一、鸡胚胎体外操作技术的研究现状和进展（论文文献综述）
周青青,张琼谊,余桂媛,闫昌誉,黄蓉萍,韩绍聪,李怡芳,李维熙,何蓉蓉,栗原博[1]（2021）在《鸡胚模型在生物活性评价中的应用》文中指出实验动物模型在生物活性筛选及安全性评价等方面发挥着重要的作用,但由于传统的哺乳类动物实验模型难以进行快速的活性评价,而细胞等体外实验方法也具有一定的局限性。因此,线虫、果蝇及斑马鱼等模式动物已被广泛使用。其中,与传统的实验动物模型相比,鸡胚模型具有操作简便、取材容易、实验成本低及实验周期短等特点。此外,由于鸡胚发育过程清晰、易于观察及孵育期间不受母体代谢的影响,因此有利于直接评价生物活性及对不同发育阶段的作用。基于上述理由,本文对鸡胚模型在生物活性评价中的应用进行综述,旨在为该实验模型的应用提供有益的参考。
李安龙[2]（2021）在《机器人辅助视网膜静脉注射的注药器械研究》文中指出视网膜静脉阻塞是常见的视网膜血管疾病之一,导致视力严重下降甚至失明,临床上针对该疾病尚无有效的治疗方法。近年来,一种创新型的手术术式视网膜静脉注射即直接将溶栓药物注射到阻塞的视网膜静脉中溶解血栓,为患者带来了新的曙光。由于视网膜的规模和脆弱性,以及医生有限的定位精度和力感知,视网膜静脉手术注射仍然是一个具有挑战和风险的过程。手术机器人定位精度高、稳定性好,为视网膜静脉注射手术的实现提供了良好的解决方案。本研究从视网膜静脉注射手术出发,本文研究了一款用于视网膜静脉注射的注药器械,可以实现视网膜静脉穿刺,自动注射溶栓药物。且具备力感知功能,实时感知器械与视网膜组织的接触力。并配合双臂机械人进行离体动物实验验证了注药器械可行性。首先进行了高精度注药器械的研究,为视网膜静脉注射手术实现奠定基础。介绍了眼科显微手术机器人系统,确定了用于视网膜静脉注射的注药器械精度、运动空间、自由度和功能。研究了一款配合双臂机器人使用的视网膜静脉注药器械,注药器械由高精度驱动机构和双刚度级联结构的微针组成。驱动机构实现了微针旋转定位、直线进给和自动注射的功能。针对临床场景下目标血管直径通常小于200μm,微针末端外径80μm。注药器械封装完整,外部零件均易消毒,微针更换便捷,符合医生的操作习惯。其次搭建了三维微力感知系统,为视网膜静脉注射手术操作保驾护航。依据光纤布拉格光栅传感器原理,将3根光纤布拉格光栅传感器集成到微针上,实现了高精度的接触力感知。集成标定平台,采用直接标定法对横向力进行标定,采用间接标定法对轴向力进行标定。三个方向力的测量值与实际值的RMS误差分别为0.24 m N、0.18 m N和1.71 m N。二维力和三维力测量值与实际值的RMS误差分别为0.3 m N和1.73 m N。最后,通过离体动物实验,验证了注药器械视网膜静脉注射手术的可行性。规划视网膜静脉注射手术流程,配合双臂机器人对离体猪眼球视网膜静脉和十二天的鸡胚胎血管进行注射实验。结果表明,该注药器械可以成功检测到穿刺现象,并将t-PA溶液注射血管中。实验过程中,可以实时感知器械与组织的三维接触力。15组离体猪眼球视网膜静脉穿刺力的平均值为9.98 m N。17组鸡胚胎血管穿刺力的平均值为12.05 m N。通过本课题的研究,注药器械配合双臂机器人实现了机器人辅助视网膜静脉注射操作。注药器械的高精度驱动机构和双刚度级联结构微针,实现视网膜静脉注射功能。三维微力感知系统实时感知器械与组织的接触力,保障手术安全操作。离体动物实验为下一步活体动物试验和临床手术奠定基础。
袁霞[3]（2021）在《CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究》文中研究表明在哺乳动物中,可以通过体细胞核移植、体外受精和胚胎移植等胚胎工程技术以及超低温冷冻技术实现种质资源的保护和物种复原。然而由于禽类为卵生动物,其胚胎发育方式与哺乳动物相比有很大差异,导致这些胚胎工程技术和冷冻保存技术无法在禽类上广泛应用,极大地阻碍了禽类胚胎工程的研究和珍稀物种保护工作。而禽类原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）具有迁移的特性,体外培养的鸡PGCs注入正常孵化的鸡胚血管后可在受体胚胎性腺中增殖并产生了嵌合体鸡,且鸡PGCs移植到鸭早期胚胎中也能够获得嵌合体鸭,表明PGCs的异体/种间移植或许能解决禽类种质资源保存的问题。然而由于分离原代PGCs细胞数量少,且需以牺牲早期胚胎为代价,导致PGCs异种间移植应用并不广泛,禽类种质资源保护仍面临巨大难题。2006年,诱导干细胞技术问世,体细胞经过诱导重编程能够形成与胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）类似的诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPS）,诱导体细胞重编程技术的出现给为珍稀禽类的保种、转基因禽类的生产等研究开辟了新思路,诱导体细胞重编程技术能够为禽类的胚胎工程和转基因工程研究提供新的干细胞来源,诱导重编程所需的禽类体细胞的分离和冷冻技术相对简单,能够短时间获取大量的细胞,并且对个体不会造成较大伤害,因此,若能通过诱导重编程技术将禽类体细胞重编程为iPS并进一步诱导成PGCs,便能极大地解决PGCs分离困难且无法大量获得的难题。目前,诱导体细胞重编程技术已在小鼠、人、大鼠、猪、猴、牛、羊、鸡等多个物种上成功应用。本课题组前期建立了原代PGCs迁移归巢模型并成功产生了后代,同时建立了 CEF诱导鸡iPS并进一步诱导分化为iPGCs的转分化体系,但这一转分化体系的诱导效率较低,且CEF转分化形成的iPGCs细胞是否具有原代PGCs同样的产生后代的能力仍不清楚。因此,本研究利用OCT4、SOX2、NANOG、LIN28（OSNL）因子体系诱导黑羽狼山鸡CEF重编程为iPS,对该体系进行优化,通过BMP4/BMP8b/EGF体系将其诱导分化为iPGCs,进一步通过转录组测序对不同体系诱导获得的iPS细胞及iPGCs进行分析,分别比较其与原代ESCs和PGCs之间的异同,最后通过鸡胚血管移植的技术将黑羽狼山鸡iPGCs移植到受体隐性白羽鸡中,孵化出壳后饲养至性成熟,通过公母鸡自交产生后代,借助微卫星检测以及基因组重测序分析后代鸡是否来源于黑羽狼山鸡iPGCs,为实现PGCs在禽类种质资源保护过程中的广泛应用奠定基础。研究结果如下:（1）鸡iPS诱导体系的优化本研究利用OCT4、SOX2、NANOG和LIN28A（OSNL）重编程体系对鸡成纤维细胞CEF进行诱导重编程,获得了与ESCs有相似特性的狼山鸡iPS,为碱性磷酸酶染色阳性,表达SSEA-1蛋白,体外能够分化形成类胚体且表达三胚层标记基因。荧光定量结果显示,从诱导重编程的第6天开始,内源性多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等的表达逐渐被激活,而成纤维细胞标记基因Thy-1的表达逐渐被沉默。对重编程过程中不同天数的糖酵解相关基因表达、酶活性、葡萄糖摄取量及乳酸产生量的变化进行检测,结果显示,从诱导的第6天开始,重编程过程中糖酵解相关基因Hk1,Ldha,Glut1,Pfkp表达逐渐上调,并且糖酵解关键限速酶己糖激酶（HK）、乳酸脱氢酶（LDH）及果糖-6-磷酸激酶（PFK）活性在诱导第9天均显着增强（P<0.05）。同时,葡萄糖摄取量逐渐增加,乳酸产生量出现极显着堆积（P<0.01）,表明鸡CEF诱导重编程为iPS的过程中糖酵解被激活。此外,随着重编程的进行,氧化磷酸化相关基因Ndufa10及Cox4i1的表达极显着下调（P<0.01）,且鸡iPS细胞的线粒体膜电位与CEF相比出现明显下降,表明氧化磷酸化被抑制。进一步通过添加糖酵解抑制剂和激活剂发现糖酵解能够激活内源多能性基因表达从而促进鸡iPS形成。通过生物信息学分析发现Oct4、Sox2和Nanog三个转录因子在糖酵解关键基因Hk1、Pfkp和Ldha的启动子区有共同的结合位点,双荧光素酶报告实验检测显示过表达Oct4,Sox2,Nanog极显着上调了Hk1、Pfkp和Ldha等基因的转录活性（P<0.01）,且过表达Oct4,Sox2,Nanog能够上调Hk1、Pfkp和Ldha的表达并提高糖酵解水平。因此本研究OSNL体系的基础上筛选了糖酵解激活剂2i-SP来优化iPS诱导体系,结果显示,添加2i-SP后糖酵解相关基因Pkm2,Hk1,Glut1的mRNA表达均上调,葡萄糖摄取量和乳酸产生量也有不同程度的提高。同时添加2i-SP后,诱导产生的iPS克隆数从24.33±2.08极显着增加至47.00±3.61（P<0.01）,流式分析检测SSEA-1阳性细胞比例也从1.59%±0.08极显着升高到11.47%±1.93（P<0.01）,表明2i-SP通过激活糖酵解来促进鸡iPS形成。以上结果表明糖酵解能够协同核心多能性因子促进鸡体细胞诱导重编程,小分子化合物2i-SP能够提高鸡iPS的形成效率。（2）不同体系诱导的鸡iPS转录组学研究为了比较分析体外诱导重编程形成的鸡iPS细胞与ESCs的转录水平的异同以及添加不同小分子化合物对鸡iPS形成的影响,分析干细胞形成和糖代谢相关因子在不同诱导条件下的表达变化,本研究对不同体系诱导的鸡iPS、CEF及鸡ESCs进行RNA-seq,首先对不同样本的log10（FPKM）进行聚类热图分析,结果显示,重编程后的iPS基因表达模式与ESCs相似。对糖酵解及氧化磷酸化相关基因FPKM值进行聚类热图分析,结果显示iPS（OSNL）中糖酵解相关基因Hk1、Ldha、Pdk3、Pdk4、Pfkp、Slc2al、Hif1a等基因表达水平均高于iPS（OSNL）,而氧化磷酸化相关基因Mdufs1-6,Ndufa1-12等的表达水平均低于CEF,表明CEF诱导重编程为iPS后其代谢方式从氧化磷酸化转变为糖酵解。在iPS（OSNL）组和CEF组中,存在8376个基因差异表达,所有差异表达基因主要富集到细胞代谢相关的条目以及许多与糖代谢、脂代谢、蛋白合成相关的通路。与iPS（OSNL）vs CEF组相比,iPS（OSNL2i-SP）vs CEF组中有1 751个特异上调表达基因,主要富集到细胞生长调节、细胞周期正调控、胚胎骨骼系统形态发生等细胞生长发育调控的相关条目,并且还富集到自噬体、糖:质子转运体活动及碳水化合物代谢过程。（3）鸡iPS诱导分化为iPGCs的转录组学研究本研究通过BMP4/BMP8b/EGF将黑羽狼山鸡iPS诱导分化,获得了 PAS染色阳性且表达Cvh、c-KIT、Blimp1等PGCs标记基因的iPGCs。对鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化进行检测发现在iPS诱导分化为iPGCs的过程中,糖酵解相关基因Pkm2,Hk1,Ldha的表达逐渐下降,并伴随着氧化磷酸化相关基因Ndufa10和Cox4i1表达的逐渐增加,同时葡萄糖摄取量逐渐减少,乳酸产生量也逐渐降低,表明鸡iPS诱导分化为iPGCs的过程中糖酵解被抑制。为了全面解析iPGCs中基因的表达情况;鉴定iPS来源的iPGCs是否具有正常的PGC相似的特性,以及研究iPGCs体外诱导形成过程中的机制,本研究对iPS诱导的iPGCs进行了转录组测序。层次聚类结果显示iPS来源的iPGCs的表达模式接近于原代PGCs。根据筛选出的PGCs标记基因表达情况制作小提琴图,结果显示iPS体外诱导的iPGCs细胞的PGCs标记基因表达模式与原代PGCs相近。在鸡iPGCs（iPS derived）组与PGCs组中,6555个基因存在差异表达,所有差异表达基因主要富集到了一些与糖类、脂类及蛋白质代谢相关的条目以及淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸代谢、自噬和PPAR等信号通路,表明这些信号通路在体外诱导iPGCs的过程中可能发挥了重要的调控作用。（4）鸡iPGCs介导类克隆体系的建立本研究将黑羽狼山鸡CEF诱导重编程形成的iPGCs注射至孵化2.5天的隐形白羽鸡F1的血管中,建立鸡iPGCs介导的类克隆体系,利用F1代公母鸡自交获得了类克隆鸡后代F2,并对F2代类克隆鸡进行了微卫星鉴定。狼山鸡iPGCs经PKH26红色荧光细胞膜表面标记后在显微镜下呈红色荧光,分离移植了 PKH26标记的黑羽狼山鸡iPGCs细胞后的白羽鸡种蛋的生殖嵴,在显微镜下观察到受体鸡胚生殖嵴中PKH26标记的红色荧光。移植了黑羽狼山鸡CEF诱导重编程获得的iPGCs的F1代受体隐性白羽鸡胚共100枚,继续孵化至出壳并存活的F1代受体隐性白羽鸡共45只,饲养至性成熟后进行公母鸡自交,收集所产受精蛋孵化至出壳,记为F2代,共获得517只F2代后代鸡,其中F2代阳性类克隆鸡个数为193只类克隆鸡阳性率为37.33%。F2代继续饲养,至性成熟时进行测交,收集受精种蛋孵化至出壳,鸡为F3代,共获得140只F3代后代鸡,其中阳性类克隆鸡个数为64只,类克隆鸡阳性率为45.71%,接近50%。本研究选择MCW004及MCW104微卫星位点作为黑羽狼山鸡的特异分子标记,对F2代阳性类克隆鸡进行了 MCW004及MCW104位点的微卫星测序检测,结果显示不同羽色的类克隆后代鸡的MCW004及MCW104微卫星位点的长度均不一,但阳性后代中仍遗传了狼山鸡的特异位点,表明类克隆鸡为狼山鸡CEF诱导重编程形成的iPGCs来源的后代。本研究对F2代类克隆鸡自交产生的F3代类克隆鸡同样进行了微卫星检测,结果显示不同羽色的类克隆后代鸡的MCW004及MCW104微卫星位点长度仍遗传了狼山鸡的特异位点,表明本研究的CEF转分化为iPGCs介导的类克隆技术能够稳定遗传原供体的遗传特性。
