一、当前临床流式细胞分析的发展趋势(论文文献综述)
赵倩[1](2021)在《转录因子AP-1与三阴型乳腺癌的关系及其抑制剂T5224对三阴型乳腺癌细胞的作用研究》文中提出三阴型乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer,TNBC)是缺乏雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone Receptor,PR)和人表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,HER2)表达的一类乳腺癌(Breast Cancer,BC),占全部BC患者的12–17%。与其他BC亚型相比,TNBC患者肿瘤体积更大,组织学分级更高,侵袭能力更强。然而由于其缺乏ER、PR、HER2靶向受体的表达,临床治疗以化疗为主,预后在所有BC患者中最差。本课题组的前期研究发现转录因子AP-1(Activator Protein 1)家族成员Fra-1在TNBC患者中高表达,与肿瘤的高侵袭性和患者的无远处转移生存密切相关。且沉默TNBC细胞内高表达的AP-1家族成员Fra-1或c-Jun后TNBC细胞的增殖和侵袭能力被抑制。AP-1抑制剂T5224,特异地抑制AP-1(c-Fos/cJun)与DNA的结合活性,在关节炎治疗方面进入Ⅱ期临床试验,但在BC治疗中的运用尚不明确。目的:本研究采用特异的AP-1抑制剂T5224作用于TNBC细胞,在抑制剂的角度,从生物信息层面、细胞层面和分子层面进一步明确AP-1是否是TNBC患者的治疗靶点,并明确T5224是否具有抗肿瘤作用及其可能的作用机制,为TNBC患者的治疗提供理论依据。方法:使用Kaplan-Meier plotter和UCSC数据库明确转录因子AP-1家族成员Fra-1在不同PAM50分型BC患者中的表达水平及其与BC患者生存的关系。RT-qPCR及Western-blot技术明确AP-1家族成员Fra-1和c-Jun在BC细胞系中的m RNA及蛋白水平。细胞增殖实验确定T5224对TNBC细胞的剂量反应关系以及对TNBC细胞增殖的影响。RT-qPCR及Western-blot技术明确T5224对Fra-1和c-Jun的m RNA及蛋白水平的影响。划痕实验、穿孔实验以及流式细胞术明确T5224对TNBC细胞生物学功能的影响。使用Illumina Hiseq Xten测序仪进行全基因组基因表达检测;R语言4.0.3进行差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)分析,基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,并绘制火山图、聚类热图及染色体分布图;GSEA 4.1.0进行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)。结合沉默c-Jun(课题组前期研究结果),沉默Fra-1(课题组前期研究结果)及使用T5224的全基因组数据、Kaplan-Meier plotter数据库及功能富集分析结果筛选AP-1靶基因,Ch IP-qPCR技术进行靶基因验证。细胞增殖实验、划痕实验、穿孔实验以及流式细胞术明确AP-1靶基因在TNBC细胞中的生物学功能。结果:1、Fra-1在乳腺癌中的表达水平及其与预后的关系Kaplan-Meier plotter和UCSC数据库基因表达数据显示Fra-1在Basal-like型BC患者实体瘤组织中的表达水平高于其他BC亚型,且差异具有统计学意义。Kaplan-Meier plotter数据库生存分析结果显示:在BC患者或Luminal型BC患者中,Fra-1低表达者无复发生存(Recurrence-Free Survival,RFS)时间长[BC:HR=1.24(1.03,1.50),P=0.024;Luminal:HR=1.30(1.03,1.64),P=0.028],无远处转移生存(Distance Metastasis Free Survival,DMFS)时间长[BC:HR=1.70(1.27,2.26),P<0.001;Luminal:HR=1.85(1.30,2.64),P=0.001];在HER2-阳性型BC患者中Fra-1低表达者DMFS时间长[HR:2.61(1.21,5.67);P=0.031],总生存(Overall survival,OS)时间短[HR:0.35(0.12,1.00);P=0.022]。UCSC数据库生存分析结果显示:在BC患者或Luminal型BC患者中Fra-1低表达者DMFS时间长[BC:HR=1.42(1.08,1.86),P=0.008;Luminal:HR=1.61(1.10,2.35),P=0.007]。2、T5224对三阴型乳腺癌的作用效果研究1)T5224对转录因子AP-1表达水平的影响RT-qPCR和western-blot技术证实Fra-1和c-Jun在TNBC细胞株(BT549和HS578T)中的表达水平高于非TNBC细胞株(T47D、MCF-7和LCC2)。细胞增殖实验结果显示使用15μM T5224作用BT549细胞48h后增殖抑制率为43.56%;40μM T5224作用HS578T细胞48h后增殖抑制率为48.42%。RT-qPCR和westernblot技术进一步证实在15μM T5224的作用下BT549细胞中Fra-1和c-Jun的m RNA在48h时呈下调状态、蛋白在72h时呈下调状态;40μM T5224的作用下HS578T细胞中c-Jun的m RNA在48h时呈下调状态、蛋白在72h时呈下调状态,Fra-1的m RNA和蛋白在72h时呈下调状态。2)T5224对三阴型乳腺癌细胞生物学功能的影响以15μM T5224作用BT549细胞48h、40μM T5224作用HS578T细胞48h为T5224作用剂量探究T5224对TNBC细胞生物学功能的影响。流式细胞术检测细胞凋亡结果显示BT549细胞T5224组凋亡的细胞数是对照组的1.79倍,HS578T细胞T5224组凋亡的细胞数是对照组的1.29倍,且差异具有统计学意义(P<0.01)。划痕实验结果显示TNBC细胞在划痕48h后T5224组的空白区域面积明显大于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.01)。Transwell细胞侵袭实验结果显示TNBC细胞使用T5224后穿过小室的细胞数明显比对照组少,且差异具有统计学意义(P<0.01)。3)T5224对三阴型乳腺癌细胞全基因组基因表达的影响GO富集分析显示5136个DEGs参与的生物过程主要包括血管形态发生、细胞-基质粘附、对拓扑结构有误的蛋白质的应答、I型干扰素信号通路等;涉及的细胞成分主要包括粘着斑、蛋白质类细胞外基质、细胞间粘附连接等;涉及的分子功能主要包括细胞粘附分子结合、钙粘蛋白结合、生长因子结合等。GSEA分析显示使用T5224后BT549细胞GO富集分析中蛋白质的从头折叠过程、对拓扑结构有误的蛋白质的应答过程、蛋白质折叠的分子伴侣功能增强;先天免疫反应过程、对I型干扰素的应答过程、脉管系统发育过程、细胞外基质结合能力、生长因子结合能力等减弱。KEGG通路分析显示5136个DEGs参与的通路主要包括:PI3K-Akt信号通路、人乳头瘤病毒感染、粘着斑、钙信号通路等。GSEA分析显示使用T5224后BT549细胞内KEGG信号通路中粘着斑、钙信号通路、ERBB信号通路、JAK-STAT信号通路、RIG-1样受体信号通路等减弱。3、AP-1靶基因筛选及功能验证1)AP-1靶基因的筛选Kaplan-Meier plotter数据库显示OLFML2A的表达量与c-Jun正相关,且Basallike型BC患者中OLFML2A低表达者DMFS时间长[HR:3.04(1.40,6.61);P=0.029]。Ch IP-qPCR进一步证实OLFML2A与转录因子AP-1显着富集。2)OLFML2A在三阴型乳腺癌细胞中的生物学功能细胞增殖实验显示沉默OLFML2A 5天后,沉默组光密度值明显小于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术显示在BT549细胞中沉默OLFML2A 48h后凋亡的细胞数是对照组的1.53倍,在HS578T细胞中沉默OLFML2A 48h后凋亡的细胞数是对照组的1.15倍,且差异具有统计学意义(P<0.01)。划痕实验显示划痕24h后沉默OLFML2A组的空白区域面积大于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.01)。Transwell细胞侵袭实验显示沉默OLFML2A组穿过小室的细胞数比对照组少,且差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:1、Fra-1在TNBC患者及TNBC细胞中的表达量高于非TNBC患者及非TNBC细胞;c-Jun在TNBC细胞中的表达量高于非TNBC细胞。2、在BC患者或Luminal型BC患者中Fra-1低表达者RFS时间长、DMFS时间长。3、T5224抑制c-Jun和Fra-1的m RNA及蛋白水平。4、T5224具有抗肿瘤作用,可以抑制TNBC细胞的增殖能力,且呈剂量依赖关系;并促进TNBC细胞的凋亡能力,抑制TNBC细胞的迁移和侵袭能力。5、在Basal-like型BC患者中OLFML2A低表达者DMFS时间长。6、沉默OLFML2A后TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭能力被抑制,凋亡能力被促进。7、OLFML2A是转录因子AP-1调控的靶基因,T5224通过调控AP-1/OLFML2A轴,参与TNBC细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭过程。
杨景[2](2021)在《老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究》文中研究说明季节性流感病毒(Seasonal Influenza Viruses)感染引起的患病和死亡,极其容易发生在老年人群和慢性肺部疾病患者。60岁及以上老年流感患者具有较高并发症风险,譬如脑炎、肺炎甚至恶化慢性心肺疾病相关的基础疾病。世界范围流行的季节性人流感是由A/H1N1、A/H3N2和B型流感病毒引起的。流感病毒基因组包含八个RNA片段,其中两个RNA片段编码两个包膜蛋白,分别为血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。国内目前上市的常用抗流感病毒药物如奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦,均属于神经氨酸酶抑制剂。然而,最为安全长效、公共卫生获益最大的抗病毒防御,需要各年龄人群按时接种季节性流感病毒疫苗,特别是具有高感染风险的老年人群。流感病毒疫苗的免疫原性和有效性评价采用血清学检测血凝素抑制实验(Hemagglutinin Inhibition Test,HAI),特异性抗体的评价标准低估了流感病毒疫苗在老年人群中的获益情况。老年人群接种流感病毒疫苗将流感发病率降低,同时降低了住院率、减少了并发症和死亡率。然而,季节性流感疫苗虽然每年更新和接种,疫苗保护效果不如预期。一方面,流行季循环野毒株和疫苗株的不匹配;同时,老年人群疫苗接种率低;另一方,老年人群因免疫衰老出现免疫系统对流感疫苗的免疫反应下降。目前,国家人口统计局数据显示中国在迅速老龄化,截止2020年1月,有2.5388亿名60岁及以上老年人占国家总人口数的18.1%,预计在2030年老龄人口占比将达到26%。这将使流感病毒感染在老年人中造成极其沉重的疾病负担,但可以通过接种疫苗来减轻或防控。然而,在国内老年人群流感病毒疫苗接种率远低于2010年世界卫生大会提出的75%的疫苗接种覆盖率目标,仅有4%。较多因素造成老年人群疫苗接种率较低,包括政策、个人经济水平、受教育程度和健康意识等。此外,老年人群疫苗免疫后产生的流感病毒特异性抗体水平较18~60岁的成年人低,记忆B细胞和长寿浆细胞也出现显着减少。免疫衰老(Immunosenescent),成为针对60岁及以上老年人群开发新的或更有效的流感病毒疫苗的主要挑战。免疫衰老表现出免疫功能的下降和各种传染性疾病的风险增加。因此,了解免疫衰老的老年人群免疫灭活四价季节性流感病毒裂解疫苗(QIVs)免疫机制,涉及外周血转录组、T淋巴细胞、主要细胞因子和免疫球蛋白在QIVs免疫前后动态特征,有助于发现老年人群免疫中与年龄、性别相关的变化是如何导致这种风险以及出现针对流感疫苗的弱体液免疫反应。事实上,现在人们普遍认为,疫苗接种后测定HAI滴度并不能全面反映老年人群的疫苗保护效果。此外,抗体反应弱或无的老年受试者每年接种疫苗,对流感的保护效果也出现提高,这表明细胞免疫机制可能对老年人的保护也很重要。最早的,2009年Querec等研究人员将系统生物学的方法应用于黄热病毒疫苗的机制研究中,并由此衍生出系统疫苗学的概念。鉴于传统疫苗研究基于体液免疫反应,缺乏对疫苗细胞免疫的认识。此外,QIVs疫苗免疫机制是网络化、多维度的,本研究采用系统生物学研究的方法,将从多个维度,借助高通量检测手段和计算机生物信息学分析关联传统疫苗学研究的特征指标,鉴定QIVs疫苗接种后在老年人群中建立有效免疫保护的重要生物分子和信号途径,筛选出与疫苗有效性、免疫反应性和持久性相关的枢纽基因,以期寻找疫苗有效性评价的替代生物标志物,加速疫苗临床研究进展。因机体免疫机制的复杂性,将从多个维度剖析老年人群QIVs免疫机制。本研究首先采用高通量测序RNA-Seq手段获取16名人口学和免疫特征具有显着差异老年受试者的转录组数据,随后进行整合关联分析。并采用不同生物信息学分析手段,首先通过基于生物学特征驱动(Biology-Driven)的配对比较聚类分析,老年女性和老年男性在QIVs免疫过程中因性别差异化表达基因和信号通路。随后,通过基于数据驱动(Data-Driven)的权重基因共表达网络分析(WGCNA),将差异化表达基因按表达模式聚类,并将聚类的基因集关联性状特征(受试者人口学及免疫反应特征)分析,最终鉴定出影响性状特征的关键核心基因(Hub Gene)。此外,通过荧光定量qRT-PCR验证枢纽基因的表达特征与转录组结果一致。