一、基底膜侵袭实验技术对人肺腺癌细胞侵袭能力的研究（论文文献综述）
黄益龙[1]（2021）在《恶性胸膜间皮瘤间皮素表达及磁共振功能和分子靶向成像研究》文中研究表明[目 的]1.明确恶性胸膜间皮瘤（MPM）细胞系和动物异种移植模型的间皮素（MSLN）表达水平,探究MSLN对MPM迁移和侵袭能力的潜在调控机制。2.构建MSLN抗体与Fe3O4@SiO2偶联的纳米探针,并评价和分析其MRI体内外分子成像的可行性3.探讨多模态功能MRI和MSLN靶向MRI纳米探针体内外分子靶向成像检测MPM的潜在应用价值。[方法]1.Western Blotting检测MeT-5A（正常永生化间皮细胞,正常对照组）、A549（人肺腺癌,阴性对照组）、H2452（上皮型MPM）、H226（上皮型MPM）和MSTO-211H（双相型MPM）细胞株和肿瘤组织的MSLN的蛋白表达水平,RT-PCR检测细胞的mRNA表达水平。划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力;肿瘤组织Western Blotting、MSLN免疫组化和血清SMRP检测验证体内组织水平MSLN表达情况。采用慢病毒介导H226（上皮型MPM）过表达MSLN后,Western Blotting和RT-PCR验证细胞MSLN表达改变,比较野生型H226（阴性对照组）、NC（转入空载体,空白对照组）和MSLN过表达组（实验组）的N-Cadherin、MMP7和MMP9的蛋白表达、细胞迁移和侵袭能力。观察并比较不同荷瘤鼠的肿瘤生长曲线和生存期。2.采用化学偶联法将抗MSLN抗体和Fe3O4@SiO2-NH2材料连接,合成MSLN靶向MRI纳米探针。采用透射电子显微镜（TEM）观察纳米探针的形态大小;MRI分析仪检测纳米探针横向和纵向弛豫时间;血清和生理盐水分别稀释纳米探针,评价其稳定性;X射线光电子能谱（XPS）确定元素标定;ICP检测确定纳米探针铁离子浓度。细胞普鲁士蓝染色观察肿瘤细胞和探针体外结合情况;CCK8检测纳米探针对细胞毒性作用;HE染色观察注射探针后裸鼠主要器官病理改变。探针体外结合细胞后进行T2WI和T2mapping成像,且对注射探针后裸鼠的主要器官采用ICP进行铁离子浓度分析,分析探针和肿瘤细胞体内外结合能力。3.建立上皮型MPM H226（实验组）、双相型MPM MSTO-211H（实验组）和人肺腺癌细胞A549（阴性对照组）裸鼠肿瘤异种移植模型,共81只,每组27只。在肿瘤接种后第14 d、28 d和42 d,采用3.0 T MRI扫描仪进行解剖和功能成像 T1WI、T2WI、T1 mapping、T2 mapping、BOLD 和 IVIM-DWI。测量并比较H226组和MSTO-211H组间3个时间点（9只/时间点）的T1值、T2值、R2、T2*、表观弥散系数（ADC）、真实弥散系数（D）,伪弥散系数（D*）和灌注分数（f）。评估不同时间点之间的参数的差异,分析MRI多参数与预后相关的组织学特征（包括坏死分数,NF;微血管密度,MVD）之间的相关性。体外MRI成像检测不同铁离子浓度梯度的纳米探针与细胞结合后,T2信号强度和T2值变化趋势。并在A549、MSTO-211H和H226荷瘤鼠分别鼠尾静脉注射生理盐水、非靶向纳米探针和MSLN靶向纳米探针后,进行体内肿瘤组织的T2WI和T2 mapping成像,分析不同时期、不同肿瘤类型和不同纳米探针的相对T2信号强度和T2值的改变。[结果]1.H226组细胞的MSLN蛋白及mRNA表达水平高于其他肿瘤细胞（p<0.05）;而MSTO-211H迁移和侵袭能力（迁移率、迁移细胞数、迁移细胞OD值、侵袭细胞数、侵袭细胞OD值）强于其他肿瘤细胞（p<0.05）;Western Blotting、免疫组化及Elisa实验检测肿瘤组织和血清MSLN表达水平,随肿瘤生长,MPM肿瘤表达MSLN不断增加,且H226组高于MSTO-211H组（all p<0.05）,且MSTO-211H组肿瘤生长速度快于H226组,MSTO-211H组荷瘤鼠生存期短于H226组（all p<0.05）。慢病毒转染H226后,H226 MSLN过表达细胞MSLN蛋白和mRNA高于野生型和NC组（all p<0.05）,且MSLN过表达细胞的N-Cadherin、MMP7和MMP9的蛋白表达增高、迁移率、迁移细胞数、侵袭细胞数及结晶紫染色OD值增加,生存期缩短（allp<0.05）。2.成功合成MSLN靶向MRI纳米探针。横向弛豫率/纵向弛豫率比值大,表示该探针是良好的MRI阴性对比剂;XPS检测显示抗MSLN抗体偶联Fe3O4SiO2纳米探针后,C-O键显着减少,C=O键增多,表明抗体偶联成功。且纳米探针分散性良好,性状稳定。普鲁士蓝染色显示MSLN纳米探针可标记H226细胞。CCK8检测显示纳米探针对A549细胞和H226细胞活力无明显降低,对细胞不具有明显的毒性作用。注射纳米探针后,裸鼠脑、肝脏、肺、脾脏、心脏及肾脏HE染色表现与生理盐水组无差异,表明纳米探针对组织无明显毒副作用。纳米探针体外细胞结合后MRI成像显示,H226组T2信号和T2值低于A549组,且差异有统计学意义（p<0.05）。ICP检测铁离子在器官内的分布水平,H226组肿瘤组织铁离子浓度高于A549组,且差异有统计学意义（p<0.05）。3.在MPM功能MRI中,与H226相比,MSTO-211H的T2和T2*升高,而ADC、D、D*和f降低（p<0.05）。H226组的动态连续测量显示,与14d相比,ADC和D在28 d和42 d显着下降（p<0.05）,而f在28 d和42 d显着增加（p<0.05）,D*在第28 d和第42 d显着增加,而两组中的D*均显着增加。ADC与肿瘤体积和 NF 之间存在中等相关性（r=-0.53,p=0.000,r=-0.508,p=0.000）。在H226组中,f与肿瘤体积、NF和MVD呈正相关。在MSTO-211H组中,只有f与肿瘤体积、NF和MVD呈负相关,且具有中等相关性（r=-0.560,p=0.009;r=-507,p=0.001;r=-0.554,p=0.000）。在 MPM 的 MSLN 分子靶向 MRI 中,H226组细胞结合不同铁离子浓度梯度的MSLN靶向纳米探针后,呈T2信号和T2值不断下降趋势,且在铁离子浓度60μg/ml时,H226组T2信号和T2值低于 MSTO-211H 组、H2452、MeT-5A 及 A549 组（all p<0.05）。在 3 个不同的肿瘤生长时期,H226组注射非靶向和MSLN靶向纳米探针后1.5 h-3.5 h,肿瘤相对T2信号强度和T2值降低,且降低程度大于MSTO-211H组（allp<0.05）。[结论]1.MPM肿瘤细胞表达MSLN,在不同肿瘤组织学亚型和生长时期存在表达差异;且MSLN通过调控N-Cadherin、MMP7和MMP9促进肿瘤迁移侵袭能力,缩短生存期。2.所合成的MSLN靶向纳米探针毒性作用小,稳定性良好,能够特异性结合MPM细胞,特异性降低T2信号强度和T2值的效果良好。3.功能MRI参数和MSLN靶向纳米探针有助于MPM的诊断及组织学亚型鉴别,提示MPM进展,可间接评价MPM迁移侵袭能力及生存期。
张冬[2]（2020）在《IFITM3在肺腺癌中的表达及其对肺腺癌细胞生长和侵袭的调节作用》文中认为研究背景癌症是世界上最常见的死亡原因,在所有癌症中肺癌是病死率最高的,肺癌的病死率高是由于肺组织中癌细胞的增殖失控和早期转移。目前认为,长期暴露于烟草烟雾、遗传因素、空气污染是肺癌发生的主要原因。众多研究表明,肺癌通过不同遗传途径、分子表达谱及治疗反应性呈现出明显的多态性和遗传异质性,现已确定许多基因和蛋白质在癌症发生的复杂信号通路中发挥至关重要的作用。然而,目前有关肺癌发生的确切机制仍知之甚少。干扰素诱导跨膜蛋白（interferon induced transmembrane protein,IFITM）基因家族是1984年首次在IFN诱导的神经母细胞瘤的cDNA中被发现,到目前为止,人类已发现五个 IFITMs（IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5 及 IFITM10）亚基因。IFITM蛋白家族的成员均由大约130个氨基酸构成,有两个跨膜蛋白区域穿插在一个保守的细胞质区。以往的研究表明,他们属于一个小鼠基因的家族成员,由2个短的具有高度相似性但由不同N末端和C端的核心序列的跨膜结构域蛋白组成。人类的同源基因（IFITM1,IFITM2,IFITM3）都聚集在11号染色体上,IFITM家族的主要功能是调节免疫功能,抑制病毒合成或复制,调节成骨细胞骨矿化,IFITM蛋白还被认为在细胞周期控制和细胞凋亡中起作用。其中,IFITM3又称1-8U,首先在结肠肿瘤及溃疡性结肠炎患者的结肠粘膜中分离,研究证实其可作为溃疡性结肠炎相关性结肠癌的首选标记物,并且IFITM3的表达与大肠癌的转移和预后呈正相关;IFITM3的表达水平也被证实在星形胶质细胞瘤细胞中的水平显着高于正常小鼠的星形胶质细胞水平,IFITM3上调可影响神经胶质瘤细胞的增殖浸润,已被认为是脑胶质瘤发生和侵袭的关键因素;其它研究显示IFITM3在头颈部鳞状细胞癌、食管鳞癌、胃癌、肝癌组织中过度表达,预示患者预后不良,在上述癌组织中IFITM3的高水平表达促进癌细胞的增殖,并与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及远处转移等密切相关,而基因敲除技术能显着下调IFITM3的mRNA及其蛋白水平,显着抑制肿瘤细胞增殖,并诱导细胞周期停滞、促进细胞衰老和凋亡;IFITM3蛋白在浸润性乳腺癌中高表达,并且与雌激素受体和孕激素受体水平显着相关。因此,IFITM3被认为是癌症发生发展的重要参与者,可能通过直接或间接途径抑制癌细胞的凋亡,促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。目前关于IFITM3在癌症发病机制中所发挥的具体功能和潜在机制仍不清楚,而对于IFITM3在肺癌中的研究目前更是鲜为人知。在人们日益追求高质量生活的今天,癌症的早发现、早治疗显得尤为重要,进一步研究IFITM3在癌症进展中的作用机制具有重要意义。本课题以IFITM3基因为切入点,通过检测IFITM3蛋白在肺腺癌组织中表达水平,分析肺腺癌组织中IFITM3表达与肺腺癌患者临床病理特征的关系,并以此为基础,通过慢病毒介导的基因沉默及过表达技术,沉默及过表达肺腺癌细胞IFITM3基因,观察其对肺腺癌细胞株生长、迁移及侵袭的调节作用,以及上皮间质转化（EMT）是否也发生于肺腺癌的进展过程中,基质金属蛋白酶（MMP-2,MMP-9）在其中的具体作用如何,p38-MAPK信号通路是否在肺腺癌进展中发挥了积极作用,p38-MAPK信号通路特异性激动剂TNF-α和抑制剂SB203580是否可改变这一进程,同时通过裸鼠成瘤能力进一步验证IFITM3基因的促细胞增殖作用。研究目的明确IFITM3在肺腺癌发生中的作用,通过分析IFITM3蛋白在肺腺癌组织的表达,观察沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞生长、迁移、侵袭、细胞凋亡和细胞周期分布的影响,探讨IFITM3在肺腺癌进展中的作用机制,并为寻找新的生物学标志物及新的治疗方法奠定基础。研究方法1.肺腺癌癌组织中IFITM3蛋白的表达:收集50例肺腺癌组织,采用免疫组织化学染色方法检测肺腺癌组织中IFITM3的表达,分析肺腺癌中IFITM3表达及其临床意义。2.采用实时定量 PCR 检测 16HBE、H1299、H1395、H1437、H1975 及 A549细胞中IFITM3的mRNA及蛋白表达水平,选择高表达的的细胞株,通过慢病毒介导的基因沉默技术,构建IFITM3特异性沉默表达载体,转染至高表达IFITM3的肺腺癌细胞株;选择低表达的的细胞株,通过慢病毒介导的基因过表达技术,构建IFITM3特异性过表达载体,转染至低表达IFITM3的肺腺癌细胞株,通过实时定量PCR及Western blot检测IFITM3基因沉默及过表达的效率。3.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞增殖的影响:通过软琼脂培养克隆形成实验检测沉默及过表达IFITM3基因对肺癌细胞克隆形成能力的影响。4.通过流式细胞仪检测沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞周期分布的影响;流式细胞仪分析沉默及过表达IFITM3基因后肺癌细胞周期分布。Western Bolt检测沉默及过表达IFITM3基因对肺癌细胞周期蛋白的影响;流式细胞仪分析沉默及过表达IFITM3基因后肺癌细胞早期凋亡。5.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞侵袭及迁移的影响:通过Transwell侵袭实验及Transwell迁移实验检测沉默及过表达IFITM3基因对肺癌细胞侵袭及迁移能力的影响;6.沉默及过表达IFITM3基因对裸鼠成瘤能力的影响:将沉默IFITM3基因的H1299细胞及过表达IFITM3基因的A549细胞和对照组H1299细胞,分别接种于裸鼠左侧腋下接种观察出瘤,接种后第30天处死,测量瘤重量及瘤体体积。7.