李婷婷[4]（2020）在《Bmp4基因对鸡PGCs形成及分化的作用研究》文中指出原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）是精子和卵子的前体,负责遗传信息的传递,在物种世代繁衍进程中发挥着重要作用。鸡（鸟类）的PGCs在胚胎发育过程中,随着血液不断迁移,最终在生殖嵴中定居,增殖。研究表明异体移植后的鸡PGCs能够归巢至受体生殖嵴并继续发育,这一特性为禽类物种保存和资源保护提供新的材料;在PGCs上进行基因编辑,并通过移植后产生的配子将这些修饰在世代间传递,为转基因动物生产和优良品种育种材料创制提供新的方法。然而,正常情况下,一个鸡胚中最多可分离获取约3000-5000个PGCs,而异体间移植时每个受体鸡胚至少需要5000-10000个细胞,尤其对稀少或者濒危禽类来说,更不可能毁坏原种来获取PGCs,因此体内分离的PGCs远不能满足实际生产需要。目前,由于体外培养体系不完善,使得体外大量扩增PGCs仍有困难,如何大量获取PGCs仍是其有效利用的难题。近年来,已有报道体外诱导ESCs或iPSCs分化形成PGCs,但是效率低,所以需要深入探索影响PGCs形成的重要因子及其作用。研究表明BMP4是哺乳动物PGCs起源的关键因子,利用外源BMP4蛋白在体外能将哺乳动物ESCs（Embryonic stem cells）诱导分化为PGCs。本课题组前期也建立了鸡PGCs的体外BMP4诱导模型,说明BMP4蛋白在PGCs形成过程中起关键作用,但鸡Bmp4基因的功能仍未见报道。基于此,本研究结合基因编辑技术通过构建鸡Bmp4基因的敲除及通过同源重组技术构建过表达载体,设计体内外试验探究Bmp4基因在鸡PGCs形成过程中的具体功能,为后期探究其分子机制及构建Bmp4基因敲除鸡模型奠定基础,也为进一步完善PGCs形成的调控网络提供理论依据。本试验的研究结果如下:（1）Bmp4基因过表达载体构建及活性验证扩增鸡Bmp4基因CDS区,利用同源重组技术将其连接到过表达载体中,构建pCDH-CMV-Bmp4-EF1-copGFP重组载体。转染DF-1细胞,观察到绿色荧光表达,证明载体已成功转染细胞,通过qRT-PCR检测发现Bmp4表达量极显着高于对照组（5347±1.2,P<0.01）,结果显示pCDH-CMV-Bmp4-EF1-copGFP重组载体具有过表达活性,可用于后续试验。（2）Bmp4基因敲除载体构建及活性验证在Bmp4基因外显子区设计3个敲除靶点序列,分别连接到CRISPR/Cas9系统的PGMLV-GM1载体骨架上,构建Bmp4敲除载体Bmp4-sgRNA1、Bmp4-sgRNA2、Bmp4-sgRNA3,慢病毒包裹后转染 DF-1 细胞,T7E1酶切结果显示3个载体均被切成两条带,基因组上已实现Bmp4基因的敲除。同时TA克隆测序检测结果显示转染敲除载体后基因组上Bmp4序列存在碱基缺失,初步统计敲除效率分别为6.25%、12.5%、18.75%。因此,选用敲除效率最高的Bmp4-sgRNA3载体用于后续试验。（3）体外Bmp4基因功能验证体外分离培养鸡ESCs,随后分6组处理:Control组（自分化）、sg3组（转染Bmp4敲除载体）、BMP4组（添加BMP4蛋白）、OE组（转染Bmp4过表达载体）、sg3+OE组（转染敲除载体后再转染过表达载体）、sg3+BMP4组（转染敲除载体后进行BMP4蛋白诱导）。处理后观察细胞形态变化,结果显示OE组和BMP4组细胞发生分化,4d时有类胚体出现,6d时类胚体增大且数目变多;sg3和Control组无类胚体形成;sg3+OE组4d时有类胚体出现,sg3+BMP4组4d时无类胚体出现,而6d时两组均有少量类胚体。6d时qRT-PCR检测PGCs形成与分化及迁移关键基因的表达变化,结果显示,与Control组相比,OE组Bmp4（9.85±0.2）、Cvh（6.09±0.2）、C-kit（10.20±0.15）及迁移基因 Cxcr4（14.60±0.2）及 BMP4 组Bmp4（7.41 ± 0.1）、Cvh（7.02±0.24）、C-kit（7.88±0.05）、Cxcr4（14.07±0.2）基因表达量均极显着升高（P<0.01）;sg3组相关基因的表达量Bmp4（0.52±0.08）、Cvh（0.55±0.08）、C-kit（0.50±0.07）、Cxcr4（0.61 ±0.09）显着下降（P<0.5）。sg3+OE 组 Bmp4（2.88±0.05）、Cvh（2.69±0.2）、C-kit（3.19±0.1）、Cxcr4（4.91±0.1）和sg3+BMP4组Bmp4（1.98±0.1）、Cvh（2.19±0.3）、C-kit（2.47±0.04）、Cxcr4（4.19±0.26）表达量显着升高（P<0.5）。6d时流式检测Cvh阳性细胞率,OE组和BMP4组分别为15.0%±0.12和14.5%±0.10,极显着高于对照组（P<0.01）;sg3组阳性率仅为4.79%±0.01,与对照组差异不显着;sg3+OE组和sg3+BMP4组分别为7.41%±0.23、8.66%±0.19,均显着高于对照组（P<0.5）。间接免疫荧光结果与流式结果一致。以上结果均说明Bmp4基因在体外能促进鸡PGCs形成。（4）体内Bmp4基因功能验证鸡胚发育2.5d时分6组进行血管注射:Control组（空白对照）、sg3组（注射Bmp4敲除载体）、BMP4组（注射BMP4蛋白）、OE组（注射Bmp4过表达载体）、sg3+OE组（同时注射敲除和过表达载体）、sg3+BMP4组（同时注射敲除载体和BMP4蛋白）。孵化至4.5d时观察鸡胚发育情况,结果显示sg3组鸡胚小于对照组;sg3+OE和sg3+BMP4组鸡胚均比对照组大,但小于OE和BMP4组。qRT-PCR检测PGCs形成及迁移关键基因的表达变化,结果显示OE组Bmp4（4.48±0.09）、Cvh（4.71±0.1）、C-kit（4.20±0.2）及迁移基因 Cxcr4（4.76±0.22）和 BMP4 组Bmp4（3.39±0.08）、Cvh（4.36±0.13）、C-kit（4.53±0.11）、Cxcr4（5.56±0.2）与对照组相比基因表达量均极显着上调（P<0.01）;sg3 组 Bmp4（0.32±0.01）、Cvh（0.38±0.01）、C-kit（0.38±0.08）、Cxcr4（0.33±0.09）相关基因表达量与对照组相比显着下调（P<0.5）;sg3+OE 组 Bmp4（1.67±0.1）、Cvh（1.53±0.2）、C-kit（1.35±0.05）、Cxcr4（1.93±0.12）和sg3+BMP4 组 Bmp4（1.69±0.09）、Cvh1.48±0.2)、C-kit（1.21±0.1）、Cxcr4（1.87±0.13）基因表达量与对照组相比均显着上调（P<0.5）。流式检测结果显示,OE组和BMP4组Cvh基因阳性细胞率与对照组相比极显着升高（35.0%±0.10、32.5%±0.11,P<0.01）;sg3组阳性细胞率与对照组相比显着降低（5.24%±0.10,P<0.5）;sg3+OE组（15.31%±0.21）和sg3+BMP4组（17.43%±0.30）阳性细胞率均显着高于对照组（P<0.5）。WB检测结果显示sg3组BMP4蛋白表达量减少;sg3+OE和sg3+BMP4组BMP4蛋白表达量均比对照组增多,但少于OE组和BMP4组蛋白表达量。体内外功能验证结果均证明Bmp4基因促进PGCs的形成。
刘灵康,谢德明,郑喜邦[5]（2019）在《不同受体蛋壳对X期鸡胚体外换壳培养孵化率的比较》文中研究指明鸡胚是研究胚胎发育的经典模型,鸡的输卵管生物反应器是理想的动物生物反应器之一,其优点在于表达的外源蛋白能够分泌到蛋清中,可避免对鸡本身造成伤害,同时蛋清成分简单,便于后期的纯化。但是鸡的生殖系统较特殊,鸡胚的发育在蛋壳内进行,这些特点使得制备转基因鸡较困难。换壳培养技术作为获取转基因鸡过程中的关键步骤,而成为本研究的主要考虑因素。本研究主要通过对X期鸡胚用不同的受体蛋壳进行体外换壳培养,并探索其在注射和非注射状态下的鸡胚存活情况,通过统计分析比较各自的孵化率,旨在建立合适且稳定的鸡胚体外培养体系,获得较高的孵化率,从而得到最适宜的换壳培养方法。结果显示,未注射的X期鸡胚经换壳培养后,鸡双黄蛋较之鸭蛋获得了更高的孵化率,表明鸡双黄蛋更适合于用作代用蛋壳（17.4%）,而选用鸭蛋作为代用蛋壳也获得了一定的孵化率（10%）;而X期鸡胚胚盘下腔注射后,经过两次换壳培养,获得8.3%的孵化率。本研究对鸡胚显微注射与转基因鸡制备具有指导性意义。