鉴于转录组RNA-Seq仅是从RNA分子水平阐明老年人群免疫QIVs的机制,为了解细胞介导QIVs免疫的动力学特征,本研究接着采用高通量多色流式细胞术分析了人口学性状及QIVs免疫反应特征明显的17名60周岁以上老年受试者的外周血PBMC标本详细的T细胞亚群免疫表型,并将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄(Age)、性别(Sex)和疫苗相关反应原性(QIVsrelated reactogenicity)。最后,我们使用高通量多重细胞因子检测技术分析了以上老年受试者的外周血血浆样本中具有细胞免疫和体液免疫代表性的细胞因子与免疫球蛋白Ig,同样将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄(Age)、性别(Sex)和疫苗相关反应原性(QIVs-Related Reactogenicity)。确定了不同性状特征老年受试者QIVs免疫前后细胞因子网络及主要免疫球蛋白Ig的动力学特征,以期了解细胞因子在细胞免疫中发挥的作用。第一部分:通过RNA-Seq获得老年人群QIVs免疫前后转录组数据进行生物信息学分析1.性别因素对老年人群QIVs免疫效果的影响临床数据显示,流感疫苗免疫应答存在性别差异,该研究旨在鉴定出差异表达基因(DEGs)造成老年人群接种四价灭活流感疫苗出现免疫相关的性别偏倚。以60~80岁的健康成年人为对象,对接种前后的基因表达情况进行分析。受试者体液免疫水平采用血凝抑制实验检测特异性抗体滴度HAI,并分析两个性别群体差异基因表达谱与体液免疫的相关性。在老年女性中,参与I型干扰素信号通路和经典通路补体激活的DEGs在流感疫苗接种3天内出现上调。在第28天,显示老年男性偏倚模式的免疫反应与调控蛋白质加工处理以及补体活化的经典途径相关。通过生物特征驱动聚类方法确定了与老年女性和男性对QIVs接种不同反应相关的一系列DEGs。老年女性对QIVs具有更强的免疫反应,但抗体半年后出现迅速下降,而老年男性具有维持持久反应的优势。此外,我们还发现了可能导致老年人接种流感疫苗性别变异的基因。我们的研究结果强调了开发个性化季节性流感疫苗的重要性。2.枢纽基因MCEMP1和SPARC分别驱动QIVs免疫不良反应事件发生与维持有效抗体深入了解潜在的候选中心基因可能有助于产生安全有效的季节性流感免疫,以及开发针对流感病毒感染高危老年人群的个性化流感疫苗。本研究旨在通过加权基因共表达网络分析,确定与2018/19季节四价灭活流感病毒疫苗免疫诱导过程相关的潜在中枢基因。从16名老年人的63份全血样本中,共获得13345个基因,分为8个共表达模块,其中两个模块与疫苗诱导的免疫应答显着相关。功能富集分析后,利用GO条件下的疫苗相关免疫基因构建hub基因的子网络,进行hub基因的鉴定和功能验证。MCEMP1和SPARC被证实是影响QIVs诱导免疫的中心基因。在接种后7天内,MCEMP1的表达量与QIVs相关的反应性呈负相关,CXCL8/IL-8可抑制MCEMP1的表达,颗粒酶-B细胞毒介质可加剧MCEMP1的表达量。同时,SPARC的表达增加了对QIVs的免疫应答,并有助于持续的保护性体液抗体滴度。这两个基因可用于预测QIVs诱导的不良反应、免疫反应的强度以及体液抗流感抗体的持续时间。这项工作为进一步研究开发个性化的QIVs提供了线索,这些QIVs具有适当的免疫反应和对即将到来的季节性流感的持久免疫。第二部分:老年人群QIVs免疫前后T淋巴细胞分布及动力学特征衰老产生的细胞免疫损伤,表现为胸腺退化及T淋巴细胞输出减少为主的免疫系统随年龄变化特征。然而,缺乏老年人群接种QIVs前后外周血T淋巴细胞亚群的详细分布特征研究。本研究旨在确认老年人群T淋巴细胞分布特征,并比较不同性状和免疫状态分组(包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应)的T细胞亚群动力学特征差异。本研究随机筛选的60名老年受试者中,分析受试者性状涉及人口学基线特征和免疫前预存流感病毒抗体水平,其中17名受试者具有显着性状差异被选取用于鉴定老年人群外周血T淋巴细胞衰老表型的特征。通过10色高通量流式细胞术检测分析外周血T细胞亚群的详细分布特征。计算各T细胞亚群占亲本比例,并进行不同性状和免疫状态分组比较,包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应。受试者人口学特征和基线特征基本一致,血常规检测淋巴细胞数量在正常范围。按照年龄分组比较T细胞亚群分布差异,CD8+PD1-CD57-T细胞亚群在高龄组M65yrs Group中显着更高,而CD8+PD1+CD57+T细胞亚群显着低于低龄组。CD8+CD27-CD28+T细胞亚群在高龄组M65yrs Group中显着更高但频数在免后两年龄组均出现显着降低,而两年龄组中CD27+CD28+/-T细胞在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中均在QIVs免后显着增加。两年龄组中TCMs在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中均在QIVs免后显着减少,而TNs则在QIVs免后显着增加。按照性别分组比较T细胞亚群分布差异,总T(CD3+)和CD4+T细胞的比例在老年女性受试者中较老年男性高,其中CD4+在免后Day180具有显着性别差异免后Day180,CD27+CD28+T细胞比例在老年女性受试者中显着高于老年男性。在CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群中,不同性状特征和免疫反应特征的老年人群间差异较小。然而,更详细的通过耗竭表型分子(PD-1)、衰老表型分子(CD57)、共刺激分子(CD27和CD28)以及T细胞效应记忆表型分子(CD45RA和CCR7),发现QIVs免疫前后不同性状特征和免疫反应特征的老年人群间存在显着差异。第三部分:老年人群QIVs免疫反应主要细胞因子与免疫球蛋白Ig产生及动力学特征细胞因子(Cytokines)和趋化因子(Chemokines)是具有生长、分化和激活功能的冗余分泌型蛋白,调节并决定免疫反应的性质,控制免疫细胞的迁移以及免疫器官中细胞的排列。最初针对免疫损伤产生的细胞因子种类,便决定了免疫反应的发生,甚至随后的免疫反应发展结局特征是细胞毒性的、体液免疫、细胞介导的免疫还是过敏性的。因此,本研究旨在确认老年人群免疫反应相关主要细胞因子、免疫球蛋白Ig的水平特征,并比较不同性状和免疫状态分组(包括年龄、性别以及QIVs相关不良反应)的主要细胞因子、免疫球蛋白Ig动力学特征差异。在本研究中,我们使用高通量多重细胞因子检测技术,针对人口学特征及QIVs免疫反应特征明显的18名60周岁以上老年受试者的血浆样本,定量检测具有细胞免疫和体液免疫代表性的细胞因子与免疫球蛋白Ig浓度,并将这些结果进行不同性状特征分组比较,涉及年龄(Age)、性别(Sex)和疫苗相关反应原性(QIVs-Related Reactogenicity)。受试者人口学特征和基线特征基本一致,常规体检显示身体状况良好。按照年龄分组比较,IL-5在免前高龄组M65yrs Group中显着高于低龄NM65yrs Group,并在免后出现显着减少。Granzyme-B在免后低龄NM65yrs Group中显着高于高龄组M65yrs Group,免后两年龄组均出现显着增加。按照性别分组比较,IL-6在免后Day3,Female Group组中显着高于Male Group,随后Day28显着减少。IL-2在免后Day180,老年女性Female Group中显着高于老年男性组Male Group。按照免疫QIVs有无不良反应分组比较,免前,IL-12分泌在GR Group显着高于NGR Group。IL-18和IFN-alpha在QIVs免疫后Day 28,均在GR Group具有显着更高的表达。此外,Granzyme-B在免后Day 03,GR Group表达显着高于NGR Group。许多细胞因子同时具有促炎和抗炎潜能,观察到哪种活性取决于存在的免疫细胞及其对细胞因子的反应状态。体液免疫相关细胞因子IL-5和细胞毒作用相关Granzyme-B具有明显的年龄差异。同时,在QIVs免疫后,显着高表达的细胞因子IL-6和IL-2,证明了老年女性组具有更高的流感病毒特异性的细胞毒性CD8+T细胞以及CD4+记忆T细胞。
刘雨哲[3](2021)在《circSYK驱动miR-1285-3p/FGF1/β-catenin信号通路调控激素性股骨头坏死BMSCs成脂和成骨相关机制的研究》文中认为背景:股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是一类对公众健康威胁较大的骨与关节疾病,早期发病隐匿不易察觉,出现症状时多为中晚期股骨头坏死,如不采取手术治疗(如人工髋关节置换),ONFH患者将出现跛行,严重者可致终身残疾,阐述ONFH分子发病机理和发现早期分子诊断标志物一直是骨科领域关注的重点问题。我国ONFH患者的主要组成部分是激素性股骨头坏死(steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH),长期或大量使用糖皮质激素是引起SONFH的重要环境因素。近期针对中国ONFH患者的流行病学研究结果表明:24.1%的ONFH患者有糖皮质激素应用史。脂代谢紊乱学说是当前公认的引起SONFH的核心发病机制,应用超量激素会导致骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成脂分化功能亢进,大量脂肪瘀滞在髓腔内引起股骨头血供减少,抑制骨组织修复重建。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类特殊的非编码RNA,具有由反剪接形成的稳定共价闭环结构,越来越多的研究表明circRNA可通过多种分子机制在骨肉瘤、骨性关节炎、椎间盘退行性变和绝经性骨质疏松等骨骼肌肉疾病的发生和发展中发挥重要的作用,特别是有关竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)机制的调控方式已经被大量研究证实,然而目前有关circRNA对激素性股骨头坏死BMSCs的调控机制尚不清楚,circRNA是如何调控BMSCs成脂和成骨分化有待进一步研究。目的:应用高通量微阵列技术阐述circRNA和mRNA在人激素性股骨头坏死BMSCs中的差异表达谱特点;通过生物信息学分析方法和技术明晰ceRNA机制,识别调控BMSCs成脂和成骨分化的circRNA/miRNA/mRNA关键信号通路;经过深入的细胞和分子生物学实验验证关键circRNA、miRNA和mRNA,从而鉴别circRNA驱动激素性股骨头坏死BMSCs成脂/成骨转分化异常的关键信号通路及其分子靶点。研究方法:1.研究对照体系建立:从进行髋关节置换手术的16例SONFH患者和16例股骨颈骨折(femoral neck fracture,FNF)患者的大粗隆部位无菌提取新鲜骨髓血10ml,采用无菌梯度离心法分离出骨髓血中的BMSCs并传代培养;显微镜下观察BMSCs的形态;应用流式细胞术鉴定提取的BMSCs表面抗原和增殖能力。2.BMSCs培养及诱导分化:采用成骨诱导培养基诱导BMSCs成骨分化,应用茜素红S染色和氯化十六烷基吡啶成骨定量实验分析SONFH组与对照组BMSCs的成骨分化能力;采用成脂诱导培养基诱导BMSCs成脂分化,应用油红O染色和萃取成脂定量分析法分析SONFH组与对照组BMSCs的成脂分化能力。3.CircRNA和mRNA高通量芯片表达谱筛查及实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证:应用 Arraystar circRNA V2.0 芯片和Arraystar lncRNA/mRNA V4.0芯片检测3例激素性股骨头坏死患者和3例对照组患者BMSCs,以|Fold Change|≥2和P<0.05为标准筛选上调和下调的差异表达circRNA及mRNA,构建激素性股骨头坏死的差异基因表达谱,通过qRT-PCR实验验证排位前5明显上调和下调的差异表达基因的表达水平,证明微阵列分析结果与qRT-PCR结果的一致性。4.生物信息学分析:采用生物信息学分析方法进一步分析激素性股骨头坏死BMSCs 中差异表达的 circRNA 和 mRNA,通过 Arraystar homemade circRNA靶基因预测软件预测circRNA的靶miRNA;应用TargetScan和miRDB两种在线预测工具预测以上靶miRNA的靶mRNA;韦恩分析以上微阵列分析结果中的差异表达基因和预测的靶基因,筛选出共表达基因;Cytoscape构建以上基因的ceRNA网络并将其可视化呈现;GO和KEGG通路分析差异表达的mRNA;PPI蛋白互作网络分析差异表达的mRNA。最终根据生信分析结果和既往文献报道筛选出潜在调控BMSCs成脂和成骨分化的关键通路,并检测该通路中各基因在两组BMSCs中的表达情况,进一步分析它们的表达趋势和调控关系。5.细胞和分子生物学实验验证:通过生物信息学分析和基因表达检测筛选出circSYK/miR-1285-3p/成纤维细胞生长因子 1(fibroblast growth factor 1,FGF1)信号通路,构建circSYK过表达质粒和小干扰RNA,敲低/过表达BMSCs中的circSYK后应用qRT-PCR方法检测circSYK、miR-1285-3p和FGF1及调控的关键靶基因β-连环蛋白(beta-catenin,β-catenin)的表达水平;成脂诱导培养基诱导敲低/过表达circSYK的BMSCs后应用油红O成脂染色及萃取定量分析法检测BMSCs的成脂能力,应用qRT-PCR法检测各组三个关键成脂基因过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPARγ)、转录因子 CCA AT/增强子结合蛋白 α(CCAAT enhancer binding protein alpha,C/EBPα)和脂肪酶(Adipsin)的表达水平;使用成骨诱导培养基诱导敲低或过表达circSYK的BMSCs后通过茜素红S成骨染色及氯化十六烷基吡啶定量分析法检测BMSCs的成骨能力,应用qRT-PCR法检测各组三个关键成骨基因骨形态发生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)、Sp7 转录因子(Sp7 transcription factor,Osterix)和 Runt 相关转录因子 2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)的表达水平;应用Western Blot法检测以上各基因的蛋白表达水平;采用双萤光素酶报告基因实验进一步验证miR-1285-3p与circSYK和FGF1的结合位点。