一、重组日本血吸虫副肌球蛋白诱导水牛保护性免疫的研究（论文文献综述）
黄莉妮[1]（2012）在《日本血吸虫磷酸甘油酸激酶SjPGK基因的克隆表达及生物学特性的初步探索》文中指出血吸虫病（schistosomiasis）是由血吸虫感染引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。目前,以化学药物吡喹酮对血吸虫病进行治疗是血吸虫病防控采用的最主要措施,但吡喹酮不能避免重复感染,且近年来曼氏血吸虫已有吡喹酮抗性虫株的报道。因此,加强血吸虫病疫苗候选分子的筛选和疫苗的研制开发将是血吸虫病防治的重大需求。糖酵解途径是血吸虫能量代谢最重要途径之一。磷酸甘油酸激酶（PGK）是糖酵解途径的关键酶,该酶的缺乏可引起生物体代谢等功能的紊乱。作者从大鼠、小鼠来源10d童虫差异表达基因以及日本血吸虫体被表膜蛋白的研究基础上,选择SjPGK基因开展了以下研究：1日本血吸虫磷酸甘油酸激酶SjPGK的克隆和表达分析克隆了日本血吸虫SjPGK基因,生物信息学分析表明该基因全长1398bp,其中ORF为1251bp,编码416个氨基酸,理论分子量为44382.21Daltons,理论等电点为6.57, SjPGK和SmPGK氨基酸序列的相似性为94%。以看家基因Tublin为内参,应用荧光实时定量PCR技术分析了SjPGK基因在日本血吸虫7d、14d、21d、28d、35d虫体和42d雌雄虫体内的表达情况,结果表明,SjPGK基因在日本血吸虫虫体的各个阶段均有转录,其中在21d虫体内表达量最高,雄虫的表达量明显高于雌虫,在血吸虫适应性宿主小鼠来源的虫体中表达量高于非适应性宿主大鼠来源虫体。成功构建了pET-28a-SjPGK重组原核表达质粒,通过优化表达条件使重组蛋白在E.coli（DE3）中呈可溶性表达,分子量为44KDa, Western blotting分析表明该重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。2日本血吸虫重组蛋白pET-28a-SjPGK酶学活性研究日本血吸虫SjPGK重组蛋白以1,3-二磷酸甘油酸和ATP为底物,与3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联,通过检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的吸光度来检测重组蛋白酶活力。酶动力学研究表明重组蛋白的比活力为125U/mg,相对于底物3-PGA的米氏常数Km值为2.69mmol/L,相对于底物ATP的米氏常数Km值为1.51mmol/L,当pH在8-9之间,温度在30-35℃之间,该重组蛋白酶活性最高。3小鼠免疫保护试验及SjPGK蛋白的组织定位用纯化的pET-28a-SjPGK重组蛋白与206佐剂结合免疫BALB/c小鼠,与对照组相比,免疫小鼠获得了34.5%的减虫率（P<0.05）和32.2%的减卵率（P>0.05）。用ELISA方法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平及IgG1和IgG2a抗体亚型的变化,结果表明,在第一次免疫后抗重组蛋白特异性IgG. IgGl和IgG2a抗体迅速产生且一直维持在一个较高的水平。这可能与重组蛋白在小鼠体内诱导部分免疫保护作用有关。利用荧光免疫技术观察SjPGK蛋白在日本血吸虫7d、21d、28d、35d虫体及42d雌雄中的表达定位,结果显示,PGK蛋白在日本血吸虫的各个虫体均有表达,主要分布在体被表膜上。提取日本血吸虫42d虫体体被表膜蛋白,Western blotting结果显示,在44KD处呈现一阳性反应条带,证实SjPGK蛋白大量存在血吸虫的体被表膜中。本研究为深入研究SjPGK基因的生物学功能奠定了基础,为筛选新的血吸虫病疫苗候选分子提供了新思路。