李宗睿[6]（2019）在《典型有机污染物在鸡生命发育早期阶段的代际传递与生物转化》文中研究指明鸟蛋作为生物监测的工具被广泛应用于环境中污染物的污染状况调查。由于鸟蛋中的污染物只能来自于母体,因此了解污染物从母体到蛋中的代际传递过程,无论是从环境监测的角度还是从污染物对鸟类生命发育早期阶段潜在风险评价角度都具有重要意义。尽管已经有不少研究报道了卤代有机污染物在鸟类中的代际传递过程,但是所得的结果往往不尽相同,有时甚至互相矛盾。造成这种现象的原因可能与母体组织及子代样品的选择有关,然而现有研究很少开展母体组织选择对代际传递潜力影响的评价,并且关于产蛋顺序对蛋中污染物浓度及组成的研究也缺乏一致性的结果。此外,有机污染物的生物转化研究大多都是针对生物的成年期,而很少关注对污染物更为敏感的生命发育早期阶段的污染物生物转化。为此,本研究围绕鸡生命发育早期阶段的鸡蛋形成以及胚胎发育过程中污染物的代际传递、生物转化及组织分布过程,主要开展了两个方面的研究工作。一是利用人工染毒的鸡蛋孵化实验,通过化合物质量平衡计算及手性化合物对映体组成分析,研究了典型卤代有机污染物（PBDEs、PCBs、1,2-双（2,4,6-三溴苯氧基）乙烷和DPs）在鸡胚胎发育过程中的生物转化与组织分配。二是通过鸡的染毒食物喂养及产蛋实验,研究了PBDEs、PCBs和DPs在不同产蛋顺序中的浓度和组成变化,利用不同的母体组织计算并比较了化合物的代际传递潜力。此外,在国家留学基金委的资助下,我们对目前比较新型的有机磷酸酯及其代谢产物在澳大利亚不同地区鸡蛋中的分布进行了初步的研究。人工染毒的鸡蛋孵化实验结果表明,胚胎发育过程中胚胎对BDE209和DPs的吸收率（60%左右）低于其他化合物（均在80%以上）。胚胎对所研究的4种手性PCBs单体（CB95、CB91、CB149和CB132）都存在手性选择性代谢,并且对PCBs和BTBPE的代谢在孵化的前18天内就开始出现,而对PBDEs和DPs的代谢则主要发生在孵化期的最后3天。本研究确认了BDE85的一个羟基代谢产物以及其他几个潜在的代谢产物,但没有检测到DPs的代谢产物。由于在蛋壳中检测到了高浓度的BDE209,推测BDE209的减少可能主要是由于其被快速排泄出体外所致。尽管未检测到DPs的代谢产物,但化合物质量平衡计算的结果表明,在胚胎发育过程中anti-DP的代谢率（28%）高于syn-DP（12%）,确认了鸡对反式DPs的选择性代谢作用。对雏鸡肝脏、胃、心、残余卵黄及残体（肌肉为主）中污染物的分析结果表明,肝脏相对富集所有化合物,而残体相对亏损除BDE47外的全部化合物,心脏中则相对富集3个PCBs单体。这种组织分布的差异与不同器官形成的时间、脂肪含量都有关系。化合物在雏鸡肝脏与残体之间的脂肪归一化浓度之比与化合物的log KOW值之间存在显着正相关关系,表明雏鸡肝脏中相对富集高亲脂性的化合物。鸡的染毒食物喂养及产蛋实验结果表明,鸡蛋中目标化合物的浓度与组成模式随产蛋周期呈周期性的变化,且DPs和BDE209的变化模式明显不同于其他PCBs和PBDEs单体。PBDEs的同系物组成随产蛋的时间逐步由BDE209为主转为BDE100和BDE153为主;随产蛋的进程,相对难以代谢的PCBs单体（CB138和CB180）在蛋中的相对含量增加。而DPs的反式异构体比例则不断上升。成鸡对化合物的代谢及不同化合物在代际传递上的差别是造成这种变化的主要原因。利用母鸡中未发育完全的卵黄与其他母体组织中污染物含量的分析结果计算了目标化合物的代际传递潜力,结果发现当以肌肉、胃、肺和心脏作为母体组织代表时,代际传递潜力与化合物的log KOW呈负相关性(log KOW>7),而当用肝脏、脂肪、小肠和肾脏作为母体组织代表时,代际传递潜力与log KOW之间无明显关系,但DPs和BDE209呈现比其他化合物更高的代际传递潜力。结合前述DPs与BDE209在蛋中不同于其他化合物的浓度变化模式及BDE209在开始所产蛋中较高的相对丰度,我们认为后面四个组织作为母体组织反映的化合物代际传递潜力可能更符合真实情况。对澳大利亚各地区鸡蛋中有机磷酸酯的分析结果表明,不同地点鸡蛋样品的蛋黄与蛋清中均检出了部分有机磷酸酯（OPEs）及其代谢产物,并且代谢产物的含量要相对高于其母体化合物。表明此类污染物已经广泛的存在于环境之中。OPEs在蛋黄与蛋清间的分布与化合物的分子量存在负的相关性,OPEs在鸡蛋中的分布行为很可能与亲脂性的卤代阻燃剂不同。通过本研究的开展,进一步增强了对典型卤代有机污染物在鸟类生物的胚胎发育和代际传递过程中行为与归趋的理解,同时结合对OPEs在鸡蛋中赋存情况的初步探讨,为正确认识和评估此类污染物对鸟类生物生命发育早期阶段的胚胎毒性及潜在健康风险提供了依据。
牧仁[7]（2013）在《北京油鸡胚胎肝脏来源间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究》文中进行了进一步梳理干细胞研究是生命科学研究领域的热点之一，很多研究成果已应用于临床实践中。本研究以中国特有的地方优良家禽品种北京油鸡为研究对象，对7d鸡胚胎肝组织中的间充质干细胞（MSCs）进行体外分离培养，在优化的体外培养环境中细胞传至25代，冻存156支细胞，应用免疫荧光和RT-PCR技术分别对分离传代细胞进行鉴定，并对传代细胞的冻存和复苏进行探讨是否可以通过干细胞冻存保存北京油鸡这一珍贵遗传资源；对分离鉴定的MSCs通过不同的培养条件进行诱导，分别向脂肪细胞、成骨细胞、神经元和心肌细胞进行分化，应用免疫荧光和RT-PCR对诱导分化细胞进行鉴定。结果表明：（1）体外环境下能够分离培养北京油鸡胎肝来源的间充质干细胞，分离细胞经过多次传代培养后仍然具有干细胞所特有的增殖和分化潜能，细胞的各项特性符合间充质干细胞的标准。（2）在优化组（含10%FBS、5ng/mL bFGF DMEM/F12培养基）的培养体系下，鸡胎肝MSCs体外培养生长旺盛，呈现典型的成纤维细胞形态，绝大多数细胞呈长梭状或三角形或不规则形，细胞排列成漩涡状或火焰状，随着体外培养过程中细胞传代次数的增加，细胞形态趋向均一，且低代次细胞增殖较快，高代次细胞生长明显减慢，随传代次数增多老化细胞增加。（3）免疫荧光细胞化学检测显示不同代次鸡胎肝MSCs的表面标志CD29和CD44均成阳性表达，而CK19和CD34均不表达。RNA转录水平RT-PCR检测鉴定各代次MSCs表面标志CD44、CD29、CD71和CD73均成阳性表达，且灰度分析显示除了CD73的表达量随细胞代次的增加而减弱外，其他标志物的表达量差别不显着。分离培养得到的细胞为间充质干细胞，MSCs在体外传代培养后仍能维持MSCs的特性。（4）鸡胎肝MSCs随着传代次数的增加，细胞的冻存及复苏活率呈下降趋势，不同代次鸡胎肝MSCs的细胞生长曲线呈经典的“S”型，细胞倍增均历经潜伏期、对数生长期以及生长停滞期。培养的低代次鸡胎肝MSCs中所含S期细胞较高，G0/G1期细胞较低，随细胞传代次数的升高G0/G1期比例随之增高，S期细胞显着下降。冷冻复苏细胞培养符合体外细胞培养的生长规律。（5）鸡胎肝MSCs在一定的培养条件下不同代次的细胞均能够分别向脂肪细胞、成骨细胞、神经元和心肌细胞进行分化，且分化后的细胞在形态上发生了相应的变化，少部分细胞出现死亡；随着细胞代次的增高细胞的分化能力减弱，高代次分化后的细胞老化明显；实验分别通过相对应染色方法对分化后细胞进行了物理检测检验分化效果，并通过RT-PCR进一步检测了PPAR-γ、LPL，Collage typeⅠ、Osteopontin，Nestin、NF和Desmin、MyoD1这四种细胞各两种标志物，并分析了分化的目的细胞标志物的表达量变化规律，证明高代次的细胞相较于低代次的细胞分化细胞标志物均出现表达量下调的趋势，说明低代次的细胞在体外更易被诱导分化，细胞随传代次数的增加，细胞的分化能力在减弱。实验证明由7d鸡胚胎肝所分离的MSCs为多潜能间充质干类型的干细胞。研究表明：本研究从北京油鸡胚胎肝脏所分离得到的间充质干细胞符合间充质干细胞的生物学特性，细胞在体外培养的环境中最多传代达25代，液氮保存的细胞在复苏后可传代培养并保持鸡胎肝MSCs的生物学特性。鸡MSCs能在体外诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、神经元和心肌细胞。本研究初步建立了鸡胎肝MSCs分离培养及鉴定的方法及试验流程。
孙敏[8]（2012）在《鸡胚胎干细胞诱导为雄性生殖细胞及转基因鸡的制备》文中指出生殖干细胞在有性繁殖的生物中肩负着将遗传信息在世代中传递的重要任务,即通过精卵结合产生新的个体。生殖细胞的种系传递特性使得它成为动物胚胎学、发育生物学和细胞生物学等学科关注的研究对象之一。生殖细胞的可塑性使其能代替胚胎干细胞（Embryonic stem cell, ESC）用于治疗和遗传修饰,而不涉及伦理和免疫排斥问题,故引起生物学界极大关注。因此,如何迅速开展诱导来源于其他组织的干细胞分化成为雄性生殖细胞的研究显得很有必要和迫切。目前将ES细胞诱导为生殖细胞的研究已经开展,但诱导方法较多,效率较低。相对于人、鼠的ES细胞,使用鸡胚ES细胞可以克服伦理方面的限制,且取材方便,模拟临床治疗实验具有十分明显优势。因此本研究以家鸡做为实验动物模型,在比较ES和SSCs异同点的基础上,筛选适宜视黄酸（RA）浓度,比较不同基质蛋白、支持细胞、不同时期睾丸提取液和睾丸细胞条件培养液诱导ES向雄性生殖细胞方向分化的效果,为建立适宜的诱导体系和后来的临床研究提供参考。同时将诱变后有抗病毒活性的MMx蛋白通过SSCs体内介导法制备抗病转基因鸡,为制备转基因动物和培育新品种提供新的途径和思路。研究结果如下：（1）采用免疫荧光和碱性磷酸酶联合检测法鉴定鸡ES细胞和SSCs细胞的干细胞特性,RT-PCR方法检测两种细胞在Cvh、C-kit、DAZL、GDF3、integrin α6、integrin β1、 Nanog、Oct-4、Sox2、Stra8基因表达上的异同性,并通过免疫细胞化学和Western blot检测TRA-1-60、TRA-1-81、C-kit、DAZL、integrin a6、integrin β1、Sox2蛋白在两细胞上的表达差异情况。结果表明：ESC和SSCs基因表达存在差异,即未分化的ES细胞表达GDF3、Nanog、Sox2基因；SSCs表达C-kit、integrin α6、integrin β1、Cvh、Stra8、 Dazl基因,两种细胞mRNA均检测到Oct-4、β-actin基因的表达。蛋白水平上,免疫细胞化学方法和western blot方法检测的5个蛋白中ES细胞表达Sox2蛋白,SSCs表达C-kit、 integrina6、integrinβ1、Dazl蛋白。这两细胞的特异性标记物,可为ES与SSCs细胞的鉴定提供依据。（2）在鉴定鸡胚ES细胞性别的基础上,将雄性ES细胞接种到24孔板中,分别采用10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/LRA浓度进行诱导,通过细胞形态变化和上章获得的差异基因表达量变化,筛选适宜RA诱导浓度,同时探讨RA促进鸡ES向生殖细胞方向分化的潜能。结果显示：根据半定量PCR和诱导过程中细胞形态观察,确定了RA的适宜诱导浓度为10-5mol/L。在适宜浓度诱导过程中,诱导4天时类胚体出现,随后类胚体逐渐增大,8d时类胚体开始解体,随后变为单个小的圆形细胞,但10天时未观察到生殖细胞样细胞。诱导过程中相应基因表达量也发生变化：ES细胞特异基因Nanog、Sox2表达量下降,生殖细胞特异基因Stra8、Dazl、integrin α6、integrin β1、C-kit表达量上升。特别是Stra8基因,与自分化相比,显着升高。结果证明RA可启动生殖细胞相应基因的表达,对鸡胚ES细胞向雄性生殖细胞方向分化具有积极作用。（3）ES细胞在体内特定小生境中发育,其内各种基质蛋白与其他细胞相互作用影响ES细胞的增殖分化。本实验将ES细胞分别接种于胶原蛋白（collagen）、纤维连接蛋白（fibronectin）和层粘连蛋白（laminin）包被的培养皿中,在适宜RA浓度作用下研究ES细胞向生殖细胞方向发育的可能性。结果显示：三组诱导实验中,细胞水平上RA+fibronectin诱导4天时最早观察到类胚体的出现,随后细胞体积增大,在10天时观察到精原样细胞。层粘连蛋白和胶原蛋白组在诱导6天时观察到类胚体形态,而层粘连蛋白组在10天时观察到SSCs样细胞形态。相关基因表达量变化也较明显。三组中ES细胞特异基因Nanog和Sox2基因表达量均迅速下降,而纤维连接蛋白实验组中下降程度最高。Dazl表达量均有变化,RA+collagen组中在诱导2天时表达量开始升高,到第8d表达量最高,10天时表达量下降；RA+laminin组中在诱导4天时表达量为最高,随后表达量下降,到第10天表达量降到最低,显着低于SSCs本身表达量。RA+fibronectin组自第4天开始表达量一直维持高表达状态。Stra8、integrin β1、integrina6基因在三组中规律较一致,随着诱导时间的延长,表达量持续升高,但诱导10天时表达量未达到SSCs本身表达量。C-kit表达量规律不明显,RA+collagen组诱导4天时表达量最高,随后降低。RA+fibronectin组表达量变化不大。结论：ES特异基因表达量为下降趋势,C-kit、Stra8、integrinβ1、 integrina6表达量总体为上升趋势,其中RA+fibronectin和诱导组中基因变化明显。根据细胞形态变化情况和特异基因变化情况比较,三组试验诱导效果均比RA单独诱导效果好,且三种基质蛋白中RA+fibronectin诱导组效果较好。（4）研究表明支持细胞是精原细胞小境的关键因子,可能会通过分泌一些生长因子或者通过与细胞接触来调节生殖细胞发育分化过程。