结果:1.分离和培养SONFH组和对照组BMSCs。显微镜下观察两组BMSCs呈索条状,SONFH组的细胞排列相对无序;流式细胞术检测结果表明两组分离提取的细胞均符合骨髓间充质干细胞的表面抗原特性,CD73、CD90和CD105表明抗原呈阳性,CD34和CD45表面抗原表达呈阴性;对照组BMSCs处于S期的细胞百分比多于SONFH组(P<0.05)。2.油红O染色后SONFH组BMSCs在成脂诱导培养基诱导下形成了较大的脂滴,萃取定量分析结果显示SONFH组的BMSCs生成的脂滴量显着多于对照组(P<0.05),相同条件下成脂培养基诱导SONFH的BMSCs展现的成脂分化能力更强;茜素红S染色结果显示SONFH组BMSCs在成骨诱导培养基诱导后钙形成较少的钙结节,氯化十六烷基吡啶成骨定量分析结果显示SONFH组BMSC生成的钙结节显着少于对照组(P<0.05),相同条件下成骨培养基诱导SONFH的BMSCs展现出的成骨分化能力弱。3.微阵列分析两组BMSCs的circRNA和mRNA后共筛选出820个差异表达circRNA和2775个差异表达mRNA。qRT-PCR结果表明排位前五上调/下调表达的circRNA和mRNA均符合微阵列分析中的表达水平,证明了微阵列分析结果与qRT-PCR结果的一致性。4.结合circRNA和mRNA差异基因表达谱,根据靶基因预测结果分别构建了上调和下调circRNA的调控网络并完成了可视化分析,排位前五的上调差异表达circRNA共有116个靶mRNA,排位前五的下调差异表达circRNA共有446个靶mRNA;GO分析结果显示激素性股骨头坏死的BMSCs的差异表达基因富集在糖皮质激素反应、糖酵解和糖异生等与激素性股骨头坏死发病过程紧密相关的生物学过程条目中;KEGG通路分析结果显示这些基因主要富集在干细胞多能性、HIF-1、p53和碳代谢等调控干细胞的通路中;PPI蛋白互作网络进一步反映了如TMEM196、FGF1和GP6等基因可作为核心基因在蛋白质水平参与表达调控;根据生信分析结果、既往文献报道和以上构建的差异基因表达谱最终预测circSYK/miR-1285-3p/FGF 1/β-catenin信号通路可潜在调控激素性股骨头坏死BMSCs成脂和成骨分化;qRT-PCR检测结果提示SONFH组BMSCs circSYK的表达水平明显高于对照组,miR-1285-3p呈低表达,FGF1为明显高表达(P<0.05),以上基因的表达趋势符合circRNA的ceRNA调控机制。5.双萤光素酶报告基因实验中将野生型FGF1/circSYK双萤光素酶报告基因质粒与miR-1285-3p mimics共转染293T功能细胞后,萤光发光强度显着被抑制;将突变型FGF1/circSYK双萤光素酶报告基因与miR-1285-3p mimics共转染293T功能细胞后,萤光发光强度无明显改变。6.转染circSYK过表达质粒于BMSCs后circSYK的表达显着上调,miR-1285-3p表达下调,FGF1表达上调,调控BMSCs成骨和成脂的Wnt信号通路关键信号分子β-catenin的表达被抑制;油红O染色和萃取成脂定量分析结果显示实验组BMSCs形成的脂滴显着高于对照组(P<0.05),成脂分化能力强,qRT-PCR结果显示三个成脂分化关键基因PPARγ、C/EBPα和Adipsin的表达显着上调;茜素红S染色和氯化十六烷基吡啶成骨定量分析结果显示实验组BMSCs生成的钙结节较少,成骨分化能力显着减弱,qRT-PCR结果显示BMP2、RUNX2和Osterix三个成骨分化关键基因表达显着下调;以上各基因的蛋白表达水平与mRNA的基因表达趋势一致,敲低BMSCs的circYSK后的实验结果与circSYK的过表达实验结果相反。结论:1.本研究分离、培养并鉴定了激素性股骨头坏死和股骨颈骨折患者的BMSCs,激素性股骨头坏死的骨髓间充质干细胞成脂分化能力强,成骨分化能力弱。2.本研究阐述了 SONFH的circRNA和mRNA差异基因表达谱特点,为筛查SONFH关键差异表达基因提供了高通量数据。3.结合生物信息学分析方法预测出了多个可潜在调控BMSCs功能的circRNA/miRNA/mRNA信号通路,这些信号通路潜在调控SONFH的BMSCs功能。4.深入的细胞学和分子生物学验证了 circSYK通过竞争性内源RNA机制级联调控miR-1285-3p/FGF 1/β-catenin信号通路,促进BMSCs的成脂分化并抑制其成骨分化,为临床防治SONFH提供潜在的诊断标志物和治疗靶点。5.双萤光素酶报告实验证实circSYK和FGF1与miR-1285-3p存在直接的结合位点,为circSYK的ceRNA机制提供了理论依据。综上,本研究采用微阵列分析技术阐述了激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞circRNA和mRNA的差异基因表达谱特点,通过生物信息学分析方法预测出了多个潜在调控激素性股骨头坏死BMSCs功能的circRNA/miRNA/mRNA信号通路,实验验证了 circSYK可通过竞争性内源RNA机制级联调控miR-1285-3p/FGF 1/β-catenin信号通路,进而调控BMSCs成脂和成骨分化,circSYK具有作为早期诊断和治疗激素性股骨头坏死分子靶点的潜力,为进一步阐明激素性股骨头坏死的成脂功能紊乱机制提供了科学依据。
高强[4](2021)在《星蒌承气汤治疗急性缺血性卒中痰热腑实证机制研究》文中研究表明急性缺血性脑卒中(Acute Ischemic Stroke,AIS),即急性脑梗死,中医称缺血性中风,是脑组织因局部的血流循环障碍缺血、缺氧而发生的软化、坏死。目前溶栓是治疗缺血性卒中急性期最快、最有效的方法,但由于适应证严格、时间窗短、出血和再灌注损伤风险高,其临床效果受到限制。基础与临床研究证实,中医药治疗中风独具优势。中医认为痰热腑实证是缺血性中风急性期最为常见的证型,而化痰通腑法代表方星蒌承气汤是治疗中风急性期痰热腑实证的代表性方剂。星蒌承气汤“脑病治肠”、“上病治下”的中医理论与现代医学提出的“菌-肠-脑轴”具有异曲同工之妙。诸多临床试验及系统性综述已证实星蒌承气汤治疗缺血性卒中的确切临床疗效与神经保护作用,但是其效应机制研究尚且不足。因此本文基于网络药理学及肠道微生态理论,深入探讨缺血性中风的肠道微生态机制及化痰通腑法代表方星蒌承气汤治疗中风痰热腑实证的效应机理。目的:基于中医“上病治下”理论与现代医学“菌-肠-脑轴”理论,(1)通过中药网络药理学与分子对接技术全面探讨星蒌承气汤治疗缺血性卒中的多组分、多靶点、多通路机制;(2)明确具有“化痰通腑”作用的星蒌承气汤对急性缺血性中风痰热腑实证小鼠模型的神经保护作用,并验证网络药理学研究的关键靶点与通路;(3)探讨星蒌承气汤对急性缺血性中风痰热腑实证小鼠模型肠道菌群的影响,探讨其治疗中风痰热腑实证“通腑”与“通便”差异的肠道微生态机制;(4)观察星蒌承气汤对伪无菌小鼠急性缺血性中风模型菌-肠-脑轴的影响,验证星蒌承气汤通过直接影响肠道菌群而改善脑卒中预后的假说。方法:(1)借助TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM及TCMID等数据库收集星蒌承气汤活性成分及作用靶点,并应用STITCH等对未找到靶点的化合物进行靶点预测。通过6个数据库挖掘缺血性卒中的靶点。通过GO和KEGG富集对交集靶点进行高级功能分析,并用cytoscape3.6.0构建PPI、化合物-靶点及药物-靶点-通路网络。最后进行分子对接验证。(2)雄性C57BL/6小鼠随机分为:假手术(Sham)组、模型(MCAO)组、星蒌承气汤(XCD)组、尼莫地平(Nim)组及舒泰清(PGE)组,通过制备高脂低纤维饮食复合线栓法的小鼠急性缺血性中风痰热腑实证模型,采用神经功能评分、除胶实验、TTC和TUNNEL染色,综合评价星蒌承气汤的神经保护作用,并运用ELISA、W estern blot等技术验证网药关键靶点与通路;(3)雄性C57BL/6小鼠随机分为:Sham组、MCAO组、XCD组、Nim组与PG E组,通过制备高脂低纤维饮食复合线栓法的小鼠急性缺血性中风痰热腑实证模型,采用高通量16srDNA基因测序、代谢组学技术、免疫组化、免疫荧光、ELISA及流式多因子技术分别对肠道菌群、短链脂肪酸(SCFAs)及其受体GPR43、神经-内分泌-免疫途径相关指标(NE及TH、血清MTL、脑IBA-1及GFAP、血清炎症因子)进行分析;(4)雄性C57BL/6小鼠在术前14天服用多种抗生素剔除肠道菌群后,随机分为:伪无菌假手术(ABX-Sham)组、伪无菌模型(ABX-MCAO)组以及伪无菌中药(ABX-XCD)组,通过神经功能评分、除胶实验、TTC染色以及高通量16srDNA基因测序、代谢组学技术、免疫组化、免疫荧光、ELISA及流式多因子技术,观察中药对伪无菌小鼠菌-肠-脑轴相关指标的影响。结果:(1)网络药理学及分子对接结果表明,星蒌承气汤包含51个活性成分及44个治疗缺血性卒中的交集靶点。高级功能分析显示星蒌承气汤抗缺血性卒中的机制与脂多糖介导的信号通路、凋亡过程的调控、炎症反应、内皮屏障的建立以及对脂肪酸的反应有关。星蒌承气汤发挥作用的有10条关键KEGG信号通路。PPI网络分析得到AKT 1,PTGS2,TNF,TP53,CASP3,IL1B等关键靶点。分子对接验证了星蒌承气汤活性成分与关键靶点具有良好的对接能力。(2)星蒌承气汤神经保护作用及对网络药理学关键靶点及通路的影响:①神经功能评分:与MCAO组相比,XCD组及Nim组术后48h及72h Longa评分降低(P<0.05),PGE组未见变化(P>0.05)。②除胶实验:XCD组和Nim组术后48和72h的接触和去除胶带时间缩短(P<0.05),PGE组未见变化(P>0.05)。③TTC染色:XCD组梗死面积下降(P<0.05),Nim组及PGE组未见变化。④TUNNEL:MCAO组梗死区细胞凋亡明显增加,XCD组和Nim组TUNEL阳性染色减少(P<0.05)。⑤网络药理学验证:XCD组及Nim组TNF-α含量具有下降趋势(P>0.05);XCD组p-AKT、PI3K及NF-κB蛋白表达具有升高趋势。AKT蛋白表达组间未见明显变化(P>0.05)。(3)星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证小鼠菌-肠-脑轴影响:①肠道菌群:与MCAO组相比,XCD组α多样性有升高趋势,Nim组及PGE组无显着变化。β多样性显示MCAO组与Sham组PCoA曲线有显着差异(P<0.05)。MCAO组拟杆与变形杆菌门显着增加,厚壁菌门显着减少;XCD组拟杆菌比例显着降低,疣微菌门显着增加,Nim组变形菌门显着增加,厚壁菌门进一步降低,PGE组菌群组成与MCAO相似,变形杆菌略降低。此外,XCD组Akkermansia比率增加,Nim组Klebsiella增加最为显着,而 PGE 组 Parabacteroides 和Escherichia/Shigella增加较为显着。②SCFAs 及GPR43:MCAO组的SCFAs含量显着降低(P<0.05),XCD组丁酸含量增加(P<0.05)。XCD组及Nim组GPR43表达显着降低(P<0.05)。③自主神经途径:XCD组NE有下降趋势,PGE组NE有上升趋势(P>0.05)。MCAO组及PGE组TH蛋白表达上升(P<0.05),XCD组及Nim组TH表达未见显着变化趋势(P>0.05)。④神经内分泌途径:MCAO组MTL显着升高(P<0.05),PGE组有升高趋势(P>0.05),XCD组及Nim组MTL显着下降(P<0.05)。⑤免疫途径:MCAO组星形胶质细胞增生、肥大,显着活化,小胶质细胞迅速从“静息态”转变为“激活态”,从梗死周边区域向病变部位募集,而XCD组星形胶质细胞及小胶质细胞活化较MCAO组降低。MCAO 组 TNF-α、IL-17A、IL-22 升高(P<0.05),而 XCD 和 Nim 组的 IL-10显着升高(P<0.05),TNF-α、IL-17A 和 IL-22 降低。(4)星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证伪无菌小鼠菌-肠-脑轴影响:①神经保护作用:与ABX-MCAO组相比,ABX-XCD组在Longa评分、除胶实验及TTC染色等方面未见显着变化(P>0.05)。②肠道菌群:ABX-MCAO和ABX-XCD组的α多样性低于ABX-Sham,PCoA分析显示ABX-XCD组肠道菌群的β多样性和组成与AB X-MCAO组相似。相对丰度结果显示,在ABX组中,小鼠的微生物区系均以变形杆菌为特征,这与正常小鼠有显着差异。LEfSe分析显示MCAO组富集了更多的病原体或机会性病原体,包括Bacteroidetes,EscherichiaShigella与Helicobacter,而 XCD富集了Verrucomicrobia和Akkermansia等有益菌群。条件致病菌如Streptococcus,Lact ococcus,Morganella,Klebsiella,Proteobacteria,Enterobacteriaceae 等在 ABX-XCD组富集显着增多。PGE组富集菌群主要有oSelenomonadales、cNegativicutes、gRomboutsia及fPeptostreptococcaceae。③SCFAs 及 GPR43:ABX-XCD 的丙酸显着下降(P<0.05)。ABX-MCAO 组 GPR43 表达显着上调(P<0.05),ABX-XCD 组 G PR43表达显着降低(P<0.05)。④自主神经途径:ABX-XCD组NE含量未见显着变化(P>0.05),TH蛋白表达未见显着变化(P>0.05)。⑤神经内分泌途径:ABX-MCAO组MTL升高趋势(P>0.05),ABX-XCD组MTL未见显着变化(P>0.05)。⑥免疫途径:ABX-XCD组IL-22显着升高(P<0.05),IL-17A有降低趋势(P>0.05),余未见显着变化趋势(P>0.05)。ABX-MCAO组星形胶质细胞表达显着升高,小胶质细胞显着活化,ABX-XCD组星形胶质细胞及小胶质细胞活化较ABX-MCAO组有降低趋势。结论:星蒌承气汤对急性缺血性中风痰热腑实证小鼠具有一定神经保护作用,其效应机制具有多成分、多靶点、多通路特点。其对伪无菌小鼠中风模型则未发现确切的脑保护效应,说明其脑保护的部分机制是通过改善肠道微生态实现的。其具体机制包括提高肠道短链脂肪酸,尤其是丁酸含量,增强肠道短链脂肪酸受体GPR43表达,增加血液IL10、减少TNF-α等炎性因子及MTL水平,最终减少梗死区域胶质细胞活化和神经细胞凋亡,从而达到中风脑保护的作用。本研究成果对中风病的临床治疗具有重要的指导意义——对于中风后便秘患者,仅仅“通便”治疗是不够的,需要结合患者的证候特点进行中医药“化痰通腑”治疗,才能取得好的临床效果。
