一、重组β-半乳糖苷酶腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达（论文文献综述）
徐泓杰[1]（2021）在《Krüppel样因子4通过促进血管平滑肌细胞自噬缓解主动脉衰老的机制研究》文中研究指明研究背景随着我国人口的老龄化,衰老人群大大增加。人体衰老是一种不可逆的生物学过程,年轻化的趋势也愈加明显,使其成为多种退行性和慢性疾病的危险因素。而对于老龄化人群中高发病率和死亡率的心血管疾病来说,衰老的影响尤为重要,各种应激因素造成的平滑肌细胞早衰是引起心血管衰老的始动因素。自噬即细胞内异常细胞器及蛋白质的清除过程,在细胞衰老过程中发挥着特殊作用。自噬过程的受损与细胞的衰老进程密切相关,有研究发现改变细胞的自噬功能可以延缓细胞的早衰。因此通过调控自噬的发展来延缓心血管老化的进程似乎是减缓因衰老引起的各种心血管疾病发生发展的新研究方向,这使得自噬成为近几年来在衰老相关心血管退行性疾病研究中的热点。有研究表明,锌指结构转录因子Krüppel样因子4（Krüppel like factor 4,KLF-4）的沉默能诱导角质形成细胞的复制性衰老,但KLF-4在心血管衰老中的作用及具体机制还未有研究。Klf-4基因具有维持干细胞分化潜能和基因组稳定性等作用,同时有研究提示KLF-4对自噬的诱导作用在多种心血管疾病的发展中发挥作用。但KLF-4对自噬的调控是否对血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）的衰老产生影响以其相关的分子机制还未有研究。端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase,TERT）是端粒酶复合物中的一个催化亚基,对延长端粒、延缓衰老发挥着重要作用。TERT除了在细胞核内发挥作用以外,核外的TERT对于细胞功能的作用也越来越引起大家的关注。一方面研究发现在不依赖于端粒酶的情况下,TERT还可通过m-TOR途径调控自噬的进展;另一方面有证据显示TERT的表达受到KLF-4的调控,这些均高度提示TERT在核外对细胞功能发挥重要的调节作用。目的（一）通过细胞和动物实验探究KLF-4在血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）诱导的衰老主动脉血管中的作用。（二）明确KLF-4具有通过自噬抵抗AngⅡ诱导主动脉血管衰老的作用。（三）探索KLF-4通过自噬抵抗AngⅡ诱导主动脉血管衰老的分子机制。方法（一）小鼠主动脉血管衰老模型的建立及鉴定1、小鼠主动脉血管衰老模型的建立:采用皮下埋置缓释泵的方式缓慢泵入AngⅡ以建立小鼠主动脉血管衰老模型。取4-6周龄小鼠,随机分为实验组和对照组并编号,实验组用AngⅡ缓释泵（1ug/kg/min）缓慢刺激,对照组采用生理盐水以缓释泵的方式模拟刺激,分别在第1、2、3、4周时用颈椎脱臼法处死小鼠后,立即取主动脉血管浸泡于4%多聚甲醛中,固定过夜后脱水制作石蜡切片。2、主动脉血管衰老的鉴定:通过免疫组织化学染色的方法检测P53在主动脉组织中的表达情况。（二）VSMCs的分离培养、VSMCs早衰模型的建立1、VSMCs的分离培养:采用组织块贴壁的方法,分离培养出原代的大鼠VSMCs。首先在获取大鼠主动脉后刮除内、外膜,剪成5mm2大小的组织块,贴壁于24孔板内,孔内加入500μl含20%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中,放置于细胞培养箱中待大鼠VSMCs爬出。爬出的VSMCs称为原代大鼠VSMCs,继续生长到融合度达到90%时传代,孔板中的组织块可以放置于新的24孔板中继续贴壁培养。2、VSMCs衰老模型的建立:采用第4-8代的大鼠VSMCs用于实验,实验组用含10-7m M AngⅡ和0.5%FBS的DMEM培养基处理大鼠VSMCs 72h,期间每天更换培养基一次,建立大鼠VSMCs早衰细胞模型,对照组则用含等量磷酸盐缓冲液（PBS）和0.5%FBS的DMEM培养基培养相同时间。3、早衰VSMCs的检测:通过免疫印迹的方法检测P53蛋白的表达;通过β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞数量。（三）自噬的检测及干预方法1、组织中自噬水平的检测:通过免疫组织化学染色检测BECN1蛋白的阳性表达。2、细胞中自噬水平的检测:通过免疫印迹的方法检测BECN1蛋白的表达水平和LC3Ⅱ/Ⅰ的转化比;通过转染GFP-m RFP-LC3腺病毒可以观察到自噬体、溶酶体的变化,显示自噬流的改变。3、自噬的干预:通过雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）的预刺激来提高细胞的自噬功能,通过3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）的预刺激来抑制细胞自噬功能。（四）KLF-4抵抗AngⅡ诱导VSMCs衰老的分子机制研究1、腺病毒感染:将细胞接种于细胞培养板中,培养细胞至融合度达到50-70%,按照相应的感染复数（Multiple of infection,MOI）加入适宜体积的病毒液于半量DMEM培养基中混匀,再加入细胞培养板中,2h后补足培养基,12-24h后更换正常培养液,48-72h后观察荧光表达情况并行相关检测。2、si-RNA转染:利用lipofectomne2000脂质体转染TERT-si RNA。3、免疫荧光染色:对贴壁的细胞用4%多聚甲醛进行固定后,依次经过透膜、封闭、一抗孵育、荧光二抗孵育,染核后镜检。4、蛋白质印迹法（Western blot,WB）:提取细胞总蛋白后通过电泳转膜将蛋白固定到PVDF膜上,再依次经过封闭、一抗孵育、二抗孵育后显影目的蛋白。5、染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）:依据Simple Ch IP Enzymatic Chromatin IP Kit（Magnetic Beads）产品中的操作流程说明检测蛋白与DNA的相互作用。（五）实验数据的统计及分析利用SPSS 20.0软件处理实验数据,两组间比较采用t检验或wilcoxon秩和检验,P<0.05代表结果的差异具有统计学意义。结果（一）KLF-4抵抗AngⅡ诱导的VSMCs衰老通过AngⅡ缓慢刺激的方式成功诱导了小鼠主动脉血管衰老模型,免疫组化结果显示衰老相关蛋白P53在AngⅡ诱导组中呈现阳性表达,且随着AngⅡ刺激时间的延长阳性率也逐渐增加,而且P53主要表达在主动脉血管中膜的VSMCs的细胞核中。KLF-4蛋白的免疫组化实验结果显示KLF-4在衰老主动脉血管中阳性率呈现随AngⅡ刺激时间先上升后缓慢下降的趋势。随后在体外通过10-7m M AngⅡ刺激VSMCs 72h构建细胞衰老模型,β-半乳糖苷酶染色显示AngⅡ处理组衰老细胞明显增多,随后的WB结果显示AngⅡ处理组衰老相关蛋白P53表达升高也验证了衰老VSMCs模型构建成功。WB和免疫荧光染色结果进一步显示AngⅡ处理组KLF-4表达明显下降。随后在AngⅡ诱导的衰老VSMCs中过表达KLF-4后,P53蛋白的表达水平下降,β-糖苷酶染色结果也显示衰老VSMCs明显减少。本部分结果说明KLF-4能抵抗AngⅡ诱导的VSMCs衰老。（二）KLF-4通过促进细胞自噬抵抗AngⅡ诱导的VSMCs衰老在通过AngⅡ刺激构建的小鼠主动脉血管衰老模型中,免疫组化实验结果显示自噬相关蛋白BECN1的表达也是随刺激时间延长呈现先上升后缓慢下降的趋势。在细胞实验中,利用AngⅡ构建衰老VSMCs后,衰老VSMCs自噬流通量出现下降,WB结果进一步显示自噬相关标志性蛋白发生改变,包括LC3Ⅱ/Ⅰ转化比和BECN1表达的下降。通过以上结果我们观察到血管衰老过程中VSMCs自噬功能的降低。随后对AngⅡ处理的VSMCs过表达KLF-4后,发现LC3Ⅱ/Ⅰ转化比升高提示KLF-4增强了AngⅡ诱导的衰老VSMCs的自噬功能。对AngⅡ诱导的衰老VSMCs过表达KLF-4前,使用自噬抑制剂3-MA预处理以降低细胞自噬功能,β-半乳糖苷酶染色和P53蛋白表达检测结果则显示使用3-MA抑制早衰VSMCs自噬功能后,KLF-4抵抗AngⅡ诱导的VSMCs衰老的作用减弱。本部分结果说明KLF-4通过促进VSMCs的自噬功能抵抗AngⅡ诱导的VSMCs衰老。（三）KLF-4通过上调细胞自噬水平调控AngⅡ诱导VSMCs衰老的作用机制研究通过生物信息学网站预测显示KLF-4与Tert基因的结合位点,Ch IP实验验证了KLF-4对Tert基因表达的调控作用,同时WB结果也证实了在VSMCs和AngⅡ诱导的早衰VSMCs中,过表达KLF-4明显增加TERT蛋白的表达。随后在AngⅡ诱导的小鼠主动脉衰老血管模型中,免疫组化实验结果显示TERT的表达也是随着刺激时间延长呈现先上升后缓慢下降的趋势。同时在体外细胞实验中,WB结果显示AngⅡ诱导的衰老VSMCs中TERT表达明显下降。以上结果提示TERT在KLF-4抵抗AngⅡ诱导的VSMCs衰老过程中的作用。在对AngⅡ诱导的衰老VSMCs过表达TERT后,自噬流通量和自噬相关蛋白BECN1表达水平和LC3Ⅱ/Ⅰ转化比均出现增加,同时β-半乳糖苷酶染色结果和P53表达水平的降低都提示细胞衰老的减缓。在对AngⅡ诱导的衰老VSMCs敲低TERT的表达后,细胞衰老程度进一步加重也验证了TERT蛋白与衰老的关系。随后在早衰VSMCs中敲低TERT后给予自噬诱导剂雷帕霉素刺激后,VSMCs的自噬相关蛋白表达增加,β-半乳糖苷酶染色和P53蛋白表达结果提示衰老得到缓解。这些说明TERT也是通过上调自噬抵抗AngⅡ诱导的VSMCs衰老作用。进一步的挽救实验表明,KLF-4增强AngⅡ诱导的早衰VSMCs自噬水平和缓解细胞衰老的作用,在敲低TERT后这些作用均被抑制。综合以上结果可认为KLF-4抵抗AngⅡ诱导的VSMCs衰老是通过TERT介导的VSMCs自噬来实现的。结论我们的研究发现KLF-4通过增强TERT介导的VSMCs自噬功能抵抗AngⅡ诱导的VSMCs衰老。
张浩[2]（2021）在《Apelin通过AMPK/Autophagy通路调控间充质干细胞衰老的机制研究》文中研究表明在全世界范围内,心肌梗死（Myocardial Infarction,MI）存在高患病率和高死亡率的特点,尤其是老龄人群。近年来,大量的动物实验和临床试验证实间充质干胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）移植对MI有良好的治疗效果,逐渐成为了医学领域研究热点。目前,MSCs治疗MI以自体移植为主。然而对于MI这一与年龄相关疾病而言,MSCs的整体质量随着患者本身的年龄增长出现衰老,导致功能下降。因此,对来源于老年人的骨髓间充质干细胞（bonemarrow-derived MSCs,BMSCs）,在体外进行改造增强其功能具有重要意义。目的:1.比较年轻间充质干细胞（young mesenchymal stem cells,YMSCs）和衰老间充质干细胞（aged mesenchymal stem cell,AMSCs）的功能差异。2.明确Apelin介导AMPK/Autophagy通路调控MSCs衰老。方法:1.CCK8,Ki67免疫荧光染色法,累计群体倍增数实验检测MSCs增殖能力。2.SA-β-gal衰老试剂盒检测MSCs衰老。3.荧光定量RT-PCR检测MSCs中Apelin的m RNA表达量。4.ELISA试剂盒检测YMSCs和AMSCs分泌Apelin的能力。5.Western blot检测YMSCs和AMSCs的Apelin蛋白,衰老相关蛋白p16,p21,自噬相关蛋白p62,Beclin,LC3ΙΙ/Ι表达水平。6.透射电镜检测YMSCs和AMSCs细胞中的自噬小体数量。7.使用si RNA质粒转染YMSCs敲低Apelin,SA-β-gal衰老试剂盒检测衰老,Western blot检测Apelin蛋白,衰老相关蛋白p16,p21,自噬相关蛋白p62,Beclin,LC3ΙΙ/Ι,透射电镜检测细胞中自噬小体数量。8.使用慢病毒感染AMSCs过表达Apelin,Western blot检测Apelin蛋白,分别给予自噬抑制剂（3-MA）和AMPK抑制剂（化合物C）后,SA-β-gal衰老试剂盒检测衰老程度,Western blot检测AMPK,p-AMPK,自噬相关蛋白p62,Beclin,LC3ΙΙ/Ι,透射电镜检测细胞中自噬小体数量。结果:1.AMSCs增殖能力降低。CCK8实验与Ki67免疫荧光结果表明与YMSCs相比较,AMSCs的增殖明显下降（P<0.01）。2.AMSCs出现细胞衰老。AMSCs的SA-β-gal阳性率显着高于YMSCs（P<0.01）。AMSCs在P7代就基本停止了生长,而YMSCs可以继续增殖到P11代左右。随着代数增加,AMSCs增殖速率逐渐减缓,且远低于YMSCs。3.AMSCs中Apelin表达水平低且自噬功能受损。Western blot,RT-PCR,ELISA试剂盒结果表明在AMSCs中Apelin蛋白和m RNA,Cd M中Apelin浓度水平均显着低于YMSCs（P<0.01）与YMSCs相比较,AMSCs的衰老相关蛋白p16,p21表达显着升高（P<0.01）;自噬相关蛋白p62表达增高,Beclin,LC3ΙΙ/Ι表达降低（P<0.05）。透射电镜结果表明AMSCs自噬小体数量也显着少于YMSCs（P<0.01）。4.在YMSCs中敲低Apelin通过Autophagy调控细胞衰老状态。用Apelin-si RNA处理YMSCs后,Western blot结果表明Apelin在YMSCs表达减少（P<0.001）,衰老相关蛋白p16,p21表达水平增高（P<0.05）,自噬相关蛋白p62表达增高（P<0.001）,而Beclin,LC3ΙΙ/Ι表达降低（P<0.05）。SA-β-gal阳性率也显着增高（P<0.01）。5.在AMSCs中过表达Apelin通过AMPK/Autophagy通路,使细胞年轻化。在AMSCs中过表达Apelin后,Western blot结果表明在Apelin在AMSCs表达增高（P<0.01）,SA-β-gal阳性率降低（P<0.01）,透射电镜检测细胞中自噬小体数量增加（P<0.01）,衰老相关蛋白p16,p21表达水平减少（P<0.01）,自噬相关蛋白p62表达减少（P<0.001）,Beclin,LC3ΙΙ/Ι表达增高（P<0.01）。使用3-MA后则会减弱这种作用。同时过表达Apelin后p-AMPK表达增加（P<0.001）,SA-β-gal阳性率降低（P<0.01）,透射电镜检测细胞中自噬小体数量增加（P<0.001）,但是使用AMPK抑制剂Compound C后则会降低上述作用。结论:1.与YMSCs相比较,AMSCs增殖能力下降,存在明显的衰老。2.与YMSCs相比较,AMSCs中Apelin蛋白和m RNA以及Cd M中含量均下降显着,而衰老相关蛋白p16,p21表达升高。3.敲低Apelin通过Autophagy调控YMSCs衰老。4.过表达Apelin通过AMPK/Autophagy通路使AMSCs年轻化。