本实验在适宜RA浓度条件下,不同时期睾丸提取液和睾丸组织条件培养基、鸡胚睾丸支持细胞共培养后及综合因素诱导,探讨不同方法对ES向雄性生殖细胞方向分化的影响。结果显示：RA+支持细胞实验组在诱导2天时类胚体出现,随后其体积增大,诱导10天观察到精原样细胞。基因变化过程中,Nanog基因表达量降低,而Sox2基因高表达。Dazl在诱导2天时表达量达到最高,随后逐渐降低。而Stra8、integrinβ1、integrina6基因表达量在诱导4天开始一直维持高水平表达,且在诱导10天时检测到Sox2、Daz1、integrinβ1、integrina6蛋白表达。在不同时期睾丸提取液和睾丸条件培养液实验组中,细胞形态变化差异较小,在诱导4天时类胚体出现,诱导10天时SSCs样细胞出现。在性成熟期睾丸提取液和条件培养液试验中8d出现SSCs样细胞。基因表达量上Nanog表达量逐渐上升,而Sox2表达量下降。性成熟睾丸提取液和条件培养液中,Dazl、Stra8、integrinβ1和integrina6表达量逐渐升高。而在RA+Fibronectin+支持细胞综合因素诱导过程中,诱导第2天即出现类胚体,同时ES特异基因Nanog、Sox2表达量下降明显。Dazl, Stra8,integrin(31, integrina6表达量逐渐升高。C-kit在诱导4天时表达量升高,随后保持相同水平,诱导10天时,检测到Dazl、C-kit蛋白的表达。结论：不同时期睾丸提取液和睾丸组织培养条件培养基诱导下,性成熟期睾丸提取液和睾丸组织条件培养液诱导效果较好。与单因素和双因素诱导相比,综合因素诱导效果并没有明显变化。几组实验中RA与支持细胞共诱导组效果最好。（5）利用精原干细胞介导的方法体内转染融合基因EGFP-MMx,制备抗病毒性疾病转基因鸡。采用脂质体包埋法,睾丸内注射EGFP-MMx融合基因,术后采集30d、40d、50d、60d、70d、80d睾丸组织进行冰冻切片、基因组PCR、点杂交实验,转染后60d公鸡精液人工授精于正常母鸡,对后代血液采用PCR检测技术、RT-PCR和Western blot方法检测外源基因EGFP-MMx的整合表达情况。结果显示：睾丸冰冻切片结果显示大部分实验鸡有绿色荧光,且在60d荧光数及亮度达到最高水平。提取18只实验公鸡睾丸组织基因组,分别以EFGP和MMx基因序列设计引物进行PCR检测和点杂交,阳性率分别为77.8%和72.2%。提取4只实验公鸡7个不同时期的精液基因组进行PCR检测,阳性率为25%。对于38只F1代进行血液DNA.RNA和蛋白水平检测,阳性率分别为10.53%（4/38）、10.53%（4/38）、7.89%（3/38）。结果证明外源基因通过睾丸注射法可整合到基因组上,可作为培育抗病转基因鸡的新途径。综上,本实验探索了不同方法对家鸡ES细胞向雄性生殖细胞的诱导效果及SSCs细胞体内介导制备转基因鸡的可行性,得出以下结论：RA作用下,将ES细胞和支持细胞共培养效果较好,可较好的诱导ES向雄性生殖细胞方向分化；通过SSCs体内介导法,获得3只携带抗病基因的转基因鸡。这些结果一方面能为雄性生殖细胞的临床应用提供理论基础,另一方面可为培育新品种提供新的思路。
于敏莉[9]（2012）在《维甲酸对鸡胚生殖细胞增殖和减数分裂调控的研究》文中进行了进一步梳理家禽的胚胎发育有独特的规律,通过对家禽原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）的体外研究,可以更深入地了解其胚胎发育过程及影响因素,并可对其基因进行遗传操作,制作各种研究模型,从而为生殖生物学和发育生物学等研究提供了一个优良的动物模型。为了更深层次揭示禽类生殖细胞增殖和分化的细胞内部和外源性调控机理、性腺发育和配子形成的分子机理,本实验以海兰鸡鸡胚为材料,分离了不同时期的PGC,进行体外培养并优化培养模型,研究了维甲酸（RA）对PGC粘附和增殖的作用及其胞内信号传导机制,同时还研究了RA对胚胎期卵巢生殖细胞减数分裂启动过程中的调控作用,探索基于LV-siRNA的慢病毒载体法生产转基因家禽的可行性,建立Raldh2基因敲除的转基因鸡模型,为进一步研究胚胎早期发育的机理、转基因家禽的制备奠定了基础。1.鸡胚PGC的分离、培养及鉴定在体视显微镜下用玻璃针分离19期3.5d鸡胚生殖嵴部位或28期5.5d鸡胚性腺,胰蛋白酶+EDTA消化分散组织,用KO-DMEM添加7.5%胎牛血清和10ng/ml白血病抑制因子（LIF）、10ng/ml碱性成纤维生长因子（bFGF）、10ng/ml干细胞生长因子（SCF）、0.1mMMEM非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺（Glu）、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的培养液,通过PGC和体细胞体外共培养的方式建立原代培养模型。然后传代于鸡胚成纤维细胞饲养层上进行继代培养。同时我们从13-15期鸡胚血液中分离提取PGC,在饲养层上进行原代和传代培养。传至3-5代后,用碱性磷酸酶（AKP）、过碘酸雪夫氏（PAS）化学反应及c-kit、SSEA-1,3,4、EMA-1等免疫细胞化学鉴定PGC,用PCNA和BrdU掺入法检测细胞的增殖活性。并收集PGC集落,采用RT-PCR方法检测干细胞多能性相关基因（Pou5fl,Sox2和Nanog）的表达。上述结果表明我们建立的PGC-体细胞共培养模型较好的维持了PGC的生物特性及未分化状态,且具有较强的增殖活性。因此,该模型是可用于PGC体外增殖和分化调控的研究。2.RA对鸡胚PGC粘附和增殖的影响及其机理的研究本实验研究了RA对鸡胚PGC粘附和增殖的影响及其相关的信号传导途径。结果表明：经过RA（0.1-10μM）处理后,PGC的集落数目和面积呈时间和剂量依赖性增加。同时RA能够促进细胞间的粘附,提高粘附蛋白E-钙粘蛋白、α-连锁蛋白和β-连锁蛋白的mRNA水平,增强PGC的粘附性,并存在一定的剂量效应关系。流式分析结果显示,PGC经过RA处理4天后,S/G2期（4N）的PGC数量显着增加,说明此部分细胞已经进入有丝分裂期。此外,RA能激活PGC中PKC和Akt活性,促进NF-κB的核转移,提高钙粘蛋白和β-catenin的磷酸化水平,然而这些刺激作用分别被LY294002（P13K抑制剂）,KP372-1（Akt抑制剂）,SN50（NF-κB抑制剂）和H7（PKC抑制剂）所阻断。RA显着上调PGC中细胞周期蛋白cyclin D1/E, CDK2/6和原癌基因c-fos, c-myc（?）勺表达,但是这种上调作用被H7、LY294002、KP372-1和SN50所抑制：综上所述,在体外培养条件下,RA通过PI3K/Akt/NF-κB信号级联反应及与PKC/β-catenin之间的交联反应促进鸡胚PGC的增殖,揭示RA在调控鸡胚胎生殖细胞发育中起着重要的作用。3.RA对鸡胚生殖细胞减数分裂的调控机理的研究在本实验中,我们结合胚胎期卵巢的体外培养和RNA干扰等手段,探索RA对鸡胚胎期生殖细胞减数分裂的调控及作用机制。SCP3和γH2AX免疫荧光染色结果表明,鸡胚卵巢生殖细胞在15.5天进入减数分裂,比例逐渐增加,到18.5天,进入减数分裂的细胞几乎遍布整个卵巢。减数分裂早期标志基因Strs8mRNA的表达在12.5天开始显着上调,早于减数分裂启动的时间：而减数分裂标志基因Scp3和Dmcl mRNA（?）内表达则在15.5天显着上调,再次验证鸡胚卵巢生殖细胞在15.5天进入减数分裂；RA合成酶基因Raldh2在15.5天显着上调而降解酶Cyp26bl却逐渐下降,表明Raldh2在RA聚集并维持减数分裂中的重要作用；RA受体RARβ则略微升高,表明其在RA启动减数分裂中的介导作用。而在雄性睾丸中,这些基因的表达变化很小,一直保持较低水平。10.5天和12.5天鸡胚卵巢在无血清的体外培养体系中分别培养5天和3天,生殖细胞能白发启动减数分裂：在培养体系中添加RA能明显增加进入减数分裂的细胞比例,显着上调了减数分裂相关基因Stra8,Scp3和Dmcl（?）的mRNA表达水平。Raldh2shRNA干扰后显着抑制了RA诱导减数分裂启动的作用。综上所述,我们的研究表明,RA及其信号通路对减数分裂启动中的重要调控作用,并首次报道了Raldh2基因敲减能够显着抑制生殖细胞进入减数分裂。4.利用shRNA慢病毒载体制备转基因鸡模型研究生殖细胞的发育本实验采用RNA干涉（RNAi）的方法,成功设计了三对针对Raldh2基因序列的保守区域的shRNA （short hairpin）分子,并构建质粒干涉载体。转染鸡胚15.5天卵巢生殖细胞后,转染效率达到80%-90%。通过qRT-PCR及SCP3免疫荧光染色检测,结果表明Raldh2-gallus-1224很好的抑制了Raldh2的表达,成功筛选出能高效抑制Raldh2复制的靶位点。针对有效位点构建了携带有能高效抑制Raldh2的shRNA慢病毒载体,将包装后的病毒注射到X期鸡胚胚盘内进行转基因操作,建立Raldh2基因敲减的转基因鸡模型。结果发现Raldh2基因敲减的转基因鸡胚外观与对照组的鸡胚相比无明显差异,卵巢形态大致正常,应用PCR检测GFP在胚体内的表达,进一步证实我们成功制备了转基因鸡模型,且qRT-PCR检测到Raldh2的表达显着下降。本实验为探索基于LV-siRNA慢病毒载体法生产转基因家禽的可行性,建立基因敲减的转基因鸡模型,为研究卵泡发育的分子机制奠定基础。以上实验结果表明：鸡胚PGC的体外共培养模型可用于PGC增殖和分化调控的研究,经AKP、PAS及c-kit、SSEA-1、3、4和EMA-1免疫细胞化学染色和干细胞多能性相关基因（Pou5fl,Sox2和Nanog）表达的RT-PCR检测等多种方法证实了PGC的原始性。利用此模型我们研究了维甲酸在PGC体外培养中的促增殖和粘附作用及其分子机理：我们还描述了鸡胚卵巢生殖细胞体内减数分裂启动中的形态学和分子变化,通过组织培养和RNA干扰等手段研究了RA对减数分裂启动的调控作用。这些发现将为禽类干细胞系的建立和转基因模型的制备奠定基础,同时也为进一步研究生殖细胞的发育提供理论指导和实验平台。