李家国[5](2021)在《具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的设计、合成及生物活性研究》文中研究指明抗体偶联药物(Antibody-drug conjugate,ADC)现已成为抗肿瘤药物研发的热点方向,为肿瘤治疗开启了新的篇章。此类药物是由抗体,连接子和细胞毒素三个组分组成的有机整体,利用抗体的靶向性将小分子细胞毒素递送至靶组织并释放,从而有效地杀灭肿瘤细胞,实现了抗体和小分子化学药物优势的强强联合。目前,全球已先后批准了6个ADC药物上市。ADC概念虽简单,但理想的ADC设计却十分复杂,各组分的变化均可能对其整体造成影响。ADC的进一步发展依旧存在诸多挑战:(1)当前以一甲基澳瑞他汀E(Monomethyl Auristatin E,MMAE)为毒素的ADC所使用的抗体均为非免疫型抗体,较为单一。其设计理念主要是利用抗体的靶向性将细胞毒素递送至肿瘤部位。但尚未充分考虑如何协同发挥抗体的其他治疗作用;(2)传统的ADC连接子设计策略仅考虑到两点,其一保证连接子结构在血液中的稳定性。其二,连接子在肿瘤组织中依赖酶及其他因素降解释放药物。但这些释药酶及其他因素往往也存在于正常组织中,会使ADC产生非特异性释药问题;(3)ADC对细胞毒素要求较高,往往需要有效浓度在皮摩尔级别,仅有少部分毒素可被应用于ADC中。如微管蛋白抑制剂类细胞毒素MMAE和DM1,但它们只对处于分裂期的肿瘤细胞起作用。因此,需进一步挖掘具有不同作用机制且高活性的新型ADC毒素。本文针对上述ADC三个组分各自存在的问题进行了一系列创新和改进工作,共设计出四类具有抗肿瘤作用的新型ADC,并对其进行了合成、表征及针对性的生物活性评价工作:1.针对MMAE-ADC抗体作用单一的问题,本文将当前免疫治疗抗体的优势与ADC技术结合起来,使毒素MMAE通过酶裂解型二肽连接子与程序性凋亡配体1(Programmed Cell Death Ligand-1,PD-L1)抗体偶联,设计并合成4个基于免疫协同机制的新型MMAE-ADC(Ⅰ类)。这种策略可利用PD-L1抗原在多种肿瘤细胞高表达实现靶向性,同时也可通过阻断PD-1/PD-L1信号通路激活肿瘤浸润T细胞的免疫功能与ADC协同杀伤肿瘤细胞,增强治疗效果。对该类ADC的生物学功能及体内外活性评估结果表明,所制备的ADC 3具有与PD-L1抗体相似的抗原亲和力及内化能力。对多种PD-L1高表达肿瘤细胞系有较好的抑制活性和选择性,最小IC50值可达到9.75 nM。同时,ADC 3可显着增强T细胞活性,保留了PD-L1抗体的免疫激活功能,可起到与ADC协同杀伤肿瘤细胞的作用。在小鼠异种移植模型中,其表现出优于PD-L1抗体的抗肿瘤治疗效果,具有很大的应用潜力。2.针对连接子的非特异性释药问题,本课题尝试通过两种创新性设计策略旨在解决该问题。(1)策略一:设计基于紫外光控释药机制的新型ADC(Ⅱ类)本文设想是否可利用外源性的光条件,在肿瘤部位定点调控毒素释放,而不依赖传统的非特异性释药方式。具体来说,通过将紫外光可激活基团邻硝基苄基(o-Nitrobenzyl,ONB)结构与传统ADC连接子上的对氨基苄基间隔子巧妙替换,首次设计并合成2个目标ADC。进一步对它们的释药情况、体外药效及体内靶向性进行评估。结果表明,在短暂紫外照射后ADC 5和6可快速释放出MMAE有效地杀灭Heceptin耐药的肿瘤细胞,对BT474-Her DR细胞的抑制活性最好,IC50值均为0.04 nM,比未光照时抑制活性提高51倍和54倍。同时,在小鼠体内荧光成像实验中,该类ADC表现出良好的肿瘤靶向能力和器官特异性。(2)策略二:设计基于硝基还原酶释药机制的新型ADC(Ⅲ类)硝基还原酶(Nitroreductase,NTR)在实体瘤的缺氧环境中表达上调而在正常组织中低表达。在课题组前期工作中,利用实体瘤内NTR的缺氧特异性还原机制,首次将NTR敏感基团对硝基苄氧羰基(p-N itrobenzyloxycarbonyl,PNBC)引入到ADC连接子中,得到2个基于NTR释药机制的新型ADC。在酶及细胞释药实验中,缺氧条件下ADC 7和8均能释放出毒素MMAE,呈现出显着的NTR缺氧释药特异性。同时,ADC 7和8对人表皮生长因子受体2高表达的肿瘤细胞表现出与毒素MMAE相近的抑制活性。进一步的体内研究正在进行中。以上研究初步证明上述两种释药机制的新型ADC策略具有可行性。3.针对ADC毒素种类少,作用机制单一的问题,本文首次设计了以Talazoparib作为新机制毒素的ADC(Ⅳ类),对Talazoparib能否成为ADC的细胞毒素进行了初步探索。Talazoparib是一种聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)抑制剂,IC50值为0.57 nM。该药可抑制DNA修复,通过协同致死效应使BRCA基因缺陷的肿瘤细胞凋亡,具有不同于其他ADC毒素的作用机制。本文利用上述连接子的设计策略,使用ONB基团和PNBC基团封闭Talazoparib的活性位点,合成1个紫外光激活前药47和5个NTR缺氧激活前药59-63。该前药策略可避免高毒性Talazoparib在未到达肿瘤部位前释放对正常组织产生毒性,而在紫外光照或缺氧等特殊条件下又可完成毒素的特异性释放。对前药47进行了针对性的生物活性评价。其具有较好的PBS稳定性。在PARP-1酶实验、PARylation实验中,抑制活性与原药Talazoparib相比分别降低了380倍和658倍,证明活性封闭成功。另一方面,在细胞毒性实验中,短暂紫外照射后,前药47可快速恢复对BRCA基因缺陷的MX-1和Capan-1肿瘤细胞的抑制活性,IC50值分别为0.577μM和0.092μM,具有作为ADC细胞毒素的潜力。针对前药59-63进行的常氧体外药效学实验,意外地发现其对酶及细胞增殖的抑制活性上均与原药类似,预示着可将其作为一种独立的新细胞毒素发展。目前将上述两类前药与不同连接子连接,然后再与抗体偶联制备成ADC的工作正在进行中。综上,本论文共设计出四类新型ADC,合成了6个全新的ADC分子、4个关键连接子,4个连接子-毒素载荷以及6个有潜力成为ADC毒素的前药化合物。针对当前ADC设计策略上存在的一些问题,本文从抗体、连接子和细胞毒素三部分分别进行创新,并将这些设计策略相互结合,进行了初步的探索和验证。这些工作为ADC的进一步研究提供了新思路。
马琳沣[6](2021)在《氧化压力在丙戊酸引起肝毒性中的作用研究》文中指出癫痫是一种常见的慢性神经系统疾病,目前药物治疗是控制癫痫的主要手段。丙戊酸(VPA)是一种广泛应用于临床的广谱抗癫痫药,对各类癫痫及痉挛的发作疗效显着,同时还可以用作双向情感障碍的治疗。虽然VPA的有效性和安全性已经得到了临床的广泛验证,但是仍存在一些不良反应,其中以肝毒性最为严重。在长期接受VPA治疗的患者中有61%会发展成为非酒精性脂肪肝(NAFLD),如不及时干预,NAFLD将进一步发展为非酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化、甚至肝癌。因此,阐明VPA致肝毒性机制,寻找潜在治疗新靶点并进行干预治疗具有重要意义。目前普遍认为VPA引起的肝毒性与其活性代谢产物有关。VPA进入肝脏后,会在体内酶系的作用下进行生物转化,包括葡萄糖醛酸化反应、线粒体介导的β氧化、细胞色素P450酶系(CYP)介导的ω氧化。其中,由P450催化生成的4-ene-VPA及2,4-diene-VPA被认为可通过抑制线粒体β氧化代谢并生成一些毒性产物,如亲电子基,氧自由基等。它们可以通过直接破坏细胞内包括DNA、蛋白质、脂质等大分子物质导致细胞死亡,造成肝毒性。但与此同时,体外研究表明内源性产生的4-ene-VPA及2,4-diene-VPA的剂量并不足以诱导机体产生肝毒性。说明VPA代谢致毒并不能完全揭示VPA引起的肝毒性。而目前,大量的研究表明氧化压力(Oxidative stress)在VPA引起肝毒性中发挥了重要的作用。但是,氧化压力产生的来源及其作用机制尚不明确。本研究以癫痫患者、LO2细胞以及小鼠建立VPA肝毒性模型为基础,系统的研究了氧化压力在VPA肝毒性中的作用及机制。氧化压力是体内氧化压力与抗氧化作用失衡的一种状态,并会导致活性氧自由基(ROS)的过量积累。在清除氧化压力及有毒物质的代谢中,谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢酶(CAT)起到了关键作用。抗氧化酶的基因缺失及突变与药物性肝损伤的易感性密切相关。基于氧化压力在VPA肝损伤中的重要作用,本课题首先在长期服用VPA治疗的癫痫患者中研究了四种抗氧化酶基因多态性[GST mu1(GSTM1),GST theta 1(GSTT1),CAT C-262T,GPX Pro200Leu以及SOD2 Val16Ala]对VPA引起的肝功异常的影响。结果表明,CAT C-262T在肝功能正常的患者组跟肝功能异常的患者组中所呈现的基因多态性有着显着性的差异,同时线性回归分析也说明了CAT C-262T是VPA引起肝功能异常的一个风险因素。这表明CAT C-262T的基因多态性在VPA造成的肝功能异常中发挥了至关重要的作用,也间接证明氧化压力是VPA引起肝毒性的一个重要来源。CYP2E1是氧化压力产生的重要来源之一,与NAFLD的发生密切相关。有文献报道促进CYP2E1表达能增加VPA引起肝毒性。但是CYP2E1是否直接参与VPA引起的肝毒性仍未见报道。本研究着重探究了CYP2E1在VPA引起的氧化压力的产生及其诱导肝脂质化中的作用机制。通过体内外的研究,我们发现VPA在引起肝脂质化的同时会伴随着ROS的产生,抗氧化剂NAC抑制ROS的水平,同时显着减轻VPA引起的肝脂质化,证明氧化压力参与了VPA引起肝脂质化的过程。下一步,体内外的研究表明VPA显着提高了CYP2E1的m RNA、蛋白水平及酶活力水平。使用CYP2E1抑制剂DAS及特异性敲低CYP2E1的表达量均可降低ROS水平以及VPA引起的肝脂质化,说明由CYP2E1产生的ROS是VPA引起肝脂质化的重要来源。为分析氧化压力引起VPA肝脂质化的分子机制,我们研究了与脂转运、合成及外排相关基因的表达水平。结果表明VPA可提高CD36及DGAT2的m RNA及蛋白表达量,并且NAC、DAS都可逆转此过程。由此,我们推测VPA可通过诱导CYP2E1的表达,致使氧化压力积累及其CD36、DGAT2过表达、导致体内外肝脂质化。此结论通过体外的时间进行曲线进一步得到证实。此外,有研究表明铁死亡与氧化压力及NAFLD的发生密切相关,我们随后在动物水平初步的研究了铁死亡在VPA引起肝毒性中的作用。研究结果发现VPA在引起小鼠肝毒性的同时也会诱发铁死亡。在此过程中,一方面VPA可以通过减少GPX4的表达量、降低机体对过氧化脂质的还原能力造成脂质过氧化;另一方面,VPA通过对铁反应元件系统的调节,提高了体内二价铁的水平,造成铁过载并诱发铁死亡,加剧了丙戊酸引起的肝毒性。综上所述,我们的结果表明VPA引起的氧化压力是抗氧化酶活性降低、CYP2E1酶活力提高以及二价铁水平升高共同作用的结果。VPA可通过引起肝功能异常,促进CYP2E1表达并诱导ROS从而进一步促进脂转运蛋白CD36和甘油三酯合成蛋白DGAT2的表达肝脂质化、诱发铁死亡引起肝毒性。这些结果为将来为以CYP2E1和铁离子为靶点进行VPA肝毒性的干预性治疗提供了全新思路,也为其临床合理用药提供了理论及实验基础。