张文静[3]（2020）在《rDNA转录障碍诱发血管平滑肌细胞衰老及动脉瘤样退行性病变的发生》文中研究说明研究目的血管平滑肌细胞衰老（senescence）在多种血管疾病的发病机制中可能占有重要位置。动脉瘤（Aneurysm）是由血管壁退行性变引起的血管管腔病理性扩张。临床上常见的动脉瘤是腹主动脉瘤（Abdominal Aortic Aneurysm,AAA）。AAA破裂及其相关并发症引起的总死亡率超过80%。最新研究发现,血管平滑肌细胞衰老与AAA的发生发展亦密切相关。细胞衰老是多种应激条件下慢性损伤的结果,例如氧化应激、基因毒性应激和复制应激等。核仁是发生核糖体DNA（ribosomal DNA,rDNA）转录和核糖体生物合成的场所。抑制真核细胞中RNA聚合酶Ⅰ（RNA polymerase Ⅰ,PoI Ⅰ）介导的rDNA转录可触发一种独特的细胞应激反应,称为核仁应激（也称为核糖体应激）。我们课题组前期研究发现在血管平滑肌细胞中抑制rDNA转录、诱导核仁应激能够引起G2/M细胞周期阻滞,并且某些细胞衰老的标志物表达上调。本课题中我们对这一现象进行更深入的研究。我们提出以下科学假说:干扰rDNA转录过程诱导细胞核仁应激能够诱发血管平滑肌细胞出现衰老的表型,并且能够加速动脉管壁出现动脉瘤样的退行性病理改变。为了验证这一假说,我们主要关注了以下三个方面的科学问题:（1）人AAA组织和小鼠AAA模型中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达是否发生变化;（2）用平滑肌特异性敲除TIF-IA（Pol Ⅰ转录复合体关键组分之一）的小鼠及特异性Pol Ⅰ抑制剂（CX-5461）为手段,研究干扰rDNA转录、诱导细胞核仁应激是否能加速血管壁动脉瘤样退行性病变的发生发展;（3）在细胞水平阐明干扰rDNA转录诱发核仁应激反应是否加速血管平滑肌细胞出现衰老表型,探索可能的机制,并进一步验证在AAA组织中是否存在以上这些细胞学改变。研究方法一、动脉瘤组织中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达变化及干扰rDNA转录对血管壁动脉瘤样退行性病变发生发展的影响1.动物模型及分组选用8周龄ApoE-/-雄性小鼠建立Ang Ⅱ诱导的AAA模型;选用8周龄C57BL/6雄性小鼠建立CaCl2/PBS（Ca/P）诱导的AAA模型。ApoE-/-小鼠被随机分为2组,假手术组和Ang Ⅱ模型组,每组12只。在第7天及第28天取材。将C57BL/6小鼠随机分为2组,PBS对照组和Ca/P模型组,每组12只。在第7天及第28天取材。在药物干预实验中,C57BL/6小鼠被随机分为3组,每组10只,分别为 PBS 组、Ca/P 组和 Ca/P+CX-5461 处理组（CX+Ca/P）。2.Ang Ⅱ诱导的AAA模型将Ang Ⅱ按照1000ng/min/kg的剂量灌入渗透泵中,假手术（Sham）组灌入等量生理盐水。ApoE-/-小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40mg/kg）溶液进行麻醉后,小鼠取俯卧位,颈后部备皮后取一长约1cm的横切口,用眼科剪钝性分离背部皮肤与皮下组织,按照分组将渗透泵埋于皮下,将渗透泵置于皮下,逐层缝合切口。待小鼠苏醒后放回鼠笼,给予普通饮食。分别于造模第7天、第28天取材。用qPCR检测血管组织中UBF、TIF-IA、TBP、RPA43（Pol Ⅰ与TIF-IA连接的亚基）mRNA的表达变化。3.Ca/P诱导的AAA模型C57BL/6小鼠用小动物麻醉机吸入异氟烷气体进行麻醉,备皮后取下腹部正中切口,找到腹主动脉,仔细分离周围结缔组织,暴露出肾下腹主动脉段（近心端至肾动脉分叉处,远心端至髂动脉分叉处）。将充分浸润CaCl2溶液（0.5M）的棉条覆盖在腹主动脉表面,敷育10分钟。然后换成浸润无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的棉条继续敷育5分钟。敷育完毕后用生理盐水冲洗腹腔,用无菌棉球将冲洗液吸干。PBS对照组只敷育浸润PBS的棉条15分钟。逐层缝合组织,待小鼠苏醒后放回鼠笼,术后给予美洛昔康（1mg/kg）镇痛处理。分别于造模第7天、第28天取材。用qPCR检测血管组织中UBF、TIF-IA、TBP、RPA43 mRNA的表达变化。药物干预实验:CX+Ca/P组在敷育棉条的部位滴加50μL含CX-5461（终浓度10μM）的Pluronic F127凝胶。PBS组和Ca/P组滴加等量不含药物的Pluronic F127凝胶。待F127凝胶凝固后将肠管复位。术后4周取材,观察腹主动脉血管有无明显膨出并测量其最大直径,对组织切片进行弹性纤维染色（Verhoeff’s van gieson染色,简称EVG染色）和苏木素-伊红（HE）染色,对血管弹力层的破坏进行评分并作比较。4.smTIF-IA-/-小鼠的繁育及表型检测将雌性TIF-IAflox/flox小鼠和雄性平滑肌细胞骨架蛋白（SMA）启动子驱动的Cre表达小鼠（SMA-Cre）交配繁殖,得到TIF-IA+/-Cre小鼠,再将雌雄TIF-IA+/-Cre小鼠交配繁殖得到平滑肌特异性敲除TIF-IA基因（smTIF-IA-/-小鼠。取同窝出生的TIF-IA+/+小鼠作为野生型对照。观察小鼠状态、体重,检测并记录小鼠血压。取不同周龄小鼠进行解剖取材,将小鼠主动脉血管进行HE染色及EVG染色并统计血管中膜的平均厚度、观察弹力层形态改变、免疫组化检测平滑肌α肌动蛋白（α-SMA）、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、以及巨噬细胞标记物F4/80的表达。5.人腹主动脉瘤组织标本收集及处理收集2016年10月至2018年9月于山东大学齐鲁医院行腹主动脉瘤切除加人工血管置换术的患者组织标本。收集2016年11月至2018年3月于山东大学齐鲁医院器官移植中心进行肾脏移植术时部分残留的正常腹主动脉组织作为正常对照。用qPCR检测组织中UBF、TBP、TIF-IA mRNA的表达及pre-rRNA/18S rRNA的比值。Western blot检测组织中TBP、TIF-IA的蛋白表达。二、干扰rDNA转录对血管平滑肌细胞衰老的影响及其与动脉瘤病变的关系1.Pol I抑制剂对血管平滑肌细胞衰老表型的影响分别用两种Pol I抑制剂CX-5461和BMH-21处理小鼠平滑肌细胞系（MOVAS）和人主动脉平滑肌细胞（HASMC）。用SA-β-Gal（衰老相关β半乳糖苷酶）染色实验检测衰老细胞的比例,用qPCR检测衰老相关标志物p21CiPⅠ、P16INK4a和纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的表达,以及衰老相关分泌因子白介素（IL）-6和IL-8的表达。2.TIF-IA基因沉默对血管平滑肌细胞衰老表型的影响用表达shRNA的慢病毒载体敲低MOVAS细胞中TIF-IA基因的表达,用qPCR和Western blot检测慢病毒干扰效率。用qPCR检测敲低TIF-IA基因对rDNA转录复合体关键因子UBF、polr-1A（编码Pol Ⅰ最大的亚基）和RPA43表达的影响;检测其对p21Cip1、PAI-1、IL-6及IL-8表达的影响。用Cell Counting Kit-8（CCK-8）和流式细胞术分别检测TIF-IA基因沉默对细胞增殖和细胞周期的影响。3.TIF-IA基因沉默对平滑肌细胞DNA损伤反应的影响敲低TIF-IA基因后,用细胞免疫荧光检测MOVAS细胞中核仁磷蛋白（nucleophosmin,NPM）在细胞核中的分布,用Western blot和/或免疫荧光检测p53蛋白及其磷酸化水平以及ATM、ATR的磷酸化水平。用细胞免疫荧光检测敲低TIF-IA对MOVAS细胞核中磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）和DNA依赖蛋白酶的催化亚单位（DNA-PKCs）水平的影响。用碱性彗星电泳实验检测敲低TIF-IA基因对DNA链断裂的影响。4.AAA组织中核仁应激、细胞衰老及DNA损伤反应的变化用qPCR检测人AAA组织中p21Cip1、PAI-1、MMP-2和MMP-9的表达。用免疫组化/免疫荧光检测人AAA中膜组织中DNA损伤通路相关的p53、ATR及ATM/ATR底物S/T*Q的磷酸化水平,检测γH2AX的表达变化并用免疫荧光双标法将γH2AX与α-SMA共定位。为了明确AAA中DNA损伤是否与核仁应激增加有关,对NPM进行了免疫荧光染色,并将NPM和γH2AX进行共定位,对共定位情况进行分析。在smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜组织中,用免疫组化检测p53及ATR磷酸化水平。用SA-β-Gal染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）实验检测smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜细胞的衰老和凋亡情况。用免疫组化检测组织中PAI-1及IL-8的表达变化。结果一、动脉瘤组织中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达变化及干扰rDNA转录对血管壁动脉瘤样退行性病变发生发展的影响1.人腹主动脉瘤组织中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达变化qPCR检测结果显示,与正常主动脉组织相比,人AAA组织中TIF-IA mRNA表达水平下调,而TBP mRNA表达上调,UBF的表达没有显着改变。Western blot检测结果显示TIF-IA蛋白表达降低,TBP蛋白表达升高。qPCR检测结果显示45S pre-rRNA与成熟18S rRNA的比率下降。2.Ang Ⅱ诱导的AAA组织中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达变化多普勒超声检测显示,Ang Ⅱ诱导的AAA模型中第7天腹主动脉最大直径增大50%,第28天最大直径增大140%。qPCR结果显示,第7天时UBF、TBP和RPA43的表达水平没有显着改变,而TIF-IA的水平降低。第28天时UBF、TIF-IA的表达水平均降低,而TBP和RPA43表达没有明显变化。3.Ca/P诱导的AAA组织中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达变化HE染色结果显示,Ca/P诱导的AAA模型于第7天开始出现中膜弹性纤维破坏和炎症细胞浸润;第28天中膜弹性纤维破坏加重、出现明显弹力层断裂及炎症细胞浸润。qPCR结果显示,UBF的表达在第7天没有变化,但在第28天显着下降。TIF-IA的表达在第7天和第28天均显着下调。TBP的表达在第7天上调,而在第28天没有明显变化。相比之下,RPA43在两个时间点的表达均无明显变化。4.SsmTIF-IA-/-小鼠主动脉壁自发出现动脉瘤样退行性病变smTIF-IA-/-、鼠在出生时可以存活,但表现出生长迟缓,体重比野生型小鼠约轻1 0-20%。在4～10周龄时发生自发性死亡,死亡发生前无明显的行为异常。对死亡小鼠进行尸检,未发现腹腔或胸腔出血。组织病理学检查显示,100%的smTIF-IA-/-小鼠在胸、腹主动脉均有广泛的动脉瘤样退行性病变。组织病理学检查显示血管病变表现为弹力层的紊乱和断裂,平滑肌细胞减少,主动脉血管壁平均厚度降低。免疫组化结果显示,smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜MMP-2和MMP-9表达水平升高。此外,smTIF-IA-/-小鼠主动脉血管周围区域巨噬细胞浸润增加。5.特异性Pol Ⅰ抑制剂CX-5461加重Ca/P诱导的AAA形成为了进一步阐明干扰rDNA转录是否在动脉瘤形成中起致病作用,我们在Ca/P模型中腹主动脉周围局部应用CX-5461干预。结果显示,CX-5461增加了Ca/P诱导的AAA发生率。经CX-5461处理的腹主动脉的平均直径明显大于对单纯造模组。组织病理学分析显示,CX-5461处理的腹主动脉中膜弹力层断裂和丢失更为明显。对小鼠血管中膜弹性纤维组织分级统计发现,CX+Ca/P组腹主动脉中膜弹性纤维分级高于Ca/P组（评分越高组织破坏越显着）。二、干扰rDNA转录对血管平滑肌细胞衰老的影响及其与动脉瘤病变的关系1.抑制rDNA转录诱导平滑肌细胞出现衰老样表型SA-β-Gal染色显示CX-5461（0.5μM）处理MOVAS细胞后衰老细胞比例升高。qPCR结果显示,CX-5461和另外一个Pol Ⅰ抑制剂BMH-21（0.5μM）处理后细胞衰老相关基因p21Cip1、p16INK4a和PAI-1的表达水平与对照组相比均显着升高,同时衰老相关分泌因子IL-6和IL-8的mRNA表达水平也高于对照组。用BMH-21（5μM）处理HASMC细胞同样增加SA-β-Gal阳性衰老细胞的比例。qPCR 结果显示,CX-5461（0.5μM）和 BMH-21 处理 HASMC 后p21Cip1、p16INK4a和PAI-1的表达水平均显着上调。Western blot结果显示,BMH-21处理的HASMC中p21Cip1蛋白表达增加。2.TIF-IA基因沉默诱导MOVAS细胞出现类似衰老的表型MOVAS细胞中沉默TIF-IA基因表达48小时后,qPCR和Wstern blot检测均显示TIF-IA基因敲低效率大于90%,而Pol Ⅰ复合体其它组分UBF、Polr-1A和RPA43的水平均无明显变化。CCK-8实验结果显示TIF-IA基因敲低后细胞增殖速率减慢。流式细胞术检测结果显示TIF-IA基因敲低诱导细胞出现G2/M期阻滞和S期时相延长。TIF-IA基因敲低组细胞中p21Cip1、PAI-1、IL-6和IL-8的表达水平显着高于对照组。3.干扰rDNA转录引起平滑肌细胞核仁应激及p53通路激活细胞免疫荧光结果显示,敲低TIF-IA基因使MOVAS细胞核仁蛋白NPM在核仁/核质中的比例下降,提示NPM出现核仁向核质的弥散。核仁形态改变,出现了核仁帽结构,提示细胞出现核仁应激反应。Western blot和细胞免疫荧光检测发现TIF-IA基因沉默显着增加了 p53（Ser15位）的磷酸化水平,而总的p53蛋白水平没有明显变化。4.干扰rDNA转录引起的p53磷酸化可能与激活非典型的DNA损伤反应有关细胞免疫荧光检测结果显示MOVAS细胞中敲低TIF-IA显着增加ATM/ATR的磷酸化水平,同时增加γH2AX和DNA-PKCs阳性细胞的比例。然而用碱性彗星电泳实验检测发现干扰rDNA转录并没有引起广泛的DNA链断裂,提示干扰rDNA转录在血管平滑肌细胞中引起的p53磷酸化可能与激活一种非典型性的DNA损伤反应有关。5.细胞核仁应激、DNA损伤反应、衰老与动脉瘤病变的关系qPCR结果显示人AAA组织中PAI-1、p21Cip1、MMP-2和MMP-9的表达均上调,表明细胞衰老水平增加。根据α-SMA免疫组化结果选取中膜富含平滑肌细胞的区域进行观察,NPM免疫荧光染色显示AAA组织中核仁形态异常（表现为NPM荧光信号弥散）的细胞数量增加。免疫组化结果显示p53磷酸化（Ser15）水平在AAA组织中显着升高。在AAA组织中,细胞核中γH2AX染色阳性细胞的比例显着增加。免疫荧光结果显示phospho-ATR阳性细胞比例比对照血管组升高。此外,ATM/ATR底物功能域S/T*Q的磷酸化水平在AAA组织中也呈增加趋势。深入分析γH2AX和NPM免疫荧光双标结果发现,一半以上的γH2AX阳性细胞中γH2AX与弥散的NPM呈现共定位。没有γH2AX-NPM共定位的γH2AX 阳性细胞中,大部分核仁结构完好（没有核仁应激现象））。这些结果提示在AAA组织中细胞p53磷酸化水平增加伴随核仁应激增加和DNA损伤反应增加,而且DNA损伤反应的发生部分定位于核仁内,提示可能与rDNA有关。为进一步验证以上结果,我们在smTIF-IA-/-小鼠主动脉中进行观察,SA-β-Gal染色显示smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜中衰老细胞数量增多。免疫组化结果显示smTIF-IA-/-小鼠主动脉中膜细胞p-p53和p-ATR 阳性细胞比例增高,同时IL-8和PAI-1表达增多。相反,TUNEL染色结果显示与野生型小鼠相比,smTIF-I A-/-小鼠主动脉中膜中细胞凋亡没有发生明显改变。结论动脉瘤组织中Pol Ⅰ转录复合体关键组分的表达水平出现差异性改变。整体情况下干扰平滑肌细胞rDNA转录过程加速血管壁动脉瘤样退行性病变的发生发展。在体外,干扰平滑肌细胞rDNA转录过程,诱导细胞核仁应激,可能通过触发非典型性DNA损伤反应激活p53通路,进一步导致平滑肌细胞出现衰老样表型。在人AAA组织中膜中细胞p53磷酸化水平增加,并伴随核仁应激增加和DNA损伤反应增加,而且DNA损伤反应的发生部分定位于核仁内,提示可能与rDNA有关。创新性及意义1.首次揭示了 rDNA转录障碍可能参与动脉瘤的发生发展。2.构建的平滑肌细胞特异性TIF-IA基因敲除小鼠可能作为研究动脉瘤样病变发生的新型动物模型。局限性1.在体内实验中尚未完成针对细胞衰老进行的干预实验。2.在体外实验中没有观察抑制DNA损伤反应对平滑肌细胞衰老的影响,不能确立诱发的非典型性DNA损伤反应与细胞衰老之间的因果联系。