满朝来[10]（2008）在《利用转基因技术研究肌抑素基因对鸡骨骼肌发育的影响》文中研究表明肌抑素（myostatin,又名GDF-8）,为转化生长因子-beta（TGF-β）超家族成员之一,其功能是负向调控骨骼肌的生长和发育。随着研究的深入myostatin基因的一些新功能被逐渐发现,其在肌肉的发生、生长发育、再生、萎缩和退化等过程中均扮演着重要角色,日益显现出该基因在功能上的重要性。为进一步研究myostatin基因在胚胎发生和体内骨骼肌发育中的功能作用和机制,本研究以鸡为研究对象,分别在体外和体内对myostatin进行了功能研究和结构分析,获得了较好的实验结果。具体过程如下:逆转录病毒介导法建立转基因鸡技术平台:即将标记基因（增强型绿色荧光蛋白,EGFP）克隆到逆转录病毒表达载体,以phoenix或HEK293T细胞进行泛嗜性VSV-G（水泡性口炎病毒囊膜蛋白）病毒包装,并用包装病毒体外侵染原代鸡胚胎成肌细胞（Chicken Embryonic Myoblasts,CEM）检测病毒侵染效率、整合及转录活性,然后大量包装病毒并超离浓缩后,将浓缩病毒进行新生种蛋胚盘下腔接种,分别对接毒5天发育全胚和新生雏鸡的不同脏器进行基因组PCR鉴定分析。结果表明:包装的逆转录病毒在体外具有侵染和转录活性;体内鉴定分析显示标记基因EGFP已整合到5天鸡胚和一只雏鸡的胸腺和皮肤组织基因组中,表明制备嵌合型GFP转基因鸡的技术平台基本建立。Myostatin基因在鸡胚胎发育早期的功能初探:即针对鸡myostatin基因编码序列设计四条靶片段（19bp）,并将其克隆到RNAi逆转录病毒表达载体pSIREN-RetroQ中,体外分析表明RNAi能封闭靶基因myostatin的转录活性。利用转基因鸡技术平台,大量包装泛嗜性RNAi逆转录病毒,将浓缩病毒进行新生种蛋胚盘下腔接种,回收5天接毒发育鸡胚进行全胚半定量分析。结果表明:重组RNAi病毒能够下调5天胚胎myostatin的表达,并诱导MyoD和myogenin两基因表达明显上调,P21表达下调,促进myostatin下调组织部位的肌肉发生。另原位杂交分析表明:myostatin在胚胎不同组织部位表达量存在差异,在脑和眼等部位高表达,说明myostatin在鸡胚胎早期发育中可能还具有其他重要作用。Myostatin基因在雏鸡胸肌发育中的功能初探:将包装浓缩后的RNAi病毒和RNAi重组质粒分别梯度接种0天雏鸡的胸肌,并以PBS接种组雏鸡为对照,饲养10天后宰杀雏鸡观察胸肌表型变化,提取各组雏鸡胸肌组织RNA和蛋白进行分析。结果表明:胸肌接种myostatin的RNAi重组病毒或质粒后,能够封闭靶基因myostatin的表达,诱导MyoD、myogenin、Pax7和mIGF-1的转录水平上调和P21下调。RNAi接种组雏鸡表现出胸肌丰满肥厚,肌纤维肥大,肌纤维内细胞核增多。鸡myostatin基因启动子活性分析:为深入理解myostatin基因的表达调控机制,本实验克隆了肉鸡和蛋鸡5’端调控区2.0kb片段,序列分析表明不同种属动物myostatin基因启动子间保守性较高,而且在肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子区域也保守地存在着多个CAAT盒和E盒。此外,在其他种属动物如牛、猪、羊等myostatin基因启动子上的一些肌肉生长反应元件在肉鸡和蛋鸡中也同样保守存在。根据肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子间的SNP位点的不同,设计了肉鸡和蛋鸡六个不同长度的启动子片段并克隆到pGL3-Basic载体中,将重组载体分别转染和相互转染肉鸡和蛋鸡胚胎成肌细胞（CEM）,通过Luciferase Assay System和β-Galactosidase Enzyme Assay System两检测系统相结合,利用缺失分析的方法来比较肉鸡和蛋鸡启动子活性及差异。结果表明:肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子间转录活性存在差异,其中肉鸡和蛋鸡在0.2kb片段处活性差异较大。肉鸡和蛋鸡启动子在各自细胞中活性均较高,但相比较而言蛋鸡细胞环境更适于myostatin基因的转录。突变分析表明:0.2kb片段的-19bp SNP位点为该片段在肉鸡和蛋鸡间活性差异的关键位点。总之,肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子间确实存在转录活性差异,而这种转录活性差异与肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子间的SNP位点的存在和肉鸡和蛋鸡不同的细胞内环境有关。通过以上分析表明:转基因鸡技术平台与RNAi技术相结合的方法来研究myostatin在鸡胚胎发育早期的作用和出生后骨骼肌增生中功能取得了较好效果,结果表明myostatin不但在鸡胚胎发育早期显着影响着肌肉发生和相关基因的表达变化,而且可能具有除参与肌肉发生外的其它作用,另在雏鸡体内骨骼肌生长发育中也起着重要作用。启动子分析表明:肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子间存在活性差异,并且这种差异与细胞环境和启动子本身均有关。本实验在结构和功能两个方面对鸡myostatin基因进行了初步研究,希望能够为深入了解myostatin的功能和应用提供参考。
二、鸡胚胎体外操作技术的研究现状和进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鸡胚胎体外操作技术的研究现状和进展（论文提纲范文）
（1）鸡胚模型在生物活性评价中的应用（论文提纲范文）
| 1 鸡胚的组织结构与特点 |
| 2 鸡胚模型在疾病机理及生物活性评价中的应用 |
| 2.1 鸡胚模型在神经系统相关疾病中的应用 |
| 2.2 鸡胚模型在血管系统相关疾病中的应用 |
| 2.3 鸡胚模型在心脏系统相关疾病中的应用 |
| 2.4 鸡胚模型在眼部系统相关疾病中的应用 |
| 2.5 鸡胚模型在肝脏系统相关疾病中的应用 |
| 2.6 鸡胚模型在骨骼系统相关疾病中的应用 |
| 2.7 鸡胚模型在肿瘤学研究中的应用 |
| 2.8 鸡胚模型在病毒和微生物等相关疾病中的应用 |
| 3 鸡胚模型在安全性评价中的应用 |
| 4 鸡胚细胞系在生物学研究中的应用 |
| 5 结语 |
（2）机器人辅助视网膜静脉注射的注药器械研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景和意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 眼科手术机器人研究现状 |
| 1.2.2 智能手术器械研究现状 |
| 1.2.3 国内外研究现状综述及简析 |
| 1.3 本文主要研究内容 |
| 1.4 本文章节结构安排 |
| 第二章 高精度的注药器械研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 眼科显微手术机器人系统介绍 |
| 2.3 高精度驱动机构 |
| 2.4 双刚度级联结构微针 |
| 2.5 有限元仿真 |
| 2.5.1 结构数值仿真 |
| 2.5.2 应力应变数值仿真 |
| 2.5.3 刚度数值仿真 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 三维微力感知系统搭建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 三维微力感知原理 |
| 3.3 三维微力感知系统搭建 |
| 3.4 微针标定方法 |
| 3.5 微针标定实验 |
| 3.5.1 径向力标定 |
| 3.5.2 轴向力标定 |
| 3.5.3 标定结果 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 高精度的三维微力感知注药器械离体动物实验 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 眼科显微手术机器人系统 |
| 4.3 离体猪眼球视网膜静脉注射实验 |
| 4.4 鸡胚胎血管注射实验 |
| 4.4.1 血栓制作方法 |
| 4.4.2 鸡胚胎血管注射实验 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.6 实验分析与讨论 |
| 4.7 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
（3）CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 原始生殖细胞(PGCs) |
| 1.1.1 鸡PGCs的起源和迁移 |
| 1.1.2 鸡PGCs的分离和培养 |
| 1.1.3 PGCs细胞的体外诱导 |
| 1.1.4 PGCs的应用 |
| 1.2 细胞重编程 |
| 1.2.1 细胞重编程的研究进展 |
| 1.2.2 体细胞诱导重编程的分子机制 |
| 1.2.3 体细胞诱导重编程体系的优化 |
| 1.2.4 诱导多能干细胞的应用 |
| 1.3 本课题前期研究发现 |
| 1.4 本课题研究的目的与意义 |
| 1.5 参考文献 |
| 第2章 鸡iPS诱导体系的优化 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.1.4 鸡CEF诱导重编程为iPS |
| 2.1.5 鸡iPS的鉴定 |
| 2.1.6 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖代谢变化 |
| 2.1.7 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖酵解功能研究 |
| 2.1.8 核心多能性因子OCT4/SOX2/NANOG对糖酵解的调控作用 |
| 2.1.9 鸡iPS诱导体系的优化 |
| 2.1.10 数据分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 鸡CEF诱导重编程为iPS及鉴定 |
| 2.2.2 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖代谢变化 |
| 2.2.3 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中糖酵解功能研究 |
| 2.2.4 核心多能性因子OCT4/SOX2/NANOG对糖酵解的调控作用研究 |
| 2.2.5 小分子化合物2i-SP优化鸡iPS诱导体系 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 2.5 参考文献 |
| 第3章 不同体系诱导的鸡iPS转录组学研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 主要仪器和设备 |
| 3.1.4 细胞分离纯化 |
| 3.1.5 RNA抽提和质量检测 |
| 3.1.6 cDNA文库构建及测序 |
| 3.1.7 RNA-seq数据分析步骤 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 RNA样品检测结果 |
| 3.2.2 测序数据产出统计 |
| 3.2.3 参考序列比对分析 |
| 3.2.4 RNA-seq整体质量评估 |
| 3.2.5 不同体系诱导的iPS细胞相关性分析 |
| 3.2.6 不同体系诱导的iPS细胞差异表达基因筛选 |
| 3.2.7 鸡CEF诱导重编程为iPS过程中差异表达基因功能分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 3.5 参考文献 |
| 第4章 鸡iPS诱导分化为iPGCs的转录组学研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 主要仪器和设备 |
| 4.1.4 鸡iPS/ESCs诱导分化为iPGCs |
| 4.1.5 鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化研究 |
| 4.1.6 鸡iPS体外诱导的iPGCs转录组测序 |
| 4.1.7 数据分析 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 鸡iPS诱导分化为iPGCs |
| 4.2.2 鸡iPS诱导分化为iPGCs过程中糖代谢变化 |
| 4.2.3 鸡iPS体外诱导的iPGCs转录组学研究 |
| 4.2.4 鸡iPGCs (iPS-derived)与PGCs差异表达基因功能分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 4.5 参考文献 |
| 第5章 鸡iPGCs介导类克隆体系的建立 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验试剂 |
| 5.1.3 主要仪器和设备 |
| 5.1.4 鸡iPGCs介导类克隆鸡生产 |
| 5.1.5 类克隆鸡微卫星检测 |
| 5.1.6 数据分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 鸡iPGCs介导类克隆鸡生产 |