通过Western Bolt检测沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞基质金属蛋白酶蛋白表达及对上皮细胞间质转化标志物表达的影响:Western blot检测沉默及过表达IFITM3基因后MMP-2及MMP-9的表达情况;Western blot检测沉默及过表达IFITM3基因对EMT标记物Vimentin、Snail及E-cadherin表达的影响。8.Western blot检测p38-MAPK信号通路在IFITM3诱导EMT中的作用:Western blot检测沉默IFITM3基因组加入p38-MAPK通路激活剂TNF-α后磷酸化p38、Vimentin、Snail及E-cadherin的表达情况;过表达IFITM3基因组加入p38-MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580后磷酸化p38、Vimentin、Snail及E-cadherin的表达情况。研究结果:1.IFITM3蛋白在人肺腺癌中的表达及临床意义结果表明,50例肺腺癌组织中的IFITM3蛋白表达呈阳性的有41例（82.00%）。TNM分期（Ⅲ+Ⅳ期）患者肺癌组织内IFITM3的表达高于TNM分期（Ⅰ+Ⅱ期）患者;在有淋巴结转移患者肺癌组织内IFITM3表达高于无淋巴结转移病例,提示IFITM3蛋白在肺癌组织内的表达与淋巴结转移和TNM分期有关。2.肺腺癌细胞IFITM3的表达及转染效率。采用了实时定量 PCR 检测 16HBE、H1299、H1395、H1437、H1975 及 A549细胞中IFITM3的mRNA表达水平,Western blot检测各细胞株IFITM3的蛋白表达水平。结果显示,IFITM3在人支气管上皮样细胞16HBE仅有少量表达,在H1299和H1975细胞表达较高,在H1395和A549细胞表达较低,因此,选择H1299和H1975细胞行基因沉默,选择H1395和A549细胞行基因过表达进行下一步研究。并通过实时定量PCR及Western blot检测转染效率,1v-shIFITM3转染H1299和H1975细胞后IFITM3 mRNA及蛋白的表达被明显的抑制;过表达质粒转染H1395和A549细胞后IFITM3 mRNA及蛋白的表达则明显增加。3.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞增殖的影响:采用软琼脂培养克隆形成实验显示沉默IFITM3基因后H1299和H1975细胞克隆形成能力明显下降,提示沉默IFITM3能够抑制肿瘤细胞生长;过表达IFITM3基因后H1395和A549细胞克隆形成能力明显增强,提示过表达IFITM3能够促进肿瘤细胞生长。4.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞周期分布、细胞周期蛋白及肺癌细胞早期凋亡的影响流式细胞仪检测细胞周期分布结果显示随着IFITM3的下调,处在G0/G1期的细胞数量显着增加,而在G2/M期及S期的细胞减少,这些结果表明,沉默IFITM3表达,可将H1299和H1975细胞阻滞于G0/G1期,从而抑制肿瘤细胞的增殖;随着IFITM3的过表达,处在G0/G1期的细胞数量显着减少,而在G2/M期及S期的细胞增加,过表达IFITM3促进H1395和A549细胞的增殖。Western blot检测细胞周期蛋白结果显示沉默IFITM3表达,可降低H1299和H1975细胞CDK4及cyclin D1的表达,而P21的表达升高;过表达IFITM3,可升高H1395和A549细胞CDK4及cyclin D1的表达,P21则表达降低。Annexin V-FITC及PI复染法流式细胞仪检测肺癌细胞早期凋亡结果显示沉默IFITM3促进H1299和H1975细胞早期凋亡,过表达IFITM3抑制H1395和A549细胞早期凋亡。5.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞侵袭及迁移能力的影响Transwell侵袭实验结果显示沉默IFITM3基因后H1299和H1975细胞侵袭能力明显降低,过表达IFITM3基因后H1395和A549细胞侵袭能力明显增强。Transwell迁移实验结果显示沉默IFITM3基因后H1299和H1975细胞迁移能力明显降低。过表达IFITM3基因后H1395和A549细胞迁移能力明显增强。6.沉默及过表达IFITM3基因对裸鼠成瘤能力的的作用沉默IFITM3基因可抑制H1299细胞裸鼠成瘤能力,过表达IFITM3基因可增强A549细胞裸鼠成瘤能力。7.沉默及过表达IFITM3基因对肺腺癌细胞基质金属蛋白酶蛋白表达及对上皮细胞间质转化标志物表达的影响:Western blot检测IFITM3基因对MMP-2及MMP-9的表达结果显示,沉默IFITM3表达可降低H1299和H1975细胞MMP-2及MMP-9的表达,过表达IFITM3可升高H1395和A549细胞MMP-2及MMP-9的表达。Western blot检测IFITM3基因对EMT标记物的表达结果显示,沉默IFITM3可降低H1395和H1975细胞Vimentin及Snail的表达,E-cadherin的表达升高;过表达IFITM3可升高H1395和A549细胞Vimentin及Snail的表达,E-cadherin的表达降低。8.Western blot检测p38-MAPK信号通路在IFITM3诱导EMT中的作用Western blot实验结果表明沉默IFITM3基因,非磷酸化p3 8表达无明显改变,磷酸化p38的表达显着下降,在沉默IFITM3基因的H1299和H1975细胞中加入TNF-α,p38-MAPK通路激活后E-cadherin的表达降低,磷酸化p38、Vimentin、Snail的表达升高;过表达IFITM3基因,非磷酸化p38表达无明显改变,磷酸化p38的表达显着增加,在过表达IFITM3基因的H1395和A549细胞中加入SB203580特异性抑制p38-MAPK信号通路,E-cadherin的表达升高,磷酸化p38、Vimentin、Snail的表达显着降低,这些结果表明:IFITM3可以通过p38-MAPK信号通路诱导EMT的发生。研究结论1.IFITM3蛋白在肺腺癌组织内呈现高表达,并与淋巴结转移和TNM分期有关。2.沉默IFITM3基因后,肺腺癌细胞的增殖能力下降,并促进其凋亡;过表达IFITM3基因后,肺腺癌细胞的增殖能力上升,并减少其凋亡。3.沉默IFITM3基因导致肺腺癌细胞侵袭和迁移能力明显降低,过表达IFITM3基因导致肺腺癌细胞侵袭和迁移能力明显增强。4.沉默IFITM3基因可抑制肺腺癌细胞裸鼠成瘤能力,过表达IFITM3基因可增强肺腺癌细胞裸鼠成瘤能力。5.沉默IFITM3基因导致MMP-2、MMP-9蛋白的表达降低,过表达IFITM3基因后MMP-2、MMP-9蛋白的表达升高,IFITM3可以通过p38-MAPK信号通路诱导上皮细胞间质转化的发生,从而促进肺癌细胞的侵袭和转移能力。以上结果提示IFITM3在肺腺癌细胞的增殖、侵袭、转移中发挥重要作用,IFITM3表达与肺腺癌的病情发展有关,IFITM3有望成为肺腺癌治疗的新靶点。
王明琦[3]（2020）在《硫化氢调控人肺腺癌细胞增殖、迁移及血管生成机制的研究》文中提出肺癌是一种严重威胁人类生命和健康的恶性肿瘤,其发病率和死亡率在全世界范围内均位列首位。由于肺癌早期临床症状不明显,不易诊断,肺癌患者确诊时往往已至肺癌晚期或发生转移,3年生存率低于20%。目前,外科手术联合放射治疗和化学药物治疗依然是肺癌最有效的治疗手段,但其不良反应和并发症明显。因此,理解肺癌的发生机制,阐明肺癌发生发展的分子机制,寻找新的治疗方法和手段迫在眉睫。一直以来,硫化氢（H2S）被人们看作是有毒气体或空气污染物。直到一氧化氮（NO）作为心血管调节剂的生理功能被发现,H2S作为新型气体信号小分子,其生理作用才逐渐受到人们的关注。研究表明H2S可广泛参与心血管系统、消化系统、神经系统、呼吸系统等的调节过程,且与肿瘤的发生发展密切相关。人体内的H2S主要是由3种内源性硫化氢合成酶:胱硫醚-β-合成酶（CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）和巯基丙酮酸转移酶（MPST）,以L-半胱氨酸为底物催化而来。肺是人体的呼吸器官,H2S作为气体分子,通过鼻腔吸入肺部进入体内,因此二者关系最为紧密。肺腺癌是肺癌的主要种类,而H2S在肺腺癌中作用的相关研究报道较少,作用机制尚不明确。本文主要围绕H2S在肺腺癌中的生物学功能和分子机制进行深入研究和探索。首先,本文检测了人肺腺癌组织和相邻癌旁组织中内源性硫化氢合成酶的表达情况。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和western blot实验结果显示,30对肺腺癌组织临床样本中3种硫化氢合成酶CBS、CSE和MPST的表达量显着高于癌旁组织。其中,CBS和CSE的表达水平与肺腺癌肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移程度有明显相关性,而MPST的表达水平主要与肿瘤大小有关。体外结果同样表明,肺腺癌A549、95D和NCI-H1395细胞中硫化氢合成酶以及H2S含量明显高于正常肺上皮BEAS-2B细胞。本文选择H2S含量最多的A549细胞系进行后续实验。其次,以硫氢化钠（NaHS）作为H2S供体,通过MTT实验检测NaHS对A549细胞的作用。实验结果表明,低浓度的外源NaHS（0-50μM）可促进A549细胞增殖,而2000μM浓度的NaHS则显着促进A549细胞凋亡。选取与H2S在体内含量近似的50μM NaHS作为实验浓度刺激A549细胞24小时。结果显示,该浓度可显着促进A549细胞增殖、迁移和侵袭,加快肿瘤上皮间质转化（EMT）过程。采用化学抑制剂和小干扰RNA（siRNA）基因沉默手段分别对肺腺癌中主要产生H2S的CBS和CSE进行抑制。结果表明,化学抑制剂氨基氧乙酸（AOAA）和DL-炔丙基甘氨酸（PAG）都能显着抑制细胞增殖,并将细胞周期阻滞在G2/M期,促进细胞凋亡;同时抑制细胞划痕愈合、transwell侵袭及EMT过程。上述结果在siRNA基因沉默实验中得到进一步验证。此外,H2S作为无机电子供体可促进A549细胞能量代谢过程,提高线粒体膜电位,加速ATP的产生和糖酵解过程。AOAA和PAG分别抑制CBS和CSE酶活性后,线粒体膜电位下降,进而抑制A549细胞内ATP的生成以及葡萄糖分解和转化过程。再次,western blot实验结果显示,H2S可在肿瘤缺氧微环境中增加缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达量。免疫荧光实验结果表明,H2S可增加HIF-1α积累,促进HIF-1α进入细胞核的过程。进一步采用双荧光素酶报告基因检测H2S对HIF-1α的转录活性的影响。结果显示,在氯化钴（CoCl2）模拟化学缺氧微环境条件下,H2S可提高HIF-1α的转录活性,而AOAA和PAG作用后可明显抑制A549细胞中HIF-1α转录活性。缺氧诱导的HIF-1α表达增加可促进A549细胞中硫化氢合成酶的表达量,进而提高胞内H2S含量。HIF-1α抑制剂2-MeOE2和siRNA基因沉默HIF-1α均能显着抑制缺氧条件下A549细胞中CBS和CSE的表达,进而抑制H2S的产量。因此,H2S和HIF-1α之间存在正反馈调控作用。同时,外源NaHS通过提高内源硫化氢合成酶的表达量进一步提升内源H2S的产量。最后,体外小管生成实验结果表明,H2S可协同HIF-1α通过PI3K/AKT信号通路,上调血管内皮生成因子（VEGF）的表达,促进A549细胞血管生成。AOAA和PAG作用显着减少了VEGF表达,抑制了人脐静脉内皮HUVEC细胞增殖、迁移和小管的形成。裸鼠成瘤实验也显示AOAA和PAG可以抑制移植瘤的生长和血管生成过程。综上所述,H2S可促进A549细胞增殖、迁移以及EMT过程,同时增加HIF-1α的转录活性。而肿瘤缺氧微环境可促进A549细胞中H2S生成,形成H2S与HIF-1α的正反馈调控通路。H2S协同HIF-1α上调VEGF表达,促进肺腺癌血管生成过程。本研究结果表明,H2S在肺腺癌中发挥促癌作用,抑制硫化氢合成酶可有效抑制肺腺癌肿瘤的增殖过程。本论文为H2S在肺腺癌中的研究提供了基础,为肺腺癌的预防、诊断以及靶向治疗提供新思路。