胡艳红[4]（2020）在《益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的机制研究》文中研究说明国际糖尿病联盟数据显示,2019年全球20-79岁成人死亡人数中,因患糖尿病而致死的约占11.3%;65-99岁年龄段人群中,糖尿病患病率约占19.3%（约1.356亿）,预计到2030年,65岁以上（65-99岁）的糖尿病患者人数将达到1.952亿,2045年约2.762亿。这些数据表明糖尿病是全球人口老龄化社会的慢性疾病负担,预防糖尿病及其并发症对延缓衰老与衰老相关性疾病的研究,应对人口老龄化意义重大。流行病学调查研究显示,糖尿病血管病变是糖尿病患者主要常见并发症,与糖尿病血糖波动密切相关,是其他多种并发症发生的病理基础。血管是人体多种器官的重要组成部分,血管衰老是引起人体多器官系统衰老的重要病理生理基础,是血管相关性疾病发生的高危因素,故研究糖尿病血管衰老及其并发症对延缓糖尿病血管病变,提高老年人身体健康刻不容缓。糖尿病血管衰老分糖尿病大血管衰老和糖尿病微血管衰老,其中胸主动脉和颈总动脉是大血管衰老主要损伤部位,胸主动脉和颈总动脉作为心脑的主要供血部位,两血管衰老可进一步加重心肌纤维化、脑认知功能障碍等心脑血管损伤,导致心脑老化。血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC）作为血管壁中膜的主要构成成分,其异常增殖、迁移、细胞周期改变和表型转化,是导致VSMC衰老,加速血管衰老,最终诱导糖尿病血管衰老的重要病理因素。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin,mTOR）通路是影响衰老的主要信号通路,现大量研究发现,AMPK/mTOR通路在糖尿病大血管损伤、糖尿病心脏病、糖尿病脑病、糖尿病肾病及糖尿病视网膜损伤等糖尿病血管病变方面具有重要预防和保护作用,也是影响VSMC增殖、迁移和表型转化的重要途径,可减少VSMC衰老,参与血管衰老进程,并与糖代谢关系密切。因此基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的作用机制意义重大。人参三七川芎提取物（Ginseng Radix et Rhizoma,Notoginseng Radixet Rhizomaand Chuanxiong Rhizomaextracts,GSC）是益气活血药人参、三七、川芎的醇提取物,前期药理学研究显示,GSC具有较好的抗衰老功效,在一定程度上可以从整体、血管组织、细胞和分子水平延缓大鼠生理性血管衰老和复制性血管内皮细胞和VSMC衰老。但对于疾病造成的病理性血管衰老的机制及GSC对此类血管衰老及并发症的干预研究仍处于初步阶段。因此本研究通过构建体内糖尿病小鼠血管衰老及血管衰老并发症模型和体外高糖诱导人主动脉血管平滑肌细胞（Human Aortic Smooth Muscle Cell,HASMC）衰老模型,观察益气活血药GSC对糖尿病小鼠颈总动脉、胸主动脉血管衰老,心脑老化及高糖诱导HASMC衰老的保护作用,并以AMPK抑制剂和基因转染技术抑制HASMC中AMPK表达为切入点,探讨基于AMPK/mTOR通路GSC对高糖诱导HASMC衰老的调节作用和机制。第一部分益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症的体内实验研究实验一益气活血药延缓糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老的机制研究目的:探讨GSC对糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老的作用机制。方法:腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）联合高脂饲料长期喂养诱导糖尿病小鼠模型,造模7个月后,随机分为空白对照（Control）组、糖尿病（HG）组、GSC-L组、GSC-H组和二甲双胍（Met）组,连续给药9周。取材前购进新一批4周龄雄性C57BL/6小鼠正常适应性喂养7天,作为青年（Young）组。观察各组小鼠一般状态,检测小鼠随机血糖,使用苏木精-伊红（HE）染色、胶原纤维（Masson）染色结合透射电镜（TEM）检测小鼠颈总动脉病理形态学变化,采用冯库萨（Von Kossa）染色检测小鼠颈总动脉、胸主动脉钙盐沉积程度,免疫组化（IHC-P）和蛋白免疫印迹法（WB）检测小鼠颈总动脉和胸主动脉中基质金属蛋白酶2（Matrix metalloproteinases 2,MMP-2）、周期蛋白依赖激酶抑制因子2A（p16）、周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A（p21）、runt 相关转录因子-2（Runt-related transcriptionfactor-2,Runx2）、骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscle actin,α-SMA）与平滑肌 22α 蛋白（Smooth Muscle 22α,SM22α）蛋白表达。结果:Young组和Control组小鼠体型适中、反应灵敏、活泼好动、毛发黑亮有光泽,血糖较低,颈总动脉、胸主动脉病理形态学改变较轻,各衰老蛋白表达较正常;与Control组相比较,HG组小鼠体型瘦弱、反应迟钝、弓背卷体、精神萎靡、毛竖无光泽间杂黄白色毛发,血糖升高显着（P<0.01）。颈总动脉血管纤维化,血管壁内皮细胞和VSMC损伤严重,胞质裂解、突起,胞内空泡和溶酶体等大量增多,中外膜厚度,颈总动脉和胸主动脉血管钙盐沉积程度等血管病理形态学改变加重（P<0.01）。颈总动脉和胸主动脉OPN蛋白表达增加,SM22α蛋白表达减少（P<0.01）。颈总动脉Runx2、p16、p21和MMP2蛋白高表达,α-SMA低表达（P<0.01）;与HG相比较,GSC-L、GSC-H和Met组小鼠外在衰老状态明显好转,血糖下降显着（P<0.05）,颈总动脉血管纤维化、血管壁中内膜层超微结构、中外膜厚度、颈总动脉和胸主动脉血管钙盐沉积程度明显减轻（P<0.01）。颈总动脉和胸主动脉OPN蛋白表达减少,SM22α蛋白表达增强（P<0.05）。颈总动脉Runx2、p16、p21和MMP2蛋白高表达被抑制,α-SMA表达增强（P<0.05）。结论:高糖可以通过改变小鼠一般状态,刺激颈总动脉血管纤维化、血管壁中内膜层超微结构、中外膜厚度,颈总动脉和胸主动脉血管钙盐沉积程度等血管衰老病理形态学变化改变,调节MMP2、p16、p21、Runx2、OPN、α-SMA、SM22α相关衰老蛋白表达,诱导小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老。GSC可以降低糖尿病小鼠血糖水平,改善小鼠外在衰老状态和体内血管衰老病理性变化,延缓糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老,其作用机制可能是通过调节MMP2、p16、p21、Runx2、OPN、α-SMA、SM22α蛋白表达来发挥作用。实验二基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠心脏老化的影响目的:观察GSC在糖尿病小鼠心脏老化中对AMPK/mTOR通路的影响。方法:由于体内实验一显示Young组和Control组糖尿病小鼠血管没有出现显着衰老病理变化,故在检测糖尿病心肌纤维化时只分Control组、HG组、GSC-L组、GSC-H组和Met组五组。其余分组同体内实验一。分别使用HE、Masson、Von Kossa结合TEM检测小鼠心脏组织病理形态学改变,采用IHC-P和WB检测心脏组织中胶原蛋白Ⅰ型（Collagen types I,Collagen I）、胶原蛋白Ⅲ型（Collagen types Ⅲ,Collagen Ⅲ）、转化生长因子 β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）蛋白表达,WB 检测 MMP-2、抑癌基因 p53（Tumor suppressor p53,p53）、磷酸化抑癌基因 p-p53（Phospho-tumor suppressor p53,p-p53）蛋白和 AMPK/mTOR 通路表达。结果:Young和Control组小鼠心肌纤维、心肌细胞排列均匀致密、有规则,结构清晰完整。心脏微血管染色均匀,未见明显钙盐沉积。MMP2、p53、p-p53及AMPK/mTOR通路表达不显着;与Control组相比较,HG组心肌细胞体积增大,核皱缩,线粒体肿胀、变性、线粒体嵴空泡化,甚至断裂。细胞间隙增宽,排列紊乱,多见炎细胞浸润,并可见灶性坏死。心脏微血管正常结构被破坏,血管弹性纤维间有大量棕色钙盐颗粒沉积,心肌间质尤其是在微血管周围有蓝染胶原纤维大量沉积（P<0.01）。心肌中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、MMP2、p53、p-p53 蛋白高表达,p-LKB1/LKB1、p-AMPK/AMPK蛋白比值显着降低,p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K蛋白比值升高显着（P<0.05）。与HG组相比较,GSC-L、GSC-H和Met组小鼠心脏组织病理形态学显着改善（P<0.05）,CollagenⅠ、CollagenⅢ、TGF-β1、MMP2、p53、p-p53 蛋白表达水平下降,可有效上调 p-LKB1/LKB1 和 p-AMPK/AMPK 蛋白比值,下调 p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K 蛋白比值（P<0.05）。结论:高糖通过刺激小鼠心脏发生心肌纤维化、心脏超微结构改变、心脏微血管纤维化和钙化等病理形态学改变,增加心肌纤维化标志物Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1和衰老蛋白MMP2、p53和p-p53表达,促进AMPK/mTOR通路中各蛋白异常表达,从而诱导心脏老化。GSC能够改善糖尿病小鼠心脏病理形态学变化,延缓心脏老化,其作用机制可能是通过调控AMPK/mTOR通路表达,抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、TGF-β1、MMP2、p53和p-p53蛋白表达来发挥作用。实验三基于AMPK-mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠脑老化的影响目的:观察GSC在糖尿病小鼠脑老化中对AMPK/mTOR通路的影响。方法:由于体内实验一和实验二显示Young组和Control组糖尿病小鼠血管没有出现显着衰老病理变化,故在检测糖尿病小鼠海马区尼氏体数量变化和神经元损伤时,没有检测Young组病理变化。其余分组同体内实验一。使用旷场实验检测小鼠行为学变化,分别使用HE、Nissl、Von Kossa结合TEM检测小鼠脑组织海马区组织病理形态学改变,采用IHC-P检测海马组织晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end-product,AGE）和β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）蛋白表达,WB检测海马组织AGE、糖基化终末产物受体（Receptor of advanced glycation end-products,RAGE）、Aβ、MMP2、p53、p-p53 和AMPK/mTOR通路表达。结果:Young和Control组小鼠行为学、脑微血管病理形态学及超微结构无显着改变,衰老蛋白及AMPK/mTOR通路表达无显着差异;与Control组相比较,HG组小鼠中央活动总时间和总行径路程均显着下降（P<0.01）,脑微血管内细胞数量减少、排列紊乱,可见血管腔狭窄,血管壁有棕色颗粒沉积。神经元核膜皱缩,染色质分布不均匀,电子密度低,胞浆内细胞器部分溶解消失,脑微血管壁结构欠清晰。尼氏体、神经元和锥体细胞数量减少（P<0.01）。海马区AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53的蛋白表达水平显着增加,AMPK/mTOR通路表达存在显着差异（P<0.01）;与HG组相比较,各药物干预组小鼠行为学、脑微血管病理形态学均显着改善,海马CA1、CA3和DG区神经元变性减轻,尼氏体、神经元和锥体细胞数量增加（P<0.01）,海马区AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53蛋白活性显着下降,AMPK/mTOR通路表达被改善（P<0.05）。结论:高糖可以诱导小鼠海马区尼氏体数目减少,导致神经元受损及超微结构改变,加速脑微血管钙化等病理改变,增加AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53蛋白表达,促使AMPK/mTOR通路中各蛋白异常表达,改变小鼠行为学变化,致使脑老化。GSC可以从行为学方面改善糖尿病小鼠的衰老状态,并通过抑制小鼠海马区尼氏体缺失和神经元损伤,缓解脑微血管钙化和海马区超微结构改变,充分发挥脑保护作用。其保护机制可能是通过调节AMPK/mTOR通路,抑制AGE、RAGE、Aβ、MMP2、p53和p-p53蛋白表达有关。第二部分益气活血药延缓高糖诱导血管平滑肌细胞衰老的体外实验研究实验一建立高糖诱导的HASMC衰老模型目的:探索一种稳定的高糖诱导的病理性HASMC衰老模型,为研究GSC延缓血管衰老提供一种新的细胞实验模型。方法:取第6或7代HASMC接种贴壁后,用无血清DMEM低糖基础培养基饥饿24h,然后选择5.5、11、22、33、44、66、88和110 mmol/L浓度的高糖培养基分别干预24h、48h、72h、96h,用MTT筛选诱导HASMC衰老的最佳高糖浓度和干预时间。继而依次使用β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色检测细胞衰老程度,划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力,流式检测细胞周期,WB检测衰老相关蛋白MMP2、p53、p-p53和表型转化标志蛋白SM22α、α-SMA、Runx2、OPN和重组人骨形态发生蛋白-2（Recombinant Human Bone Morphogenetic protein-2,BMP-2）表达,进一步验证最佳高糖造模浓度和干预时间。结果:MTT结果显示:33 mmol/LD-Glucose干预HASMC 72h时,HG组细胞增殖活力显着下降,D-M组细胞增殖活力变化不明显,确立为诱导HASMC衰老模型最佳高糖浓度和干预时间。