| 5.2.2 微卫星检测类克隆鸡品种关系 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 本章小结 |
| 5.5 参考文献 |
| 全文结论与创新点 |
| 论文有待进一步深入研究的问题 |
| 附录 |
| 原始数据表 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）Bmp4基因对鸡PGCs形成及分化的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 PGCs的起源和迁移、鉴定及应用 |
| 1.1.1 PGCs的起源及迁移 |
| 1.1.2 PGCs的鉴定 |
| 1.1.3 PGCs的起源及迁移的调控 |
| 1.1.4 PGCs的应用 |
| 1.2 基因功能验证方法的研究进展 |
| 1.3 基因编辑技术的发展及应用 |
| 1.3.1 基因编辑技术简介 |
| 1.3.2 基因编辑技术在生产中的应用 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第2章 Bmp4基因CDS区扩增及过表达载体构建 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 试剂及配制 |
| 2.1.4 引物设计与合成 |
| 2.1.5 试验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 Bmp4基因CDS区扩增 |
| 2.2.2 pCDH-CMV-Bmp4-EF1-copGFP载体构建 |
| 2.2.3 DF-1细胞的培养与转染 |
| 2.2.4 qRT-PCR检测pCDH-CMV-Bmp4-EF1-copGFP载体活性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 Bmp4基因敲除靶点设计及载体构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 仪器与设备 |
| 3.1.3 试剂及配制 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 Bmp4-sgRNA敲除载体构建 |
| 3.2.2 DF-1细胞转染及药物筛选 |
| 3.2.3 T7E1酶切检测 |
| 3.2.4 TA克隆测序 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 Bmp4基因对鸡原始生殖细胞形成及分化的影响研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 仪器与设备 |
| 4.1.3 试剂配制 |
| 4.1.4 ESCs的分离与培养 |
| 4.1.5 鸡胚注射 |
| 4.1.6 qRT-PCR检测 |
| 4.1.7 间接免疫荧光 |
| 4.1.8 流式细胞分析 |
| 4.1.9 WB |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 体外检测Bmp4基因促进PGCs的形成 |
| 4.2.2 体内检测Bmp4基因促进PGCs形成与迁移 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 全文结论与创新 |
| 全文结论 |
| 全文创新点 |
| 后续试验 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 定量及流式原始数据 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
| 致谢 |
（6）典型有机污染物在鸡生命发育早期阶段的代际传递与生物转化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 卤代有机污染物及有机磷酸酯概述 |
| 1.1.1 卤系阻燃剂(HFRs) |
| 1.1.1.1 PBDEs |
| 1.1.1.2 BTBPE |
| 1.1.1.3 DPs |
| 1.1.2 PCBs |
| 1.1.3 OPEs |
| 1.2 OHPs在鸟类中的迁移与转化规律 |
| 1.2.1 OHPs在鸟类中的生物转化研究 |
| 1.2.2 OHPs在鸟类中的代际传递研究 |
| 1.2.3 OHPs在鸟类中的组织分布 |
| 1.3 鸟蛋等生物样品中OPEs与其代谢产物(mOPEs)概述 |
| 1.4 研究思路与内容 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.1.1鸡胚胎的孵化发育实验 |
| 2.1.2鸡的喂养及产蛋实验 |
| 2.1.3 澳洲鸡蛋样品 |
| 2.2 样品分析 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 试剂与标准品 |
| 2.2.3 仪器设备 |
| 2.2.4 复合层析柱的制备 |
| 2.3 样品前处理 |
| 2.3.1鸡的胚胎发育及代际传递实验 |
| 2.3.2 澳洲鸡蛋样品 |
| 2.4 仪器分析 |
| 2.5 质量控制与质量保证(QA/QC) |
| 2.6 数据处理 |
| 第3章 卤代有机污染物在鸡的胚胎发育过程中的吸收与代谢 |
| 3.1 胚胎发育过程中对OHPs的吸收 |
| 3.2 胚胎发育过程对OHPs的生物转化 |
| 3.2.1 PCBs与 PBDEs同系物的差异性代谢 |
| 3.2.2 DPs与 BTBPE的潜在代谢能力 |
| 3.3 本章小结 |
| 第4章 卤代有机污染物在鸡的代际传递过程中的迁移与转化 |
| 4.1 母鸡对OHPs的胃肠道吸收 |
| 4.2 母鸡所产的鸡蛋中OHPs的特征模式 |
| 4.2.1 OHCs在产蛋中的浓度变化 |
| 4.2.2 OHCs在产蛋中的组成变化 |
| 4.2.3 母鸡产蛋过程中的PCBs手性特征 |
| 4.2.4 OHCs的代际传递特征 |
| 4.3 本章小结 |
| 第5章 卤代有机污染物在鸡体内的组织分布 |
| 5.1 典型OHPs在新生雏鸡体内的组织分布 |
| 5.1.1 PBDEs与PCBs的组织分布 |
| 5.1.2 手性PCBs以及DPs与BTBPE在雏鸡体内的组织分布 |
| 5.2 OHPs在成鸡体内的组织分布 |
| 5.3 本章小结 |
| 第6章 鸡蛋中的有机磷酸酯及其代谢产物 |
| 6.1 鸡蛋中OPEs与mOPEs的浓度与组成 |
| 6.2 鸡蛋中OPEs与mOPEs的关系 |
| 6.3 OPEs与mOPEs在蛋黄和蛋清间的分配 |
| 6.4 人体通过食用鸡蛋造成的OPEs和mOPEs的暴露评价 |
| 6.5 本章小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 7.1 主要研究结论 |
| 7.2 创新点与不足 |
| 7.3 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（7）北京油鸡胚胎肝脏来源间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 插图 |
| 附表清单 |
| 缩略语表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 我国是畜禽遗传资源大国 |
| 1.1.1 我国珍贵的畜禽遗传资源简介 |
| 1.1.2 北京油鸡是中国特有地方优良家禽品种 |
| 1.1.3 我国特有畜禽遗传资源保存及其所面临的问题和存在的不足 |
| 1.1.4 我国畜禽遗传资源保种存在的主要问题 |
| 1.2 间充质干细胞分布广泛来源多样 |
| 1.2.1 骨髓来源的 MSCs |
| 1.2.2 脂肪来源 MSCs |
| 1.2.3 脐带来源 MSCs |
| 1.2.4 胎盘来源 MSCs |
| 1.2.5 羊水干细胞 |
| 1.3 间充质干细胞的分离、培养和鉴定 |
| 1.3.1 间充质干细胞的分离 |
| 1.3.2 间充质干细胞培养 |
| 1.3.3 间充质干细胞的鉴定 |
| 1.4 MSCs 的分化潜能 |
| 1.4.1 MSCs 体内研究 |
| 1.4.2 MSCs 体外研究 |
| 1.5 肝脏中存在的干细胞 |
| 1.5.1 肝脏干细胞的种类 |
| 1.5.2 肝细胞 |
| 1.5.3 卵圆细胞 |
| 1.5.4 造血干细胞 |
| 1.5.5 间充质干细胞 |
| 1.6 间充质干细胞的应用前景 |
| 1.6.1 间充质干细胞在细胞替代治疗中的应用前景 |
| 1.6.2 MSCs 基因治疗的临床应用前景 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 2 鸡 MSCs 的分离培养及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 仪器设备和耗材 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 试剂配制 |
| 2.4.1 细胞分离培养试剂 |
| 2.4.2 荧光免疫细胞化学 |
| 2.4.3 RT-PCR |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 鸡 MSCs 的分离培养 |
| 2.5.2 鸡 MSCs 的传代培养 |
| 2.5.3 鸡 MSCs 培养体系筛选 |
| 2.5.4 鸡 MSCs 的冻存与复苏 |
| 2.5.5 鸡 MSCs 的免疫荧光细胞化学鉴定 |
| 2.5.6 鸡 MSCs 的 RT-PCR 鉴定 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.6.1 鸡 MSCs 的分离培养 |
| 2.6.2 鸡 MSCs 的传代培养 |
| 2.6.3 鸡 MSCs 培养体系筛选 |
| 2.6.4 鸡 MSCs 的冻存与复苏 |
| 2.6.5 鸡 MSCs 的免疫荧光鉴定 |
| 2.6.6 鸡 MSCs RT-PCR 鉴定 |
| 2.7 讨论 |
| 2.7.1 鸡 MSCs 的分离与扩增 |
| 2.7.2 鸡 MSCs 的培养体系 |
| 2.7.3 鸡 MSCs 的冻存与复苏 |
| 2.7.4 鸡 MSCs 鉴定 |
| 2.8 本章小结 |
| 3 鸡 MSCs 生物学特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 仪器设备和耗材 |
| 3.3 实验试剂 |
| 3.4 试剂配制 |
| 3.4.1 细胞周期试剂配制 |
| 3.4.2 向脂肪细胞诱导试剂配制 |
| 3.4.3 向神经元细胞诱导试剂配制 |
| 3.4.4 向成骨细胞诱导试剂配制 |
| 3.4.5 向心肌细胞诱导试剂配制 |
| 3.4.6 其他检测鉴定试剂配制 |
| 3.5 实验方法 |
| 3.5.1 细胞冻存前后活率测定 |
| 3.5.2 生长曲线 |
| 3.5.3 细胞周期 |
| 3.5.4 诱导分化 |
| 3.6 实验结果 |
| 3.6.1 冻存前后活率 |
| 3.6.2 生长曲线 |
| 3.6.3 细胞周期 |
| 3.6.4 诱导分化 |
| 3.7 讨论 |
| 3.7.1 生长增殖特性 |
| 3.7.2 细胞周期 |
| 3.7.3 体外诱导分化 |
| 3.8 本章小结 |