罗四维,周秦[2]（2011）在《血吸虫疫苗的研究进展》文中认为血吸虫病是一种严重危害人民身体健康的人畜共患寄生虫病,当前,血吸虫疫苗的研究仍是世界性难题,迄今为止,还没有一种理想的疫苗可用于免疫预防以阻断血吸虫病的传播。近年来随着生物化学、分子生物学、免疫学等学科的飞速发展,人们对血吸虫疫苗的研究工作也取得了很大的进展,目前各国研究的焦点主要集中在疫苗候选分子方面。对近年来有前途的几种血吸虫疫苗的研究进展予以综述。
汪礼文[3]（2011）在《pcDNA3.1（+）-SjP14和SjGST真核表达载体的构建、鉴定及其保护作用研究》文中研究指明目的:构建pcDNA3.1+-SjP14及SjGST真核表达载体,并利用重组质粒免疫小鼠,探讨其对小鼠血吸虫感染的保护作用。方法:1. pcDNA3.1+-SjP14及SjGST真核表达载体的构建和鉴定:从日本血吸虫成虫中提取总RNA,逆转录生成cDNA,以其为模板扩增出SjP14和SjGST编码基因,将扩增产物克隆入真核表达载体pcDNA3.1+,用双酶切鉴定质粒构建成功与否。该重组质粒转染Hela细胞,RT-PCR和Western blotting检测其体外表达,以验证其能表达出重组蛋白。2. DNA疫苗的制备及保护作用研究:制备无内毒素DNA疫苗,用于免疫小鼠。将雌性BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只,生理盐水组给予100μl/鼠/次;空质粒组100μg/鼠/次;pcDNA3.1+-SjP14组,给予100μg/鼠/次;pcDNA3.1+-SjP14+ pcDNA3.1+-SjGST组分别给予100μg/鼠/次,每2周免疫一次,共3次。末次免疫后2周,经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴（30±1）条/鼠。尾蚴攻击6周后用颈稚脱臼法处死小鼠,收集成虫,计算减虫率;同时留取肝脏,部分消化后在显微镜下行虫卵计数,计算减卵率,部分肝脏用于组织病理学分析（HE染色法）,观察肝细胞变化及肉芽肿情况。结果:本实验从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出两个DNA片段（SjP14和SjGST基因）,大小分别约1070bp和670bp,并成功地将其克隆入pcDNA3.1+载体;将重组质粒pcDNA3.1+-SjP14和pcDNA3.1+-SjGST进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,分别得到一个大小与PCR扩增产物一致的片段;测序证实均具有完整开放读码框,且为无突变。纯化上述质粒,转染至Hela细胞,经新霉素筛选得出阳性单克隆细胞株,扩大培养。RT-PCR和Western blotting结果显示,两种质粒转染至Hela细胞内均可表达。分别制备无内毒素SjP14和SjGST核酸疫苗,以该疫苗免疫BALB/c小鼠,结果表明:pcDNA3.1+-Sj P14核酸疫苗能明显提高小鼠的抗血吸虫感染能力,减虫率和减卵率分别达到44.6%和61.6%;SjP14核酸疫苗与SjGST核酸疫苗联合免疫能进一步提高小鼠抗血吸虫感染作用,减虫率和减卵率分别提高至56.2%和73.5%。大体解剖可见,生理盐水和空质粒组肝脏呈暗褐色,质硬,表面可见弥漫性粟粒样虫卵结节分布,结节隆起密集,体积较大。pcDNA3.1+-SjP14组小鼠肝脏色泽略带暗红色,质地较软,表面较光滑,隐约可见少量灰白色小点,虫卵结节较少;SjP14+SjGST核酸疫苗联用组,肝脏颜色呈鲜红色,表面光滑,虫卵结节少,质软。