李煜[4]（2020）在《MiR-629-5p促进肺腺癌浸润作用发现与双重作用机制探究》文中进行了进一步梳理肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）作为最主要的肺癌亚型,其转移率在肺癌各亚型中居于首位。肿瘤转移是一个多步骤、级联的复杂过程,其中,肿瘤浸润是肿瘤转移的前提条件。但目前为止,肺腺癌浸润机制尚不明确。MicroRNA（miRNA）是内源性产生的非编码单链小RNA,能够以多种作用方式调控基因的表达,并且能够以调控多个基因的方式协同调控生理和病理过程。研究提示miRNA的异常表达与肿瘤恶性进展密切相关。因此,本课题旨在考察肺腺癌中异常表达的miRNA在肺腺癌浸润过程中的作用及分子机制,为阐明肺腺癌浸润机制提供新的思路。肺腺癌浸润相关miR-629-5p的发现:根据TCGA数据库的分析,我们选择了27个在肺腺癌中表达明显上调的miRNA并进行了体外transwell小室细胞迁移的筛选,结果表明miR-629-5p能够明显增强肺腺癌细胞的体外迁移能力。进一步检测49对人肺腺癌临床样本中miR-629-5p的表达,发现与癌旁组织相比,miR-629-5p在浸润性肺腺癌组织中显着高表达,而在非浸润性肺腺癌组织中无明显变化,结果表明了miR-629-5p与肺腺癌浸润的显着正相关性,进一步提示其可能在肺腺癌浸润过程中发挥了重要的促进作用。内源miR-629-5p促进肺腺癌浸润的验证:我们首先利用transwell小室比较了miR-629-5p低表达的A549细胞和miR-629-5p高表达的H1650细胞体外迁移与侵袭能力的差异,结果表明H1650细胞体外迁移与侵袭能力显着强于A549细胞。进一步通过尾静脉注射肺转移实验在裸鼠体内比较了H1650细胞与A549细胞肺转移能力的差异,结果显示,细胞注射45天后,A549组小鼠肺表面转移结节发生率为20%,H1650组小鼠肺表面转移结节发生率为100%,肺表面结节统计结果显示H1650组小鼠肺表面结节数量显着多于A549组,肺脏切片的结果显示H1650细胞具有显着的血管浸润特征,而在A549组中没有观察到这一现象。以上结果表明,与A549细胞相比,H1650细胞具有更强的肺表面结节形成能力和肺内的血管浸润能力,提示miR-629-5p具有明显的促进肺腺癌浸润的作用。过表达miR-629-5p促进肺腺癌浸润的确证:我们利用慢病毒构建了miR-629-5p过表达A549稳转株并进行体外transwell小室迁移与侵袭实验和体内裸鼠尾静脉注射肺转移实验,结果表明,与对照组相比,miR-629-5p过表达显着增强了A549细胞体外迁移与侵袭能力。体内结果显示,miR-629-5p过表达组小鼠肺表面转移结节发生率为100%,对照组小鼠肺表面转移结节发生率38.46%,肺表面结节统计结果表明,miR-629-5p过表达显着促进了A549细胞肺表面转移结节的形成,肺脏切片的结果显示miR-629-5p过表达使A549细胞具有了显着的血管浸润能力。以上结果进一步确证了miR-629-5p具有促进肺腺癌浸润的重要作用。MiR-629-5p促进肺腺癌浸润双重促进分子机制的探究:基于上述结果,我们进一步研究了外泌体与miR-629-5p以及肺腺癌浸润的相关性,发现了miR-629-5p在肺腺癌细胞中的作用机制,同时发现肺腺癌细胞来源外泌体中miR-629-5p对血管内皮细胞也具有重要的作用。首先,miR-629-5p在肺腺癌细胞中作用机制:通过蛋白质谱的分析,我们发现肿瘤转移相关蛋白PPWD1在miR-629-5p过表达A549细胞中表达显着下降,这一现象提示了其参与肺腺癌浸润过程的可能性。进一步我们在肺腺癌细胞中分别利用PPWD1 siRNAs和flag-PPWD1过表达质粒抑制和过表达PPWD1的方法在体外考察PPWD1的作用,结果表明抑制PPWD1表达显着促进了肺腺癌细胞的迁移与侵袭,而过表达PPWD1能够显着抑制肺腺癌细胞的迁移与侵袭,同时过表达PPWD1能够显着抑制miR-629-5p促进肺腺癌细胞迁移与侵袭的作用,临床样本的检测结果同样验证了miR-629-5p表达与PPWD1表达的负相关性。以上结果证明PPWD1表达降低在miR-629-5p促进肺腺癌细胞自身迁移、侵袭过程中发挥了关键的作用。其次,miR-629-5p在内皮细胞中作用及分子机制:利用超速离心法分离肺腺癌细胞条件培养基中外泌体并利用电镜、标志蛋白检测以及nanosight粒径检测技术对外泌体进行了鉴定,进一步检测外泌体中miR-629-5p含量发现,转移来源肺腺癌细胞外泌体中miR-629-5p的含量显着高于正常肺上皮细胞及原位来源肺腺癌细胞。这一结果提示了外泌体中miR-629-5p参与肺腺癌细胞血管浸润的可能性。在接下来的功能考察中,我们利用肿瘤细胞与内皮细胞共培养、单层内皮细胞渗透性及肿瘤细胞跨单层内皮细胞侵袭实验证明了外泌体中miR-629-5p能够通过增强单层内皮细胞的渗透性促进肺腺癌细胞跨内皮细胞侵袭的作用。检测内皮细胞渗透性相关蛋白的表达发现miR-629-5p能够显着下调非典型钙粘蛋白CELSR1的表达,进一步我们通过siRNAs抑制CELSR1表达和CRISPR-dcas9激活CELSR1表达的方法确证了其维持单层内皮细胞渗透性的能力,同时证明了CELSR1表达降低是miR-629-5p增强单层内皮渗透性的关键靶基因,临床样本免疫荧光的结果也表明了miR-629-5p表达与CELSR1表达之间的负相关性,提示了肺腺癌细胞外泌体miR-629-5p通过降低内皮细胞CELSR1表达增加内皮细胞渗透性,从而促进肺腺癌细胞血管浸润的作用。综上所述,本研究通过TCGA数据库的筛选、临床样本的分析及验证、体外体内功能考察及进一步的机制探究,首次发现了miR-629-5p具有显着的直接促进肺腺癌浸润的作用,同时揭示了miR-629-5p可以通过增强肺腺癌细胞自身迁移与侵袭能力和增加血管内皮细胞渗透性,进一步促进肺腺癌浸润的全新的双重促进作用分子机制。为阐明肺腺癌浸润转移机制提供了新依据、新思路,同时为肺腺癌的治疗提供了新靶点、新策略。
王圆[5]（2020）在《SCRIB低表达成纤维细胞促进肺癌细胞侵袭的机制研究》文中研究说明研究背景肺癌是世界上最常见的癌症相关死亡原因[1],其中肺鳞癌和腺癌是NSCLC（Non small cell lung cancer,NSCLC）最常见组织类型。肿瘤细胞发生癌基因激活,抑癌基因缺失,可导致细胞过度增殖,抑制细胞凋亡。肿瘤细胞间黏附改变,细胞骨架动力学变化,细胞外基质（extracellular matrix,ECM）降解能力增强等方式促进肿瘤细胞突破基底膜,向组织内侵袭浸润,同时,肿瘤细胞还能向血管和淋巴管内迁移至机体其他器官定植和生长[2]。肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）是肿瘤细胞生长的外部环境,在肿瘤的形成和发展中发挥重要的作用,其中,肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts,CAFs）是肿瘤间质重要组成成分。CAFs可通过分泌细胞因子及重构ECM直接影响肿瘤生长,侵袭,转移,也可通过影响肿瘤相关免疫细胞,及血管内皮细胞间接影响肿瘤进展[3]。然而CAFs的功能具有异质性,例如CAFs中caveolin-1表达缺失与三阴性乳腺癌的预后差有关[4],而另一研究发现caveolin-1在CAFs中表达促进乳腺癌的侵袭和转移[5]。NSCLC单细胞转录组测序发现6种CAFs亚型,这些亚型在患者正常肺组织中少见[6]。CAFs可作为NSCLC复发和生存预后的预测指标[7]。可见,阐明NSCLC中CAFs特异的表型和功能将为NSCLC提供新的治疗靶点。成纤维细胞是CAFs的主要细胞来源之一,其还可来源于骨髓来源间充质干细胞,周细胞,上皮或内皮细胞间充质转化（EMT）等。与正常成纤维细胞（normal fibroblasts,NAFs）相比,CAFs分泌大量炎症因子,趋化因子,生长因子和ECM成分如胶原蛋白,纤连蛋白,糖蛋白等,其自身收缩能力,侵袭能力也显着增强[8]。成纤维细胞与肿瘤细胞相互作用在肿瘤的发生发展过程中有重要影响。其中肿瘤细胞诱导间质成纤维细胞表达CAFs的分子表型和功能,例如,肺癌细胞与NAFs共培养可教化NAFs表达一系列CAFs分泌的炎症因子,而这些炎症因子在促进肺癌生长中具有重要作用[9]。网膜成纤维细胞与卵巢肿瘤细胞通过TGFα-TNFα-EGFR（tumor growth factorα-Tumor necrosis factorα-epithelial growth factor receptor）途径相互作用促进卵巢癌腹膜转移[10]。因此,研究肿瘤与成纤维细胞间的相互作用的分子机制对阐明间质细胞对肿瘤发展影响仍十分重要。SCRIB蛋白含有多个结构域,主要包括16个LRR（Leucine-rich repeats）结构域和4个PDZ结构域,它们能够结合多种类型蛋白如极化蛋白,黏附分子,信号分子蛋白,激酶等,因此,SCRIB参与多种细胞生物学过程如细胞极性,迁移,增殖,凋亡,侵袭等[11]。SCRIB可直接结合细胞信号分子或结合其他蛋白间接调控细胞信号通路活性如影响PI3K/AKT,Ras/MAPK,Hippo,WNT等信号通路。最早在黑腹果蝇生物体中发现,SCRIB的缺失诱导上皮细胞过度增生,被认为是抑癌基因。在哺乳动物中,SCRIB在乳腺,前列腺,肺上皮细胞中特异性表达缺失也与上皮结构组织紊乱相关[12-14]。在肺上皮细胞,SCRIB缺失联合KRAS突变明显促进肺腺癌的生长,并且肿瘤间质纤维化增加,巨噬细胞浸润增多,提示SCRIB的抑癌作用以及对TME的影响[13]。然而SCRIB对间质成纤维细胞功能的影响还不清楚。因此,在本文中,我们探讨了肿瘤细胞对成纤维细胞SCRIB表达的影响及其进而对肿瘤发展的影响及分子机制。研究目的本文主要探讨了NSCLC来源CAFs中SCRIB表达与肿瘤进展的相关性,以及成纤维细胞中SCRIB表达对肺癌细胞功能的影响及其分子机制。研究方法1)免疫组化检测SCRIB在临床肺鳞癌和腺癌组织间质成纤维细胞中表达情况,并根据患者临床资料做统计分析。2)小鼠肺癌细胞LLC（Lewis lung cancer）与成纤维细胞共培养,蛋白质谱方法检测和分析共培养和单独培养成纤维细胞间差异性表达蛋白,荧光定量PCR（Quantitative-PCR,Q-PCR）检测共培养成纤维细胞SCRIB表达。3)利用Incu Cyte实时动态观察SCRIB敲低与对照组成纤维细胞增殖、迁移的差异;Transwell侵袭实验检测SCRIB敲低与对照组成纤维细胞侵袭的差异。4)Western blot方法检测SCRIB敲低与对照组成纤维细胞中信号通路激活情况的差异;Transwell侵袭实验检测抑制SCRIB敲低与对照组成纤维细胞中相应信号通路对其侵袭能力的影响。5)利用Incu Cyte实时动态检测分别与SCRIB敲低及对照组成纤维细胞共培养的LLC增殖能力的差异;Transwell迁移和侵袭实验检测分别与SCRIB敲低或对照组成纤维细胞共培养的LLC迁移、侵袭能力的差异。6)LLC-成纤维细胞皮下共注射移植瘤模型观察分别与SCRIB敲低或对照组成纤维细胞共注射的LLC肿瘤生长的差异;苏木精-伊红染色法（Hematoxylin eosin,HE）检测两组共注射早期肿瘤边缘肌肉浸润的情况。7)转录组测序分析SCRIB敲低及对照组成纤维细胞之间差异性表达基因,并用q PCR及western blot方法检测SCRIB敲低及对照组成纤维细胞asporin（ASPN）表达情况。8)si RNA抑制SCRIB敲低成纤维细胞ASPN表达,并用Transwell侵袭实验检测抑制SCRIB敲低成纤维细胞ASPN后对LLC侵袭能力的影响。研究结果研究发现1)人肺鳞癌CAFs中SCRIB低表达与肿瘤分期晚,生存预后差相关,与淋巴结转移和临床分期无显着相关性。而人肺腺癌CAFs中SCRIB表达与肿瘤分期,淋巴结转移,临床分期均无显着相关性。2)与肺癌LLC细胞共培养的成纤维细胞SCRIB表达降低,LLC上清也能下调成纤维细胞SCRIB表达。3)SCRIB敲低成纤维细胞增殖能力稍减弱,侵袭能力明显增强。抑制PI3K/AKT信号通路能够减弱SCRIB敲低成纤维细胞侵袭。4)SCRIB敲低成纤维细胞对LLC增殖没有明显影响,而显着促进其迁移和侵袭。5)SCRIB敲低成纤维细胞对LLC肿瘤早期生长无明显影响,而促进了肿瘤细胞向邻近肌肉层的浸润。6)转录组学分析发现SCRIB敲低成纤维细胞ASPN表达增加,抑制ASPN减弱其促进LLC细胞体外侵袭能力。7)用数据库做ASPN转录因子预测分析,STAT5A是潜在调控ASPN的转录因子。SCRIB敲低成纤维细胞STAT5信号通路激活增加。研究结论本研究结果表明,低表达SCRIB的成纤维细胞通过PI3K/AKT信号通路促进自身的侵袭,并能通过促进ASPN的分泌促进肺癌细胞体外侵袭。