| 4 全文结论及创新点 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（8）鸡胚胎干细胞诱导为雄性生殖细胞及转基因鸡的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 胚胎干细胞 |
| 1.1 胚胎干细胞鉴定 |
| 1.1.1 细胞形态学鉴定 |
| 1.1.2 碱性磷酸酶活性(AKP)和胚胎阶段特异性表面抗原(SSEA-1)鉴定 |
| 1.2 胚胎干细胞体外培养 |
| 1.3 胚胎干细胞的应用 |
| 2 生殖细胞 |
| 2.1 精原干细胞特性 |
| 2.2 精原干细胞体外培养 |
| 2.3 精原干细胞的应用 |
| 2.3.1 转基因动物生产 |
| 2.3.2 临床应用 |
| 3 ES细胞诱导分化为雄性生殖细胞 |
| 3.1 影响ES分化为雄性生殖细胞的因素 |
| 3.1.1 内源性因素 |
| 3.1.2 外源性因素 |
| 3.2 ES向生殖细胞方向分化的诱导方法 |
| 3.2.1 改变细胞的培养条件 |
| 3.2.2 导入外源性基因 |
| 3.2.3 体内诱导 |
| 3.3 ES向生殖细胞方向分化的研究进展 |
| 3.4 体外诱导ES分化为生殖细胞的应用前景 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 5 参考文献 |
| 第二章 鸡胚ESC和SSCs形态学及差异蛋白标记的比较 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 鸡胚成纤维细胞(CEF)制备 |
| 1.4 鸡胚成纤维细胞传代 |
| 1.5 鸡胚成纤维细胞冻存 |
| 1.6 鸡胚成纤维细胞解冻 |
| 1.7 饲养层的制备 |
| 1.8 获取鸡ES细胞和SSCs细胞 |
| 1.8.1 ES细胞的培养及传代 |
| 1.8.2 SSCs细胞的培养及传代 |
| 1.9 碱性磷酸酶活性(AKP)活性鉴定 |
| 1.10 胚胎阶段特异性表面抗原(SSEA-1)免疫荧光鉴定 |
| 1.11 细胞RNA提取 |
| 1.12 Reverse Transcription-PCR(RT-PCR)检测 |
| 1.13 免疫细胞化学检测 |
| 1.14 Western blot检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 ES细胞和SSCs细胞形态比较 |
| 2.2 ES和SSCs细胞未分化状态检测 |
| 2.3 ES和SSCs细胞mRNA水平上差异比较结果 |
| 2.4 ES和SSCs细胞蛋白水平上差异比较结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第三章 视黄酸对鸡ESC向雄性生殖细胞分化的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 ES细胞性别鉴定 |
| 1.5 筛选适宜视黄酸浓度 |
| 1.6 适宜浓度诱导ES细胞向生殖细胞方向分化 |
| 1.7 荧光定量PCR检测特定基因的表达 |
| 1.8 免疫细胞化学检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 雄性ES细胞筛选 |
| 2.2 不同浓度诱导后细胞形态学变化 |
| 2.3 半定量PCR检测不同浓度诱导后相关基因表达情况 |
| 2.4 ES自分化实验组 |
| 2.5 免疫细胞化学检测结果 |
| 2.6 适宜视黄酸浓度诱导ES细胞形态变化 |
| 2.7 荧光定量PCR检测RA诱导实验组基因变化结果 |
| 2.8 免疫细胞化学检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第四章 不同基质蛋白对ESC向雄性生殖细胞方向分化的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 筛选雄性ES细胞 |
| 1.5 基质蛋白包被及雄性ES细胞接种培养 |
| 1.6 荧光定量PCR检测特定基因的表达 |
| 1.7 免疫细胞化学检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞形态变化 |
| 2.2 不同基质蛋白诱导后荧光定量检测基因表达情况 |
| 2.3 免疫细胞化学检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第五章 睾丸支持细胞、睾丸提取液及综合因素对ESC向雄性生殖细胞分化的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 睾丸支持细胞原代分离 |
| 1.5 支持细胞传代 |
| 1.6 鸡胚支持细胞冻存 |
| 1.7 鸡胚支持细胞解冻 |
| 1.8 支持细胞鉴定 |
| 1.8.1 油红染色 |
| 1.8.2 支持细胞相关基因表达的检测 |
| 1.9 丝裂霉素-C处理 |
| 1.10 支持细胞与雄性ES细胞共培养 |
| 1.11 不同时期睾丸组织提取液制备 |
| 1.12 不同时期睾丸组织条件培养基提取 |
| 1.13 睾丸组织提取液和条件培养基共同诱导ES细胞 |
| 1.14 综合因素诱导组 |
| 2 结果 |
| 2.1 支持细胞形态学观察 |
| 2.2 油红O染色 |
| 2.3 鸡胚支持细胞RT-PCR鉴定 |
| 2.4 支持细胞和ES细胞共培养后细胞形态变化 |
| 2.5 诱导后荧光定量检测相关基因表达情况 |
| 2.6 免疫细胞化学检测特定蛋白表达情况 |
| 2.7 不同时期睾丸组织提取液诱导组 |
| 2.8 不同时期睾丸组织条件培养液诱导组 |
| 2.9 综合因素诱导实验组结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第六章 SSCs体内介导法制备抗病转基因鸡 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 睾丸注射 |
| 1.3 睾丸冰冻切片检测 |
| 1.4 人工授精 |
| 1.5 PCR检测 |
| 1.5.1 引物设计及合成 |
| 1.5.2 PCR扩增检测 |
| 1.6 睾丸组织基因组dot blotting检测 |
| 1.7 RT-PCR检测EGFP-MMx基因的表达情况 |
| 1.8 Western blot检测EGFP-MMx融合蛋白的表达 |
| 2 结果 |
| 2.1 睾丸冰冻切片检测 |
| 2.2 睾丸组织基因组PCR结果 |
| 2.3 睾丸组织基因组dot blotting检测 |
| 2.4 精液品质检测 |
| 2.5 精液PCR检测结果 |
| 2.6 F1代胚胎荧光检测结果 |
| 2.7 血液PCR检测结果 |
| 2.8 RT-PCR检测EGFP-MMx基因的表达结果 |
| 2.9 Western blot检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 参考文献 |
| 第七章 结论和创新点 |
| 致谢 |
| 博士期间发表的论文 |
（9）维甲酸对鸡胚生殖细胞增殖和减数分裂调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 禽类原始生殖细胞的研究进展 |
| 1.1 干细胞的起源 |
| 1.2 干细胞的生物学特性 |
| 1.3 禽类PGC的特性 |
| 1.4 PGC的起源 |
| 1.5 禽类PGC的迁移 |
| 1.6 原始生殖细胞的应用 |
| 1.6.1 PGC作为研究胚胎发育的体外模型 |
| 1.6.2 PGC在种质资源保护中的应用 |
| 1.6.3 转基因家禽的制备 |
| 1.6.4 药物生产 |
| 1.7 小结 |
| 第二节 细胞外基质对PGC迁移的影响及调控 |
| 2.1 粘附蛋白的结构和影响因素 |
| 2.2 E-钙粘蛋白的结构和功能调节 |
| 2.2.1 E-钙粘蛋白生物学特性 |
| 2.2.2 E-钙粘蛋白/连锁蛋白复合体的生物学特性 |
| 2.2.3 E-钙粘蛋白的调控 |
| 2.3 粘附分子在细胞信号传导中的作用 |
| 2.4 粘附分子在生殖细胞发育中的作用 |
| 2.5 ECM在PGC迁移中的作用 |
| 第三节 禽类原始生殖细胞增殖的调控 |
| 3.1 PGC的增殖 |
| 3.2 生长因子对PGC增殖的调控 |
| 3.2.1 白血病抑制因子 |
| 3.2.2 干细胞生长因子 |
| 3.2.3 碱性成纤维生长因子 |
| 3.2.4 肿瘤坏死因子TNF-α和cAMP |
| 3.2.5 维甲酸(RA) |
| 3.2.6 其它细胞因子 |
| 3.2.7 负调控因子 |
| 3.3 细胞信号通路对PGC增殖的调控 |
| 3.3.1 LIF信号通路 |
| 3.3.2 BMP信号通路 |
| 3.3.3 Wnt途径 |
| 3.3.4 Oct4 |
| 3.3.5 Nanog |
| 3.3.6 Sox2 |
| 3.3.7 NF-κB信号 |
| 3.4 细胞周期相关基因控制PGC的增殖 |
| 第四节 禽类原始生殖细胞分化的调控 |
| 4.1 禽类性腺发育 |
| 4.1.1 胚胎性腺的基本过程 |
| 4.1.2 PGC与性腺发生和发育的关系 |
| 4.2 禽类性腺发育的调控及其机理 |
| 4.2.1 减数分裂 |
| 4.2.2 维甲酸在PGC分化中的调控 |
| 4.2.3 Nanos2和PGC分化 |
| 4.2.4 FGF9在PGC分化中的调控 |
| 4.3 卵母细胞发生的分子调控 |
| 4.3.1 卵母细胞的发生 |
| 4.3.2 禽类卵巢的发育 |
| 第五节 利用转基因技术研究生殖细胞发育的调控机理 |
| 5.1 转基因鸡的研究现状 |
| 5.2 RNA干扰的研究进展 |
| 5.2.1 小RNAs的分类 |
| 5.2.2 RNAi作用机制 |
| 5.2.3 RNAi作用的特点 |
| 5.2.4 siRNA与shRNA的比较 |
| 5.2.5 RNA干扰的应用 |
| 5.3 转基因鸡的制备方法 |
| 5.3.1 慢病毒感染法 |
| 5.3.2 原始生殖细胞介导法 |
| 5.3.3 精子载体法 |
| 5.3.4 显微注射法 |
| 5.4 RNAi转基因动物的研究 |
| 5.4.1 RNAi转基因动物的研究现状 |
| 5.4.2 RNAi制备转基因动物的优势 |
| 5.4.3 RNAi转基因动物存在的问题与应用前景 |
| 第六节 本研究的目的和内容 |
| 6.1 本研究的目的和意义 |
| 6.2 研究目标及内容 |
| 第二章 维甲酸对鸡胚原始生殖细胞粘附调控机理的研究 |
| 第一节 鸡胚原始生殖细胞体外培养模型的建立及优化 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要试剂及配制 |
| 1.2.4 饲养层的制备 |
| 1.2.5 生殖嵴和性腺PGC的分离、纯化和培养 |
| 1.2.6 血液中PGC的分离、纯化和培养 |
| 1.2.7 鸡胚PGC的染色鉴定 |
| 1.2.8 RT-PCR检测PGC特异基因的表达 |
| 1.2.9 性腺切片免疫组织化学染色 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 生殖嵴、性腺PGC体外分离培养及鉴定 |
| 1.3.2 血液PGC体外分离培养及鉴定 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 PGC的分离及培养 |
| 1.4.2 鸡胚PGC的培养条件 |
| 1.4.3 鸡胚PGC的鉴定 |
| 1.5 小结 |
| 第二节 维甲酸对鸡胚原始生殖细胞粘附的影响及其机理的研究 |