与Control组相比较,HG组HASMC增殖活力、迁移能力、S期细胞百分比及SM22α、α-SMA蛋白表达水平下降（P<0.05）,SA-β-gal蓝染比率、G0/G1期细胞所占百分比及MMP2、p53、p-p53、Runx2、OPN、BMP-2蛋白表达水平上升（P<0.05）。结论:33 mmol/LD-Glucose培养基作用HASMC72h时,细胞衰老较为明显,为诱导HASMC衰老模型的最佳高糖浓度和最佳作用时间。HASMC衰老机制可能与改变细胞增殖迁移能力、SA-β-gal表达、细胞周期、表型转化,调节p53、p-53、MMP2、SM22α、α-SMA、Runx2、OPN、BMP-2 蛋白表达有关。实验二益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响目的:观察GSC对高糖诱导的HASMC衰老的影响。方法:在体内实验一细胞模型的基础上,分别筛选GSC和Met最佳干预浓度,然后分为Control组、HG组、GSC-L组、GSC-M组、GSC-L组和Met组。在体内实验一检测方法的基础上,再使用免疫荧光检测α-SMA和OPN荧光表达。结果:与Control组相比较,HG组HASMC增殖活力、迁移能力、S期细胞百分比、α-SMA荧光表达及SM22α、α-SMA蛋白表达水平下降（P<0.05）,SA-β-gal蓝染比率、G0/G1期细胞所占百分比、OPN荧光表达及MMP2、p53、p-p53、Runx2、OPN、BMP-2蛋白表达水平上升（P<0.05）;与HG组相比较,GSC和Met干预组细胞增殖活力和迁移能力增加,细胞SA-β-gal蓝染比率和G0/G1期细胞所占百分比下降,S期上升,衰老蛋白MMP2、p53、p-p53及合成型标志物Runx2、OPN、BMP-2表达受到抑制,收缩型标志物SM22α、α-SMA蛋白表达水平增加（P<0.05）。结论:GSC通过改善HASMC增殖迁移能力、细胞周期、表型转化和β-半乳糖苷酶表达可延缓高糖诱导的HASMC衰老,其干预机制可能与降低MMP2、p53、p-p53、OPN、Runx2、BMP-2表达水平,增加SM22α、α-SMA表达水平密切相关。实验三基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响目的:观察GSC在HASMC衰老中对AMPK/mTOR信号通路的影响。通过AMPK抑制剂和基因转染技术干扰AMPK活性与表达,进一步探讨GSC延缓HASMC衰老的作用机制。方法:在体内实验一细胞模型的基础上,基因转染技术干扰AMPK活性分为Control组、HG组、GSC组和Met组,其余分组同体内实验二。WB检测AMPK/mTOR通路活化,AMPK抑制剂Compound C和AMPKα1慢病毒颗粒干扰AMPK活化后,采用体内实验一检测方法进行具体指标检测。结果:1)与Control组相比较,HG组HASMC p-AMPK/AMPK比值下调,p-mTOR/mTOR比值上调（P<0.01）;与HG组相比较,药物干预组p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR比值趋于正常（P<0.05）。2)Compound C抑制AMPK活性后,与HG组相比较,药物干预组HASMC增殖迁移能力、细胞周期改变、SA-β-gal蓝染比率、表型转化及 MMP2、p-p53、p53、Runx2、OPN 和 BMP-2 蛋白表达和 AMPK/mTOR 通路表达方面尚未有显着差异。3)AMPKα1沉默后,与SCR shRNA阴性对照组比较,AMPKα1 shRNA转染后HASMC中AMPK磷酸化与未磷酸化表达水平下调（P<0.01）,mTOR磷酸化与未磷酸化表达水平上调显着（P<0.01）,HASMC增殖迁移能力及SM22α、α-SMA蛋白表达均下降,MMP2、p-p53、p53、Runx2、OPN和BMP-2蛋白表达上调,部分具有统计学差异（P<0.05,P<0.01）;与HG组相比较,药物干预组HASMC增殖迁移能力、表型转化及衰老相关蛋白和AMPK/mTOR通路表达尚未有显着差异。结论:AMPK/mTOR通路参与高糖诱导HASMC衰老这一过程,GSC可以调控AMPK/mTOR通路,保护HASMC衰老。通过AMPK抑制剂和RNA干扰技术干扰AMPK表达后,GSC抑制高糖诱导HASMC衰老的作用显着减弱。提示GSC抑制高糖诱导HASMC衰老的作用机制,部分可能来源于对AMPK/mTOR通路的调控。综上所述,本研究利用体内糖尿病小鼠血管衰老及血管衰老并发症模型及体外高糖诱导的HASMC衰老模型,证明益气活血药GSC可以延缓糖尿病小鼠颈总动脉、胸主动脉血管衰老,心脑老化及高糖诱导的HASMC衰老。并通过AMPK抑制剂和RNA干扰技术干扰HASMC AMPK表达后,观察GSC对HASMC衰老的作用,进一步证实GSC延缓糖尿病血管衰老及并发症的机制可能是通过调控AMPK/mTOR通路及其上下游通路来发挥作用的,以往未从此角度探索益气活血药对血管衰老及血管衰老并发症的保护作用,为中医药防治糖尿病心脑血管疾病提供了新思路。
李书国,童格,叶明,邓娟娟,邵文[5]（2020）在《SIRT1对大鼠血管平滑肌细胞衰老的影响》文中研究说明目的:研究沉默信息调节因子1（SIRT1）对血管平滑肌细胞衰老的影响。方法:分离培养大鼠血管平滑肌细胞,取对数生长期细胞分为对照组、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）组、AngⅡ+Lv-NC组、AngⅡ+Lv-SIRT1组,用100 nmoL/L的AngⅡ诱导血管平滑肌细胞衰老,AngⅡ+Lv-NC和AngⅡ+Lv-SIRT1组血管平滑肌细胞分别转染阴性对照慢病毒载体和SIRT1过表达慢病毒载体,对照组细胞仅常规培养。采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中SIRT1的表达。β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况,Western blot检测细胞中衰老相关蛋白P21、P53表达,PI单染法检测细胞周期变化。结果:衰老诱导后的血管平滑肌细胞β-半乳糖苷酶阳性率升高,细胞中P21、P53蛋白表达水平升高,G0/G1期细胞比例增多（P<0.05）。过表达SIRT1能够降低衰老诱导条件下血管平滑肌细胞β-半乳糖苷酶的阳性率,减少细胞中P21、P53蛋白表达,降低G0/G1期细胞比例（P<0.05）。结论:SIRT1能够抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞衰老。
常早上[6]（2019）在《FoxO3在小鼠心脏氧化损伤及衰老过程中的作用机制研究》文中研究说明目的:百草枯（PQ）能促进脑组织细胞衰老,从而导致帕金森病。并且,PQ诱发心力衰竭和氧化损伤,但PQ是否以及如何诱导心脏衰老仍不清楚。在此,我们报道PQ诱导心肌细胞株H9c2氧化损伤以及细胞衰老相关表型,PQ体内诱导与心脏衰老相关的心室重塑和功能障碍表型。此外,PQ在体内和体外都抑制长寿因子FoxO3的活化。心血管疾病已经成为影响我国人口健康的主要原因,衰老是导致心血管疾病高发的一个重要诱导因素。因此,探索心脏衰老及靶向干预疗法,是目前衰老领域的研究热点和前沿。在本研究中,我们通过H2O2诱导心肌细胞衰老,以及自然年轻鼠（3月龄）、自然衰老鼠（24月龄）、全身敲除FoxO3年轻鼠（3月龄）和全身敲除FoxO3年老鼠（23月龄）,探索FoxO3在心脏衰老中的作用及其可能涉及的机制。并通过高通量测序,深入阐明介导心脏衰老的分子和细胞学机制,寻找缓解心肌氧化损伤,以及有效干预衰老相关心血管疾病的有效途径。方法:（一）:（1）利用q PCR、WB,检测PQ对FoxO3 mRNA和总蛋白的影响,检测Akt/FoxO3通路相关蛋白的表达变化。（2）通过si RNA干扰FoxO3,使用DCH2DCF检测H9c2细胞内ROS的含量,JC-1染色检测H9c2细胞线粒体膜电位的变化,FITC-PI检测细胞凋亡以及PI染色检测细胞周期的变化。（3）通过慢病毒系统筛选并建立H9c2细胞的FoxO3基因沉默稳定细胞株（sh FoxO3）,对照组（sh NC）。WB检测PQ对超氧化物歧化酶SOD2,过氧化氢酶Catalase,衰老标记物p53,p16以及凋亡相关蛋白Bax/Bcl2的影响。（二）:（1）构建心脏特异性敲除靶基因的小鼠(FoxO3-/-),标记为CKO,动物实验分为三组,对照组注射PBS,WT组注射PQ和CKO组注射PQ,每周一次,连续四周。利用q PCR、WB,检测PQ对心脏组织FoxO3 mRNA和蛋白的影响,检测Akt/FoxO3通路相关蛋白的表达变化,免疫荧光检测PQ对FoxO3在细胞核中表达的影响。（2）DHE免疫荧光检测小鼠心脏组织内ROS含量,MDA检测心脏组织脂质氧化程度。利用TUNEL染色技术,分析小鼠心脏组织细胞凋亡,免疫组化检测8-OHd G的变化。WB检测SOD2、Catalase、p53、p16、p21,p27和Bax/Bcl2蛋白的变化。（3）构建过表达载体SOD2、Catalase,转染H9c2细胞,以及Ch IP-PCR证明FoxO3与小鼠心脏SOD2、Catalase启动子结合。构建FoxO3及Catalase腺相关病毒载体系统（AAV9）,分析心脏过表达FoxO3、Catalase缓解PQ诱导的氧化损伤。（三）:（1）H2O2诱导H9c2细胞衰老,使用WB,检测H2O2诱导H9c2细胞衰老对FoxO3蛋白的影响,以及Akt/FoxO3通路相关蛋白的表达变化。（2）通过si RNA沉默FoxO3,使用DCH2DCF检测衰老H9c2细胞内ROS的含量,FITC-PI检测细胞凋亡的变化。（3）通过慢病毒系统筛选并建立H9c2细胞的FoxO3基因沉默稳定细胞株（sh FoxO3）,对照组（sh NC）,WB检测衰老H9c2细胞SOD2,衰老标记物p53、p16、p21、p27,凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3/Caspase3、Cleaved-Caspase9/Caspase9、Bax/Bcl2的变化以及q PCR方法检测端粒长度的变化。（四）:（1）构建全身敲除靶基因FoxO3的小鼠(FoxO3-/-),标记为EKO,并且在蛋白水平验证FoxO3敲除效率。动物实验分为四组,WT年轻（3月龄）、WT年老（24月龄）、EKO年轻（3月龄）和EKO年老（23月龄）鼠,使用q PCR、WB,检测自然老年鼠中FoxO3mRNA和蛋白的变化,检测Akt/FoxO3通路相关蛋白的表达变化,免疫荧光检测自然衰老对FoxO3在细胞核中表达的影响。（2）q PCR检测衰老相关分泌因子SASP变化:TNFα、MMP3、IL-8、IL-6和IL-1β。检测自然衰老和EKO老年鼠线粒体拷贝数变化CoxΙ/β-globion,Cytb/H19,PGC1α和线粒体中ATP含量的变化,透射电镜检测心肌组织中线粒体形态的变化。（3）WT年轻、WT年老、EKO年轻和EKO年老鼠,免疫荧光检测γH2AX和Lamin B的变化。（4）WB检测衰老相关蛋白p53、p16、p21,p27和凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9、Bax/BCL2,自噬相关蛋白LC3B,增殖相关蛋白PCNA的变化以及p-m TOR、P-AMPK、P-Erk,P-MAPK蛋白和P-IκB的变化。（5）通过RNA-seq高通量测序,分析WT年轻、WT年老、EKO年轻和EKO年老鼠差异性基因和相关信号通路的变化。并且在mRNA水平验证能量代谢靶基因Myh7、Aldob、Mapk9、ACADSB、PTGES3、HADHB、Tcf7L2,NADK2的变化。结果:（一）:（1）PQ诱导显着抑制FoxO3 mRNA和蛋白的表达,抑制Akt/FoxO3活性。（2）PQ诱导H9c2细胞ROS积累,细胞凋亡,线粒体膜电位下降,抑制细胞周期,促使细胞衰老,敲除FoxO3,进一步加剧以上表型。（二）:（1）PQ诱导小鼠心脏心室重构,WGA表明PQ诱导心肌细胞肥大,上调肥大相关基因的表达,诱导小鼠心脏组织内积累ROS,促进脂质氧化物丙二醛（MDA）的生成,心脏特异性敲除FoxO3进一步加剧上述表型。（2）过表达SOD2、Catalase,显着促使细胞增殖,抑制PQ诱导的细胞凋亡。Ch IP-PCR证明FoxO3结合SOD2,Catalase启动子区域,正向调控SOD2和Catalase的表达。心脏过表达FoxO3和Catalase,表明FoxO3、Catalase缓解PQ诱导的心室重构。（三）:（1）H2O2诱导H9c2细胞衰老,显着抑制FoxO3蛋白的表达,和Akt/FoxO3活化。（2）WB证明si RNA有效的沉默FoxO3,H2O2诱导H9c2细胞ROS积累,细胞凋亡,敲除FoxO3,进一步加剧以上表型。（四）:（1）自然衰老降低FoxO3 mRNA和蛋白在小鼠心脏组织的表达,抑制Akt/FoxO3通路的活化。（2）SASP结果表明,自然衰老上调TNFα,MMP3,IL-6和IL-1β细胞因子,敲除FoxO3,促使IL-6和IL-1β的表达,抑制TNFα的表达。（3）衰老心脏组织抑制能量代谢,破坏线粒体形态和结构。全身敲除FoxO3进一步导致线粒体结构紊乱.（4）衰老心脏组织促使γH2AX表达,抑制Lamin B表达,EKO老年鼠进一步促使γH2AX表达,下调Lamin B表达。（5）WT年轻鼠、WT年老鼠、EKO年轻鼠,EKO年老鼠,高通量测序表明有37个差异性基因是重叠的,通过Go和KEGG分析表明,37个差异性基因主要集中在线粒体氧化磷酸化和能量代谢途径。ACADSB和PTGES3作为靶基因进一步研究。结论:（1）PQ和H2O2诱导H9c2细胞衰老表型,抑制增殖,促进凋亡,β-gal活性增加,以及p53,p16蛋白表达。体内实验表明FoxO3敲除加剧PQ诱导和自然衰老的心肌肥厚、纤维化、凋亡、氧化损伤。（2）体内实验通过染色质免疫沉淀验证FoxO3与心脏Cat和SOD2基因启动子结合,过表达Cat或SOD2可缓解PQ诱导的FoxO3敲除的心肌细胞衰老表型。FoxO3和Cat在心脏中的过表达显着抑制了PQ诱导的心脏损伤和与衰老相关的表型。（3）FoxO3参与到m TOR、AMPK,自噬通路,共同调控衰老过程,高通量测序再次证明FoxO3主要参与到线粒体生物合成和能量代谢,从而调控哺乳动物的心脏衰老过程。