石剑林[6]（2020）在《成纤维细胞激动蛋白促进肺腺癌增殖的机理研究》文中研究表明[研究目的]越来越多的研究表明,肿瘤的发生、发展过程是与其周围的免疫细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等肿瘤微环境中各种成分动态相互影响的结果。而其内的各种促进肿瘤及抑制肿瘤发展的炎性反应共同影响着肿瘤的演进过程。最新的研究发现肿瘤微环境中Ⅰ型干扰素及其下游关键信号通路分子的缺失（STAT1、STAT2等）可间接促进免疫抑制状态的产生,最终导致肿瘤的增殖及转移;而更重要的是肿瘤细胞可减少其内源性Ⅰ型干扰素的释放,从而导致免疫逃逸。肿瘤微环境内如何实现促炎及免疫抑制的转换仍然是本学科一个未解决的问题。人成纤维细胞激动蛋白（fibroblast activation protein,FAP）是一种整合于细胞膜上的Ⅱ型丝氨酸蛋白酶,为肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts,CAFs）表面最重要的标记物之一。目前研究发现FAP主要表达于90%的上皮源性恶性肿瘤周围的活化成纤维细胞表面及一过性表达于骨髓间充质细胞、伤口周围组织及某些纤维化病灶中,而其在良性病变中基本不表达。FAP参与了肿瘤微环境中局部免疫反应的形成,阻断FAP的功能可抑制肿瘤的增殖。而同时给予Interferon-γ和TNF-α的中和性抗体又能促进肿瘤的增殖。这提示FAP可能调控局部干扰素和肿瘤坏死因子的表达。另外在CAFs相关的动物模型中研究发现FAP参与JAK-STAT信号通路的激活,这也是Ⅰ型干扰素的主要效应通路。本课题组在前期工作中成功构建了过表达FAP的小鼠成纤维细胞株（3T3）,且分离得到FAP阳性的CAFs。通过转录本测序及生物信息学方法,发现FAP可下调干扰素诱导基因（RIG-I、STAT2、IRF7等）。因此我们有理由相信CAFs表面表达的FAP可能通过下调ISGs的表达并诱导肿瘤微环境对Ⅰ型干扰素产生失能和效应抵抗。为了在人肺癌细胞及动物模型中验证这一科学假说,同时探讨肺腺癌患者中FAP的表达是否与患者预后相关。我们设计并完成了以下实验,实验方法及结果内容如下:[方法]一、组织芯片及TCGA数据分析FAP在肺腺癌人群中的表达和预后通过大样本的人肺腺癌组织芯片结果及对比TCGA数据,分析FAP在肺腺癌组织和癌旁组织内的表达情况及FAP与肺腺癌患者预后之间的关系。二、成纤维细胞激动蛋白促进肺腺癌增殖的机理研究细胞实验:将FAP过表达慢病毒（OE）和空载体对照病毒（NC）分别感染目的细胞株HFF、BJ及SPC-A-1,构建FAP过表达及阴性对照细胞模型。应用Cell counting kit-8（CCK8）检测过表达FAP后各细胞株的增殖能力,将Poly（I:C）通过转染试剂转染至FAP过表达及对照细胞株后,应用ELISA试剂盒检测内源性IFN-β释放的情况。并分别将待测细胞株FAP-3T3、NC-3T3、小鼠CAFs、FAP-HFF、NC-HFF、FAP-BJ及NC-BJ细胞株进行转录本测序并生物信息学分析,行qPCR及Western Blot实验验证下游分子机制。动物模型:给予裸鼠皮下注射FAP过表达及相应对照细胞株（FAP-HFF+SPC-A-1、NC-HFF+SPC-A-1及FAP-SPC-A-1、NC-SPC-A-1）,同时在瘤旁皮下注射Ⅰ型干扰素,观察并测量裸鼠体重、肿瘤体积和肿瘤重量。裸鼠移植瘤组织行HE染色及免疫组化检测干扰素诱导基因的表达情况。[结 果]一、临床样本及TCGA数据分析FAP在肺腺癌人群中的表达和预后选择94例临床可手术的肺腺癌患者作为研究对象,对其手术后肺腺癌病理标本进行针对FAP的免疫组化分析发现:FAP在癌胞浆中呈高表达为29例（31.52%）,低表达63例（68.48%）;而在癌旁胞浆中均为低表达。FAP在癌间质中呈高表达为49例（53.26%）,低表达43例（46.74%）;在癌旁间质中除2例高表达（2.38%）外,其余均为低表达。肺腺癌及癌旁组织内FAP的表达差异具有统计学意义（P<0.05）。肺腺癌患者术后10年随访的生存分析数据显示肺腺癌间质内FAP高表达的患者预后更差,结果具有统计学差异（P=0.019）。二、成纤维细胞激动蛋白促肺腺癌增殖的机理研究本研究体外实验证实:人成纤维细胞株FAP-HFF、FAP-BJ及肺腺癌细胞株FAP-SPC-A-1,小鼠成纤维细胞株FAP-3T3的增殖能力均高于对照组,同时给予外源性Ⅰ型干扰素刺激后,FAP过表达细胞株的增殖能力同样高于对照组（P<0.05）。将Poly（I:C）转染至FAP过表达及对照细胞株后,ELISA实验证实FAP可减少内源性IFN-β的释放（P>0.05）。同时进行转录本测序及生物信息学分析后提示FAP可能通过上调细胞增殖相关分子（细胞周期、细胞分裂等）及下调Ⅰ型干扰素相关信号分子从而促进肺腺癌细胞增殖,并通过qPCR及Western Blot验证相对于NC-HFF和NC-3T3,FAP-HFF及FAP-3T3细胞株中STAT2蛋白表达有下调。FAP-SPC-A-1细胞中细胞周期相关蛋白CCNB1的表达有上调,而FAP-HFF及NC-HFF细胞株中CCNB1的表达无明显差异。动物实验结果证实:于BALB/c裸鼠背部皮下分别接种FAP-SPC-A-1及对照细胞株,FAP-HFF和SPC-A-1混合细胞液及相应对照细胞株,同时分别于瘤旁注射人IFN-α2b 20000U/只/d,发现Ⅰ型干扰素可促进FAP过表达细胞株的体内成瘤（P<0.05）。裸鼠移植瘤免疫组化染色后显示:未给予外源性Ⅰ型干扰素刺激时,STAT1、STAT2、ISG15、IRF7在各实验组移植瘤中表达无差异,结果无统计学意义（P>0.05）。而给予外源性Ⅰ型干扰素刺激后,干扰素组（FAP-SPC-A-1和FAP-HFF+SPC-A-1）相对于观察组而言,STAT1、ISG15、IRF7表达上调,结果具有统计学意义（P<0.05）。并且在干扰素组中,FAP-SPC-A-1组及FAP-HFF+SPC-A-1 组相对于对照细胞组（NC-SPC-A-1 组及 NC-HFF、SPC-A-1）组而言,STAT2下调明显,结果具有统计学意义（P<0.05）。[结 论]一、FAP在人肺腺癌组织内相比癌旁为高表达,且肿瘤间质内FAP高表达的患者预后更差,结果具有统计学差异（P=0.019）;二、FAP可在体外促进人成纤维细胞株HFF、BJ,人肺腺癌细胞株SPC-A-1及小鼠成纤维细胞株3T3的增殖,机制可能为上调细胞周期蛋白CCNB1的表达;三、FAP可在体内外Ⅰ型干扰素的刺激下促进细胞株（HFF、SPC-A-1）的增殖,机制可能为下调STAT2的表达;四、FAP可减少体外小鼠成纤维细胞株3T3及人成纤维细胞株HFF中内源性Ⅰ型干扰素IFN-β的释放。
陈艳[7]（2019）在《miR-32靶向ITGA6抑制肺癌生长和转移的作用及机制研究》文中研究表明[目的]分析miR-32、ITGA6的表达水平之间的相关性以及与NSCLC患者临床病理参数的相关性,并通过体外、体内实验研究miR-32靶向调节ITGA6表达在NSCLC生长和转移中的作用及其机制,为临床NSCLC诊治提供新的分子标志物和潜在的重要靶点。[方法]1、qPCR技术检测NSCLC患者癌组织、配对远端对照肺组织中miR-32的表达水平,收集整理患者临床病理参数。2、采用 miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors、pGpU6/GFP/Neo-miR-32,通过脂质体瞬时转染NSCLC细胞,荧光显微镜和qPCR评价转染效果;采用CCK实验、平板克隆实验、划痕实验、Transwell侵袭实验研究miR-32对NSCLC细胞增殖能力、成瘤能力、迁移和转移能力的影响。3、采用生物信息学分析软件（PITA、RNA22、TargetScan、picTar、miRanda、microT）和在线数据库分析miR-32潜在的靶基因;构建野生型和突变型ITGA6 3’UTR,与miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors共转染297T,进行双荧光素酶报告基因检测;miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors 通过脂质体瞬时转染 A549 和XWLC-05细胞后,qPCR和Western blot技术检测miR-32、ITGA6的表达水平;分析qPCR检测NSCLC患者肿瘤组织中miR-32与ITGA6表达水平之间的相关性;采用免疫组织化学技术检测NSCLC患者癌组织、配对远端对照肺组织中ITGA6、ITGB4的表达水平,收集整理患者临床病理参数;采用MTS实验、软琼脂克隆实验、Transwell体外侵袭和迁移实验等体外实验研究整合素α6β4对NSCLC细胞增殖能力、成瘤能力、转移和迁移能力的影响;采用裸鼠皮下移植瘤模型和SCID小鼠肺原位移植瘤模型,体内实验研究整合素α6β4在NSCLC生长和转移中的作用。4、通过慢病毒感染构建具有GFP和LUC标记稳定表达miR-32、miR-NC的A549细胞,并采用qPCR和Western blot技术检测miR-32、ITGA6表达水平,评价筛选结果;通过皮下注射GFP标记的实验组（LV-miR-32）、对照组（LV-miR-NC）的A549细胞,构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察裸鼠一般情况,测量裸鼠体重、瘤体大小。接种肿瘤细胞后22天时处死裸鼠,测量瘤体重量和大小,肿瘤组织一部分速冻,进行qPCR检测miR-32表达,另一部分10%中性甲醛固定,进行HE染色;通过尾静下注射LUC标记的实验组（LV-miR-32）、对照组（LV-miR-NC）的A549细胞,构建SCID小鼠肺转移模型。接种肿瘤细胞后30天进行小动物活体成像,并处死小鼠,肺组织固定后进行HE染色。5、miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors及其阴性对照通过脂质体瞬时转染A549 和 XWLC-05 细胞,qPCR 和 Western blot 技术检测 miR-32、ITGA6、FAK、pFAK、E-cadherin、Vimentin、SLUG 表达水平。并通过 Rescue 实验,qPCR 和Western blot 技术检测 miR-32、ITGA6、FAK、pFAK、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、E-cadherin、Vimentin、SLUG 表达水平,进一步研究 miR-32 在 NSCLC进展中的作用机制。[结果]1、miR-32在94例NSCLC组织中的相对表达量为0.79（0.14,1.71）,而在配对远端对照肺组织中的相对表达量1.00（0.37,3.65）,差异具有统计学意义（P<0.01）;miR-32在37例宣威NSCLC组织中的相对表达量明显低于配对远端对照肺组织（P<0.05）,而37例宣威NSCLC组织中miR-32相对表达量与57例非宣威NSCLC比较,差异无统计学意义（P>0.05）;miR-32的表达水平与患者年龄、性别、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移、病理类型之间均没有相关性（分别P>0.05）。2、qPCR结果显示,miR-32在NSCLC细胞中的表达水平低于正常支气管上皮细胞16HBE,差异有统计学意义（分别P<0.01）。转染miR-32-5p mimics、pGpU6/GFP/Neo-miR-32 的 A549、XWLC-05、H157、YTMLC 细胞中 miR-32 的表达水平均高于阴性对照组（分别P<0.001）。CCK实验结果显示,转染miR-32-5p mimics的A549、XWLC-05细胞增殖明显受到抑制（分别P<0.001）,而转染miR-32-5p inhibitors的A549、XWLC-05细胞增殖率明显高于其阴性对照inhibitors NC（分别P<0.001）。平板克隆形成实验结果显示,转染miR-32-5p mimics的A549、XWLC-05、H157细胞克隆数明显低于阴性对照组miR-NC（分别P<0.001）。划痕实验结果显示,转染 pGpU6/GFP/Neo-miR-32 的 A549、XWLC-05、H157、YTMLC细胞伤口愈合速度明显慢于阴性对照组（分别P<0.001）。Transwell侵袭实验结果显示,转染 pGpU6/GFP/Neo-miR-32 的 A549、XWLC-05、H157、YTMLC侵袭细胞数明显低于阴性对照组（分别P<0.001）。3、4 个数据库（PITA、TargetScan、miRanda、microT）预测 ITGA6 具有 miR-32的结合位点;双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-32-5p mimics可明显抑制野生型ITGA6 3’UTR质粒荧光素酶活性（P<0.001）,而突变型ITGA6 3’UTR质粒活性则无明显变化（P>0.05）。相反,miR-32-5p inhibitors则可明显促进野生型ITGA6 3’UTR质粒荧光素酶活性（P<0.001）;qPCR结果显示,转染miR-32-5p mimics的A549和XWLC-05中miR-32表达水平均明显高于阴性对照组（分别P<0.001,P<0.05）,而ITGA6表达水平均明显低于阴性对照组（分别P<0.01）。转染miR-32-5p inhibitor的A549和XWLC-05中miR-32表达水平则均明显低于阴性对照组（分别P<0.001,P<0.05）,而ITGA6的表达水平均明显高于阴性对照组（分别P<0.001,P<0.01）;Western blot 结果显示,转染 miR-32-5p mimics后,A549和XWLC-05中ITGA6蛋白的表达水平均低于阴性对照组。NSCLC肿瘤组织中miR-32和ITGA6的相对表达呈现负相关关系（r=-0.34,P<0.001）;整合素α6β4在NSCLC肿瘤组织中的表达均高于配对远端对照肺组织（分别P<0.05,P<0.001）。整合素α6β4的表达均与NSCLC患者复发转移密切相关（分别P<0.01）;整合素α6β4在NSCLC细胞株中均有表达。抑制整合素α6β4表达的实验组H460SM细胞软琼脂克隆形成率、迁移率、侵袭率均低于与阴性对照组（分别P<0.05）;抑制ITGA6、ITGB4表达的实验组裸鼠皮下移植瘤体积小于阴性对照组（分别P<0.05）;抑制ITGA6、ITGB4表达的的实验组SCID小鼠肺癌原位移植瘤转移率低于阴性对照组（分别P<0.05）。4、qPCR和Western blot技术检测稳定表达miR-32和miR-NC的A549细胞中miR-32、ITGA6的表达,结果显示实验组（A549/LV-miR-32）miR-32的表达均明显高于对照组(（A549/LV-miR-NC）,而ITGA6的表达则均明显低于对照组（分别P<0.001）。