刘剑华[7](2021)在《肿瘤微环境响应性聚氨基酸纳米药物用于前列腺癌化学免疫治疗》文中研究表明研究背景:近年来,我国前列腺癌发病率的上升趋势愈加明显,自2008年起前列腺癌发病率稳居男性泌尿系统肿瘤的首位,应引起国内医学界更多关注。目前,前列腺癌首选的治疗手段为根治性手术或根治性放疗,术后可辅助放/化疗,如能接受标准化治疗,预后良好。但由于前列腺癌起病隐匿,且我国尚未开展大规模筛查,新发病例中70%已发展为局部晚期或转移性前列腺癌,已不适宜根治性治疗。雄激素剥夺治疗(Androgen deprivation therapy,ADT)是晚期前列腺癌的主要系统性治疗手段,但其不良反应严重,发生概率较高,且会随着治疗时间延长不断增加。随病情进展,前列腺癌最终将发展为去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC),此时现有的治疗手段都失去了对生存期的收益,急需开发新的治疗方法以改善该患者群体的生活质量,延长生存期。在近期的研究中免疫疗法,尤其是以抗PD-L1抗体为代表的免疫检查点抑制剂,展现出对多种血液系统肿瘤和实体肿瘤良好的疗效,因此开发前列腺癌的免疫检查点阻断治疗也成了研究热点。随着研究的推进,前列腺癌免疫治疗不得不面对的问题也逐渐浮出水面,约半数的前列腺癌属于“冷”肿瘤,即肿瘤微环境(Tumor micro-environment,TME)内缺乏足够的免疫细胞浸润,大幅限制了疗效。如何实现“冷”肿瘤向“热”肿瘤的转变成为了前列腺癌免疫治疗的突破口。实验目的:为了提高前列腺癌的免疫治疗效果,减少治疗所带来的副作用,本论文从肿瘤特有微环境出发,设计并制备了具有pH和还原双响应性的聚乙二醇单甲醚-聚(谷氨酸-co-胱氨酸)[methoxy poly(ethylene glycol)-poly(L-glutamic acid-co-L-cystine),m PEG-P(LG-co-LC)]纳米凝胶用于抗肿瘤药物阿霉素(DOX)的体内递送,实现与抗PD-L1抗体协同治疗前列腺癌。在体内循环过程中,m PEG-P(LG-co-LC)纳米凝胶可以有效保护DOX,通过实体瘤的高通透性和滞留效应(Enhanced permeability and retention effect,EPR)实现肿瘤部位的聚集。肿瘤细胞内的低pH与高谷胱甘肽(GSH)条件分别使纳米凝胶中DOX的氨基(-NH2)与谷氨酸链段中的羧基(-COOH)解离,纳米凝胶中S-S键断裂,触发了DOX的快速释放。DOX在诱导肿瘤细胞凋亡的同时,亦可以引起免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death,ICD),使肿瘤细胞释放肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen,TAA)和危险相关模式分子(Damage associated molecular patterns,DAMPs),从而促进肿瘤组织内免疫细胞的浸润,实现非免疫原性的TME转化为免疫原性,提高了肿瘤对αPD-L1的敏感性,显着增强了免疫检查点抑制剂的肿瘤抑制效果。实验方法:第一部分,我们利用DOX的-NH2与纳米凝胶中-COOH之间正负电相互作用,实现纳米凝胶(NP)对DOX高效稳定的负载(DOX NP)。首先,对DOX NP的组装性能和药物负载及释放行为等进行充分表征。随后,通过MTT法评估DOX NP对肿瘤的细胞毒性。通过流式细胞术评价肿瘤细胞对DOX NP的摄取情况。通过活体成像仪离体成像观察不同药物制剂在小鼠体内的分布情况。构建C57BL/6小鼠皮下异体移植前列腺癌肿瘤模型,通过体内肿瘤抑制实验和免疫组织化学染色评价DOX NP的肿瘤抑制能力。最后通过小鼠体重监测、生化指标及各脏器的组织病理学检测对纳米药物的安全性进行系统评价。第二部分,我们评估了DOX NP联合PD-L1抗体对前列腺癌化学免疫治疗的效果。首先,通过检测肿瘤细胞表面钙网蛋白(Calreticulin,CRT)的暴露和三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)及高迁移率族蛋白1(High mobility group box 1,HMGB1)的释放情况,来评估DOX NP诱导ICD的能力。通过体内肿瘤抑制实验和免疫组织化学染色系统评价DOX NP与αPD-L1联合治疗对肿瘤的抑制能力。通过流式细胞术和ELISA对治疗后的小鼠体内免疫状态(CD8+T、Treg和活化DCs等)和血清中细胞因子水平进行评价。实验结果:第一部分结果表明,在PBS(pH 7.4)中,NP的流体力学直径为94.6±0.6 nm,负载DOX后粒径增加至127.8±2.3 nm,载药前后zeta电势从-20.1±1.0 m V升高至-6.8±0.4 m V,说明DOX正电性的-NH2与NP中负电性的-COOH成功地通过正负电相互作用结合,载药率为17.3%,载药效率为86.5%。DOX NP在生理环境(pH 7.4)下可以相对稳定存在,而在酸性环境中,DOX的累积释放量随着pH值的降低而逐渐增加。在pH 5.3且有GSH同时存在的情况下,DOX的累积释放量最大,证明了DOX NP具有良好的pH和还原响应性。细胞水平实验结果显示,经过GSH预处理的细胞经DOX NP共培养后具有与游离DOX组相近的肿瘤细胞毒性,且两组均高于DOX NP组,说明高GSH浓度促进了DOX NP中DOX的释放。细胞摄取实验中,DOX组具有最强的荧光强度,DOX NP组最弱,这是由于游离的DOX以自由扩散的方式进入细胞,而DOX NP通过内吞作用进入细胞。对于DOX NP的细胞摄取,经过GSH预处理细胞组的DOX荧光强度要高于未经GSH预处理组的DOX,再次证明了GSH可以加速DOX NP的药物释放。经静脉注射6 h和12 h后,游离DOX在肝部的聚集明显多于DOX NP组,而在肿瘤部位的聚集很少,并随时间延长肿瘤部位的药物荧光强度减弱,相反地,DOX NP组随时间延长在肿瘤部位的荧光强度增强,约为同时间点游离DOX荧光强度的3倍,表明纳米凝胶有效地减少了药物在肝脏的聚集,同时通过EPR效应提高了其在肿瘤部位的聚集,减少了不良反应的发生。DOX NP在体内肿瘤抑制实验中展示出最强的肿瘤抑制能力,TUNEL及免疫组织化学染色结果显示,DOX NP治疗组中肿瘤细胞凋亡数量最多。DOX NP的各主要器官病理切片没有显示出明显毒性,治疗过程中小鼠体重没有明显波动,证明DOX NP具有更可靠的安全性。第二部分结果表明,DOX与DOX NP均能有效的诱导肿瘤细胞发生ICD,且DOX NP略强于DOX。在体内DOX NP联合抗PD-L1抗体(DOX NP+αPD-L1)具有最强的肿瘤抑制作用,且肿瘤浸润淋巴细胞和肿瘤引流淋巴结中CD8+T细胞的比例均高于游离DOX+αPD-L1和PBS组,并有效抑制了Treg的募集。治疗结束后,相对于其他治疗组,DOX NP+αPD-L1治疗组的免疫抑制性细胞因子TGF-β的水平降低,起到免疫调节作用的细胞因子IFN-γ表达水平升高。肿瘤组织的TUNEL及免疫组织化学染色也证实了DOX NP+αPD-L1治疗组优异的肿瘤抑制能力。结论:(1)成功制备了酸性与还原双响应性的m PEG-p(LG-co-LC)载药纳米凝胶DOX NP。(2)DOX NP可在肿瘤部位选择性聚集,并有效降低全身不良反应。(3)DOX NP既能在一定程度上抑制肿瘤生长,还能够诱导肿瘤细胞发生ICD。(4)DOX NP与αPD-L1的联合具有更强的肿瘤抑制能力,为化学免疫治疗的临床应用提供了理论基础。
赵丽娇[8](2021)在《芳香烃受体AHR的内源性配体ITE抗神经胶质瘤的作用机制研究》文中提出胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是一种最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,具有迅速切换迁移模式的特性,阻断GBM的侵袭极具挑战性,寻求能够阻断多种迁移模式的药物是亟待解决的问题。前期我们的研究发现一种内源性芳基烃受体(Aryl Hydrocarbon Receptor,AHR)激动剂,小分子2-(1H-吲哚-3-羰基)-噻唑-4-羧酸甲酯(2-(1H-indole-3-carbonyl)-thiazole-4-carboxylic acid methyl ester,ITE),可以阻断神经胶质瘤细胞迁移,为确定介导ITE-AHR效应的基因,我们分析了数据库中可能与AHR调控的迁移相关基因。并将其与RNA-seq收集的ITE处理后的基因表达变化进行比较。从两个基因集的交集中选择了可能相关基因,以供进一步研究。MYH9是非肌肉肌球蛋白IIA(non-muscle myosin,NMIIA)的组成部分,我们发现可通过ITE治疗降低其蛋白的表达水平。当MYH9在神经胶质瘤细胞中过表达时,通过划痕实验发现其表达水平和细胞迁移能力之间具有良好的相关性。MYH9的过表达消除了ITE的迁移抑制作用,提示ITE-AHR通过抑制MYH9表达来抑制细胞迁移。MYH9对于3D密闭空间中的细胞迁移至关重要,ITE通过AHR影响MYH9的事实开辟了新的研发途径。胶质母细胞瘤作为一种缺乏T细胞浸润的“冷”肿瘤,其中色氨酸双加氧酶IDO/TDO产生的犬尿氨酸(Kynurenine,Kyn)通过与AHR结合起到免疫抑制作用。目前已经开发的AHR拮抗剂,可以激活IDO过表达的癌症模型中的免疫反应。据报道,AHR可以像肿瘤抑制剂一样阻断神经胶质瘤细胞的侵袭,如何在癌症中靶向AHR仍然是一个未知的问题。在本文中,我们报道了ITE与PD1抗体协同作用,通过减少髓样来源的抑制性细胞(myeloid derived suppressive cells,MDSC)浸润来激活免疫。ITE与PD1抗体联合显着增加了神经胶质瘤组织中CD3+CD8+和CD3+CD4+T细胞的百分比。免疫调节基因的基因表达谱显示,已知的MDSC诱导物IL11被显着下调,这在ITE与PD1抗体联合组的蛋白水平上得到了证实。ITE单独使用抑制体外培养的GL261细胞中IL11的表达,并抑制IL11诱导PBMC向MDSC分化。在ITE组中,抑制IL11下游Stat3的磷酸化。在这种原位小鼠神经胶质瘤模型中,观察到的IL11-STAT3抑制作用是ITE抑制MDSC浸润,激活免疫的机制之一,因为还可能有其它通路。
杨丽婷[9](2021)在《己酮可可碱通过ROS诱导人结直肠癌SW620细胞凋亡机制的研究》文中研究说明实验目的:结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤之一,2020年全球癌症统计结果显示,中国结直肠癌的发病和死亡比例分别占12.2%和9.5%。此外,由于现代社会中越来越多的年轻人因不健康的生活和饮食方式等因素,导致结直肠癌的发病趋于年轻化。当前结直肠癌大多数病例的医治方法仍是手术和化疗,虽然这些方法在临床治疗中有一定的疗效,但是其治疗费用高昂、术后复发率高、副作用大、肝肾等相关功能受到损伤以及引起并发症等弊端也成为治疗结直肠癌的主要问题,靶向治疗与上述手段相比,虽然其毒副作用较小,针对性较高,但也因耐药性大大的限制了临床应用,因此急需开发廉价、高效、低毒的新型治疗药物。己酮可可碱(PTX)是一种从可可豆中提取得到的黄嘌呤化合物,已用于治疗脑部血循环障碍、外周血管病、突发性耳聋、间歇性跛行等疾病,最近还被证明具有抗癌活性,能抑制乳腺癌、黑色素瘤等多种癌细胞增殖,但其在结直肠癌中的作用机制还未完全明确。因此本实验利用结直肠癌SW620细胞,研究PTX诱导其凋亡机制,由此为PTX在治疗结直肠癌方面提供新的理论,其可能作为治疗结直肠癌的潜在先导化合物。实验方法:使用不同浓度的PTX处理SW620细胞,检测内容如下:1.使用倒置显微镜观察SW620细胞的形态;利用MTT法检测PTX对细胞增殖的作用。2.通过Annexin V-FITC/PI双染色法、PI单染色法和DCFH-DA探针法处理SW620细胞,利用流式细胞术检测药物对其凋亡程度、周期分布和细胞内活性氧(ROS)水平变化的作用;DAPI染色后利用荧光显微镜观察PTX对SW620细胞的影响。3.利用免疫印迹法(western blot,WB)检测凋亡、周期、自噬和AKT/GSK-3β通路相关蛋白表达,包括Cleaved-PARP、Cyclin D1、p21、LC3B、Beclin-1、AKT、p-AKT、GSK-3β和p-GSK-3β。4.将SW620细胞分别经ROS清除剂NAC和自噬抑制剂3-MA预先处理后,通过MTT法和WB法检测药物刺激产生的细胞内ROS对细胞增殖、细胞自噬及AKT/GSK-3β信号通路产生的影响。结果:1.通过MTT法证明PTX能抑制人结直肠癌细胞的增殖,其抑制程度呈现浓度依赖性,并且经显微镜观察,随着PTX浓度的增加,SW620细胞的形态发生明显变化。2.通过流式细胞术显示,经PTX作用后SW620细胞周期多分布在G0/G1期,且呈现浓度依赖性。WB实验显示在SW620细胞中PTX能上调p21以及下调Cyclin D1蛋白。3.流式细胞术结果证明,PTX能使SW620细胞发生凋亡,随着PTX浓度的增加,DAPI染色观察到蓝色荧光变得强烈且数目增加。4.流式细胞术结果证明,PTX能增加细胞内ROS水平并且呈现浓度依赖。此外,MTT实验结果显示,NAC预处理后能恢复SW620细胞活力,减弱PTX对SW620细胞增殖的抑制作用。5.WB实验结果显示,PTX可上调Cleaved-PARP、抑制AKT和GSK-3β磷酸化,由此影响AKT/GSK-3β通路,而加入NAC处理后,p-AKT和p-GSK-3β表达量增加,AKT和GSK-3β没有明显的变化。6.通过WB实验检测自噬相关蛋白,结果显示随着PTX药物浓度的增加,LC3B-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达量均呈上调趋势,而经NAC预处理后,两者的表达量均降低。MTT实验结果显示,在SW620细胞中3-MA预处理后可减弱PTX对其增殖的影响。结论:根据以上实验结果可以证明,PTX能抑制SW620细胞增殖,诱导细胞凋亡。第一,PTX通过降低Cyclin D1蛋白的表达水平和上调p21的表达,将细胞周期阻遏在G0/G1期,以抑制SW620细胞增殖。第二,PTX能诱导胞内ROS增加,通过ROS介导下调p-AKT和p-GSK-3β表达,抑制AKT/GSK-3β通路,并且通过ROS上调LC3B-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达,激活凋亡性自噬的发生,最终促进SW620细胞凋亡。综上,PTX不仅具有已用于临床治疗的改善脑循环,消炎等作用,还可以作为一种潜在的先导化合物,为结直肠癌的治疗提供一个新的策略。