翟纯刚[7]（2018）在《DKK3抑制动脉粥样硬化病变和心肌纤维化的作用及其机制研究》文中研究表明1研究背景动脉粥样硬化疾病（atherosclerosis,AS）是一种动脉管壁的进展性炎症疾病,在引起急性心脑血管疾病例如心肌梗死和中风之前可以很多年都没有临床症状。在AS的发展过程中,伴随内皮细胞损伤,脂肪和胆固醇逐渐沉积在动脉管壁上,形成AS脂核,在脂核之外,覆盖着一层由平滑肌细胞（SMC）、成纤维细胞和胶原组织等形成的纤维帽。AS斑块中还有巨噬细胞、T细胞和中性粒细胞等炎性细胞的浸润。当纤维帽中的SMC减少、细胞外基质合成减少或降解增多时,斑块纤维帽变薄,导致斑块不稳定和斑块破裂,引发急性冠脉事件。因此寻找增加斑块稳定性的方法和药物具有重要的临床意义。目前,在干细胞与AS领域的研究表明,间充质干细胞（MSC）可以迁移到损伤组织,分化为功能细胞并且修复受损的组织。移植的MSC可以定位到破裂的斑块区域,分化成为内皮细胞并分泌胶原纤维。此外,骨髓、血液循环以及动脉外膜中的平滑肌祖细胞都可以分化为SMC并迁移到损伤区域;在某些条件下,外膜中的胚胎成纤维细胞也可以向内膜迁移并分化为SMC。干细胞抗原1（Stem cell antigen 1,Sca1）是外膜平滑肌祖细胞的常见标志物,由于外膜中的Sca1+血管祖细胞和胚胎成纤维细胞更靠近AS的损伤内膜并且来源更加广泛,因此如何有序调控Sca1细胞和胚胎成纤维细胞向SMC的精准分化变得更加重要。大量研究表明,DKK3对于胚胎组织的生长发育不可缺少,例如神经管上皮、胚芽和骨组织,另外DKK3可以抑制多种类型的细胞肿瘤,过表达时可以抑制细胞的增殖;目前,有研究指出DKK3能够影响上皮-间充质的转化,促进部分诱导的多能干细胞（partially induced pluripotent stem cell）向平滑肌细胞分化。因此DKK3可能是一种合适的干细胞诱导因子,深入研究DKK3诱导调控外膜Sca1+血管祖细胞和胚胎成纤维细胞向SMC分化影响斑块稳定性的机制具有十分重要的临床意义。2研究目的我们的研究目的包括:（1）研究DKK3对于胚胎成纤维细胞和Sca1+细胞诱导分化的促进作用及其分子机制;（2）研究两种分化而来的SMC对于DKK3-/-ApoE-/-小鼠串联狭窄手术引起的动脉粥样硬化病变的作用,探讨DKK3对于AS斑块炎症、平滑肌细胞数量以及细胞外基质含量的影响;（3）研究DKK3对于家兔动脉粥样硬化斑块的影响;（4）在临床患者中研究DKK3与动脉粥样硬化斑块稳定性的关系。3研究方法1.小鼠串联狭窄病变模型将 8 周龄 DKK3-/-/ApoE-/-和 DKK3+/+/ApoE-/-小鼠（C57BL/6J 背景）高脂喂养6周然后进行手术。麻醉后分离右侧颈总动脉,分别在距离颈动脉分叉处1mm的远端和距离远端狭窄3mm的近端制作一个外径为150μm的串联狭窄。继续饲养4周造成动脉粥样硬化模型。2.血管外膜细胞孵育将总量为1×106来源于GFP转基因小鼠的Sca-1+祖细胞与25μL的Matrigel（?）基底膜混合,然后接种于接受串联狭窄手术小鼠的颈动脉外膜中。4周后取材进行后续实验。3.DKK3凝胶释放实验在DKK3释放实验中,将重组的DKK3（200ng/mL）与30%的Pluronic 127凝胶混合,然后外敷于接受串联狭窄手术的小鼠的颈动脉外膜上将血管包住。4周后取材进行后续实验。4.静脉移植实验选取3月龄DKK3-/-/ApoE-/-和DKK3+/+/ApoE-/-小鼠,麻醉后将右侧颈总动脉游离,切去一段动脉,取一段同窝异体小鼠的腔静脉用8.0丝线与两个动脉断端吻合。观察到移植静脉有搏动证明移植成功。5.股动脉损伤和细胞孵育实验DKK3+/+/APoE-/-小鼠麻醉后分离双侧股动脉,来回插入0.25mm导丝三次造成动脉损伤,长度为从股动脉到远端肌肉分支4mm。右侧损伤股动脉外膜注入25μL的Matrigel?人工基底膜,其中包含源自SM22-Lacz小鼠的Sca-1+细胞和胚胎成纤维细胞（1×106）,另一端作为对照,72小时后取材。6.体内基质胶栓实验在严重免疫缺陷小鼠背部和腰间皮下注射50μL混有HUVECs的基质胶,实验组胶内加入标记有Qtracker?605的胚胎成纤维细胞分化的SMC,对照组胶内加入未诱导的胚胎成纤维细胞。每组小鼠各选择六个注射点。12天后处死小鼠并将栓子取出,一部分迅速投入液氮,进行后续的冰冻切片实验;另一部分用4%福尔马林溶液浸泡过夜后进行组织学染色。7.组织学染色石蜡切片或冰冻切片用H&E染色观察形态,免疫组织化学染色检查RAM-11、α-SMA、MMP-9,免疫荧光检测 SM22、SMMHC、SMA、CD68,Collal、DKK3、elastin、CD31、CD144、Calponin、Sca1,天狼猩红染色检查弹力纤维和胶原。8.β-半乳糖苷酶原位染色取5mm经过损伤手术的股动脉,剥去脂肪组织和血管外膜后沿长轴纵切,用β-半乳糖苷酶染色固定液固定组织,加入染色工作液,37℃孵育直至部分细胞颜色变蓝。然后在普通光学显微镜下观察、拍照。9.细胞培养人类胚胎成纤维细胞购自ATCC,用F-12K培养基（ATCC,30-2004）培养。每两天更换一次培养基,每三天按照1:3或者1:7的比例传代。小鼠Sca-1+祖细胞和胚胎成纤维细胞分离自不同小鼠的主动脉内膜,包括ApoE-/-小鼠、野生型小鼠以及转基因小鼠（GFP-Sca-1;SM22-LacZ）,然后用抗Sca-1磁珠试剂盒纯化细胞。纯化后细胞用含10%的EmbryoMax?内皮细胞级的高品质胎牛血清的DMEM培养基培养,培养基中加入10ng/ml的白血病抑制因子和0.1mM的2-巯基乙醇,培养皿同样预先包被0.4%的明胶。分离Sca-1+细胞后,剩余细胞用胚胎成纤维细胞培养基继续培养,传代5次后即为纯化的胚胎成纤维细胞。10.细胞转染和药物刺激人类胚胎成纤维细胞和Sca1+细胞加入过表达腺病毒,24小时后换液,继续加入指定药物刺激,培养至指定时间收取细胞;人类胚胎成纤维细胞和Sca1+细胞加入沉默慢病毒和polybrene,24小时后换液,继续加入指定药物刺激,培养至指定时间收取细胞。11.胚胎成纤维细胞核转染ATF6用NHDF核转染试剂盒对人胚胎成纤维细胞进行电穿孔转染ATF6转录因子质粒,对照组用PCMV5空载体。将2×106个细胞和2μg的空载体或ATF6质粒共培养,然后接种于包被明胶的培养板上,在DM培养基中分化48小时,收集细胞进行Q-PCR实验。12.RNA提取、反转录和Q-PCR按照说明书用RNA提取试剂盒提取总RNA,用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,然后进行Q-PCR。13.免疫印迹将20-50μg总蛋白与1×的SDS上样缓冲液煮沸10分钟,根据蛋白分子量的不同选择4%-12%的Bis-Tris胶,然后用90V电压电泳分离蛋白,200mA电流转膜2小时将胶上蛋白转至PVDF膜上,然后用TBST配制的5%牛奶室温下封闭1小时,用相应一抗孵育过夜。第二天用相应辣根过氧化物酶标记的二抗孵育PVDF膜,室温下孵育2小时,然后用ECL化学发光法检测蛋白。14.细胞免疫荧光细胞首先用4%多聚甲醛固定,然后在室温下用5%猪血清封闭30分钟。用相应一抗孵育过夜。第二天用相应的荧光二抗37℃下孵育30分钟,用DAPI染核,用荧光显微镜或者共聚焦显微镜观察。15.酶联免疫吸附试验（ELISA）血清或培养基按照说明书进行稀释后按照步骤进行操作,检测血清和培养基中DKK3浓度,培养基中的胶原1a1和TGFβ1的浓度。16.荧光素酶活性分析在进行胚胎成纤维细胞实验时,预先在12孔板中包被明胶,转染DKK3过表达病毒,24小时后用myocardin或SMMHC启动子报告载体转染细胞,对照组加入pGL3-Luc-Renilla。转染48小时后用多功能酶标仪检测荧光素酶和光素酶活性。相对荧光素酶单位（Relative Luciferase Unit,RLU）定义为荧光素酶与光素酶的比值,空白对照组设置为1.0。17.家兔实验20只体重在1.5-2.0 kg,年龄在8-10周的新西兰大白兔随机分为2组,每组10只。首先耳缘静脉注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉家兔,利多卡因局部麻醉后暴露右侧股动脉,用小剪刀剪一个小口,插入针鞘,将导丝从针鞘插入直到胸主动脉,取一个4-Fr球囊导管（3.5×15 mm2）沿导丝进入股动脉,进入足够深度后用肝素盐水充盈球囊,加压至8个大气压力,然后将球囊导管回抽至腹主动脉分叉处,释放球囊内压力并再次插入到胸主动脉处,反复进入回抽三次造成动脉内膜损伤。术后家兔继续用含1%胆固醇和3%猪油的饲料喂养12周。从第12周开始,每两周通过耳缘静脉注射一次腺病毒,病毒量为2.5×109pfu,实验组注射DKK3过表达病毒,对照组注射相同量的腺病毒空载体,从第13周开始,每两周耳中动脉取血一次,第20周处死家兔,取整段主动脉进行后续实验。18.主动脉油红O染色分离整段主动脉,剥离血管外膜和脂肪组织,纵切,暴露血管内膜,拍照后用油红O染液浸泡2-4小时然后用70%酒精脱色直到仅内膜中的脂肪组织着色。然后用蒸馏水冲洗,置于4%福尔马林溶液中保存。将染色后的整段血管展开后拍照分析。19.血脂检测小鼠处死时心脏取血0.5-1.0mL,室温下静置1小时直至血液凝结,然后以2000 g/min的速度离心15分钟。家兔造模后分别在第12、13、14、15、17、20周取血,用全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）的含量。20.临床患者检测收集山东大学齐鲁医院从2015年6月至2015年]2月的病例,根据患者的病史和临床症状按照Braunwald分类法分为稳定性心绞痛组和不稳定性心绞痛组。记录入组患者的一般临床指标,包括身高、体重、年龄、性别、血压、血糖、每日吸烟和饮酒量。入组患者在用药前进行一次静脉采血,化验室检测其血清中白细胞、肌酐、纤维蛋白原、同型半胱氨酸、空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白,用ELISA试剂盒检测血清中DKK3含量。4研究结果1.DKK3敲除改变动脉粥样硬化斑块成分利用串联狭窄手术构建小鼠动脉粥样硬化模型,4周后进行HE染色可见DKK3-/-ApoE—/-双敲小鼠斑块内出血多于DKK3+/+ApoE-/-小鼠,而斑块中SMC含量和细胞外基质含量少于DKK3+/+ApoE--小鼠,巨噬细胞浸润多于DKK3+/+ApoE-/-小鼠,天狼猩红染色显示DKK3-/-ApoE-/-双敲小鼠弹力纤维和胶原表达减少。2.DKK敲除增加移植血管破裂发生率构建小鼠颈动脉移植模型,在DKK3-/-ApoE-/-双敲小鼠组,十只小鼠全部发生了移植血管破裂并发症,可见破裂、坏死、钙化和红细胞聚集,而DKK3+/+ApoE-/-小鼠组仅有2只发生移植血管破裂并发症。检测斑块内成分发现DKK3-/-ApoE-/-双敲小鼠斑块内SMC减少而CD68+巨噬细胞增多,而弹力纤维和胶原含量减少。3.DKK3促进Sca1+细胞迁移对小鼠进行串联狭窄手术,取带有GFP标记的转基因小鼠的原代Sca1+细胞,注射到手术后的颈动脉外膜中,结果发现Sca1+细胞在4周内迁移到DKK3+/+ApoE-/-小鼠内膜,并部分分化为SMC,而Sca1+细胞在DKK3--ApoE--双敲小鼠血管外膜中的迁移能力降低。此外,Sca1+细胞减少了 DKK3+/+ApoE--小鼠斑块内出血的发生率。4.Sca1+细胞和胚胎成纤维细胞促进内膜损伤修复对DKK3+/+ApoE-/-小鼠进行股动脉损伤手术,将来自SM22-Lacz小鼠和野生型小鼠的Sca1+细胞和胚胎成纤维细胞注射至其血管外膜,3天后可见细胞迁移至内膜并分化为SMC。5.DKK3在体外可以诱导胚胎成纤维细胞分化为SMCDKK3可以促进胚胎成纤维细胞在DM分化培养基中的分化,4天后形态上即逐渐向SMC转化,在基因水平和蛋白水平上都表达SMC的特异分子,并且可见SMMHC和myocadin的启动子活性明显增加。6.DKK3诱导胚胎成纤维细胞向SMC的分化受TGF-β1调节在DKK3过表达和仅有空载体处理的胚胎成纤维细胞中添加人的重组TGF-β]因子。结果同时添加DKK3过表达病毒和TGF-β1重组蛋白的胚胎成纤维细胞形态与未处理的胚胎成纤维细胞和仅添加TGF-β1因子的成纤维细胞明显不同,前者形态更趋向于平滑肌。PCR和免疫印迹显示TGF-β]刺激可以进一步增加过表达DKK3的胚胎成纤维细胞表达SMC特异分子和细胞外基质。在DKK3过表达的胚胎成纤维细胞中添加TGF-β1受体ALK5的特异性抑制剂,结果显示,ALK5受抑制后,SMC特异蛋白的表达显着下降。同样,向培养基中添加抑制活化TGF-β1的特异性中和抗体也可以抑制SMC标志物的表达。向添加TGF-β1细胞因子的胚胎成纤维细胞的培养基中加入含或不含DKK3沉默（shDKK3）的慢病毒。结果显示,DKK3沉默后,SMC特异蛋白和细胞外基质明显减少。用慢病毒外源性沉默TGF-β1的表达也可以减少SMC特异蛋白和细胞外基质的分泌,这表明SMC的分化进程受到了抑制。7.DKK3通过激活ATF6调节TGF-β1的表达通过Qiagen Champion芯片转录因子搜索发现当DKK3过表达时转录激活因子6（ATF6）上调。为了验证DKK3是否能够诱导ATF6的表达,我们对胚胎成纤维细胞感染了 shDKK3或者空病毒载体,结果发现DKK3沉默时,ATF6表达也下降,同时,用小干扰RNA沉默ATF6也可以导致TGF-β1在基因水平和蛋白水平的减少,相反ATF6过表达则不仅可以增加TGF-β1的表达还能增加SMC各种特异蛋白和细胞外基质的表达。8.DKK3诱导胚胎成纤维细胞分化为有功能的SMC我们还采用基质胶栓注射的实验来研究诱导的SMC与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）混合时在体内形成功能血管的能力。DKK3诱导的SMC添加了红色追踪标签然后在人工基底膜中与HUVEC混合,混合后注入重症综合性免疫缺陷（SCID）小鼠皮下。两周后收取标本并进行H&E染色。结果显示这些细胞可以形成完整的血管。冰冻切片免疫荧光染色检测内皮细胞标志物,结果显示内皮细胞形成了组成血管内衬的管状结构,而诱导分化的SMC正确定位到了外层,包裹住内层的内皮小管,形成了两层坚固的血管层。因此我们推断由DKK3诱导分化而来的平滑肌具有形成体内完整血管的功能。9.DKK3促进Sca1+祖细胞分化为SMCSca1+细胞接种于预先铺有胶原IV基质的培养皿中并且用DM分化培养基培养。PCR和免疫印迹结果显示SMC特异蛋白和DKK3表达量都上升。ELISA检测细胞培养基显示Sca1+细胞向SMC的分化过程中DKK3表达量升高。免疫荧光染色显示SMC的特异蛋白和DKK3表达都增多。用shDKK3沉默DKK3可以看到SMC特异蛋白减少,用DKK3抗体中和分泌型DKK3也可以得到相同结果。用重组DKK3蛋白或者过表达DKK3刺激细胞进行研究,结果表明SMC特异蛋白增多。10.DKK3通过调节Wnt通路促进Sca1+祖细胞分化用DKK3的抗体中和了 Sca1+细胞培养基中的DKK3因子,可以看到Wnt通路的靶基因下调,用shDKK3沉默DKK3也可以得到相似的结果。我们用反转录实时定量PCR分析器分析小鼠的Wnt通路。当DKK3过表达时,大部分与Wnt通路相关的基因表达明显增加;相反,加入shDKK3时,大部分Wnt通路基因表达下降。用Wnt通路的特异性抑制剂可以发现Wnt通路受到抑制后Sca1+细胞分化过程中SMC特异蛋白表达减少。免疫印迹分析表明过表达DKK3导致小鼠Sca1+细胞中活化状态的β-catenin增加,然而用特异性抑制剂抑制Wnt通路后,即使过表达DKK3,SMC标志物也会减少。综上所述,DKK3可以通过激活Wnt通路使Sca1+细胞分化为SMC。11.外源性DKK3可以减轻DKK3-/-ApoE-/小鼠动脉粥样硬化斑块形成对DKK3-/-ApoE-/-小鼠进行串联狭窄手术,然后在其颈动脉外膜敷上含有200μg/ml重组DKK3的pluronic凝胶。对照组采用DKK3+/+ApoE--小鼠,其颈动脉外膜测的pluronic凝胶中含有200μg/ml的小鼠血清蛋白。手术4周后取材切片进行H&E染色。结果显示,凝胶中DKK3蛋白的释放能够极大减少DKK3-/-ApoE-/-小鼠斑块中的红细胞数量。免疫荧光染色结果显示凝胶释放DKK3可以增加DKK3-/-ApoE-/-小鼠斑块中SMC的含量,减少CD68巨噬细胞的浸润,与DKK3+/+ApoE-/-小鼠没有明显差异。天狼猩红染色显示两组小鼠的细胞外基质含量也没有明显差异。因此这些结果表明外源性给予DKK3同样能够减少斑块内出血和巨噬细胞浸润、增加SMC和细胞外基质含量,从而改变斑块成分。12.DKK3过表达可以改变家兔动脉粥样硬化斑块的成分通过球囊拉伤加高脂喂养的方法构建家兔晚期动脉粥样硬化斑块模型。喂养10周后,通过耳缘静脉注射腺病毒的方法使家兔过表达DKK3。血清ELISA检测显示注射后DKK3持续升高。免疫组化检测结果显示DKK3腺病毒注射组斑块中SMC含量明显高于空载体注射组,而巨噬细胞浸润明显少于空载体注射组,而且MMP9+细胞少于空载体注射组。天狼猩红染色结果显示DKK3腺病毒注射组ECM含量高于空载体注射组。