裸鼠皮下移植瘤模型结果显示,与对照组(（A549/LV-miR-NC）比较,实验组（A549/LV-miR-32）小鼠皮下移植瘤增长趋势明显受到抑制,差异有统计学意义（P<0.01）。实验组移植瘤离体肿瘤重量、肿瘤体积均小于对照组（分别P<0.01,P<0.05）。qPCR结果显示,实验组移植瘤离体肿瘤miR-32表达水平明显高于对照组（P<0.01）。SCID小鼠尾静脉注射肺转移模型实验结果显示,对照组肺脏肿瘤结节数明显多于实验组（P<0.001）。5、瞬时转染 miR-32-5p mimics 的 A549 和 XWLC-05 细胞中 ITGA6、pFAK（Y397）、pFAK（Y925）、Vimentin表达水平均低于阴性对照组,E-cadherin则高于阴性对照组（分别P<0.05）,而瞬时转染miR-32-5p inhibitors的A549和XWLC-05细胞中ITGA6、pFAK（Y397）、pFAK（Y925）、Vimentin 表达水平均高于阴性对照组,E-cadherin则低于阴性对照组阴性对照组（分别P<0.05）;与miR-NC和过表达对照质粒瞬时共转染比较,miR-32-5p mimics和过表达对照质粒瞬时共转染A549和 XWLC-05 细胞,ITGA6 蛋白及其下游 pFAK（Y397）、pFAK（Y925）、p-AKT、p-ERKl/2表达水平降低,E-cadherin表达水平升高而Vimentin、SLUG表达水平降低（分别P<0.00l,P<0.0l）。与miR-32-5p mimics和过表达对照质粒瞬时共转染比较,miR-32-5p mimics和ITGA6过表达质粒瞬时共转染A549和XWLC-05细胞,可部分逆转由于miR-32-5p mimics所造成的ITGA6蛋白表达的抑制,增加下游 pFAK（Y397）、pFAK（Y925）、p-AKT（ser473）、p-ERK1/2（pT202/Y204）磷酸化蛋白表达水平,增加Vimentin、SLUG表达,降低E-cadherin表达。[结论]1、miR-32在NSCLC肿瘤组织中呈低表达,提示miR-32在NSCLC发生发展中可能发挥抑癌miRNA的作用。2、过表达miR-32可抑制NSCLC生长和转移。3、整合素α6β4信号通路可促进NSCLC生长和转移。ITGA6是miR-32新的靶基因。miR-32可抑制ITGA6表达,抑制整合素α6β4信号通路的活化,抑制AKT、ERK激活,降低SLUG的表达,进而抑制NSCLC的侵袭和转移。
王浩铭[8]（2019）在《siRNA沉默Notch1基因表达对肺癌细胞SPC-A-1BM侵袭性的影响》文中认为目的:探讨Notch1基因沉默对人肺腺癌细胞SPC-A-1BM侵袭能力的影响及其对基质金属蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9,MMP-9）基因表达的影响。方法:1.培养人正常支气管上皮细胞16HBE和人肺腺癌细胞SPC-A-1BM,待均达到对数生长期时,提取总RNA并逆转录成cDNA,然后通过实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR）检测Notch1 mRNA在两种细胞中表达情况。2.在第一步结果的基础上,将人肺腺癌细胞SPC-A-1BM分为3个组,分别为:空白对照组（无siRNA干扰）、siRNA阴性对照组（Notch1非特异性siRNA干扰,siRNA-NC）和siRNA实验组（Notch1特异性siRNA干扰,siRNA-Notch1）,利用RNA干扰技术设计合成能够靶向沉默Notch1基因的小干扰RNA序列,并在核酸转染试剂脂质体LipofectamineTM2000（Lipo2000）介导下转染SPC-A-1BM细胞,在各组细胞转染36h后,利用RT-PCR和蛋白免疫印迹（Western Blot,BT）技术检测转染后各组SPC-A-1BM细胞中Notch1 mRNA和蛋白表达水平的变化。3.Transwell细胞侵袭实验研究转染后各组SPC-A-1BM细胞侵袭能力的差异;4.通过RT-PCR和Western Blot技术检测转染后各组SPC-A-1BM细胞中MMP-9mRNA和蛋白表达水平的变化。在得到各组数据资料后,通过单因素方差分析的方法进行统计学分析,以P<0.05为具有统计学差异。结果:1.Notch1基因在肺腺癌细胞株SPC-A-1BM中的表达:RT-PCR结果显示SPC-A-1BM细胞中Notch1 mRNA表达量是16HBE细胞中的4.121±0.913倍,并有统计学差异（P<0.05）。2.Notch1基因沉默后各组肺腺癌细胞SPC-A-1BM中Notch1mRNA及蛋白表达水平:结果显示空白对照组、siRNA阴性对照组和siRNA实验组细胞中Notch1 mRNA相对表达量分别为1.000±0.000、0.967±0.026和0.347±0.045,蛋白相对表达量分别为0.551±0.026、0.519±0.060和0.242±0.024,对实验数据进行统计学分析,发现siRNA实验组与siRNA阴性对照组及空白对照组相比,Notch1mRNA及蛋白表达水平均下降,并有统计学意义（P<0.05）。siRNA阴性对照组较空白对照组相比无统计学差异（P>0.05）;说明Notch1-siRNA可以有效的抑制SPC-A-1BM细胞中Notch1 mRNA及蛋白的表达。3.Notch1基因沉默对肺腺癌SPC-A-1BM侵袭性的影响:对各组肺腺癌细胞SPC-A-1BM进行转染并继续培养36h后进行Transwell细胞侵袭实验,结果显示空白对照组、siRNA阴性对照组和siRNA实验组中穿膜细胞个数分别为84.17±5.69、81.67±4.65和30.83±3.62,进行统计学分析,发现siRNA实验组与空白对照组相比抑制率为63%,有统计学差异（P<0.05）,siRNA阴性对照组与空白对照组相比抑制率为3%,无统计学差异（P>0.05）;表明siRNA靶向沉默Notch1能够降低肺腺癌细胞SPC-A-1BM的侵袭性。4.Notch1基因沉默后各组肺腺癌细胞SPC-A-1BM中MMP-9 mRNA及蛋白表达水平:结果显示空白对照组、siRNA阴性对照组和siRNA实验组细胞中MMP-9 mRNA的相对表达量分别为1.000±0.000、0.979±0.037和0.389±0.025,MMP-9蛋白的相对表达量分别为0.394±0.058、0.372±0.050和0.234±0.034,进行统计学分析,发现siRNA实验组较siRNA阴性对照组及空白对照组相比,MMP-9 mRNA及蛋白表达水平均下降,并有统计学意义（P<0.05）,siRNA阴性对照组较空白对照组相比无统计学差异（P>0.05）;表明沉默Notch1基因能够下调MMP-9表达。结论:Notch1在肺腺癌细胞SPC-A-1BM中存在过表达,siRNA靶向沉默Notch1基因能够抑制SPC-A-1BM细胞侵袭,并能够下调MMP-9的表达,提示NSCLC中Notch1可能通过MMP-9途径抑制促进细胞侵袭转移。
陈文娟[9]（2019）在《下调雌激素受体β对肺腺癌细胞生物学行为的影响及初步机制研究》文中进行了进一步梳理背景:肺癌是全球癌症发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,其中肺腺癌是主要的病理类型。雌激素及其不同类型的受体被报道参与了乳腺癌、卵巢癌及肠癌等多种恶性肿瘤的发生发展。其中雌激素受体β与肺腺癌的相关报道多集中在回顾性的病例分析,且存在诸多争议。我们前期研究也发现雌激素与肺癌发生发展相关。因此,深入研究雌激素及其受体β在肺腺癌发生发展过程中的作用及探讨初步机制具有重要的意义。目的:通过应用免疫组织化学、基因转染和构建NOD/SCID小鼠肺转移瘤模型等多种方法发现雌激素受体β在癌组织中较癌旁组织高表达;下调雌激素受体β的表达能明显抑制A549肺癌细胞克隆形成、侵袭和迁移等生物学功能,机制可能与抑制pERK、MMP-2和MMP-9的表达有关;动物体内实验证实下调A549肺癌细胞中ERβ的表达可抑制NOD/SCID小鼠肺部转移瘤的形成。此研究为雌激素相关药物在肺腺癌的治疗和预防提供了新的理论依据。方法和内容:1、应用免疫组织化学的方法（immunohistochemistry,IHC）检测75对肺腺癌组织与相应癌旁组织中雌激素受体β表达水平;2、用Western blot检测雌激素受体β在人肺腺癌细胞株A549与正常人支气管上皮细胞株（human bronchial epithelial cells,HBE）中的表达;3、MTT方法检测雌激素（E2）及雌激素受体β激动剂（DPN）和雌激素受体α激动剂（PPT）对A549细胞增殖能力的影响;4、构建雌激素受体β表达下调的A549细胞,通过平板克隆实验、侵袭实验和迁移实验等在体外观察下调雌激素受体β对A549细胞的生物学功能的影响;5、用Western blot检测下调ERβ表达后ERK、pERK、MMP-2及MMP-9蛋白表达的变化,初步探讨下调ERβ影响A549细胞生物学功能的机制;6、构建NOD/SCID小鼠肺转移瘤动物模型,观察雌激素受体β下调对小鼠肺部转移瘤形成的影响。结果:1、在75对人肺腺癌组织/癌旁组织中,ERβ蛋白在癌组织中的表达高于癌旁组织（p<0.001）;2、ERβ蛋白的表达在肺腺癌A549细胞中较人正常支气管上皮细胞高;3、雌激素E2和雌激素受体β激动剂DPN促进A549细胞的增殖,雌激素受体α激动剂PPT对A549细胞的增殖无显着影响;4、下调ERβ表达明显抑制A549细胞克隆形成、侵袭和迁移等生物学功能;5、下调ERβ表达明显抑制pERK、MMP-2和MMP-9蛋白的表达;6、下调A549细胞中ERβ的表达可抑制NOD/SCID小鼠肺部转移瘤的形成。结论:1、ERβ表达与肺腺癌的发生发展相关;2、下调A549细胞中雌激素受体β的表达可能通过下调pERK、MMP-2和MMP-9表达,从而抑制A549肺癌细胞克隆形成、侵袭和迁移等生物学功能,同时抑制NOD/SCID小鼠肺部转移瘤的形成。
钟名天[10]（2019）在《氯化血根碱抗小细胞肺癌及三氧化二砷诱导BEAS-2B细胞恶性转化的作用机制研究》文中研究指明目的:1.建立以细胞增殖抑制率为筛选指标的体外筛选法,对小细胞肺癌细胞系NCI-H1688细胞进行天然产物化合物筛选;2.探讨氯化血根碱对三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞增殖的影响,并进一步探讨三氧化二砷诱导人肺支气管上皮细胞恶性转化的作用机制;3.探讨氯化血根碱抗小细胞肺癌的作用,及其联合帕比司他对小细胞肺癌生长的影响,并进一步探讨其抗小细胞肺癌的作用机制。方法:1.对NCI-H1688细胞进行天然产物化合物筛选实验研究通过CCK-8检测方法进行细胞增殖实验,检测640个天然产物化合物对人小细胞肺癌细胞系NCI-H1688细胞增殖的影响;同时,检测初筛得到的39个天然产物化合物对人正常支气管上皮细胞16HBE细胞增殖的影响。2.三氧化二砷诱导人肺支气管上皮细胞恶性转化的实验研究通过CCK-8检测方法进行细胞增殖实验,检测氯化血根碱对三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞增殖的影响;通过实时荧光定量PCR检测氯化血根碱对三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞中miR-301a表达水平的影响。同时,通过实时荧光定量PCR检测三氧化二砷对BEAS-2B细胞中miR-301a表达水平的影响;通过ELISA检测三氧化二砷处理的BEAS-2B细胞培养液中IL-6的水平;通过实时荧光定量PCR检测IL-6/IL-6抑制剂/STAT3抑制剂处理的BEAS-2B细胞中miR-301a的表达水平。采用瞬时转染技术抑制BEAS-2B细胞中miR-301a的表达,通过蛋白质免疫印迹法检测三氧化二砷处理的BEAS-2B细胞中磷酸化STAT3、总STAT3和I κ B a蛋白表达水平;采用瞬时转染技术抑制BEAS-2B-As细胞中miR-301a的表达,通过CCK-8检测方法进行细胞增殖实验、通过软琼脂克隆形成实验、通过transwell小室细胞迁移实验和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术,检测细胞增殖、克隆形成、细胞迁移和凋亡的情况。并且,通过蛋白质免疫印迹法检测miR-301a靶基因（SMAD4,RUNX3,PTEN,NKRF,BIM,P63,PIAS3,GADD45 α）蛋白表达水平;通过荧光素酶报告基因和蛋白质免疫印迹法检测共转染pGL3-SMAD4 3’ UTR和miR-301a模拟物的BEAS-2B-As细胞中荧光素酶活性和SMAD4蛋白表达水平。同时,采用慢病毒转染技术抑制BEAS-2B-As细胞中SMAD4的表达,通过CCK-8检测方法进行细胞增殖实验、通过transwell小室细胞迁移实验和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术,检测细胞增殖、细胞迁移和凋亡的情况。