李文杰[10](2021)在《鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究》文中进行了进一步梳理鸡贫血病毒VP3基因表达的凋亡蛋白Apoptin在正常细胞中无细胞毒性,而在肿瘤细胞中能够特异性诱导细胞发生凋亡。表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3能够在多种肿瘤细胞中特异性表达Apoptin蛋白并诱导肿瘤细胞凋亡,且Ad-VT可以在肿瘤细胞中特异性复制起到溶瘤作用。癌症是人类死亡的主要原因之一。2020年乳腺癌超越肺癌成为发病率第一的癌症;并且女性中乳腺癌的死亡率居女性癌症死亡率首位。目前针对乳腺癌的治疗方法副作用大,对转移患者疗效欠佳,并且患者经治疗后仍有复发的风险。因此,仍然需要继续寻找更有效地治疗手段。在癌症内部有一部分细胞被称为癌症起始细胞或癌症干细胞,这部分细胞在癌症起始、治疗抵抗、转移和复发中起关键作用。这意味着,以乳腺癌干细胞为靶标可能是根除乳腺癌的有前途的治疗策略。迄今为止,还没有针对癌症干细胞的特定药物。因此,诱导癌症干细胞分化并靶向杀伤癌症干细胞可能有助于开发针对癌症的新的治疗策略,在治疗癌症时可能具有临床优势。本研究目的是富集分选表型为CD44+CD24-的乳腺癌干细胞,对其干细胞特性进行分析。利用本课题组前期构建的表达鸡贫血病毒VP3基因的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3作用于乳腺癌干细胞,分析重组腺病毒对细胞的杀伤作用、干性抑制及增加乳腺癌干细胞药物敏感性的作用。通过靶向癌症干细胞,诱导其分化,抑制其治疗抗性寻找临床癌症治疗的新策略。首先是采用无血清悬浮培养与磁珠分选方法富集分选乳腺癌干细胞,对其自我更新、分化、耐药性等进行分析;其次是利用重组腺病毒作用于乳腺癌干细胞,对乳腺癌干细胞中干细胞比例、细胞增殖能力、细胞凋亡水平、细胞迁移侵袭能力等进行检测分析;之后检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的体内肿瘤形成能力的影响、体内肿瘤杀伤作用;最后利用Ad-VT与紫杉醇联合应用于乳腺癌干细胞后,检测乳腺癌干细胞中干细胞比例、细胞增殖能力、细胞凋亡水平、细胞迁移侵袭能力等,分析Ad-VT是否能够使乳腺癌干细胞对化疗药的敏感性增强,从而抑制癌症干细胞的治疗抗性。本研究主要取得如下结果:1.对乳腺癌干细胞的干性特征进行检测分析后发现,无血清培养条件下,乳腺癌干细胞能够形成乳腺癌细胞球;血清诱导实验显示乳腺癌干细胞能够分化增殖,自我更新能力强于乳腺癌细胞;干细胞调控因子表达上调,过表达与人类肿瘤干细胞相关的多个基因;对化疗药紫杉醇也具有一定的耐药性。2.通过检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的体外抑制作用后发现,Ad-VT与Ad-VP3作用下,CD44+CD24-细胞群比例降低,干细胞调控因子表达下调,乳腺癌干细胞干性受到抑制;Ad-VT与Ad-VP3能够抑制细胞增殖;对细胞线粒体膜电位及凋亡蛋白表达进行检测,结果显示Ad-VT与Ad-VP3能够诱导乳腺癌干细胞线粒体途径的凋亡;细胞迁移与侵袭实验结果也显示乳腺癌干细胞的迁移侵袭能力受到抑制。3.检测重组腺病毒对乳腺癌干细胞的小鼠体内抑制作用。小鼠体内成瘤结果显示Ad-VT与Ad-VP3作用后的乳腺癌干细胞干性受到抑制,失去了体内肿瘤形成的能力;将状态良好的乳腺癌干细胞进行小鼠皮下注射荷瘤,重组腺病毒对荷瘤成功的小鼠进行注射治疗,结果显示Ad-VT与Ad-VP3对乳腺癌干细胞小鼠荷瘤模型具有体内杀伤作用,能够抑制小鼠体内肿瘤生长。4.Ad-VT与紫杉醇联合作用能够抑制乳腺癌干细胞耐药性,Ad-VT与紫杉醇联合使用后对乳腺癌干细胞的干性抑制、诱导细胞凋亡水平、对细胞的增殖抑制、迁移侵袭抑制均显着强于Ad-VT单独治疗组及紫杉醇单独治疗组,并且联合应用增强了对乳腺癌干细胞的小鼠体内肿瘤形成能力的抑制。综上所述,经富集分选的乳腺癌干细胞具有自我更新、分化、治疗抗性等干细胞特性,表达VP3蛋白的重组腺病毒Ad-VT与Ad-VP3对乳腺癌干细胞具有一定的体内外抑制作用,能够抑制乳腺癌干细胞干性,Ad-VT能够增强乳腺癌干细胞对药物的敏感性,抑制乳腺癌干细胞的治疗抗性,增强化疗药紫杉醇抑制乳腺癌干细胞的作用。
二、当前临床流式细胞分析的发展趋势(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、当前临床流式细胞分析的发展趋势(论文提纲范文)
(1)转录因子AP-1与三阴型乳腺癌的关系及其抑制剂T5224对三阴型乳腺癌细胞的作用研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
英文缩写词 |
第1章 绪论 |
1.1 乳腺癌 |
1.1.1 流行病学特征 |
1.1.2 乳腺癌分型 |
1.1.3 乳腺癌治疗 |
1.1.4 乳腺癌预后 |
1.1.5 三阴型乳腺癌 |
1.2 AP-1蛋白 |
1.2.1 AP-1与炎症性疾病 |
1.2.2 AP-1与肿瘤 |
1.3 AP-1抑制剂 |
1.3.1 SP100030 |
1.3.2 Curcumin |
1.3.3 Momordin I |
1.3.4 T5224 |
1.4 立题依据 |
第2章 材料与方法 |
2.1 资料来源 |
2.2 细胞株 |
2.3 主要试剂 |
2.4 主要仪器 |
2.5 细胞培养 |
2.6 T5224配制 |
2.7 RNA提取 |
2.8 全基因组基因表达检测(RNA-Seq) |
2.9 实时荧光定量PCR |
2.10 Western-blot |
2.11 基因沉默 |
2.12 增殖实验 |
2.13 凋亡实验 |
2.14 划痕实验 |
2.15 侵袭实验 |
2.16 ChIP-qPCR |
2.17 统计分析 |
第3章 结果 |
3.1 Fra-1在乳腺癌中的表达水平及其与预后的关系 |
3.1.1 Fra-1在乳腺癌患者组织内的表达水平 |
3.1.2 Fra-1表达水平与乳腺癌患者预后的关系 |
3.2 T5224 对三阴型乳腺癌的作用效果研究 |
3.2.1 AP-1在乳腺癌细胞中的表达水平 |
3.2.2 三阴型乳腺癌细胞中T5224对AP-1表达水平的抑制作用 |
3.2.3 T5224 对三阴型乳腺癌细胞生物学功能的影响 |
3.2.4 T5224 对三阴型乳腺癌细胞全基因组基因表达的影响 |
3.3 AP-1靶基因筛选及功能验证 |
3.3.1 AP-1靶基因筛选 |
3.3.2 OLFML2A在三阴型乳腺癌中的生物学功能 |
第4章 讨论 |
4.1 转录因子AP-1在三阴型乳腺癌中的表达水平 |
4.2 T5224 的生物学作用 |
4.3 T5224 对三阴型乳腺癌细胞全基因组基因表达的影响 |
4.3.1 血管形态发生对乳腺癌的影响 |
4.3.2 粘着斑及细胞外基质对乳腺癌的影响 |
4.3.3 免疫系统及干扰素对乳腺癌的影响 |
4.3.4 PI3K-Akt信号通路对乳腺癌的影响 |
4.3.5 人乳头瘤病毒对乳腺癌的影响 |
4.3.6 Hippo信号通路对乳腺癌的影响 |
4.3.7 钙信号通路对乳腺癌的影响 |
4.4 嗅素结构域蛋白家族与肿瘤 |
4.5 AP-1相关信号传导途径与乳腺癌 |
4.6 下一步研究计划 |
第5章 结论 |
本研究的创新点 |
参考文献 |
作者简介及在攻读学位期间的科研成果 |
项目支撑和资金支持 |
致谢 |
(2)老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究(论文提纲范文)
武汉生物制品研究所博士学位论文创新点概述 |
摘要 |
Abstract |
缩略语表 |
1. 前言 |
1.1 立题依据 |
1.2 研究进展 |
1.3 研究内容和目标 |
2. 第一章60周岁及以上老年人群免疫QIVs前后外周全血Total mRNA表达谱研究 |
引言 |
2.1 材料与方法 |
2.2 结果 |
2.3 讨论 |
2.4 本章小结 |
3. 第二章60周岁及以上老年人群QIVs免疫前后T淋巴细胞分布及动力学特征 |
引言 |
3.1 材料与方法 |
3.2 结果 |
3.3 讨论 |
3.4 本章小结 |
4. 第三章 老年人群QIVs免疫反应主要细胞因子与免疫球蛋白Ig产生及动力学特征 |
引言 |
4.1 材料与方法 |
4.2 结果 |
4.3 讨论 |
4.4 本章小结 |
5. 全文创新性总结 |
6. 文献综述--老年人群流感病毒疫苗有效性评价所面临的挑战 |
6.1 影响流感病毒疫苗有效性评价的混杂因素 |
6.2 流感病毒免疫史对流感病毒疫苗有效性评价的影响 |
6.3 流行病学研究提升针对老年人群开发下一代流感病毒疫苗 |
6.4 结论 |
致谢 |
附录 |
附录 Ⅰ |
附录a. 受试者入选、排除标准及提前终止实验标准 |
附录b. 实验组和对照组QIVs疫苗株 |
附录c. 63 份老年人外周全血转录组测序原始数据Raw-Data存储于GEO公共数据库 |
附录d. Supplementary Materials (Figure S and Table S) |
Figure S |
Table S |
References |
(3)circSYK驱动miR-1285-3p/FGF1/β-catenin信号通路调控激素性股骨头坏死BMSCs成脂和成骨相关机制的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
中英文缩略表 |
第1章 绪论 |
第2章 激素性股骨头坏死病例对照体系建立、BMSCs分离、培养及鉴定 |
概述 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 激素性股骨头坏死病例及对照组体系的建立 |
2.1.2 主要实验试剂 |
2.1.3 实验仪器 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 BMSCs分离、培养及传代 |
2.2.2 BMSCs表面抗原检测 |
2.2.3 BMSCs细胞周期检测 |
2.2.4 BMSCs成脂诱导分化及染色: |
2.2.5 BMSCs成脂能力定量分析 |
2.2.6 BMSCs成骨诱导分化及染色 |
2.2.7 BMSCs成骨能力定量分析 |
2.2.8 统计学分析 |
2.3 结果 |
2.3.1 入组患者信息 |
2.3.2 分离培养的BMSCs形态学特征 |
2.3.3 分离培养的BMSCs表面抗原检测 |
2.3.4 分离培养的BMSCs细胞周期鉴定 |
2.3.5 SONFH组和对照组BMSCs成脂分化能力鉴定 |
2.3.6 SONFH组和对照组BMSCs成骨分化能力鉴定 |
2.4 讨论 |
第3章 构建激素性股骨头坏死BMSCs的circRNA和 mRNA差异基因表达谱 |
概述 |
3.1 实验材料 |
3.1.1 实验试剂 |
3.1.2 实验仪器 |
3.1.3 circRNA和 mRNA芯片信息 |
3.2 方法 |
3.2.1 BMSCs总RNA提取和纯化 |
3.2.2 BMSCscircRNA和 mRNA芯片数据获取和处理 |
3.2.3 实时荧光定量PCR验证circRNA和 mRNA芯片数据 |
3.2.4 统计学分析 |
3.3 结果 |
3.3.1 circRNA芯片数据标准化和差异基因表达谱统计 |
3.3.2 mRNA芯片数据标准化和差异基因表达谱统计 |
3.3.3 差异表达circRNA的验证 |
3.3.4 差异表达mRNA的验证 |
3.4 讨论 |
第4章 生物信息学分析SONFH差异表达基因及调控BMSCs成脂和成骨关键circRNA通路的选择 |
概述 |
4.1 实验材料 |
4.1.1 实验试剂 |
4.1.2 实验仪器 |
4.1.3 生物信息学分析工具 |
4.2 研究方法 |
4.2.1 差异表达circRNA的生物信息学分析 |
4.2.2 关键circRNA-miRNA-mRNA调控通路的选择及基因表达验证 |
4.2.3 统计学分析 |
4.3 结果 |
4.3.1 circRNA的预测靶基因及共表达mRNA韦恩分析 |
4.3.2 激素性股骨头坏死circRNA-miRNA-mRNA调控网络预测 |
4.3.3 激素性股骨头坏死差异表达mRNA的功能富集分析 |
4.3.4 激素性股骨头坏死差异表达基因的蛋白-蛋白互作网络 |
4.3.5 关键circRNA-miRNA-mRNA调控通路的选择 |
4.3.6 激素性股骨头坏死BMSCscircSYK/miR-1285-3p/FGF1 表达调控趋势 |
4.4 讨论 |
第5章 circSYK通过miR-1285-3p/FGF1/β-catenin调控BMSCs成脂和成骨分化的作用机制验证 |
概述 |
5.1 实验材料 |
5.1.1 实验试剂 |
5.1.2 实验仪器 |
5.2 实验方法 |
5.2.1 circSYK干扰实验 |
5.2.2 circSYK过表达实验 |
5.2.3 统计学分析 |
5.3 结果 |
5.3.1 敲低circSYK抑制BMSCs成脂分化,促进BMSCs成骨分化 |
5.3.2 过表达circSYK促进BMSCs成脂分化,抑制BMSCs成骨分化 |
5.4 讨论 |
第6章 miR-1285-3p与 circSYK和 FGF1 结合位点验证 |
概述 |
6.1 实验材料 |
6.1.1 实验试剂 |
6.1.2 实验仪器 |
6.2 实验方法 |
6.2.1 构建circ-SYK和 FGF1 双萤光素酶报告基因质粒 |
6.2.2 将带有目的序列的双萤光素酶报告基因质粒转染293T细胞 |
6.2.3 双萤光素酶报告基因检测 |
6.2.4 统计学分析 |
6.3 结果 |
6.3.1 circ-SYK和 FGF1与miR-1285-3p野生型/突变型结合位点预测 |
6.3.2 circSYK和 FGF1与miR-1285-3p的结合位点验证 |
6.4 讨论 |
第7章 结论 |
创新点与不足 |
参考文献 |
附录 综述 环状RNA在骨科常见疾病中的研究进展 |
综述参考文献 |
作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
致谢 |
(4)星蒌承气汤治疗急性缺血性卒中痰热腑实证机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
符号说明 |
第一部分 文献综述 |
第一章 星蒌承气汤药效物质基础及对缺血性卒中神经保护机制研究进展 |
1 大黄 |
1.1 中医认识 |
1.2 化学成分及神经保护作用 |
2 胆南星 |
2.1 中医认识 |
2.2 化学成分及神经保护作用 |
3 瓜蒌 |
3.1 中医认识 |
3.2 化学成分及神经保护作用 |
4 羌活 |
4.1 中医认识 |
4.2 化学成分及神经保护作用 |
5 芒硝 |
参考文献 |
第二章 基于肠道微生态理论的缺血性卒中病因与发病机制研究进展 |
1 肠道微生态与肠道微生态失调 |
2 菌-肠-脑轴 |
3 从肠到脑的上行通路 |
4 从脑到肠的下行通路 |
5 脑卒中相关危险因素与肠道菌群 |
6 卒中并发症的肠道微生态机制 |
7 结论 |
参考文献 |
前言 |
第二部分 基于网络药理学与分子对接的星蒌承气汤治疗缺血性卒中的机制研究 |
1 研究资料 |
2 研究方法 |
2.1 星蒌承气汤化学活性成分的检索与筛选 |
2.2 星蒌承气汤化学成分及缺血性卒中靶点筛选 |
2.3 交集基因蛋白互作网络(PPI)分析 |
2.4 基因本体论(Gene ontology,GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 |
2.5 可视化网络构建与分析 |