油红O染色结果显示两组斑块大小没有明显差别。13.不稳定心绞痛患者血清中DKK3含量降低分别收集稳定性心绞痛患者和不稳定性心绞痛患者血清。用ELISA的方法检测其血清中DKK3含量,结果显示不稳定性心绞痛患者血清DKK3水平降低。5研究结论1.我们首次证明了 DKK3是一种强有力的SMC分化诱导因子,在胚胎成纤维细胞中,DKK3可能通过与某种受体结合来激活ATF6进而激活TGF-β1,导致胚胎成纤维细胞分化为平滑肌细胞。2.在Sca1+血管祖细胞中,DKK3通过间接结合到Wnt结合位点ATF6,然后激活Wnt/β-catenin通路导致Sca1+血管祖细胞分化为平滑肌细胞。3.DKK3通过其诱导分化功能增加小鼠和家兔动脉粥样硬化易损斑块内平滑肌细胞和胶原纤维、弹力纤维含量,减少巨噬细胞浸润和斑块内出血的发生率,具有重要的治疗作用。4.不稳定心绞痛患者血清DKK3浓度下降,提示DKK3可能可以作为分子标志物预测不稳定心绞痛的发生。1.研究背景心肌纤维化是指心脏组织中胶原异常增殖、不同类型的胶原构成比例失调、排列紊乱。任何能够增加心脏后负荷以及影响神经-体液的因素都可能导致心脏肥大和心肌纤维化,表现为室壁僵硬、收缩能力和灌注下降。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）激活是导致心肌纤维化的最重要原因。血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,AngⅡ）AngⅡ是RAAS系统中最重要的组分,可以直接影响心肌细胞和成纤维细胞,导致心肌细胞肥大和成纤维细胞增殖、过度分泌细胞外基质。因此,阻断AngⅡ的生物学效应必将对损伤的心肌产生保护作用。研究发现血管紧张素转化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2）可以裂解血管紧张素Ⅱ并且形成血管紧张素1-7（Ang1-7）,后者对于心肌肥厚和纤维化具有一定的保护作用,显示出ACE2潜在的治疗价值。同时,近年研究发现,金属蛋白酶 17（A disintegrin and metalloproteinase 17,AD AM1 7）具有降解 ACE2的功能,因此我们推测其可能与血管紧张素Ⅱ导致的心肌损伤存在相关性。β-连环蛋白（β-catenin）是Wnt通路的核心效应分子,当其在细胞质中增多时引起细胞核转位增多,进而引起促心肌肥厚和纤维化相关基因转录增多,导致心肌纤维化和心肌肥厚。糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）是一种抗心肌肥厚激酶,游离状态的GSK-3β可以被招募到卷曲蛋白受体（Frizzled receptor）上,从而与β-catenin结合,促进β-catenin的降解,阻断其核转录。转化生长因子β1（transforming growth factor,TGF-β1）的生物学功能非常广泛,主要包括诱导内皮细胞合成功能、促进成纤维细胞合成胶原、抑制基质金属蛋白酶活性等。在心肌纤维化的过程中,TGF-β1不仅调节各种信号转导途径,还可以直接刺激CF细胞增殖,是导致心肌纤维化最重要的调节因子。因此,在本实验中我们检测了 TGF-β1在AngⅡ诱导的心肌纤维化中的作用。目前,已有研究报道dickkopf-3（DKK3）对于心肌具有一定保护作用,而其在AngⅡ诱导的心肌纤维化中的作用尚不清楚,对心肌组织中GSK-3β/β-catenin信号通路和ADAM17/ACE2的表达变化也没有研究,对此我们进行了本次研究。此外我们还研究了 DKK3是否影响TGF-β1/Smad3信号通路进而调节AngⅡ的致纤维化作用。2.研究目的本研究的目的主要有四个:（1）研究DKK3过表达是否减轻AngⅡ诱导的心肌肥厚和纤维化;（2）在AngⅡ诱导的心肌纤维化小鼠模型中,研究DKK3是否能够影响GSK-3β/β-catenin信号通路;（3）研究DKK3与ADAM17/ACE2和TGF-β1信号通路的关系;（4）研究DKK3对AngⅡ诱导的炎症和成纤维细胞增殖的作用。3.研究方法1.小鼠原代心脏成纤维细胞培养无菌条件下取新生C57BL/6小鼠的心脏,在培养基中剪碎后用Ⅱ型胶原酶消化三小时。离心后用完全培养基重悬沉淀,置于培养箱培养。2小时后换液去除未贴壁杂质,然后继续培养纯化成纤维细胞以备后续实验。2.细胞转染和药物刺激过表达实验首先将DKK3过表达病毒或者空载体按MOI=100加入成纤维细胞中,24小时后换液,加入1μg/ml的血管紧张素Ⅱ,共培养48小时后进行后续实验。分组如下:OV+AngⅡ组:DKK3过表达病毒+血管紧张素Ⅱ;AD+AngⅡ组:空载体病毒+血管紧张素Ⅱ;AngⅡ组:仅加血管紧张素Ⅱ;OV组:仅加DKK3过表达病毒;AD组:仅加空载体病毒;NC组:空白对照。3.细胞抑制实验原代心脏成纤维细胞接种后生长至30%然后进行刺激。将DKK3的小干扰RNA及对照RNA与载体混合后加入培养基,4小时后换液,24小时后加入1μg/ml的血管紧张素Ⅱ,再培养48小时,提取蛋白进行下一步实验。共分为四组:组1（NC-siRNA）:仅添加阴性小干扰RNA;组2（NC-siRNA+Angll）:加入阴性小干扰 RNA 和 AngⅡ;组 3（DKK3-siRNA+Angll）:加入 DKK3 小干扰 RNA 和 AngⅡ;组 4（DKK3-siRNA）:仅加入 DKK3 小干扰 RNA。4.动物实验取60只10到12周龄的野生型C57BL/6小鼠,随机分为4组,用微量泵以1000 ng/kg/min的速度缓慢泵入血管紧张素Ⅱ或生理盐水,持续28天,埋泵前三天尾静脉注射DKK3过表达腺病毒或空白病毒载体（2×109pfu）,在第15天注射第二次病毒,第31天测量血压并处死小鼠。动物实验分组如下:组1（OV+AngⅡ）:注射DKK3过表达病毒+泵入血管紧张素Ⅱ;组2（AD+Angll）:注射空病毒载体+泵入血管紧张素Ⅱ;组3（OV）:注射DKK3过表达病毒+泵生理盐水;组4（AD）:注射空病毒载体+泵生理盐水。5.实时定量RT-PCR使用TRlzol试剂提取小鼠左心室的总RNA,然后用PCR热循环仪进行实时定量PCR,检测心房钠尿肽（atrial natriuretic peptide,ANP）和β肌球蛋白重链（beta-myosin heavy chain,β-MHC）。具体参数为 95℃ 运行 30 s 然后 95℃ 运行 5 s共40个循环,最后56℃运行10 s。GAPDH用作内参,实验结果采用2△△CT进行计算。6.免疫印迹（Western blot）分析使用相应的蛋白提取试剂盒提取小鼠左心室或原代心肌成纤维细胞的总蛋白和核蛋白。各组调整相同蛋白上样量,电泳分离不同分子量蛋白,然后转至PVDF膜上。4℃条件下孵育相应的抗体过夜。所用一抗包括兔抗DKK3抗体、兔抗胶原Ⅰ、胶原Ⅲ抗体,兔抗磷酸化ADAM 17（T735）抗体,兔抗ACE2抗体、兔抗TGF-β1抗体、兔抗ADAM17抗体、兔抗GSK-3β抗体、兔抗磷酸化GSK-3β（Ser9）抗体、兔抗 β-catenin 抗体,兔抗活化 β-catenin（Ser33/37/Thr41）抗体、兔抗Bcl-2抗体、兔抗Bax抗体、兔抗Smad3、磷酸化Smad3（Ser423/425）抗体以及小鼠抗β-actin抗体,第二天孵育相应二抗后用化学发光法检测蛋白表达。7.细胞增殖分析（EDU）采用EDU（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine）染色的方法检测细胞增殖。在染色前进行细胞爬片并加入相应的药物刺激,然后加入含FBS和EDU的染料,多聚甲醛固定后用Triton X-100进行细胞通透,加入甘氨酸中和多聚甲醛;用Apollo-Fluor覆盖细胞并在室温下避光孵育、Hoechst33342染色后避光拍照,统计阳性细胞的百分比。8.免疫荧光CFs细胞用4%多聚甲醛固定后用山羊血清封闭,用Triton X-100进行细胞通透,加入兔抗active-β-catenin抗体覆盖细胞,4℃孵育过夜。第二天加入抗兔荧光二抗,避光孵育后DAPl染核,荧光显微镜拍照并计数分析。9.酶联免疫吸附实验（ELISA）小鼠血清DKK3浓度、Ang（1-7）、炎症因子白介素1β（IL-]β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的浓度用ELISA试剂盒检测。操作步骤均按照试剂盒说明书进行,重复三次取平均值。10.小鼠心功能及病理学检测小鼠处死前（第31天）用小动物超声仪进行心功能的检测。在第3天和第31天尾静脉测量小鼠血压。处死前测量小鼠体重和胫骨长度,处死后进行心脏灌洗,然后吸干水分称量心脏重量,计算心重比（HW/BW）及心胫骨比（HW/TL）。取下心脏后进行大体标本拍照比较。11.组织病理学和免疫组织化学小鼠心脏取下后浸泡在4%多聚甲醛中,24小时后流水冲洗过夜,在心尖部中下1/3的位置进行石蜡包埋。然后切片,厚度为5μm。进行H&E、Masson染色。免疫组织化学所用一抗为兔抗ACE2、兔抗胶原Ⅰ、胶原Ⅲ,兔抗CD45、CD68以及兔抗IL-6,二抗为北京中山金桥公司生产试剂盒,按照说明书进行操作,应用Image-Pro Plus 6.0进行数据分析。4.研究结果泵入血管紧张素后,尾静脉注射DKK3过表达病毒的小鼠比仅注射生理盐水的小鼠心脏肥大和间质纤维化水平明显减轻,而且心肌肥大相关指标ANP和β-MHC明显减少;纤维化相关指标胶原Ⅰ和胶原Ⅲ明显减少,心肌炎症反应降低;在体外实验中,DKK3过表达还可以减少心肌成纤维细胞的增殖和炎症反应,抑制磷酸化GSK-3β表达,减少β-catenin核转录;另外DKK3过表达可以降低磷酸化的ADAM]7的表达,进而增加ACE2的表达,促进血管紧张素Ⅱ的降解,增加Ang（1-7）的含量;当敲减DKK3时,磷酸化ADAM17表达增多,导致ACE2表达下降。同时,DKK3过表达还可以抑制AngⅡ诱导的TGF-β1信号通路激活,DKK3敲减可以增强TGF-β1信号通路。5.研究结论DKK3过表达能够抑制血管紧张素Ⅱ引起的心肌肥厚和纤维化,其机制与抑制GSK-3β和β-catenin,并且减少β-catenin核转录有关;另外DKK3过表达可以降低磷酸化的ADAM17的表达,进而增加ACE2的表达,促进AngⅡ的降解,增加Ang（1-7）的含量;同时,DKK3还可以抑制AngⅡ诱导的TGF-β1信号通路激活。
李汉骏[8]（2017）在《Foxp1在骨髓间充质干细胞命运决定和衰老过程中的作用研究》文中指出骨质疏松是一种在中老年群体中常见的骨骼疾病,患者体内骨质形成与骨质吸收的稳态被打破,骨质吸收快于骨质形成,导致骨量减少、骨骼疼痛、骨折风险加剧。骨质疏松很大程度上与衰老有关,在中国50岁以上中老年人群体中,约20%的人患有骨质疏松;40岁以上人群和60岁以上人群的比较说明:60岁以上老年人中骨质疏松症的发病率明显增高。骨质疏松患者成骨能力明显下降,骨髓常伴有严重的脂肪化,这些表型的出现都与骨髓间充质干细胞的衰老息息相关。骨髓间充质干细胞能够分化成包括成骨细胞、脂肪细胞等在内的骨组织细胞,在骨髓间充质干细胞衰老的过程中,它的分化能力发生改变、更倾向于分化成脂肪细胞而非成骨细胞,自我更新能力逐渐下降,细胞进入静息状态。然而这些衰老现象背后的具体调控机制仍然未得到阐明。在本课题中,我们研究了转录因子Foxp1在骨髓间充质干细胞分化和衰老过程中的功能。我们发现,随着年龄的增长,Foxp1在骨髓间充质干细胞中表达量逐渐降低;与之相反的是,干细胞衰老标志物p16Ink4a表达量逐渐上调。本课题利用Prx1-Cre在骨髓间充质干细胞和前体细胞中敲除了Foxp1,我们发现Prx1-Cre;Foxp1fl/fl小鼠在年轻时就表现出明显的老年性骨质疏松表型——骨量下降、骨髓内脂肪细胞增多,且随着年龄增长表型愈发严重。Prx1-Cre;Foxp1fl/fl敲除鼠的骨髓间充质干细胞增殖速度减慢,自我更新能力下降,更青睐于向脂肪细胞分化而非向成骨细胞分化,出现一系列明显的早衰表型。本课题还使用了Nestin-Cre在Nestin+的骨髓间充质干细胞中敲除Foxp1,我们发现Nestin-Cre;Foxp1fl/fl小鼠骨量也明显下降,骨髓内脂肪细胞增多,骨髓间充质干细胞成脂肪分化增强而成骨分化能力减弱。在原代骨髓间充质干细胞和C3H10T1/2间充质细胞系中过表达Foxp1会抑制它向脂肪细胞分化,促进它向成骨细胞分化。在分子机制层面,我们发现Foxp1能够直接与PPARγ启动子结合,阻遏PPARγ的转录,也能通过与C/EBPβ/δ结合,抑制它们对PPARγ的转录激活作用,从而抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化;Foxp1能够阻遏RBPjk对下游基因的转录激活作用,从而抑制了Notch信号通路活性,促进间充质干细胞向成骨细胞分化。我们还发现,Foxp1可以结合在p16Ink4a的启动子上,直接抑制p16Ink4a的转录。Prx1-Cre;Foxp1fl/fl;p16-/-双敲小鼠可以在一定程度上弥补Prx1-Cre;Foxp1fl/fl小鼠骨量下降的表型。这些实验证明Foxp1在一定程度上通过调控p16Ink4a表达调控了MSC衰老。我们在老年人的骨髓间充质干细胞中过表达FOXP1可以提升它们的增殖能力,也能够提高它们的成骨分化能力,抑制它们成脂肪分化能力。综上所述,我们发现Foxp1以一种年龄和剂量依赖的方式调控了骨髓间充质干细胞的分化和衰老。随着年龄增长,Foxp1表达量逐渐降低,一方面通过调控PPARγ和Notch信号通路的活性,使骨髓间充质干细胞更倾向于向脂肪细胞分化,另一方面通过上调p16Ink4a的表达使骨髓间充质干细胞进入静息状态。这些发现加深了对骨髓间充质干细胞命运决定和衰老调控的认识,同时也为骨质疏松症等骨骼衰老性疾病的治疗提供了崭新思路。
赵晖[9]（2014）在《GALC基因慢病毒构建高表达β-半乳糖苷酶成纤维细胞衰老模型与结肠癌细胞相互作用的初步研究》文中研究说明目的了解及进一步明确结直肠癌肿瘤微环境中衰老肿瘤间质细胞与上皮肿瘤细胞间的相互作用。方法1.回顾性分析了采用卡培他滨联合奥沙利铂方案进行新辅助化疗的结直肠癌患者16例，采用免疫组化法观察病理组织标本的肿瘤间质比、间质β-半乳糖苷酶活性、P53、Villin、Ki67、E-cadherin的表达，同时进行生存分析及化疗不良反应的观察。2.采用慢病毒载体转染构建高表达GALC基因（半乳糖苷酶基因）人胚胎肺成纤维细胞（HFL1），以及运用过氧化氢诱导HFL1细胞衰老。3.高表达GALC基因HFL1细胞的相关衰老方面指标的检测：运用免疫组织化学法进行β-半乳糖苷酶染色；PI法细胞周期检测；qRT-PCR及Western-blot法进行p16基因、p21基因、p53基因的表达，qRT-PCR法进行端粒酶蛋白催化亚基（TERT）mRNA的表达。4.将结肠癌细胞株与高表达GALC基因HFL1细胞共培养，采用CCK8法检测结肠癌细胞株细胞活力；碘化丙啶法对结肠癌细胞株细胞周期检测；TransWell法检测结肠癌细胞株迁移能力。结果1.采用Xelox方案新辅助化疗局部晚期结直肠癌患者，16例患者中客观缓解率为25.00%，疾病控制率为68.75%，中位总生存时间为12.00月，无进展生存期为13.43±6.10月。出现III—IV度不良反应分别为手足综合征6.25%、腹泻6.25%、中性粒细胞减少12.50%，贫血为6.25%。化疗后肿瘤间质比提高率为37.50%（6例），间质β-半乳糖苷酶染色表达为强阳性率为37.50%（6例）。化疗后间质β-半乳糖苷酶染色表达阳性与生存相关。2.慢病毒载体转染构建高表达GALC基因HFL1细胞可稳定转染，细胞形态具有衰老间质细胞表现，与过氧化氢诱导HFL1细胞衰老形态相似。3.高表达GALC基因HFL1细胞β-半乳糖苷酶染色呈阳性表现，细胞周期GO/G1期细胞比例明显增多；p21基因mRNA较正常HFL1细胞升高，TERTmRNA明显下降，并且具有统计学差异；p16及p21基因的蛋白表达较正常HFL1细胞明显增加。4.与高表达GALC基因HFL1细胞共培养条件下，LOVO细胞活力明显增加，有统计学差异；共培养24小时及48小时后， LOVO细胞的G0/G1期的比例均明显降低同时G2/M期的比例升高；RKO细胞的迁移能力增强，有统计学差异。结论1.采用Xelox方案新辅助化疗局部晚期结直肠癌患者，疗效可靠，不良反应可以耐受，化疗后间质β-半乳糖苷酶染色表达阳性与生存相关。2.慢病毒载体转染构建高表达GALC基因HFL1细胞可稳定转染，并且具有衰老细胞的相关形态及分子生物学特征。3.高表达GALC基因HFL1细胞与结肠癌细胞株共培养，可影响结肠癌细胞株的细胞周期、细胞活力及细胞迁移能力。