建立裸鼠异种移植瘤模型,设立Anti-control组和Anti-miR-301a组,测量两组肿瘤的体积,通过免疫组织化学法检测两组肿瘤组织切片中SMAD4阳性细胞数量;建立裸鼠异种移植瘤模型,设立shRNA-control组和shRNA-SMAD4组,测量两组肿瘤的体积,通过蛋白质免疫印迹法检测SMAD4、磷酸化STAT3、总STAT3蛋白表达水平。通过TCGA数据库分析腺癌和鳞状细胞癌的临床组织样本,探究miR-301a与SMAD4在肺癌组织中的相关性。3.氯化血根碱及其联合帕比司他抗小细胞肺癌的实验研究通过CCK-8检测方法进行细胞增殖实验,检测氯化血根碱对人小细胞肺癌细胞系NCI-H1688,NCI-H82和NCI-H526细胞增殖的影响;通过克隆形成实验、通过PI单染流式细胞术、通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和DAPI细胞染色、通过细胞划痕实验、通过transwell小室细胞迁移和侵袭实验,检测氯化血根碱对NCI-H1688细胞克隆形成、细胞周期分布、凋亡、运动、迁移和侵袭的影响。通过转录组测序和生物信息学分析,揭示氯化血根碱抑制人小细胞肺癌细胞系NCI-H1688的作用靶点;通过实时荧光定量PCR检测氯化血根碱处理的NCI-H1688和NCI-H82细胞中CDKN1A,CDKN1B,CDKN1C和P53基因mRNA表达水平;同时,通过蛋白质免疫印迹法验证CDKN1A,CDKN1B,CDKN1C和P53蛋白表达水平。建立裸鼠异种移植瘤模型,设立对照组和氯化血根碱治疗组,测量两组肿瘤的体积和重量,通过免疫组织化学法检测两组肿瘤组织切片中CDKN1A阳性细胞数量。通过实时荧光定量PCR检测小细胞肺癌细胞系NCI-H1688,NCI-H82和NCI-H526细胞中CDKN1A基因mRNA表达水平;同时,通过蛋白质免疫印迹法验证小细胞肺癌细胞系NCI-H1688,NCI-H82和NCI-H526细胞中CDKN1A蛋白表达水平。采用慢病毒转染技术抑制NCI-H1688细胞中CDKNIA的表达,通过建立稳定表达shRNA-CDKNIA的NCI-H1688细胞株,通过CCK-8检测方法和克隆形成实验检测CDKN1A对NCI-H1688细胞增殖和克隆形成的影响。通过Oncomine及TCGA数据库分析肺癌的临床组织样本中CDKN1A基因的表达水平。通过CCK-8检测方法检测氯化血根碱联合帕比司他、吉西他滨、THZ1和（+）-JQ1对人小细胞肺癌细胞系NCI-H1688细胞增殖的影响;通过PI单染流式细胞术检测氯化血根碱联合帕比司他对NCI-H1688细胞周期分布的影响;最后,通过蛋白质免疫印迹法检测氯化血根碱联合帕比司他处理的NCI-H1688细胞中CDKN1A,CDKN1B,CDKN1C和P53蛋白表达水平。结果:1.初步筛选得到39个天然产物化合物具有抑制人小细胞肺癌细胞增殖的作用,通过对比39个候选药物对正常细胞的杀伤力,并结合文献调研,发现氯化血根碱不仅能够抑制小细胞肺癌,并且对正常细胞的杀伤力小,是潜在的小细胞肺癌抑制物。2.1μM氯化血根碱处理三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞以及正常人肺支气管上皮细胞16HBE和BEAS-2B细胞后,对比三株细胞的抑制率,发现氯化血根碱能够抑制BEAS-2B-As细胞增殖,同时对正常细胞的影响较小。接着,不同浓度氯化血根碱（0.8,0.9,1,2,3μM）处理BEAS-2B-As细胞24,48,72小时,发现随着氯化血根碱作用浓度和作用时间的增加,细胞增殖抑制率逐步升高。同时,不同浓度氯化血根碱（0,0.5,1,1.5μM）处理BEAS-2B-As细胞24小时后检测miR-301a的表达,发现随着氯化血根碱作用浓度的增加,miR-301a的表达逐步下降。3.0.25μM三氧化二砷处理BEAS-2B细胞6个月,BEAS-2B细胞发生恶性转化。与未转化的BEAS-2B细胞比较,三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞中miR-301a呈现高表达。同时,不同浓度三氧化二砷（0,2.5,5,10μM）处理BEAS-2B细胞12小时后检测miR-301a的表达,发现随着三氧化二砷作用浓度的增加,miR-301a的表达显着升高。并且,0.25μM三氧化二砷处理BEAS-2B细胞不同细胞传代数目,检测miR-301a的表达,发现随着三氧化二砷暴露时间的增加（10-30代）,miR-301a的表达逐步升高。4.不同浓度三氧化二砷（0,5,10μM）和过氧化氢（阳性对照）处理BEAS-2B细胞24小时,通过ELISA检测细胞培养液中IL-6的水平,发现三氧化二砷10μM作用浓度时,IL-6水平最高。并且,不同浓度IL-6（0,10,50,100ng/mL）处理BEAS-2B细胞,检测miR-301a的表达,发现在IL-6的刺激下,随着IL-6作用浓度的增加,miR-301a表达显着升高。但是,STAT3抑制剂（S31-201,30μM）能够逆转miR-301a的高表达。同时,STAT3抑制剂和IL-6抑制剂（Anti-IL-6）均能逆转三氧化二砷处理BEAS-2B细胞后miR-301a的高表达。不同浓度三氧化二砷（0,5,10μM）处理分别转染Anti-control或Anti-miR-301a的BEAS-2B细胞24小时,通过蛋白质免疫印迹法检测磷酸化STAT3、总STAT3和IκBα蛋白表达,发现三氧化二砷能够激活STAT3的表达,抑制miR-301a的表达能够抑制STAT3的激活,而I κ Bα的表达没有显着差异。5.在分别转染Anti-control和Anti-miR-301a的BEAS-2B-As细胞中检测细胞增殖和克隆形成能力,以及细胞迁移和诱导细胞凋亡的能力,发现通过抑制miR-301a的表达能够抑制三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞增殖、克隆形成和细胞迁移,并增强阿霉素诱导的细胞凋亡。6.通过检测部分已报道的mi R-301a靶基因的蛋白表达,发现在三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B-As细胞中,SMAD4和NKRF的表达明显低于正常BEAS-2B细胞。并且,在BEAS-2B-As细胞中,抑制mi R-301a的表达可以显着增强SMAD4的表达,而NKRF的表达无明显变化。同时,通过荧光素酶报告基因,发现共转染pGL3-SMAD4 3’ UTR和miR-301a模拟物的BEAS-2B-As细胞中荧光素酶活性明显降低,同时,SMAD4蛋白表达也明显降低。7.在BEAS-2B-As细胞中,抑制miR-301a的表达并通过shRNA敲低SMAD4的表达,可以促进细胞增殖、迁移并抑制细胞凋亡。在裸鼠异种移植瘤模型中,发现抑制miR-301a的表达能够抑制裸鼠肿瘤的生长。并且,SMAD4在Anti-miR-301a裸鼠肿瘤组织切片中的阳性细胞数明显增多。同时,在裸鼠异种移植瘤模型中,发现抑制mi R-301a和SMAD4的表达能够促进裸鼠肿瘤的生长。通过蛋白质免疫印迹法检测SMAD4、磷酸化STAT3、总STAT3蛋白表达,发现抑制miR-301a的表达能够诱导SMAD4高表达并显着抑制STAT3的激活,而抑制SMAD4的表达能够使STAT3再次被激活。同时,通过抑制BEAS-2B细胞中mmiR-301a的表达,并经三氧化二砷处理,同样发现抑制SMAD4的表达能够促进STAT3的激活。8.通过TCGA数据库获取肺癌临床患者的基因组图谱数据,与正常肺组织样本比较,发现miR-301a在肺腺癌和肺鳞癌组织样本中的表达均明显高于正常组织,而其靶基因SMAD4在肺癌组织样本中的表达则明显低于正常组织。并且,在肺腺癌中,miR-301a与SMAD4呈负相关,而在肺鳞癌中,miR-301a与SMAD4无显着的相关性。9.不同浓度氯化血根碱（0,0.9,1,2,3,4μM）处理NCI-H1688,NCI-H82和NCI-H526细胞24,48,72小时,检测氯化血根碱对小细胞肺癌细胞增殖的影响,发现氯化血根碱能够抑制小细胞肺癌细胞增殖,并具有时间、浓度依赖性。同时,通过克隆形成实验检测氯化血根碱对NCI-H1688细胞克隆形成的影响,发现氯化血根碱能够抑制NCI-H1688细胞克隆形成,并且具有浓度依赖性的抑制作用。不同浓度氯化血根碱（0,0.5,1,1.5μM）处理NCI-H1688细胞24小时,通过流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡情况,发现随着氯化血根碱作用浓度的增加,G1期细胞比例逐渐增加,S期和G2/M期细胞比例逐渐下降,早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例逐渐增加。不同浓度氯化血根碱（0,0.5,1,1.5μM）作用于已做划痕处理的NCI-H1688细胞,观察比较各浓度组0小时和24小时的划痕面积,发现对照组划痕随着时间的增加,划痕逐渐愈合,划痕面积逐渐减小;氯化血根碱处理组（0.5,1,1.5μM）划痕随着氯化血根碱作用浓度的增加,划痕愈合现象逐渐消失,划痕面积变化逐渐不明显。不同浓度氯化血根碱（0,300,400,500nM）处理NCI-H1688细胞24小时,通过transwell小室细胞迁移实验观察穿过transwell小室的细胞数量,发现与对照组比较,氯化血根碱处理组（300,400,500nM）穿过transwell小室的细胞数量明显减少,并且随着氯化血根碱作用浓度的增加,穿过transwell小室的细胞数量逐渐减少。细胞侵袭实验结果与细胞迁移实验结果一致。10.不同浓度氯化血根碱(0,0.5,0.75,1μM处理NCI-H1688和NCI-H82细胞24小时,通过实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测CDKN1A,CDKN1B,CDKN1C和P53表达水平,发现与对照组比较,氯化血根碱处理组（0.5,0.75,1μM）CDKN1A和CDKN1B基因mRNA表达水平上升,并且随着氯化血根碱作用浓度的增加,CDKN1A和CDKN1B的表达量也逐渐增加;而CDKN1C和P53的表达差异不明显。同时,与对照组比较,氯化血根碱处理组（0.5,0.75,1μM）CDKN1A蛋白表达也明显上调,并且随着氯化血根碱作用浓度的增加,CDKN1A的表达量也逐渐增加;CDKN1B蛋白表达量较对照组有所上调,但各浓度间差异不明显;CDKN1C和P53蛋白表达差异不明显。11.在裸鼠异种移植瘤模型中,发现氯化血根碱能够抑制裸鼠肿瘤的生长。同时,CDKN1A在氯化血根碱治疗组裸鼠移植瘤组织切片中的阳性细胞数明显增多。12.通过实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测小细胞肺癌细胞系NCI-H1688,NCI-H82和NCI-H526细胞中CDKN1A的表达（包括mRNA和蛋白水平）明显低于正常细胞。同时,CDKN1A在小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌临床肿瘤组织样本中的表达均明显低于正常组织。并且,抑制CDKN1A的表达可以促进NCI-H1688细胞增殖和克隆形成。13.氯化血根碱与帕比司他联用具有高度协同作用,能够更好的抑制小细胞肺癌细胞系NCI-H1688细胞生长和增殖。0.5μM氯化血根碱、60nM帕比司他及两者联合处理NCI-H1688细胞24小时,通过流式细胞术检测细胞周期分布情况,发现0.5μM氯化血根碱联合60nM帕比司他处理组G1期细胞比例最高。同时,0.5μM氯化血根碱联合60nM帕比司他处理组CDKN1A表达明显上调,而CDKN1B、CDKN1C和P53蛋白表达有所下降。结论:1.筛选得到39个化合物作为潜在的小细胞肺癌抑制物;氯化血根碱不仅能够抑制小细胞肺癌细胞增殖,并且对正常细胞的杀伤力小,是潜在的小细胞肺癌抑制物。2.miR-301a是一种致癌miRNA,氯化血根碱能够抑制miR-301a的表达并抑制BEAS-2B-As细胞增殖。SMAD4是miR-301a的靶基因,miR-301a和SMAD4在三氧化二砷诱导的癌变中,起着重要的作用。并且,激活STAT3/mmiR-301a/SMAD4在三氧化二砷诱导的人肺支气管上皮细胞转化过程中,起着关键的正向调节作用。3.氯化血根碱能够抑制小细胞肺癌细胞生长和增殖,能够抑制细胞周期、运动、迁移和侵袭,以及促进细胞凋亡。同时,氯化血根碱联合帕比司他能够增强抗小细胞肺癌的作用。并且,氯化血根碱通过上调CDKN1A的表达发挥抗小细胞肺癌的作用。
二、基底膜侵袭实验技术对人肺腺癌细胞侵袭能力的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基底膜侵袭实验技术对人肺腺癌细胞侵袭能力的研究（论文提纲范文）
（1）恶性胸膜间皮瘤间皮素表达及磁共振功能和分子靶向成像研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分: 恶性胸膜间皮瘤MSLN表达及其调控迁移、侵袭能力的分子机制 |
| 目的 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分: MSLN靶向磁共振纳米探针的制备及评价 |
| 目的 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分: MPM功能和MSLN分子靶向MRI成像的体内外实验研究 |