2.6 分子对接 |
3 研究结果 |
3.1 星蒌承气汤潜在化学活性成分的检索与筛选结果 |
3.2 星蒌承气汤活性成分靶点及缺血性卒中靶点预测结果 |
3.3 GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析结果 |
3.4 可视化网络构建与分析 |
3.5 分子对接 |
4 讨论 |
4.1 网络药理学在中医药现代化研究中的应用 |
4.2 基于网络药理学方法探讨星蒌承气汤活性成分 |
4.3 基于网络药理学方法探讨星蒌承气汤效应机制 |
5 小结 |
第三部分 实验研究 |
实验一 星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证小鼠神经保护作用及网络药理学关键靶点及通路实验验证 |
1 实验材料 |
1.1 实验对象 |
1.2 实验试剂 |
1.3 实验仪器设备与耗材 |
1.4 实验药物的配置 |
2 实验方法 |
2.1 分组与给药 |
2.2 模型制备 |
2.3 神经功能评分 |
2.4 除胶实验 |
2.5 TTC染色 |
2.6 取材及处理 |
2.7 TUNEL法检测皮层梗死周围细胞凋亡情况 |
2.8 脑组织ELISA |
2.9 脑组织Western blot |
2.10 统计分析 |
3 研究结果 |
3.1 神经功能评分 |
3.2 除胶实验 |
3.3 脑梗死体积评价 |
3.4 对缺血侧脑组织细胞凋亡的影响 |
3.5 星蒌承气汤对缺血侧脑组织TNF-α的影响 |
3.6 星蒌承气汤对缺血侧脑组织AKT、p-AKt、PI3K及NF-κB蛋白表达的影响 |
4 讨论 |
4.1 星萎承气汤是治疗中风病急性期痰热腑实证的具有确切临床疗效的代表方剂 |
4.2 化痰通腑法代表方星蒌承气汤脑保护作用及中医理论探讨 |
4.3 卒中模型神经功能评分探讨 |
4.4 卒中模型行为学选择 |
4.5 星蒌承气汤与细胞凋亡 |
4.6 网络药理学关键靼点及通路实验验证 |
5 小结 |
实验二 星蒌承气汤对中风急性期痰热腑实证小鼠菌-肠-脑轴影响 |
1 实验材料 |
1.1 实验对象 |
1.2 实验试剂 |
1.3 实验仪器设备与耗材 |
1.4 实验药物的配置 |
2 实验方法 |
2.1 分组与给药 |
2.2 模型制备 |
2.3 取材及处理 |
2.4 免疫组化 |
2.5 免疫荧光 |
2.6 ELISA检测 |
2.8 肠道菌群分析 |
2.9 盲肠内容物短链脂肪酸(SCFAs)检测 |
2.10 统计分析 |
3 结果 |
3.1 星蒌承气汤对中风痰热腑实证小鼠肠道菌群的影响 |
3.2 星蒌承气汤对中风痰热腑实证小鼠肠道菌群代谢产物短链脂肪酸及短链脂肪酸受体的影响 |
3.3 星蒌承气对菌-肠-脑轴神经-内分泌-免疫途径相关指标影响 |
4 讨论 |
4.1 基于脑肠互动理论探讨化痰通腑法治疗中风病的理论基础 |
4.2 星蒌承气汤对短链脂肪酸影响 |
4.3 星萎承气汤对菌-肠-脑轴自主神经途径影响 |
4.4 星蒌承气汤对菌-肠-脑轴神经内分泌途径影响 |
4.5 星萎承气汤对菌-肠-脑轴免疫途径影响 |
5 小结 |
实验三 星萎承气汤对中风急性期痰热腑实证伪无菌小鼠菌-肠-脑轴影响 |
1 实验材料 |
1.1 实验对象 |
1.2 实验试剂 |
1.3 实验仪器设备与耗材 |
1.4 实验药物的配置 |
2 实验方法 |
2.1 分组与给药 |
2.2 模型制备 |
2.3 神经功能评分 |
2.4 除胶实验 |
2.5 TTC染色 |
2.6 取材及处理 |
2.7 免疫组化、免疫荧光 |
2.8 ELISA检测 |
2.9 肠道菌群分析 |
2.10 盲肠内容物SCFAs分析 |
2.11 统计分析 |
3 结果 |
3.1 神经功能评分 |
3.2 除胶实验 |
3.3 脑梗死体积评价 |
3.4 肠道菌群 |
3.5 短链脂肪酸 |
3.6 星蒌承气汤对伪无菌小鼠菌-肠-脑轴神经-内分泌-免疫途径相关指标影响 |
4 讨论 |
4.1 伪无菌模型建立及评价 |
4.2 肠道菌群是星蒌承气汤发挥作用的重要靶点 |
4.3 星蒌承气汤治疗急性期缺血性卒中机制的初步探讨 |
5 小结 |
结语 |
创新点 |
参考文献 |
附录 |
致谢 |
在学期间主要研究成果 |
(5)具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的设计、合成及生物活性研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
缩写词表 |
第1章 绪论 |
1.1 癌症的概述 |
1.2 癌症的治疗手段 |
1.3 抗体偶联药物的概述 |
1.4 抗体偶联药物的作用机制 |
1.5 抗体偶联药物三大组成元件的选择 |
1.5.1 抗体偶联药物抗体的选择 |
1.5.2 抗体偶联药物连接子的选择 |
1.5.3 抗体偶联药物毒素的选择 |
1.6 抗体偶联药物的研究进展 |
1.6.1 已上市的抗体偶联药物 |
1.6.2 我国抗体偶联药物研发现状 |
1.7 课题设计思路 |
第2章 具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的设计 |
2.1 基于免疫协同机制的新型MMAE-ADC(Ⅰ类)的设计 |
2.1.1 MMAE-ADC抗体部分的不足及免疫疗法的优势 |
2.1.2 基于免疫协同机制的新型MMAE-ADC(Ⅰ类)的构建 |
2.2 基于紫外光控释药机制的新型ADC(Ⅱ类)的设计 |
2.2.1 当前ADC连接子释药机制的不足 |
2.2.2 基于紫外光控释药机制的新型ADC(Ⅱ类)的构建 |
2.3 基于硝基还原酶释药机制的新型ADC(Ⅲ类)的设计 |
2.3.1 酶可裂解型连接子释药机制的不足 |
2.3.2 实体瘤特异的硝基还原酶 |
2.3.3 基于硝基还原酶释药机制的新型ADC(Ⅲ类)的构建 |
2.4 以Talazoparib作为新机制毒素的ADC(IV类)的设计 |
2.4.1 当前ADC细胞毒素存在的不足 |
2.4.2 PARP抑制剂Talazoparib及其作用机制 |
2.4.3 Talazoparib前药及相应ADC的构建 |
2.5 本章小结 |
第3章 具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的合成及表征 |
3.1 具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的合成 |
3.1.1 基于免疫协同机制的新型MMAE-ADC(Ⅰ类)的合成 |
3.1.2 基于紫外光控释药机制的新型ADC(Ⅱ类)的合成 |
3.1.3 基于硝基还原酶释药机制的新型ADC(Ⅲ类)的合成 |
3.1.4 以Talazoparib作为新机制毒素的ADC(IV类)的合成 |
3.2 具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的表征 |
3.2.1 二喹啉甲酸法测ADC浓度 |
3.2.2 ADC DAR值的测量 |
3.2.3 ADC聚合度检测 |
3.2.4 ADC内毒素检测 |
3.3 本章小结 |
第4章 具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的生物活性评价 |
4.1 基于免疫协同机制的新型MMAE-ADC(Ⅰ类)的生物评价 |
4.1.1 细胞抗原表达检测 |
4.1.2 PD-L1 抗体内化检测 |
4.1.3 ADC蛋白亲和力实验 |
4.1.4 激光共聚焦荧光实验 |
4.1.5 体外细胞毒性评估 |
4.1.6 外周血T细胞激活实验 |
4.1.7 小鼠体内药效学实验 |
4.2 基于紫外光控释药机制的新型ADC(Ⅱ类)的生物评价 |
4.2.1 连接子-毒素载荷的稳定性实验 |
4.2.2 连接子-毒素载荷的紫外光解实验 |
4.2.3 连接子-毒素载荷的微管蛋白抑制实验 |
4.2.4 连接子-毒素载荷的细胞毒性实验 |
4.2.5 ADC抗原亲和力实验 |
4.2.6 ADC与细胞表面HER2 抗原结合实验 |
4.2.7 激光共聚焦荧光实验 |
4.2.8 ADC光照前后的细胞毒性评价 |
4.2.9 小鼠荧光成像实验 |
4.3 基于硝基还原酶释药机制的新型ADC(Ⅲ类)的生物评价 |
4.3.1 连接子-毒素载荷的酶解释药实验 |
4.3.2 ADC体外细胞水平释药实验 |
4.3.3 ADC体外细胞毒性实验 |
4.4 以Talazoparib作为新机制毒素的ADC(IV类)的生物评价 |
4.4.1 Talazoparib紫外光激活前药的生物评价 |
4.4.2 Talazoparib NTR缺氧激活前药的生物评价 |
4.5 本章小结 |
第5章 实验部分 |
5.1 化学实验部分 |
5.1.1 材料与仪器 |
5.1.2 化合物的合成 |
5.2 偶联实验部分 |
5.2.1 材料与仪器 |
5.2.2 抗体与药物的偶联 |
5.3 表征实验部分 |
5.3.1 材料与仪器 |
5.3.2 表征实验方法 |
5.4 生物实验部分 |
5.4.1 材料与仪器 |
5.4.2 生物实验方法 |
第6章 结论 |
创新点 |
参考文献 |
附图 |
作者简介及博士期间学术成果 |
致谢 |
(6)氧化压力在丙戊酸引起肝毒性中的作用研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
英文缩略词表 |
第一章 前言 |
1.1 丙戊酸的临床应用现状 |
1.2 丙戊酸与肝毒性 |
1.2.1 肝功能异常 |
1.2.2 特异质肝毒性 |
1.2.3 非酒精性脂肪肝 |
1.3 丙戊酸代谢与肝毒性 |
1.3.1 葡萄糖醛酸化 |
1.3.2 线粒体β氧化 |
1.3.3 细胞色素P450 氧化 |
1.4 氧化压力与肝毒性 |
1.4.1 氧化压力概述 |
1.4.2 氧化压力的来源 |
1.4.3 氧化压力引起肝毒性的机制 |
1.5 铁死亡与肝毒性 |
1.5.1 铁死亡概述 |
1.5.2 铁死亡的机制 |
1.5.3 铁死亡与非酒精性脂肪肝 |
1.6 本研究的内容及意义 |
第二章 在癫痫患者中抗氧化酶基因多态性对丙戊酸引起的肝毒性的研究 |
2.1 研究背景 |
2.2 实验材料与仪器 |
2.2.1 DNA样本 |
2.2.2 实验试剂 |
2.2.3 实验仪器 |
2.2.4 溶液配制 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 DNA提取 |
2.3.2 引物设计 |
2.3.3 PCR反应 |
2.3.4 琼脂糖凝胶电泳 |
2.4 实验结果 |
2.4.1 癫痫患者的自然情况统计 |
2.4.2 PCR产物检测 |
2.4.3 抗氧化酶基因型分布频率的Hardy-Weinberg平衡 |
2.4.4 癫痫患者中抗氧化酶SNP分布频率 |
2.4.5 性别与癫痫患者中抗氧化酶SNP分布频率的关系 |
2.4.6 年龄与癫痫患者中抗氧化酶SNP分布频率的关系 |
2.4.7 抗氧化酶SNP对 VPA血药浓度的影响 |
2.4.8 VPA致肝毒性风险因素的回归分析 |
2.5 讨论与小结 |
第三章 CYP2E1-ROS-CD36/DGAT2 轴在丙戊酸引起肝脂质化中的作用 |
3.1 研究背景 |
3.2 实验材料与仪器 |
3.2.1 实验材料 |
3.2.2 实验试剂 |
3.2.3 溶液配制 |
3.2.4 实验仪器 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 细胞培养 |
3.3.2 MTT实验 |
3.3.3 Western blot |
3.3.4 实时定量PCR |
3.3.5 流式细胞术检测细胞内氧化压力 |
3.3.6 CYP2E1 酶活力检测 |
3.3.7 运用CRISPR/Cas9 技术敲除CYP2E1 |
3.3.8 生化指标检测 |
3.3.9 细胞的油红O染色 |
3.3.10 VPA引起肝脂质化的动物模型 |
3.4 实验结果 |
3.4.1 VPA对肝脂质化的影响 |
3.4.2 ROS对 VPA诱导的肝脂质化的作用 |
3.4.3 CYP2E1对VPA诱导的肝脂质化的作用 |
3.4.4 VPA对脂代谢相关基因表达的影响 |
3.5 讨论及小结 |
第四章 铁死亡在丙戊酸引起肝毒性中的作用 |
4.1 研究背景 |
4.2 实验材料与仪器 |
4.2.1 实验材料 |
4.2.2 实验试剂 |
4.2.3 溶液配制 |
4.2.4 实验仪器 |
4.3 实验方法 |
4.3.1 Western blot |
4.3.2 实时定量PCR |
4.3.3 铁含量检测 |
4.3.4 生化指标检测 |
4.3.5 铁死亡与丙戊酸引起的肝毒性动物模型 |
4.4 实验结果 |
4.4.1 VPA对小鼠肝脏的毒性作用 |
4.4.2 VPA诱发铁死亡 |
4.4.3 VPA对铁代谢的影响 |
4.4.4 铁代谢对VPA引起的肝毒性的影响 |
4.4.5 铁死亡对VPA引起的肝毒性的影响 |
4.5 讨论及小结 |
结论 |
参考文献 |
附录 |
博士期间发表的论文 |
致谢 |
(7)肿瘤微环境响应性聚氨基酸纳米药物用于前列腺癌化学免疫治疗(论文提纲范文)
中文摘要 |
abstract |
第1章 绪论 |
1.1 前列腺癌概述 |
1.1.1 前列腺癌流行病学 |
1.1.2 前列腺癌病因学 |
1.1.3 前列腺癌临床分期 |
1.1.4 前列腺癌诊断 |
1.1.5 前列腺癌的传统治疗方法 |
1.1.6 前列腺癌免疫治疗的进展 |
1.2 ICD诱导化疗纳米制剂增强联合化学免疫治疗 |
1.2.1 化学治疗纳米制剂与免疫检查点抑制剂联合 |
1.2.2 化学纳米制剂联合IDO抑制剂 |
1.2.3 化学纳米制剂联合细胞因子 |
1.2.4 化学纳米制剂联合Toll样受体激动剂 |
1.3 选题依据和研究内容 |
第2章 肿瘤微环境响应性聚氨基酸纳米药物增强前列腺癌化疗效果 |
2.1 引言 |
2.2 实验用品 |
2.2.1 实验仪器 |
2.2.2 实验试剂和药品 |
2.2.3 实验耗材 |
2.3 实验方法 |
2.3.1 DOX的包封及载药率的测量 |
2.3.2 DOX NP的表征 |