闾宏伟[10]（2012）在《S1P2受体介导内皮细胞衰老的作用研究》文中认为目的通过分析体外培养的脐静脉内皮细胞衰老模型和来自老年大鼠的肺微血管内皮细胞中1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine1-phosphate,S1P）受体的表达与细胞功能改变的关联性,探讨S1P受体在内皮细胞衰老过程中的作用,试图阐明S1P受体途径促内皮细胞衰老的作用及为预防老年心血管疾病提供实验依据。方法1.在体外培养的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）衰老过程中,分析S1P受体表达和内皮细胞功能的变化：分离人脐静脉内皮细胞,加入M199完全培养基进行培养,每3天传代一次。将细胞分组：内皮细胞培养至累积细胞群体倍增值（cumulative population doubling level, CPDL）约为15时,收集细胞,作为年轻细胞组（young cells, Y）; CPDL约为35时,作为中年细胞组（intermediate cells, I）; CPDL约为60时,作为衰老细胞组（senescent cells, S）。运用RT-PCR检测年轻、中年和衰老内皮细胞的S1P受体mRNA的表达；采用Western blot检测年轻、中年和衰老内皮细胞的S1P受体蛋白的表达；应用Matrigel胶种植法评价年轻、中年和衰老内皮细胞体外管状样结构形成能力；利用细胞跨膜迁移实验分析年轻、中年和衰老内皮细胞的趋化能力。2.S1P2受体的shRNA腺病毒载体（shRNA-S1P2）构建及筛选：设计并合成4对靶向S1P2受体的单链寡核苷酸（ss oligo）,经变性、退火形成双链寡核苷酸（ds oligo）,并插入穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle载体,测序验证后经脂质体介导转染人肺动脉内皮细胞（human pulmonary artery endothelial cells,HPAEC）,通过RT-PCR方法筛选对S1P2受体基因沉默效果最佳的穿梭质粒pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA,然后提取质粒DNA,经双酶切,回收S1P2受体基因沉默效果最佳的shRNA片段,再亚克隆至腺病毒表达载体（pAdeno-X）,筛选出正确的重组子,转染到HEK293A细胞,收集重组的腺病毒,测定病毒滴度,通过Western blot方法检测S1P2受体基因沉默的效果。3.调控S1P2受体的表达并分析其对体外脐静脉内皮细胞功能的影响：（1）过表达S1P2受体,观察体外脐静脉内皮细胞的功能变化：将培养的年轻脐静脉内皮细胞分别转染空质粒载体（pcDNA3.1）和重组质粒载体（pcDNA3.1/S1P2）；运用RT-PCR和Western blot检测空白对照内皮细胞、转染空质粒pcDNA3.1和转染重组质粒pcDNA3.1/S1P2的内皮细胞S1P受体的表达；应用Matrigel胶种植法评价空白对照组、转染空质粒pcDNA3.1组和转染重组质粒pcDNA3.1/S1P2组内皮细胞的体外管状样结构形成能力；采用细胞划痕实验检测空白对照组、转染空质粒pcDNA3.1组和转染重组质粒pcDNA3.1/S1P2组内皮细胞的损伤修复能力；利用细胞跨膜迁移实验分析空白对照组、转染空质粒pcDNA3.1组和转染重组质粒pcDNA3.1/S1P2组内皮细胞的趋化能力；（2）沉默S1P2受体的表达并检测体外衰老脐静脉内皮细胞的功能改变。将培养的衰老脐静脉内皮细胞分为3组：空白对照组细胞、干扰组细胞（转染shRNA-S1P2腺病毒载体）和干扰对照组细胞（转染对照荧光素酶基因shRNA-Luc腺病毒载体）。采用RT-PCR和Western blot检测空白对照组、干扰组和干扰对照组细胞S1P2受体的表达；应用Matrigel胶种植法评价空白对照组、干扰组和干扰对照组内皮细胞体外管状样结构形成能力；运用细胞划痕实验检测空白对照组、干扰组和干扰对照组内皮细胞的损伤修复能力；使用细胞跨膜迁移实验分析空白对照组、干扰组和干扰对照组内皮细胞的趋化能力。4.分析老年大鼠的肺微血管内皮细胞S1P受体的表达和内皮细胞功能的变化：（1）分离年轻和老年大鼠的肺微血管内皮细胞,运用RT-PCR和Western blot检测年轻和老年大鼠肺微血管内皮细胞的S1P受体表达；应用Matrigel胶种植法评价年轻和老年大鼠的肺微血管内皮细胞管状样结构的形成能力；采用细胞划痕实验检测年轻和老年大鼠肺微血管内皮细胞的损伤修复能力；使用细胞跨膜迁移实验分析年轻和老年大鼠肺微血管内皮细胞的趋化能力；（2）沉默S1P2受体的表达,检测老年大鼠的肺微血管内皮细胞的功能改变：将分离的老年大鼠的肺微血管内皮细胞分为3组处理,即空白对照组细胞,干扰组细胞（转染shRNA-S1P2腺病毒载体）,干扰对照组细胞（转染对照shRNA-Luc腺病毒载体）；采用RT-PCR和Western blot检测空白对照组、干扰组和干扰对照组细胞S1P2受体的表达；应用Matrigel胶种植法评价空白对照组、干扰组和干扰对照组内皮细胞管状样结构的形成能力；运用细胞划痕实验检测空白对照组、干扰组和干扰对照组内皮细胞的损伤修复能力；使用细胞跨膜迁移实验分析空白对照组、干扰组和干扰对照组内皮细胞的趋化能力。结果1.在体外培养的衰老脐静脉内皮细胞,S1P2受体的表达明显上调,而血管形态发生能力、损伤修复能力及迁移能力均显着下降。2.在体外培养的年轻脐静脉内皮细胞,上调S1P2受体的表达可明显降低内皮细胞的血管形态发生能力、损伤修复能力及迁移能力。3.在体外培养的衰老脐静脉内皮细胞,下调S1P2受体的表达可显着增强内皮细胞的血管形态发生能力、损伤修复能力及迁移能力。4.在老年大鼠的肺微血管内皮细胞,S1P2受体的表达明显上调,且管状结构的形成能力、损伤修复能力及迁移能力均显着下降；下调S1P2受体的表达,可显着恢复内皮细胞的血管形态发生能力、损伤修复能力及迁移能力。结论1.在体外培养的脐静脉内皮细胞的衰老过程中,S1P2受体的表达上调与内皮细胞的血管形态发生、损伤修复及迁移能力下降相关联；S1P2受体介导体外衰老的脐静脉内皮细胞的功能变化；2.体内进一步验证了S1P2受体介导老年大鼠肺微血管内皮细胞的血管形态发生、损伤修复及迁移等功能受损；3.为临床预防和干预血管的衰老提供了新的思路。
二、重组β-半乳糖苷酶腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组β-半乳糖苷酶腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达（论文提纲范文）
（1）Krüppel样因子4通过促进血管平滑肌细胞自噬缓解主动脉衰老的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 KLF-4 抵抗ANGⅡ诱导的VSMCS的衰老 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 KLF-4 通过促进细胞自噬抵抗ANGⅡ诱导的VSMCS衰老 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 KLF-4 通过促进细胞自噬抵抗ANGⅡ诱导VSMCS衰老的分子机制 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 自噬在血管衰老中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（2）Apelin通过AMPK/Autophagy通路调控间充质干细胞衰老的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 材料与仪器 |
| 2 方法 |
| 3 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 AMSCs的增殖能力降低 |
| 2 AMSCs出现细胞衰老状态 |
| 3 AMSCs中 Apelin低表达且自噬功能受损 |
| 4 Apelin通过Autophagy调控MSCs衰老 |
| 5 AMSCs中过表达Apelin,自噬功能恢复,细胞年轻化 |
| 6 Apelin通过激活AMPK信号通路提高Autophagy |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 A 主要英文缩略词表 |
| 附录 B 常用试剂配制方法 |
| 附录 C 个人简历 |
| 附录 D 综述 间充质干细胞衰老现状 |
| 参考文献 |
（3）rDNA转录障碍诱发血管平滑肌细胞衰老及动脉瘤样退行性病变的发生（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 腹主动脉瘤 |
| rDNA转录与核仁应激反应 |
| DNA损伤反应与细胞衰老 |
| 平滑肌细胞衰老与心血管疾病 |
| 第一章 动脉瘤组织中PolⅠ转录复合体关键组分的表达变化及干扰rDNA转录对血管壁动脉瘤样退行性病变发生发展的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 干扰rDNA转录对血管平滑肌细胞衰老的影响及其与动脉瘤病变的关系 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间主要科研成果及获得奖励 |
| 英文论文 |
| Western blot原始结果 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 综述一 AMPK/mTOR通路在糖尿病血管病变中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 益气活血药人参三七川芎对血管保护作用的药理研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一部分 益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症的体内实验研究 |
| 实验一 益气活血药延缓糖尿病小鼠颈总动脉和胸主动脉血管衰老的机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠心脏老化的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 基于AMPK-mTOR通路探讨益气活血药对糖尿病小鼠脑老化的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 益气活血药延缓高糖诱导血管平滑肌细胞衰老的体外实验研究 |
| 实验一 建立高糖诱导的HASMC衰老模型 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 基于AMPK/mTOR通路探讨益气活血药对高糖诱导HASMC衰老的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）SIRT1对大鼠血管平滑肌细胞衰老的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和主要试剂 |
| 1.2 血管平滑肌细胞的分离培养[7] |
| 1.3 细胞分组与转染 |
| 1.4 qRT-PCR检测SIRT1 mRNA表达水平 |
| 1.5 Western blot法检测SIRT1蛋白表达水平 |
| 1.6 β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老 |
| 1.7 Western blot法检测细胞中P21、P53蛋白的表达 |
| 1.8 PI单染法检测细胞周期 |
| 1.9 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组血管平滑肌细胞中SIRT1表达的比较 |
| 2.2 各组血管平滑肌细胞中β-半乳糖苷酶阳性率和P21、P53蛋白表达水平比较 |
| 2.3 各组血管平滑肌细胞周期分布比较 |
| 3 讨论 |
（6）FoxO3在小鼠心脏氧化损伤及衰老过程中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词注释表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 心血管疾病研究现状 |
| 1.2 氧化应激(Oxidative stress)与百草枯(PQ) |
| 1.3 转录因子FoxO3 研究进展 |
| 1.4 衰老研究进展 |
| 1.5 本研究目的和意义 |
| 第二章 FoxO3 保护H9c2 细胞氧化应激 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 FoxO3 调控心脏氧化应激的机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 FoxO3 保护心肌细胞衰老 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 FoxO3 保护心脏衰老机制 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 第七章 创新与不足 |
| 参考文献 |
| 特别鸣谢 |
| 科研成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）DKK3抑制动脉粥样硬化病变和心肌纤维化的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 论文1 DKK3诱导血管祖细胞和胚胎成纤维细胞向平滑肌细胞分化抑制动脉粥样硬化斑块病变的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献1 |
| 论文2 DKK3调节GSK-3β/β-catenin通路和ADAM17/ACE2抑制心肌肥厚和纤维化的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语说明 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 附图 |
| 参考文献2 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 英文论文1 |
| 英文论文2 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）Foxp1在骨髓间充质干细胞命运决定和衰老过程中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 间充质干细胞 |