肝组织切片镜下显示,生理盐水和空质粒组小鼠肝组织中可见大量的虫卵肉芽肿形成,肉芽肿体积较大,周围有大量炎细胞浸润,大量的肝细胞变性坏死,pcDNA3.1+-SjP14组肝脏病变较生理盐水组明显减轻,pcDNA3.1+-SjP14 + pcDNA3.1+-SjGST组肝脏损伤程度最轻,肝小叶结构基本完整,虫卵肉芽肿周围炎症反应轻,肉芽肿面积较小。结论:本研究成功地构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1+-SjP14和pcDNA3.1+-SjGST,且均可在体内外表达,pcDNA3.1+-Sj P14核酸疫苗有一定程度的抗血吸虫感染作用, pcDNA3.1+-SjP14与pcDNA3.1+-SjGST疫苗联合免疫能增强小鼠对血吸虫感染的保。
朱珠[4]（2010）在《日本血吸虫重组表膜蛋白LHD-Sj23和SjTSP2免疫保护机制的初步研究》文中研究指明日本血吸虫病（Schistosomiasis japonicium）是一种严重危害人、畜健康,影响社会和经济发展的人、畜共患寄生虫病。上世纪50年代以来,我国血吸虫病防治工作取得了举世瞩目的成就,但由于钉螺孳生环境难以得到根本改变,药物灭螺效果难以持久和巩固,并可能造成生态环境污染；长期使用吡喹酮进行扩大化疗,有产生耐药性的危险。作为灭螺、药物防治和其他综合防治措施的重要补充：血吸虫病疫苗的研究就显得十分必要。迄今研制的一些日本血吸虫疫苗保护效果还不够理想,探讨疫苗候选分子的免疫保护机制,筛选理想的免疫佐剂是提高疫苗保护效果的有效途径之一。本文以BALB/c小鼠作为实验动物模型,应用两种纯化的日本血吸虫重组表膜蛋白LHD-Sj23和SjTSP2与3种佐剂（弗氏佐剂、ISA206佐剂、ISA70M佐剂）配伍免疫小鼠,3次免疫后,各组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40±2条,感染6周后,经肝门静脉灌注法收集成虫,检测每克肝脏虫卵数,计算减虫率和肝脏减卵率。初步试验结果显示重组抗原LHD-Sj23结合三种佐剂免疫小鼠后都诱导了较高的免疫保护效果。重组抗原SjTSP2的免疫保护效果与使用的佐剂有关,其中ISA206佐剂组获得的保护效果最高,弗氏佐剂组次之,ISA70M佐剂组没有保护作用。为探讨这两种重组抗原诱导产生的免疫保护机制,本文通过流式细胞术检测了3次免疫后1周的小鼠的CD4+、CD8+细胞,及IL2、IL4、IL10、IFNγ等细胞因子的变化情况。通过ELISA方法检测免疫前、第3次免疫小鼠1周后以及尾蚴攻击6周后血清中的特异性抗体IgG及其亚型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3,和IgE、IgA、IgM的变化情况。初步实验结果显示,与空白对照组相比,免疫组小鼠CD4+、CD8+细胞的数值以及CD4+/CD8+比值,细胞因子IL2、IL4、IL10、IFNy水平都有不同程度的变化,免疫组的小鼠机体诱导产生了Th1/Th2型混合的细胞免疫反应,其中Thl型免疫应答占优势地位。同时,免疫组小鼠诱导产生了较为强烈的体液免疫应答,抗体水平明显上升的类型有IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3,显示体液免疫应答可能在小鼠抵抗血吸虫感染过程中也发挥了重要作用。本实验结果表明重组抗原LHD-Sj23和SjTSP2诱导的免疫保护效果是细胞免疫和体液免疫共同作用的结果。本文为深入探讨这两种抗日本血吸虫病候选疫苗的免疫机制提供了有一定价值的实验数据。