| 目的 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 间皮素作为恶性胸膜间皮瘤生物标志物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）IFITM3在肺腺癌中的表达及其对肺腺癌细胞生长和侵袭的调节作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩写及符号说明 |
| 第一部分 IFITM3蛋白在肺腺癌组织及肺腺癌细胞中的表达 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 IFITM3基因对肺癌细胞生物学特性的影响 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 IFITM3基因对MMP及对EMT的影响及机制 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 论文创新点及不足 |
| 综述: 肺癌的基因组及分子生物学标记物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附图表 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的论文及奖励 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文一 |
| 外文论文二 |
（3）硫化氢调控人肺腺癌细胞增殖、迁移及血管生成机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 硫化氢 |
| 1.1.1 硫化氢的生理功能 |
| 1.1.2 硫化氢与肿瘤 |
| 1.1.3 常见硫化氢供体及其治疗潜能 |
| 1.2 肺癌的发病机理 |
| 1.2.1 参与肺癌发生发展的信号通路 |
| 1.2.2 参与肺癌转移的关键因素 |
| 1.2.3 肺肿瘤血管生成 |
| 1.2.4 硫化氢对血管生成的调控 |
| 1.3 缺氧诱导因子1(HIF-1) |
| 1.3.1 HIF-1 蛋白家族 |
| 1.3.2 HIF-1 的转录后调控 |
| 1.3.3 HIF-1 的生物学功能 |
| 1.3.4 硫化氢对HIF-1 的调控 |
| 1.4 立题依据 |
| 第2章 硫化氢合成酶在肺腺癌中的表达水平分析 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 临床样本 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞和组织总RNA提取 |
| 2.2.2 实时定量PCR(qRT-PCR) |
| 2.2.3 Western blot |
| 2.2.4 免疫组化 |
| 2.2.5 H_2S含量检测 |
| 2.2.6 数据处理 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 肺腺癌组织中内源性H_2S的含量 |
| 2.3.2 硫化氢合成酶与肺腺癌临床病理特征的关系 |
| 2.3.3 人肺腺癌细胞中内源性H_2S的含量 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 硫化氢促进肺腺癌增殖、迁移的研究 |
| 3.1 实验材料和仪器 |
| 3.1.1 主要仪器 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞转染 |
| 3.2.2 细胞总RNA提取和qRT-PCR |
| 3.2.3 Western blot |
| 3.2.4 MTT实验 |
| 3.2.5 细胞周期 |
| 3.2.6 细胞凋亡 |
| 3.2.7 Caspase3 活性检测 |
| 3.2.8 划痕实验 |
| 3.2.9 细胞迁移实验 |
| 3.2.10 免疫荧光 |
| 3.2.11 克隆形成 |
| 3.2.12 数据处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 H_2S对肺腺癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.3.2 H_2S对肺腺癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.3.3 CBS或 CSE基因沉默对肺腺癌细胞增殖能力的影响 |
| 3.3.4 CBS或 CSE基因沉默对肺腺癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 硫化氢和缺氧诱导因子正反馈调控的研究 |
| 4.1 实验材料和仪器 |
| 4.1.1 主要仪器 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 qRT-PCR |
| 4.2.2 Western blot |
| 4.2.3 表达载体pcDNA3.0-mut HIF-1α的构建 |
| 4.2.4 质粒扩增和提取 |
| 4.2.5 质粒转染 |
| 4.2.6 免疫荧光 |
| 4.2.7 双荧光素酶报告基因实验 |
| 4.2.8 数据处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 H_2S对 HIF-1 蛋白表达的影响 |
| 4.3.2 NaHS对硫化氢合成酶的影响 |
| 4.3.3 缺氧微环境对H_2S含量的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 硫化氢与缺氧诱导因子协同促进肺腺癌血管生成的研究 |
| 5.1 实验材料和仪器 |
| 5.1.1 细胞株 |
| 5.1.2 实验动物 |
| 5.1.3 主要试剂和仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 qRT-PCR |
| 5.2.2 Western blot |
| 5.2.3 ELISA实验 |
| 5.2.4 MTT实验 |
| 5.2.5 Transwell实验 |
| 5.2.6 小管生成实验 |
| 5.2.7 线粒体膜电位检测 |
| 5.2.8 葡萄糖含量检测 |
| 5.2.9 ATP含量检测 |
| 5.2.10 丙酮酸含量检测 |
| 5.2.11 乳酸含量检测 |
| 5.2.12 乳酸脱氢酶活性检测 |
| 5.2.13 裸鼠成瘤实验 |
| 5.2.14 免疫组化 |
| 5.2.15 TUNEL实验 |
| 5.2.16 苏木素伊红(HE)染色 |
| 5.2.17 数据处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 H_2S对血管生成的影响 |
| 5.3.2 H_2S与 HIF-1α协同促进血管生成 |
| 5.3.3 H_2S对能量代谢的影响 |
| 5.3.4 AOAA和 PAG对裸鼠成瘤的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）MiR-629-5p促进肺腺癌浸润作用发现与双重作用机制探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 肺腺癌概述 |
| 1.1.1 肺腺癌诱发因素 |
| 1.1.2 肺腺癌病理分型 |
| 1.1.3 肺腺癌相关驱动基因 |
| 1.1.4 肺腺癌治疗现状 |
| 1.2 肿瘤浸润与转移 |
| 1.2.1 肿瘤浸润与转移级联 |
| 1.2.2 肿瘤浸润与转移相关信号通路研究进展 |
| 1.3 MICRORNA作用机制及功能研究 |
| 1.3.1 microRNA的生成 |
| 1.3.2 microRNA的表达调控 |
| 1.3.3 microRNA的生物学特性 |
| 1.3.4 microRNA作用模式 |
| 1.3.5 microRNA应用 |
| 1.4 microRNA与肿瘤 |
| 1.4.1 microRNA与肺腺癌转移 |
| 1.5 科学问题与研究意义 |
| 第2章 肺腺癌浸润相关小RNA-MIR-629-5P的发现及功能研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞株和动物 |
| 2.2.2 试剂及试剂盒 |
| 2.2.3 仪器和耗材 |
| 2.2.4 常规试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞转染 |
| 2.3.3 单克隆分选及培养 |
| 2.3.4 miR-629-5p慢病毒稳转株构建 |
| 2.3.5 肿瘤细胞迁移与侵袭实验 |
| 2.3.6 肿瘤细胞划痕实验 |
| 2.3.7 CCK-8细胞增殖检测 |
| 2.3.8 流式细胞周期检测 |
| 2.3.9 miRNA提取,cDNA合成与实时荧光定量PCR |
| 2.3.10 动物实验 |
| 2.3.11 苏木精-伊红染色 |
| 2.3.12 数据统计与分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 TCGA数据库肺腺癌microRNA表达谱分析及体外筛选 |
| 2.4.2 miR-629-5p表达水平与肺腺癌浸润性显着正相关 |
| 2.4.3 内源miR-629-5p在体外增强肺腺癌细胞迁移与侵袭能力 |
| 2.4.4 内源miR-629-5p在体内增强肺腺癌细胞浸润能力 |
| 2.4.5 过表达miR-629-5p在体外增强肺腺癌细胞迁移与侵袭能力 |
| 2.4.6 过表达miR-629-5p在体内增强肺腺癌细胞侵袭能力 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 第3章 MIR-629-5P在肿瘤细胞中促进肺腺癌浸润机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞株 |
| 3.2.2 质粒和菌株 |
| 3.2.3 引物及siRNA |
| 3.2.4 抗体 |
| 3.2.5 试剂及试剂盒 |
| 3.2.6 仪器及耗材 |
| 3.3 常规试剂配制 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 细胞培养 |
| 3.4.2 蛋白银染 |
| 3.4.3 蛋白质谱分析 |
| 3.4.4 mRNA提取,cDNA合成与实时荧光定量PCR |
| 3.4.5 免疫印迹实验 |
| 3.4.6 质粒构建、抽提与瞬时转染 |
| 3.4.7 双荧光素酶报告基因检测 |
| 3.4.8 siRNA干扰实验 |
| 3.4.9 细胞免疫荧光 |
| 3.4.10 组织免疫组化 |
| 3.4.11 数据统计与分析 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 蛋白组学分析miR-629-5p肺腺癌细胞内潜在靶点 |
| 3.5.2 miR-629-5p在肺腺癌细胞中抑制PPWD1表达 |
| 3.5.3 miR-629-5p在肺腺癌细胞中通过作用PPWD1 3'UTR抑制PPWD1表达 |
| 3.5.4 PPWD1敲低增强肺腺癌细胞迁移与侵袭能力 |
| 3.5.5 PPWD1过表达抑制肺腺癌细胞迁移与侵袭能力 |
| 3.5.6 miR-629-5p稳转株中过表达PPWD1抑制miR-629-5p的效应 |
| 3.5.7 PPWD1与miR-629-5p在肺腺癌组织中表达相关性分析 |
| 3.5.8 PPWD1下游机制研究 |
| 3.6 小结与讨论 |
| 第4章 MIR-629-5P在内皮细胞中促进肺腺癌浸润作用及机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞株 |
| 4.2.2 菌株和质粒 |
| 4.2.3 引物及siRNA |
| 4.2.4 抗体 |
| 4.2.5 试剂及试剂盒 |
| 4.2.6 仪器及耗材 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 超速离心法外泌体分离 |
| 4.3.3 外泌体粒径检测 |
| 4.3.4 外泌体电镜样本制作 |
| 4.3.5 RNA抽提,cDNA合成与实时荧光定量PCR |
| 4.3.6 肺腺癌细胞与血管内皮细胞共培养 |
| 4.3.7 单层内皮细胞渗透性实验 |
| 4.3.8 肺腺癌细胞跨内皮细胞侵袭实验 |
| 4.3.9 CRISPR-dcas9转录激活实验 |
| 4.3.10 组织免疫荧光 |
| 4.3.11 数据统计与分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 肺腺癌细胞来源外泌体的分离与鉴定 |
| 4.4.2 肺腺癌细胞来源外泌体miR-629-5p表达与肿瘤浸润性显着正相关 |
| 4.4.3 内皮细胞摄取肺腺癌细胞来源外泌体 |
| 4.4.4 肺腺癌细胞来源外泌体miR-629-5p增加单层内皮细胞渗透性 |