| 摘要 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要器材 |
| 2.2.3 主要试剂及配制 |
| 2.2.4 PGC培养及药物处理 |
| 2.2.5 PGC集落粘附性的检测 |
| 2.2.6 SSEA-1和β-catenin双标免疫荧光染色 |
| 2.2.7 细胞周期流式分析 |
| 2.2.8 RNA提取和常规RT-PCR |
| 2.2.9 Real-Time RT-PCR |
| 2.2.10 蛋白质的提取和Western Blot分析 |
| 2.2.11 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 RARs和RA合成酶在PGC及性腺中的表达情况 |
| 2.3.2 RA对PGC粘附性的作用 |
| 2.3.3 PKC在RA对增强PGC问粘附性中的介导作用 |
| 2.3.4 β-catenin在RA增强PGC粘附性中的介导作用 |
| 2.3.5 RA在体外对PGC增殖的影响 |
| 2.3.6 PKC在RA对PGC促增殖中的作用 |
| 2.3.7 RA对细胞周期蛋白mRNA表达水平的影响 |
| 2.3.8 RA在体外对PGC细胞周期的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 维甲酸对鸡胚原始生殖细胞增殖调控的研究 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要试剂及配制 |
| 1.2.4 PGC培养及药物处理 |
| 1.2.5 BrdU掺入鉴定PGC的增殖 |
| 1.2.6 细胞周期流式分析 |
| 1.2.7 RNA提取和常规RT-PCR |
| 1.2.8 Real-Time RT-PCR |
| 1.2.9 蛋白质的提取和Western Blot分析 |
| 1.2.10 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 RA在体外对PGC增殖的影响 |
| 1.3.2 PI3K/Akt在RA对PGC促增殖中的介导作用 |
| 1.3.3 NF-κB在RA对PGC促增殖中的介导作用 |
| 1.3.4 RA及抑制剂对细胞周期蛋白mRNA表达水平的影响 |
| 1.3.5 RA及抑制剂对PGC细胞周期的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第四章 维甲酸对鸡胚生殖细胞减数分裂调控机理的研究 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要试剂及配制 |
| 1.2.4 样品采集 |
| 1.2.5 鸡胚性腺组织培养和处理 |
| 1.2.6 鸡胚卵巢生殖细胞的分离培养和处理 |
| 1.2.7 Raldh2 siRNA转染 |
| 1.2.8 鸡胚性腺组织的冰冻切片 |
| 1.2.9 鸡胚性腺组织石蜡切片制作 |
| 1.2.10 胚胎期卵巢形态学观察 |
| 1.2.11 性腺冰冻切片免疫荧光染色 |
| 1.2.12 RNA提取和Real-Time RT-PCR |
| 1.2.13 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 胚胎期鸡胚卵巢发育的形态学特征 |
| 1.3.2 胚胎期鸡卵巢减数分裂阶段的变化 |
| 1.3.3 减数分裂相关基因表达的在不同时期鸡胚性腺中的表达情况 |
| 1.3.4 RA合成和降解酶在不同时期鸡胚性腺中的表达情况 |
| 1.3.5 AO染色观察体外培养卵巢的内部结构 |
| 1.3.6 RA在体外对减数分裂的影响 |
| 1.3.7 Raldh2 shRNA干扰 |
| 1.3.8 Raldh2基因敲减对减数分裂的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第五章 利用shRNA慢病毒载体制备转基因鸡模型 |
| 摘要 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 主要器材 |
| 1.2.3 主要试剂及配制 |
| 1.2.4 玻璃针的制备 |
| 1.2.5 siRNA的设计 |
| 1.2.6 病毒滴度的复核(有限稀释法测定) |
| 1.2.7 靶细胞感染预实验 |
| 1.2.8 293FT细胞的培养 |
| 1.2.9 病毒的生产 |
| 1.2.10 病毒滴度分析 |
| 1.2.11 鸡胚病毒注射 |
| 1.2.12 PCR检测目的基因的表达 |
| 1.2.13 数据分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 慢病毒滴度测定结果 |
| 1.3.2 不同转染时间绿色荧光蛋白的表达分析 |
| 1.3.3 shRNA高效抑制Raldh2复制靶位点的筛选 |
| 1.3.4 转基因个体的PCR分析 |
| 1.3.5 转基因鸡胚15.5天卵巢形态 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第六章 结论和创新点 |
| 1.1 结论 |
| 1.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表文章 |
（10）利用转基因技术研究肌抑素基因对鸡骨骼肌发育的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 课题来源、背景及意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 肌抑素(Myostatin) |
| 1.2.2 逆转录病毒与转基因鸡 |
| 1.2.3 我国关于转基因鸡和myostatin的研究现状 |
| 1.2.4 RNA干扰（RNAi）技术的选择 |
| 1.3 学位论文的主要内容 |
| 第2章 转基因鸡技术平台的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 重组EGFP逆转录病毒表达载体的构建 |
| 2.2.2 亲嗜性病毒的包装 |
| 2.2.3 泛嗜性病毒的包装 |
| 2.2.4 泛嗜性病毒介导法制备转基因鸡 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 亲嗜性病毒包装技术平台的建立 |
| 2.3.2 泛嗜性VSV-G病毒包装技术平台的建立 |
| 2.3.3 转基因鸡技术平台的建立 |
| 2.4 本章小节 |
| 第3章 Myostatin在鸡胚胎发育早期的功能初探 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 鸡myostatin基因RNAi靶序列设计 |
| 3.2.3 重组逆转录RNAi病毒载体的构建 |
| 3.2.4 重组RNAi逆转录病毒表达载体的封闭myostatin活性分析 |
| 3.2.5 重组RNAi逆转录病毒的包装和超离浓缩 |
| 3.2.6 RNAi重组病毒体外感染CEM及分析 |
| 3.2.7 RNAi组重病毒体内感染鸡胚及分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组RNAi逆转录病毒表达载体的构建 |
| 3.3.2 RNAi封闭活性的检测 |
| 3.3.3 RNAi病毒体外感染CEM分析 |
| 3.3.4 病毒体内感染鸡胚分析 |
| 3.3.5 原位杂交（ISH）分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 Myostatin在雏鸡胸肌发育中的功能初探 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 研究方法 |
| 4.2.1 Myostatin重组表达载体的构建 |
| 4.2.2 Myostatin重组RNAi和表达载体转染CEM |
| 4.2.3 重组myostatin和hIGF-1 蛋白处理CEM |
| 4.2.4 重组Myostatin质粒和病毒接种雏鸡胸肌 |
| 4.2.5 接毒雏鸡的复制完全型病毒检测 |
| 4.2.6 Western blot分析 |
| 4.2.7 细胞增生计数和统计分析 |
| 4.2.8 胸肌组织切片的制备 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Myostatin重组表达载体的构建 |
| 4.3.2 CEM中myostatin表达下调和上调分析 |
| 4.3.3 MSTN、IGF-1 处理CEM分析 |
| 4.3.4 接种病毒和重组质粒的胸肌分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 Myostatin基因启动子的活性分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 细胞及试剂 |
| 5.2.2 基因组DNA的提取 |
| 5.2.3 Myostatin基因启动子的克隆 |
| 5.2.4 Myostatin启动子的生物信息学分析 |
| 5.2.5 重组pGL3 表达载体的构建 |
| 5.2.6 细胞转染与蛋白回收 |
| 5.2.7 启动子活性分析 |
| 5.2.8 -19bp和+82bp的定点突变分析 |
| 5.2.9 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子序列分析 |
| 5.3.2 启动子的关键元件分析 |
| 5.3.3 不同长度启动子片段重组表达载体的构建 |
| 5.3.4 肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子荧光素酶活性分析 |
| 5.3.5 肉鸡和蛋鸡myostatin基因启动子活性比较分析 |
| 5.3.6 肉鸡和蛋鸡myostatin启动子的关键转录因子分析 |
| 5.3.7 肉鸡myostatin启动子的定点突变分析 |
| 5.3.8 肉鸡-196p位点分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 索引 |
| 个人简历 |
四、鸡胚胎体外操作技术的研究现状和进展（论文参考文献）
- [1]鸡胚模型在生物活性评价中的应用[J]. 周青青,张琼谊,余桂媛,闫昌誉,黄蓉萍,韩绍聪,李怡芳,李维熙,何蓉蓉,栗原博. 今日药学, 2021
- [2]机器人辅助视网膜静脉注射的注药器械研究[D]. 李安龙. 河北大学, 2021(09)
- [3]CEF转分化为iPGCs诱导体系的研究[D]. 袁霞. 扬州大学, 2021
- [4]Bmp4基因对鸡PGCs形成及分化的作用研究[D]. 李婷婷. 扬州大学, 2020
- [5]不同受体蛋壳对X期鸡胚体外换壳培养孵化率的比较[A]. 刘灵康,谢德明,郑喜邦. 2019中国畜牧兽医学会兽医外科学分会第十届会员代表大会暨第24次学术研讨会论文集, 2019
- [6]典型有机污染物在鸡生命发育早期阶段的代际传递与生物转化[D]. 李宗睿. 中国科学院大学(中国科学院广州地球化学研究所), 2019(07)
- [7]北京油鸡胚胎肝脏来源间充质干细胞的分离培养及生物学特性研究[D]. 牧仁. 内蒙古农业大学, 2013(10)
- [8]鸡胚胎干细胞诱导为雄性生殖细胞及转基因鸡的制备[D]. 孙敏. 扬州大学, 2012(08)
- [9]维甲酸对鸡胚生殖细胞增殖和减数分裂调控的研究[D]. 于敏莉. 浙江大学, 2012(08)
- [10]利用转基因技术研究肌抑素基因对鸡骨骼肌发育的影响[D]. 满朝来. 哈尔滨工业大学, 2008(03)