王艳[5]（2010）在《日本血吸虫新基因SjNANOS和SjMSP的克隆、表达及其生物学功能初步分析》文中认为血吸虫病（schistosomiasis）是一种危害严重、分布广泛的人畜共患病。半个多世纪以来,我国血吸虫病防治取得了举世瞩目的成就,但由于重复感染严重,单靠治疗药物不能控制血吸虫病的流行,加强血吸虫病疫苗候选分子的筛选和疫苗的研制开发无疑是血吸虫病防治的重要举措。血吸虫是吸虫中少见的雌雄异体虫体,雌雄合抱是雌虫发育成熟的前提。分离、鉴定与血吸虫性别分化、发育相关的分子,对探讨血吸虫的性别发育及成熟机制,筛选新的抗血吸虫疫苗候选分子都具有重要意义。作者从本实验室构建的7天童虫消减cDNA文库中,挑选两个童虫高表达EST序列,开展以下研究:1、新基因SjNANOS和SjMSP的克隆及在不同发育阶段虫体的表达分析。由获得的EST序列作为询问序列设计特异引物进行PCR扩增,克隆这两个基因的全长cDNA。通过BLAST比对,这两个基因核苷酸序列与日本血吸虫其他已知基因无显着同源性,为日本血吸虫的新基因。氨基酸序列比较发现其中一基因编码蛋白与曼氏血吸虫NANOS蛋白（登录号ref|XP002576493）有67%同源性,命名为SjNANOS,另一蛋白与曼氏血吸虫MSP蛋白（登录号ref|XP002574028.1）有79%的同源性,命名为SjMSP。SjNANOS（GenBank登录号为AY814948）序列长721bp,其中ORF大小为525bp,编码175个氨基酸,理论分子量为19.9道尔顿。SjMSP序列（GenBank的登录号为AY814293）全长为1716bp,其中ORF为1065bp,编码354个氨基酸,理论分子量为39553.92道尔顿。以看家基因NADH为内参,应用荧光定量PCR技术分析了SjNANOS和SjMSP基因在日本血吸虫7d、13d、18d、23d、32d和42d雌雄虫体内的表达情况,结果显示,SjNANOS和SjMSP在日本血吸虫童虫和成虫均有表达,其中都在18d童虫表达量最高,同时SjNANOS在雌虫的表达量高于雄虫,SjMSP在雄虫的表达量高于雌虫,提示这两个基因可能在血吸虫性别分化、发育中发挥了作用。2、SjNANOS和SJMSP的表达及动物保护试验。成功构建了pET28a（+）-SjNANOS和pET28a（+）-SjMSP重组原核表达质粒,两种重组蛋白都在E.coli（DE3）中以包涵体形式表达,分子量分别为21kD和42kD,Western blotting分析表明融合蛋白具有较好的抗原性。用纯化的SjNANOS/HIS和SjMSP/HIS重组蛋白免疫BALB/c小鼠,结果与空白对照组相比,重组蛋白SjNANOS/HIS在小鼠中分别诱导了31.4%的减虫率和53.8%的肝脏减卵率,差异极显着（p<0.01）。重组蛋白SjMSP/HIS诱导了24.8%的减虫率和20%的肝脏减卵率,差异显着（p<0.05）。应用ELISA方法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平变化,结果SjNANOS和SjMSP重组蛋白免疫组小鼠在3次免疫后均诱导产生了高水平的特异性IgG抗体,推测重组蛋白SjNANOS和SjMSP在小鼠中诱导产生的免疫保护作用可能与免疫小鼠血清中高滴度的特异性IgG抗体有关。3、RNA干扰NANOS基因表达的研究。利用RNAi技术对SjNANOS基因表达进行了初步探索,根据日本血吸虫NANOS基因序列设计3对特异性dsRNA分子S144、S323和S396,并分别以不同的剂量（2.0μg和20μg）加入到培养体系中干扰靶基因的表达。利用Real-time PCR、Western bloting等技术检测SjNANOS基因的转录,其中以S323的干扰效果最好,在培养6天时抑制率可高达88%。