| 1.1.1 间充质干细胞的定义 |
| 1.1.2 间充质干细胞的鉴定原则和方法 |
| 1.1.2.1 克隆形成实验（CFU-F assay） |
| 1.1.2.2 分化能力检测 |
| 1.1.2.3 自我更新能力检测 |
| 1.1.3 间充质干细胞的标志物（marker） |
| 1.1.3.1 CD105 |
| 1.1.3.2 PαS |
| 1.1.3.3 Nestin |
| 1.1.3.4 Mx1-Cre |
| 1.1.3.5 Prx1-Cre |
| 1.1.3.6 Leptin Receptor |
| 1.1.3.7 Sox1 |
| 1.2 MSC成骨和成脂肪分化的信号通路和转录调控 |
| 1.2.1 信号通路 |
| 1.2.1.1 Wnt信号通路 |
| 1.2.1.2 Notch信号通路 |
| 1.2.1.3 BMP信号通路 |
| 1.2.2 转录因子 |
| 1.2.2.1 PPARγ |
| 1.2.2.2 C/EBP家族 |
| 1.2.2.3 RUNX2 |
| 1.2.2.4 MSX2 |
| 1.2.2.5 OSTERIX |
| 1.2.2.6 ATF4 |
| 1.2.2.7 TAZ |
| 1.2.2.8 Rb |
| 1.2.2.9 Maf |
| 1.3 间充质干细胞衰老 |
| 1.3.1 衰老的定义 |
| 1.3.2 MSC的衰老表型 |
| 1.3.3 衰老相关的分子机制与信号通路 |
| 1.3.3.1 p16和p53 |
| 1.3.3.2 表观遗传 |
| 1.3.3.3 ROS |
| 1.4 FOXP1的特性、表达谱与功能 |
| 1.4.1 FOX基因家族 |
| 1.4.2 FOXP基因亚家族 |
| 1.4.2.1 FOXP亚家族发现历史 |
| 1.4.2.2 FOXP亚家族的蛋白结构 |
| 1.4.2.3 FOXP家族的DNA结合位点 |
| 1.4.2.4 FOXP1的几种选择性剪接形式 |
| 1.4.3 Foxp1的表达谱与功能 |
| 1.4.3.1 Foxp1在胚胎干细胞中的表达和功能 |
| 1.4.3.2 Foxp1在心脏中的表达和功能 |
| 1.4.3.3 Foxp1在肺和呼吸道中的表达和功能 |
| 1.4.3.4 Foxp1在食管发育过程中的表达和功能 |
| 1.4.3.5 Foxp1在B细胞发育过程中的表达和功能 |
| 1.4.3.6 Foxp1在T细胞发育过程中的表达和功能 |
| 1.4.3.7 Foxp1在单核细胞发育过程中的表达和功能 |
| 1.4.3.8 Foxp1在毛囊干细胞和毛发发育过程中的表达和功能 |
| 1.4.3.9 Foxp1在神经系统中的表达和功能 |
| 1.4.3.10 Foxp1在胰岛细胞中的表达和功能 |
| 1.4.3.11 Foxp1在肝脏中的表达和功能 |
| 1.4.4 FOXP1与癌症的关系 |
| 1.4.4.1 FOXP1与弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL） |
| 1.4.4.2 FOXP1与黏膜相关淋巴组织（MALT）淋巴瘤 |
| 1.4.4.3 FOXP1与乳腺癌 |
| 1.4.4.4 FOXP1与子宫内膜癌 |
| 1.4.4.5 FOXP1与前列腺癌 |
| 1.4.4.6 FOXP1与肺癌 |
| 1.4.4.7 小结 |
| 1.5 本课题的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键科学问题 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.1.1 获得Foxp1基因敲除小鼠 |
| 1.5.1.2 分析Foxp1条件敲除小鼠的表型 |
| 1.5.1.3 运用细胞和分子生物学手段研究Foxp1的调控机制 |
| 1.5.2 研究目标 |
| 1.5.3 拟解决的关键科学问题 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 无机试剂 |
| 2.1.2 有机试剂 |
| 2.1.3 细胞培养用试剂和试剂盒 |
| 2.1.4 酶 |
| 2.1.5 蛋白实验相关试剂 |
| 2.1.6 其他商品化试剂和试剂盒 |
| 2.1.7 重要耗材 |
| 2.1.8 质粒 |
| 2.1.9 引物 |
| 2.1.10 小鼠 |
| 2.1.11 抗体 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DNA相关实验技术 |
| 2.2.2 RNA相关实验技术 |
| 2.2.3 蛋白质相关实验技术 |
| 2.2.4 细胞相关实验技术 |
| 2.2.5 组织学相关实验技术 |
| 2.2.6 流式细胞术 |
| 2.2.7 染色质免疫共沉淀 |
| 2.2.8 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Foxp1在骨髓间充质干细胞中的表达谱系 |
| 3.2 Foxp1调控骨髓间充质干细胞的分化 |
| 3.2.1 Prx1-Cre; Foxp1~(fl/fl)敲除小鼠出现骨质疏松、骨髓脂肪化表型 |
| 3.2.2 Prx1-Cre; Foxp1~(fl/fl)小鼠骨髓间充质干细胞成脂肪能力增强、成骨能力减弱 |
| 3.2.3 Nestin-Cre; Foxp1~(fl/fl)小鼠成骨不全、骨髓脂肪细胞增多 |
| 3.2.4 Nestin-Cre; Foxp1~(fl/fl)小鼠骨髓间充质干细胞成脂能力增强、成骨能力减弱 |
| 3.2.5 在软骨细胞和成骨细胞中敲除Foxp1并未影响小鼠出生后骨质重塑 |
| 3.2.6 Foxp1缺失不影响骨髓间充质干细胞成软骨分化 |
| 3.2.7 过表达Foxp1抑制C3H10T1/2 细胞和原代骨髓间充质干细胞成脂肪分化、促进成骨分化 |
| 3.2.8 Foxp1调控MSC成脂分化和成骨分化的分子机制 |
| 3.2.8.1 Foxp1抑制MSC成脂肪分化的分子机制 |
| 3.2.8.2 Foxp1促进MSC成骨分化的分子机制 |
| 3.3 Foxp1调控MSC的衰老 |
| 3.3.1 敲除Foxp1后MSC呈现出早衰表型 |
| 3.3.2 Foxp1可能通过抑制p16~(Ink4a)的转录从而调控衰老 |
| 3.3.3 过表达Foxp1可以延缓人类骨髓间充质干细胞的衰老 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Foxp1随着骨髓间充质干细胞衰老表达量降低 |
| 4.2 Foxp1通过抑制PPARγ 转录抑制成脂 |
| 4.3 Foxp1通过抑制Notch信号通路活性促进成骨 |
| 4.4 Foxp1通过调控p16~(Ink4a)调控MSC衰老 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）GALC基因慢病毒构建高表达β-半乳糖苷酶成纤维细胞衰老模型与结肠癌细胞相互作用的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 晚期大肠癌的新辅助化疗后的间质衰老及相关病理指标的分析 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3. 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 生存随访 |
| 2.2. 病理相关指标 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 GALC 基因慢病毒构建以及过氧化氢诱导的高表达β-半乳糖苷酶 HFL1 细胞衰老模型的建立 |
| 引言 |
| 1. Galc（galactosylceramidase）双标记慢病毒载体构建 |
| 1.1 实验材料及方法 |
| 1.2. 方法（实验流程） |
| 1.3 测序结果 |
| 2. 病毒包装及滴度测定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2. 结果 |
| 3. 高表达 GALC 的 HFL1 细胞系构建 |
| 3.1. 材料与方法 |
| 3.2. 结果 |
| 4. 过氧化氢诱导的 HFL1 细胞衰老模型的建立 |
| 4.1. 实验材料和方法 |
| 4.2. 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 高表达 GALC 基因（半乳糖苷酶基因）HFL1 细胞相关衰老指标验证 |
| 引言 |
| 1. 高表达 GALC 基因（半乳糖苷酶基因）HFL1 细胞β-半乳糖苷酶染色实验 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 2.细胞周期的检测 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 3 Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 检测 HFL1-GALC 衰老指标 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 4. Western-blot 法检测 HFL1-GALC 细胞的衰老指标 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 Transwel 小室共培养条件下高表达β-半乳糖苷酶 HFL1 细胞对结肠癌细胞的影响 |
| 引言 |
| 1. 支原体的检测 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 2. 共培养条件下细胞活力、细胞周期、细胞迁移 |
| 2.1 相关实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文结论 |
| 附录 |
| 英文缩略语表 |
| 1. 实验所需一般试剂 |
| 2. 实验所需仪器 |
| 3. 器皿及耗材 |
| 4. 所需试剂 |
| 发表文章 |
| 致谢 |
（10）S1P2受体介导内皮细胞衰老的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 技术路线 |
| 缩略词简表 |
| 前言 |
| 第一章 脐静脉内皮细胞衰老过程中S1P受体表达和细胞功能改变的相关性 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 光镜形态学观察和细胞免疫荧光鉴定原代分离和培养的脐静脉内皮细胞 |
| 1.2.2 体外培养的衰老脐静脉内皮细胞的β-半乳糖苷酶染色 |
| 1.2.3 RT-PCR检测年轻、中年和衰老脐静脉内皮细胞的S1P受体的mRNA表达 |
| 1.2.4 Western blot检测年轻、中年和衰老脐静脉内皮细胞的S1P受体的蛋白表达 |
| 1.2.5 细胞跨膜迁移实验分析年轻、中年和衰老脐静脉内皮细胞的趋化性 |
| 1.2.6 S1P处理和对照的3组脐静脉内皮细胞的体外管状样结构形成 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 结论 |
| 第二章 S1P2受体的shRNA腺病毒载体的构建及筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA重组质粒的酶切和PCR鉴定结果 |
| 2.2.2 转染pRNAT-H1.1/Shuttle-shRNA质粒到人肺动脉内皮细胞后,RT-PCR筛选最佳沉默效果的重组质粒 |
| 2.2.3 重组腺病毒的鉴定、包装及其滴度测定 |
| 2.2.4 采用Western blot技术鉴定重组腺病毒shRNA-S1P2对HPAEC S1P2受体基因沉默的效果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 调控S1P2受体表达后对脐静脉内皮细胞的功能影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 RT-PCR和Western blot检测转染空白质粒和S1P2重组质粒的年轻内皮细胞的S1P2受体的mRNA和蛋白表达 |
| 3.2.2 过表达S1P2受体对年轻脐静脉内皮细胞的体外管状样结构形成、损伤修复和迁移能力的影响 |
| 3.2.3 沉默S1P2受体后,采用RT-PCR和Western blot检测衰老脐静脉内皮细胞的S1P2受体的mRNA和蛋白表达 |
| 3.2.4 沉默S1P2受体对衰老脐静脉内皮细胞的体外管状样结构形成、损伤修复和趋化反应的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 S1P2受体对老年大鼠的肺微血管内皮细胞的作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 采用光镜观察形态学和细胞免疫荧光技术鉴定原代分离的大鼠PMECs |
| 4.2.2 采用RT-PCR和Western blot检测年轻和老年大鼠PMECs的S1P受体的mRNA和蛋白表达 |
| 4.2.3 来自老年大鼠的PMECs对S1P诱导的内皮形态发生、损伤修复和趋化反应 |
| 4.2.4 沉默S1P2基因后,衰老PMECs空白对照组、干扰组和干扰对照组的S1P #2受体的mRNA和蛋白表达 |
| 4.2.5 沉默S1P2受体对衰老PMECs的形态发生、损伤修复和趋化反应的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 综述1 |
| 参考文献 |
| 综述2 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
四、重组β-半乳糖苷酶腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达（论文参考文献）
- [1]Krüppel样因子4通过促进血管平滑肌细胞自噬缓解主动脉衰老的机制研究[D]. 徐泓杰. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(09)
- [2]Apelin通过AMPK/Autophagy通路调控间充质干细胞衰老的机制研究[D]. 张浩. 蚌埠医学院, 2021(01)
- [3]rDNA转录障碍诱发血管平滑肌细胞衰老及动脉瘤样退行性病变的发生[D]. 张文静. 山东大学, 2020(04)
- [4]益气活血药延缓糖尿病血管衰老及其并发症心脑老化的机制研究[D]. 胡艳红. 中国中医科学院, 2020(01)
- [5]SIRT1对大鼠血管平滑肌细胞衰老的影响[J]. 李书国,童格,叶明,邓娟娟,邵文. 郑州大学学报(医学版), 2020(01)
- [6]FoxO3在小鼠心脏氧化损伤及衰老过程中的作用机制研究[D]. 常早上. 暨南大学, 2019
- [7]DKK3抑制动脉粥样硬化病变和心肌纤维化的作用及其机制研究[D]. 翟纯刚. 山东大学, 2018(12)
- [8]Foxp1在骨髓间充质干细胞命运决定和衰老过程中的作用研究[D]. 李汉骏. 上海交通大学, 2017(06)
- [9]GALC基因慢病毒构建高表达β-半乳糖苷酶成纤维细胞衰老模型与结肠癌细胞相互作用的初步研究[D]. 赵晖. 上海交通大学, 2014(07)
- [10]S1P2受体介导内皮细胞衰老的作用研究[D]. 闾宏伟. 中南大学, 2012(12)