| 4.4.5 肺腺癌细胞来源外泌体miR-629-5p促进肺腺癌细胞跨内皮细胞侵袭 |
| 4.4.6 外源转染miR-629-5p mimics通过增加内皮细胞渗透性促进肺腺癌跨内皮细胞侵袭 |
| 4.4.7 miR-629-5p在内皮细胞中抑制CELSR1表达 |
| 4.4.8 miR-629-5p在内皮细胞中通过作用CELSR1 3'UTR抑制CELSR1表达 |
| 4.4.9 CELSR1敲低增加内皮细胞渗透性 |
| 4.4.10 内皮细胞中激活表达CELSR1抑制miR-629-5p效应 |
| 4.4.11 CELSR1与miR-629-5p在肺腺癌内皮组织中表达相关性分析 |
| 4.5 小结与讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新性要点 |
| 5.2.1 首次发现了miR-629-5p促进肺腺癌浸润的作用 |
| 5.2.2 揭示了miR-629-5p促进肺腺癌浸润的双重作用机制 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）SCRIB低表达成纤维细胞促进肺癌细胞侵袭的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 肿瘤相关成纤维SCRIB表达与肺鳞癌预后呈正相关 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 肺癌细胞下调成纤维细胞SCRIB表达 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 SCRIB低表达成纤维细胞依赖PI3K/AKT通路增强其侵袭能力 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四部分 SCRIB低表达成纤维细胞通过增加ASPORIN促进肺癌细胞侵袭.. |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 SCRIB蛋白调控组织发育和肿瘤形成的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（6）成纤维细胞激动蛋白促进肺腺癌增殖的机理研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 临床组织样本分析FAP在肺腺癌人群中的表达及预后 |
| 一. 前言 |
| 二. 材料与方法 |
| 2.1. 实验仪器和材料 |
| 2.2. 实验技术路线 |
| 2.3. 实验方法 |
| 2.4. 统计学处理 |
| 三. 结果 |
| 3.1. 组织芯片的基本资料 |
| 3.2 FAP在肺腺癌组织样本中的表达及预后情况 |
| 3.3 TCGA数据分析FAP在人腺癌组织中表达及预后情况 |
| 四. 讨论 |
| 五. 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 FAP促进肺腺癌增殖的机理研究 |
| 一. 前言 |
| 二. 材料与方法 |
| 2.1. 实验仪器和材料 |
| 2.2. 实验技术路线 |
| 2.3. 实验方法 |
| 2.4. 统计学分析 |
| 三. 结果 |
| 3.1. 目的基因过表达慢病毒载体结果 |
| 3.2 FAP基因过表达慢病毒感染目的细胞及稳定细胞系的筛选 |
| 3.3 免疫印迹(Western Blot)检测目的细胞株内FAP蛋白的表达情况 |
| 3.4 Cell counting kit-8 (CCK8)检测过表达FAP后各细胞株增殖能力 |
| 3.5. ELISA法检测FAP抑制内源性IFN-β的释放 |
| 3.6. 小鼠细胞及人细胞转录本测序分析 |
| 3.7. PCR及western blot验证下游分子机制 |
| 3.8. 实验用裸鼠照片 |
| 3.9. 裸鼠移植瘤体积及重量数据分析 |
| 3.10. 各组裸鼠体重变化情况 |
| 3.11 裸鼠移植瘤组织的HE染色情况 |
| 3.12 裸鼠肿瘤组织免疫组化染色 |
| 四. 讨论 |
| 五. 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 昆明医科大学医学伦理委员会科研课题伦理审核表 |
| 综述 成纤维细胞激动蛋白在肿瘤微环境中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（7）miR-32靶向ITGA6抑制肺癌生长和转移的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 肺癌研究概况 |
| 2. 上皮间质转化与肺癌进展 |
| 3. 整合素α6β4信号通路在肿瘤生长和转移中的作用及其机制 |
| 4. microRNA与肺癌相关性研究 |
| 5. ITGA6与miRNA |
| 6. miR-32与肿瘤相关性研究 |
| 第一部分 miR-32在非小细胞肺癌患者中的表达及其临床意义研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 miR-32对非小细胞肺癌生物学行为的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 ITGA6作为miR-32直接靶基因的研究及其在非小细胞肺癌生长和转移中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 过表达miR-32抑制非小细胞肺癌生长和转移体内实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第五部分 miR-32靶向ITGA6抑制非小细胞肺癌生长和转移机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 MicroRNA与肺癌相关研究最新进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）siRNA沉默Notch1基因表达对肺癌细胞SPC-A-1BM侵袭性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1 细胞株 |
| 2 实验仪器 |
| 3 实验试剂 |
| 4 细胞培养 |
| 5 细胞转染与分组 |
| 6 实时荧光定量PCR(RT- PCR) |
| 6.1 RNA的提取 |
| 6.2 逆转录反应 |
| 6.3 引物的设计与合成 |
| 6.4 实时荧光定量PCR |
| 6.5 定量结果分析 |
| 7 Western Blot |
| 7.1 蛋白提取 |
| 7.2 蛋白浓度测定(BCA法) |
| 7.3 蛋白变性 |
| 7.4 电泳 |
| 8 Transwell实验检测细胞侵袭性变化 |
| 9 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1.Notch1在16HBE和 SPC-A-1BM细胞中mRNA的相对表达量分析 |
| 2.siRNA沉默Notch1 基因对SPC-A-1BM细胞中Notch1 mRNA及蛋白相对表达量的影响 |
| 3.siRNA沉默Notch1 基因对SPC-A-1BM细胞侵袭性的影响 |
| 4.siRNA沉默Notch1 基因对SPC-A-1BM细胞中MMP-9 mRNA及蛋白相对表达量的影响 |
| 讨论 |
| 实验结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
（9）下调雌激素受体β对肺腺癌细胞生物学行为的影响及初步机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 雌激素受体β在肺腺癌组织和细胞中的表达 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 下调雌激素受β对肺腺癌细胞A549 生物学功能的影响及机制探讨 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 下调雌激素受体β对小鼠肺转移瘤形成的影响 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）氯化血根碱抗小细胞肺癌及三氧化二砷诱导BEAS-2B细胞恶性转化的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 小细胞肺癌靶向治疗的研究进展 |
| 1.1 小细胞肺癌总论 |
| 1.2 小细胞肺癌的临床治疗 |
| 1.2.1 新药研发 |
| 1.2.2 维持治疗 |
| 1.2.3 靶向治疗 |
| 1.3 小细胞肺癌的潜在治疗靶点 |
| 1.4 天然产物化合物 |
| 第二章 对NCI-H1688细胞进行天然产物化合物筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CCK-8法检测640个化合物对NCI-H1688细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 氯化血根碱对小细胞肺癌细胞和正常细胞生长的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 筛选得到39个化合物作为潜在的小细胞肺癌抑制物 |
| 2.4.2 筛选得到氯化血根碱作为潜在的小细胞肺癌抑制物 |
| 第三章 氯化血根碱抑制三氧化二砷诱导转化的BEAS-2B细胞增殖及三氧化二砷诱导人肺支气管上皮细胞恶性转化的作用机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 氯化血根碱对BEAS-2B-As细胞生长和增殖的影响 |
| 3.3.2 三氧化二砷能够诱导mi R-301a的表达 |
| 3.3.3 三氧化二砷通过IL-6/STAT3信号通路诱导miR-301a的表达 |
| 3.3.4 miR-301a对BEAS-2B-As细胞生长、增殖、迁移和凋亡的影响 |
| 3.3.5 miR-301a与SMAD4靶向调控关系的验证 |
| 3.3.6 SMAD4对BEAS-2B-As细胞恶性特征的影响 |
| 3.3.7 miR-301a与SMAD4对肿瘤生长的影响 |
| 3.3.8 miR-301a与SMAD4在肺癌组织中的相关性 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 氯化血根碱抗小细胞肺癌作用及联合帕比司他抑制增殖的作用机制 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 氯化血根碱对小细胞肺癌细胞生长和增殖的影响 |
| 4.3.2 氯化血根碱对小细胞肺癌细胞周期、凋亡、运动、迁移和侵袭的影响 |
| 4.3.3 RNA-Seq分析氯化血根碱抗小细胞肺癌的分子机制 |
| 4.3.4 氯化血根碱对小细胞肺癌裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 4.3.5 CDKN1A对小细胞肺癌生长的影响 |
| 4.3.6 CDKN1A在肺癌组织中的表达 |
| 4.3.7 氯化血根碱联合帕比司他对小细胞肺癌细胞生长和增殖的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 统计学审核证明 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 详细摘要 |
四、基底膜侵袭实验技术对人肺腺癌细胞侵袭能力的研究（论文参考文献）
- [1]恶性胸膜间皮瘤间皮素表达及磁共振功能和分子靶向成像研究[D]. 黄益龙. 昆明医科大学, 2021
- [2]IFITM3在肺腺癌中的表达及其对肺腺癌细胞生长和侵袭的调节作用[D]. 张冬. 山东大学, 2020(04)
- [3]硫化氢调控人肺腺癌细胞增殖、迁移及血管生成机制的研究[D]. 王明琦. 吉林大学, 2020(08)
- [4]MiR-629-5p促进肺腺癌浸润作用发现与双重作用机制探究[D]. 李煜. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2020(07)
- [5]SCRIB低表达成纤维细胞促进肺癌细胞侵袭的机制研究[D]. 王圆. 郑州大学, 2020(02)
- [6]成纤维细胞激动蛋白促进肺腺癌增殖的机理研究[D]. 石剑林. 昆明医科大学, 2020(02)
- [7]miR-32靶向ITGA6抑制肺癌生长和转移的作用及机制研究[D]. 陈艳. 昆明医科大学, 2019
- [8]siRNA沉默Notch1基因表达对肺癌细胞SPC-A-1BM侵袭性的影响[D]. 王浩铭. 青岛大学, 2019(02)
- [9]下调雌激素受体β对肺腺癌细胞生物学行为的影响及初步机制研究[D]. 陈文娟. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [10]氯化血根碱抗小细胞肺癌及三氧化二砷诱导BEAS-2B细胞恶性转化的作用机制研究[D]. 钟名天. 广州中医药大学, 2019(03)