比较了不同的转染方式对靶基因表达的干扰效果,结果证明电击法的效果略优于浸泡法。分析了S323 dsRNA分子干扰NANOS基因的剂量效应,结果表明,dsRNA分子干扰目标基因的表达具有剂量依赖性,培养3天时,加入最高剂量（40μg）dsRAN分子可使转录水平降低84%。采用尾静脉注射技术将dsRNA分子导入到血吸虫感染的BALB/c小鼠体内,结果表明在动物体内SjNANOS基因的转录和表达也受到明显抑制。体内外干扰试验还表明,当SjNANOS的转录和表达受到抑制时,血吸虫的发育与合抱均受到影响,暗示该基因在血吸虫的生长发育中可能具有重要作用。本文首次克隆和表达了两个日本血吸虫新基因SjNANOS和SjMSP。小鼠免疫试验表明这两种基因重组抗原都可诱导部分免疫保护作用。体内外RNAi试验表明当SjNANOS基因的表达受抑制时,血吸虫的发育与合抱均受到影响。本文研究结果为深入探讨SjNANOS和SjMSP的生物学功能,筛选新的血吸虫病疫苗候选分子和药物靶标提供了基础。
高冬梅[6]（2010）在《SIEA26-28 ku-scFv抗日本血吸虫病治疗性疫苗的免疫靶向作用及其效果的研究》文中提出研究背景日本血吸虫病（Schistosomiasis japonica）是一种危害严重的人兽共患寄生虫病,它严重危害了疫区群众身体健康并影响了社会经济的发展。迄今为止,我国开展了半个多世纪的血吸虫病防治工作,并取得了举世瞩目的成绩。但由于日本血吸虫病流行的影响因素复杂,目前仍然是我国湖南、湖北、江西、安徽、江苏湖区5省和山区2省主要公共卫生问题之一。近年来,采取的以控制传染源为主的综合防治策略,虽然在疫情控制地区已经显示出了较好的防治效果,但仍未脱离以传播生态学为原理的思维模式。防治实践表明,依据疾病传播生态学原理设计的综合防治措施固然有效,但效果难以持久巩固,容易受到自然生态环境及防治投入力度变化的挑战。鉴于疫苗在预防、控制许多传染病中已证明其巨大的作用,因此,研制抗血吸虫病疫苗,弥补常规药物化疗短期效果的不足,发挥疫苗接种诱导的长期免疫预防效果,通过二者的双重效益来实现对血吸虫病长期控制效果,是近20-30年来我国乃至世界各国有关科学家共同的奋斗目标之一,也正是WHO/TDR自上个世纪80年代以来在世界范围内为协调血吸虫病疫苗研制所做努力的初衷。成熟虫卵是血吸虫病致病的主要因素和传播的唯一因子。因此,本室血吸虫病疫苗的研究主要集中于抗雌虫生殖、抗卵抗病免疫方面。近十年来,本课题组的研究结果已经证明了未成熟虫卵可溶性抗原（Soluble immatured egg antigen, SIEA）免疫可诱导动物机体产生抗虫卵胚胎发育和抗雌虫生殖产卵的效果,SIEA诱导产生的体液免疫应答,在抗血吸虫病保护性免疫中起着重要作用。抗SIEA免疫血清能够与虫卵内胚胎结合,抑制和干扰虫卵胚胎的发育；还能与雌虫卵黄腺及肠腔内膜组织结合,降低雌虫的生殖产卵功能。进一步的研究发现SIEA中26-28 ku分子抗原是诱导抗病保护性体液免疫应答中的主要效应分子之一。课题组前期应用噬菌体展示技术成功构建了日本血吸虫未成熟卵单链抗体库,获得了针对SIEA26-28 ku的特异性单链抗体（single chain antibody, scFv）,为日本血吸虫治疗性疫苗的研制打下了基础。研究目的大量表达SIEA26-28 ku-scFv和EGFP-scFv,通过柱层析法纯化蛋白,研究其抗体特异性以及靶向免疫作用效果；并将SIEA26-28 ku-scFv与DNA双价疫苗及其对应的蛋白疫苗联合使用,观察其抗病免疫的保护效果及其免疫效应机制。研究方法1、大量表达并纯化SIEA26-28 ku-scFv和EGFP-scFv,并测定其抗体特异性。