2.3.3 体外药物释放实验 |
2.3.4 细胞培养 |
2.3.5 体外细胞增殖抑制实验 |
2.3.6 细胞摄取实验 |
2.3.7 体内组织分布 |
2.3.8 实验动物及前列腺癌动物模型构建 |
2.3.9 体内肿瘤抑制 |
2.3.10 血清的生化指标 |
2.3.11 组织病理学 |
2.3.12 免疫组织化学 |
2.3.13 统计学分析 |
2.4 结果与讨论 |
2.4.1 DOX NP的制备 |
2.4.2 体外药物释放 |
2.4.3 体外细胞增殖抑制实验 |
2.4.4 细胞摄取实验 |
2.4.5 体内组织分布实验 |
2.4.6 体内肿瘤抑制实验 |
2.4.7 生化检测 |
2.4.8 肿瘤组织病理学与免疫组织化学染色分析 |
2.4.9 主要脏器的组织病理学分析 |
2.5 本章小结 |
第3章 肿瘤微环境响应性聚氨基酸纳米药物实现前列腺癌的协同化学免疫治疗 |
3.1 引言 |
3.2 实验用品 |
3.2.1 主要实验仪器 |
3.2.2 实验试剂 |
3.2.3 实验耗材 |
3.3 实验方法 |
3.3.1 体外ICD水平评估 |
3.3.2 体内抗肿瘤效应及抗肿瘤免疫调节 |
3.3.3 样品收集与制备 |
3.3.4 免疫细胞的分离与检测 |
3.3.5 细胞因子IFN-γ及TGF-β的检测 |
3.3.6 组织病理学与免疫组织化学 |
3.3.7 统计学分析 |
3.4 结果与讨论 |
3.4.1 体外ICD水平检测 |
3.4.2 体内肿瘤抑制实验 |
3.4.3 免疫细胞检测 |
3.4.4 细胞因子IFN-γ及TGF-β的检测 |
3.4.5 肿瘤组织病理学与免疫组织化学分析 |
3.4.6 组织病理学 |
3.5 本章小结 |
第4章 全文总结 |
参考文献 |
作者简介及在学期间所获得的科研成果 |
致谢 |
(8)芳香烃受体AHR的内源性配体ITE抗神经胶质瘤的作用机制研究(论文提纲范文)
摘要 |
abstract |
缩略词表 |
1 ITE抑制神经胶质瘤的作用机制 |
1.1 引言 |
1.1.1 神经胶质瘤的研究背景 |
1.1.2 AHR的研究背景 |
1.1.3 AHR与神经胶质瘤 |
1.1.4 迁移相关基因VAV3 |
1.1.5 迁移相关基因MYH9 |
1.1.6 研究目的及意义 |
1.2 实验材料和方法 |
1.2.1 实验材料 |
1.2.2 实验方法 |
1.3 实验结果 |
1.3.1 ITE对迁移相关基因VAV3 的作用 |
1.3.2 ITE对2D及3D培养细胞的影响 |
1.3.3 ITE对人胶质瘤细胞系U87MG迁移相关基因MYH9的影响 |
1.4 讨论 |
1.5 结论 |
2 AHR配体ITE与PD1抗体联用对神经胶质瘤免疫的影响 |
2.1 引言 |
2.1.1 GBM的免疫疗法 |
2.1.2 靶向特定免疫抑制因子 |
2.1.3 免疫检查点的介绍 |
2.1.4 GBM的免疫微环境 |
2.1.5 AHR的免疫调控 |
2.1.6 靶向AHR通路 |
2.1.7 研究目的及意义 |
2.2 材料和方法 |
2.2.1 实验材料 |
2.2.2 实验方法 |
2.3 实验结果 |
2.3.1 ITE与PD1抗体协同作用增加原位GL261模型鼠的存活率 |
2.3.2 ITE与PD1抗体协同作用,增加细胞毒性免疫细胞的浸润 |
2.3.3 ITE与PD1协同作用对TH17/Treg比的影响 |
2.3.4 ITE与PD1协同作用增加CD4+CD8+T细胞的比例 |
2.3.5 ITE减少了原位胶质瘤模型鼠脑肿瘤组织中MDSC的浸润 |
2.3.6 ITE与KYN处理对GL261细胞中IL11的影响 |
2.3.7 ITE处理显着抑制胶质瘤细胞中STAT3的磷酸化 |
2.4 讨论 |
2.5 结论 |
3 展望 |
致谢 |
参考文献 |
作者简介 |
(9)己酮可可碱通过ROS诱导人结直肠癌SW620细胞凋亡机制的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
缩略语对照表 |
第一章 绪论 |
1.1 结直肠癌 |
1.1.1 结直肠癌概述 |
1.1.2 结直肠癌发病因素 |
1.1.3 结直肠癌诊断 |
1.1.4 结直肠癌治疗 |
1.2 细胞周期 |
1.2.1 细胞周期概述 |
1.2.2 细胞周期调控 |
1.2.3 细胞周期与癌症 |
1.2.4 细胞周期检测 |
1.3 细胞凋亡 |
1.3.1 细胞凋亡概述 |
1.3.2 细胞凋亡途径 |
1.3.3 细胞凋亡与癌症 |
1.3.4 细胞凋亡检测 |
1.4 活性氧 |
1.4.1 活性氧概述 |
1.4.2 活性氧的调控因子 |
1.4.3 活性氧与PI3K-AKT信号通路 |
1.4.4 活性氧与癌症 |
1.4.5 活性氧检测 |
1.5 细胞自噬 |
1.5.1 细胞自噬概述 |
1.5.2 细胞自噬与ROS |
1.5.3 细胞自噬与凋亡 |
1.5.4 细胞自噬与癌症 |
1.5.5 细胞自噬检测 |
1.6 己酮可可碱 |
1.6.1 己酮可可碱概述 |
1.6.2 己酮可可碱结构 |
1.6.3 己酮可可碱功能 |
1.7 实验意义 |
1.8 实验思路设计 |
第二章 实验材料与方法 |
2.1 实验材料 |
2.1.1 实验细胞株 |
2.1.2 实验试剂 |
2.1.3 实验仪器 |
2.1.4 实验溶液配制 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 细胞复苏 |
2.2.2 细胞传代 |
2.2.3 细胞换液 |
2.2.4 细胞冻存 |
2.2.5 MTT法检测细胞活力 |
2.2.6 细胞形态学观察 |
2.2.7 DAPI染色观察 |
2.2.8 细胞凋亡检测 |
2.2.9 细胞周期检测 |
2.2.10 细胞活性氧(ROS)检测 |
2.2.11 WB检测 |
2.2.12 处理数据 |
第三章 实验结果 |
3.1 PTX抑制人结直肠癌细胞增殖 |
3.1.1 PTX对人结直肠癌SW620、HCT116、SW480 细胞增殖的影响 |
3.1.2 PTX对人正常结肠NCM460 细胞增殖的影响 |
3.1.3 PTX对人结直肠癌SW620 细胞增殖影响的形态学观察 |
3.2 PTX引起人结直肠癌SW620 细胞阻遏G0/G1 期 |
3.2.1 流式细胞术检测PTX对SW620 细胞周期的影响 |
3.2.2 WB检测PTX对细胞周期相关蛋白的影响 |
3.3 PTX对人结直肠癌SW620 细胞凋亡的影响 |
3.3.1 DAPI染色观察PTX作用后SW620 细胞凋亡变化 |
3.3.2 流式细胞术检测PTX对SW620 细胞凋亡的作用 |
3.3.3 WB检测PTX对细胞凋亡相关蛋白的影响 |
3.3.4 PTX对 SW620 细胞内活性氧(ROS)水平的影响 |
3.3.5 NAC减弱PTX对 SW620 细胞增殖的抑制作用 |
3.3.6 PTX通过抑制AKT/GSK-3β信号通路影响SW620 细胞凋亡 |
3.3.7 PTX通过ROS抑制AKT/GSK-3β信号通路影响SW620 细胞凋亡 |
3.4 PTX对人结直肠癌SW620 细胞自噬的影响 |
3.4.1 WB检测PTX对细胞自噬相关蛋白的影响 |
3.4.2 3-MA减弱PTX对 SW620 细胞增殖的抑制作用 |
3.4.3 PTX通过ROS对细胞自噬相关蛋白的影响 |
第四章 讨论 |
结论与展望 |
结论 |
创新点 |
不足之处 |
展望 |
参考文献 |
致谢 |
攻读硕士学位期间取得的科研成果 |
(10)鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
中英文缩略词 |
第一章 前言 |
1.1 凋亡素 |
1.2 溶瘤腺病毒与肿瘤治疗 |
1.3 癌症干细胞研究进展 |
1.3.1 癌症干细胞的概念 |
1.3.2 CSCs的鉴定 |
1.3.3 CSCs的特征 |
1.3.4 CSCs转录因子的标志 |
1.3.5 CSCs与癌症转移 |
1.3.6 CSC与临床治疗 |
1.3.7 CSCs与细胞凋亡 |
第二章 乳腺癌干细胞干性特征分析 |
2.1 材料 |
2.1.1 细胞 |
2.1.2 试剂和材料 |
2.1.3 仪器和设备 |
2.2 实验方法 |
2.2.1 乳腺癌干细胞MCF7-CSC分选培养与传代 |
2.2.2 MCF7-CSC血清诱导分化 |
2.2.3 细胞克隆形成能力 |
2.2.4 Western Blot检测MCF7-CSC干细胞调控因子表达水平 |
2.2.5 PCR Array检测人类肿瘤干细胞相关干性基因表达 |
2.2.6 MCF7-CSC的耐药性检测 |
2.2.7 数据处理 |
2.3 结果 |
2.3.1 MCF7-CSC分选培养 |
2.3.2 MCF7-CSC血清诱导分化能力 |
2.3.3 MCF7-CSC细胞克隆形成能力 |
2.3.4 MCF7-CSC干细胞调控因子表达 |
2.3.5 MCF7-CSC人类肿瘤干细胞相关干性基因表达 |
2.3.6 MCF7-CSC的耐药性检测 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 重组腺病毒对MCF7-CSC的抑制作用 |
3.1 材料 |
3.1.1 细胞、毒株 |
3.1.2 试剂和材料 |
3.1.3 仪器和设备 |
3.2 实验方法 |
3.2.1 重组腺病毒制备、纯化与毒价测定 |
3.2.2 重组腺病毒对MCF7-CSC干性抑制 |
3.2.3 重组腺病毒对MCF7-CSC的增殖抑制 |
3.2.4 重组腺病毒对MCF7-CSC的凋亡诱导作用 |
3.2.5 重组腺病毒对MCF7-CSC迁移侵袭能力的抑制 |
3.3 结果 |
3.3.1 重组腺病毒对MCF7-CSC的干性抑制 |
3.3.2 CFSE检测重组腺病毒对MCF7-CSC的增殖抑制 |
3.3.3 重组腺病毒对MCF7-CSC的凋亡诱导作用 |
3.3.4 重组腺病毒对MCF7-CSC迁移侵袭能力的抑制 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第四章 重组腺病毒对MCF7-CSC的小鼠体内抑制 |
4.1 材料 |
4.1.1 毒株和动物 |
4.1.2 试剂和材料 |
4.1.3 仪器和设备 |
4.2 实验方法 |
4.2.1 重组腺病毒对MCF 7-CSC小鼠体内成瘤能力的抑制 |
4.2.2 重组腺病毒对MCF 7-CSC小鼠体内肿瘤杀伤作用 |
4.3 结果 |
4.3.1 MCF 7-CSC小鼠体内成瘤能力的检测 |
4.3.2 重组腺病毒对MCF 7-CSC的小鼠体内杀伤作用 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
第五章 Ad-VT与 MCF7-CSC药物敏感性 |
5.1 材料 |
5.1.1 毒株和动物 |
5.1.2 试剂和材料 |
5.1.3 仪器和设备 |
5.2 实验方法 |
5.2.1 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的干性抑制 |
5.2.2 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的增殖抑制 |
5.2.3 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的凋亡诱导 |
5.2.4 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的迁移侵袭能力抑制 |
5.2.5 Ad-VT与紫杉醇对MCF7-CSC的小鼠体内肿瘤形成能力抑制 |
5.3 结果 |
5.3.1 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的干性抑制 |
5.3.2 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的增殖抑制 |
5.3.3 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的凋亡诱导 |
5.3.4 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的迁移侵袭能力抑制 |
5.3.5 Ad-VT促进紫杉醇对MCF7-CSC的小鼠体内成瘤能力抑制 |
5.4 讨论 |
5.5 小结 |
第六章 结论与展望 |
6.1 结论 |
6.2 展望 |
6.3 主要创新点 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间发表论文情况 |
四、当前临床流式细胞分析的发展趋势(论文参考文献)
- [1]转录因子AP-1与三阴型乳腺癌的关系及其抑制剂T5224对三阴型乳腺癌细胞的作用研究[D]. 赵倩. 吉林大学, 2021(01)
- [2]老年人群接种四价灭活流感病毒裂解疫苗免疫机制的系统生物学研究[D]. 杨景. 武汉生物制品研究所, 2021(01)
- [3]circSYK驱动miR-1285-3p/FGF1/β-catenin信号通路调控激素性股骨头坏死BMSCs成脂和成骨相关机制的研究[D]. 刘雨哲. 吉林大学, 2021(01)
- [4]星蒌承气汤治疗急性缺血性卒中痰热腑实证机制研究[D]. 高强. 北京中医药大学, 2021(01)
- [5]具有抗肿瘤作用的新型抗体偶联药物的设计、合成及生物活性研究[D]. 李家国. 吉林大学, 2021(01)
- [6]氧化压力在丙戊酸引起肝毒性中的作用研究[D]. 马琳沣. 吉林大学, 2021(01)
- [7]肿瘤微环境响应性聚氨基酸纳米药物用于前列腺癌化学免疫治疗[D]. 刘剑华. 吉林大学, 2021(01)
- [8]芳香烃受体AHR的内源性配体ITE抗神经胶质瘤的作用机制研究[D]. 赵丽娇. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [9]己酮可可碱通过ROS诱导人结直肠癌SW620细胞凋亡机制的研究[D]. 杨丽婷. 西北大学, 2021(12)
- [10]鸡贫血病毒VP3基因对乳腺癌干细胞的作用研究[D]. 李文杰. 广西大学, 2021(01)