPV病毒生活史 |
| 1.6 基于L1序列的基因分型 |
| 1.7 HPV病毒感染和免疫机制 |
| 1.8 HPV的流行现状与疾病 |
| 2. HPV结构生物学研究 |
| 2.1 生物大分子三维结构研究方法 |
| 2.2 HPV结构研究进展 |
| 3. HPV抗体中和表位研究 |
| 3.1 HPV中和抗体的筛选 |
| 3.2 基于生物化学实验手段鉴定的HPV中和抗体表位研究 |
| 3.3 基于结构生物学鉴定的HPV中和抗体表位研究 |
| 3.4 基于提供型特异性中和抗体保护的预防性疫苗研究现状 |
| 4. 研究的思路、目的及意义 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 实验主要仪器 |
| 1.2 实验菌株 |
| 1.3 大肠杆菌质粒 |
| 1.4 HPV58/59 L1基因 |
| 1.5 实验用酶 |
| 1.6 单克隆抗体 |
| 1.7 实验动物 |
| 1.8 图像工作站和软件 |
| 1.9 蛋白质结晶试剂盒 |
| 1.10 常见实验溶液及培养基 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 分子克隆相关实验方法 |
| 2.2 大肠杆菌系统的重组蛋白表达和纯化 |
| 2.3 利用表面等离子体共振技术测定抗原抗体的亲和力 |
| 2.4 单克隆抗体制备相关方法及动物免疫 |
| 2.5 蛋白质晶体的培养 |
| 2.6 X-射线晶体衍射 |
| 2.7 结构解析 |
| 2.8 低温电镜数据收集 |
| 2.9 低温电镜数据处理以及结构解析 |
| 结果与分析 |
| 第一部分: HPV型特异性中和抗体HPV58.A12A3及HPV59.28F10的筛选与性质鉴定 |
| 1. HPV59型中和单抗的筛选 |
| 1.1 酶联吸附实验(ELISA) |
| 1.2 基于假病毒细胞模型的中和滴度检测 |
| 1.3 构象性抗体的鉴定 |
| 2. 型特异性抗体HPV58.A12A3与HPV59.28F10的ELISA滴度鉴定 |
| 2.1 HPV58和HPV59抗原表达 |
| 2.2 不同形式的抗原与抗体ELISA结合能力检测 |
| 3. 型特异性抗体HPV58.A12A3与HPV59.28F10的中和滴度鉴定 |
| 3.1 抗体的生产与纯化 |
| 3.2 抗体可变区的基因提取和氨基酸序列分析 |
| 3.3 抗体的酶切与Fab的制备 |
| 3.4 抗体IgG与Fab的中和检测 |
| 4. 第一部分小结 |
| 第二部分: HPV58:A12A3 Fab与HPV59:28F10 Fab免疫复合物晶体结构与低温电镜结构解析 |
| 1. HPV58:A12A3 Fab与HPV59:28F10 Fab五聚体复合物的样品制备 |
| 2. HPV58 pentamer, HPV58 pentamer:A12A3与HPV59 pentamer:28F10晶体培养与结构解析 |
| 2.1 蛋白质样品结晶浓度的筛选 |
| 2.2 蛋白质样品的晶体培养与优化 |
| 2.3 蛋白质晶体X射线衍射及晶体结构解析 |
| 3. HPV58 VLP:A12A3与HPV59 VLP:28F10低温电镜照片采集、数据处理及三维结构重建 |
| 4. 基于晶体结构和低温电镜结构的抗体与不同形式抗原的结合方式比较 |
| 4.1 抗体A12A3结合五聚体与病毒衣壳的模式比较 |
| 4.2 抗体28F10结合五聚体与病毒衣壳的模式比较 |
| 4.3 基于结构信息探究IgG抗体“两价”结合同一 HPV病毒的潜在模型 |
| 5. 第二部分小结 |
| 第三部分: 基于复合物晶体结构的型特异性中和表位验证与功能分析 |
| 1. 型特异性抗体A12A3和28F10识别关键位点验证 |
| 1.1 抗体A12A3识别关键位点验证 |
| 1.2 抗体28F10识别关键位点验证 |
| 2. 抗体识别表位在病毒感染过程的功能分析 |
| 2.1 抗体A12A3识别表位在病毒感染过程的功能分析 |
| 2.2 抗体28F10识别表位在病毒感染过程的功能分析 |
| 3. 型特异性中和抗体A12A3和28F10识别表位对于基因型确立的作用分析 |
| 3.1 抗体A12A3和28F10识别中和表位的变异性分析 |
| 3.2 抗体A12A3和28F10识别表位对于基因型确立的作用分析 |
| 4. 第三部分小结 |
| 讨论 |
| 1. HPV代表性中和抗体——“表面外围”结合型抗体与“表面中心”结合型抗体的抗原结合模式与功能的差异 |
| 1.1 “表面外围”结合型抗体（top-fringe-bindingantibodies)抗原结合模式和功能分析 |
| 1.2 “表面中心”结合型抗体（top-center-binding antibodies)抗原结合模式和功能分析 |
| 2. HPV中和抗体结合诱导的病毒衣壳蛋白的构象变化 |
| 3. HPV型特异性中和表位的空间定位和功能研究 |
| 4. 高分辨率HPV病毒复合物的结构研究 |
| 5. 基于型特异性中和表位结构信息的广谱HPV疫苗分子设计——HPV结构疫苗学 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间的科研成果 |
四、利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比（论文参考文献）
- [1]人乳头瘤病毒31亚型L1蛋白单克隆抗体的制备及其模拟表位的淘选[D]. 寇亚停. 郑州大学, 2020(02)
- [2]人乳头瘤病毒45亚型L1蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的筛选[D]. 彭亚允. 郑州大学, 2020(02)
- [3]HPV6 L1蛋白原核表达条件优化及三色荧光假病毒中和抗体检测方法建立[D]. 李相梅. 吉林大学, 2020(08)
- [4]HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备、表征及其诊断应用[D]. 胡仁建. 西南大学, 2020(01)
- [5]基于纳米材料质谱法对人乳头瘤状病毒分型及检测方法研究[D]. 朱俐. 北京化工大学, 2019(01)
- [6]基于人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的疫苗研究进展[J]. 华春婷,孙思源,程浩,韩睿. 中华微生物学和免疫学杂志, 2019(10)
- [7]人乳头瘤病毒16型的衣壳蛋白L2的颗粒组装和截短表达纯化及性质鉴定[D]. 姚巧缤. 厦门大学, 2019(09)
- [8]HPV二价疫苗经鼻腔黏膜免疫的免疫学效果评估[D]. 霍宇娟. 内蒙古医科大学, 2019(03)
- [9]人乳头瘤病毒39/68/70型交叉疫苗研究[D]. 杨与柔. 厦门大学, 2019(09)
- [10]人乳头瘤病毒型特异性中和表位的结构与功能研究[D]. 李智海. 厦门大学, 2017(08)