大量培养带有pET32a/SIEA26-28 ku-scFv质粒和pET32a/EGFP-scFv的BL21（DE3）大肠杆菌,IPTG诱导SIEA26-28 ku-scFv和EGFP-scFv表达。用两步纯化法纯化目的蛋白。将纯化蛋白进行SDS-PAGE（或HPLC）纯度检测、Western blot鉴定、蛋白浓度测定,采用非竞争酶免疫法测定纯化后单链抗体的亲和常数。2、特异性SIEA26-28 ku单链抗体的靶向定位应用酶免疫组织化学法、间接免疫荧光法,观测特异性SIEA26-28ku单链抗体针对血吸虫雌虫及虫卵抗原的靶向定位情况。3、特异性SIEA26-28 ku单链抗体作为治疗性抗体及与疫苗联合免疫小鼠保护性效果的观察。4、特异性SIEA26-28 ku单链抗体作为治疗性疫苗联合免疫牲猪的抗病效果及其效应机制的研究。研究结果1、以pET32a质粒作为载体,构建了可溶性表达SIEA26-28 ku-scFv的工程菌株,通过Ni2+螯合亲和层析法再结合DEAE阴离子交换层析,两步纯化即可得到纯度达到98.2%的单链抗体,通过Western blot和ELISA检测证明单链抗体与日本血吸虫SIEA抗原具有高度特异性。2、SIEA26-28 ku-scFv与血吸虫未成熟虫卵、成熟虫卵及雌虫生殖系统特异性结合,结合部位主要在虫卵卵胚、雌虫卵黄腺、卵巢、子宫内卵及与生殖系统邻近的肠壁内膜。与正常人肝组织蛋白、正常鼠肝组织蛋白无交叉反应。3、SIEA26-28 ku-scFv治疗性抗体对昆明小鼠免疫保护效果：该单链抗体与DNA疫苗联用时可显着提高小鼠抗血吸虫病的免疫保护性作用,小鼠血清滴度达到1：6400,减虫率达61.4%、肝减卵率为51.2%、肠减卵率为56.6%、每雌子宫虫卵数降低54.2%,所有数值均较其它单一疫苗组高,而且肝脏血吸虫虫卵肉芽肿直径和面积均较其它单一疫苗组低。4、SIEA26-28 ku-scFv与疫苗联合应用时可明显升高猪外周血和脾细胞CD4+T细胞数和CD4+／CD8+比值,促进机体IFN-γ表达,对IL-4表达影响不明显。实验中发现,该单链抗体的单一使用虽可对感染后的猪起到一定的抗病效果,但其效果不及联合免疫组。结论1、成功构建了可溶性表达SIEA26-28 ku-scFv的工程菌株,并纯化目的蛋白。纯化后蛋白纯度高达98.2%。2、SIEA26-28 ku-scFv与血吸虫未成熟卵具有高度靶向特异性,与血吸虫结合部位主要在虫卵卵胚、雌虫卵黄腺、卵巢、子宫内卵及与生殖系统邻近的肠壁内膜。3、小鼠和猪实验表明,SIEA26-28 ku-scFv与疫苗联用可明显提高单一分子疫苗的免疫保护效果。其作用机制可能是通过其特异性的靶向作用而产生抗病效果。4、SIEA26-28 ku-scFv可明显升高猪血和脾细胞CD4+T细胞数和CD4+／CD8+比值,促进机体IFN-γ表达,对IL-4表达影响不明显,促进机体主要产生以Th1型优势为主的免疫应答。5、SIEA26-28 ku-scFv具有明显的免疫靶向效果,将其靶向作用与疫苗联合应用,可显着提高血吸虫病疫苗的抗病免疫效果。同时,抗血吸虫病疫苗与AHFP药物的联用同样具显着的抗病效果。
李晔[7]（2010）在《抗日本血吸虫病二价多表位疫苗研究》文中指出日本血吸虫病（Schistosomiasis japonicium）是一种严重危害人、畜健康,影响社会和经济发展的人、畜共患寄生虫病。近年来我国血吸虫病防治工作取得了一定的成绩,但在两湖地区血吸虫病流行仍较严重。由于钉螺孳生环境没有改变,灭螺效果难以持久和巩固,并可能造成生态环境污染;长期使用吡喹酮进行扩大化疗,有产生耐药性的危险。作为灭螺、药物防治和其他综合防治措施的重要补充,血吸虫病疫苗的研究就显得十分必要。迄今研制的一些日本血吸虫亚单位基因工程疫苗保护效果还不够理想,多价多表位疫苗是探索提高疫苗保护效果的有效途径之一。本论文应用基因工程技术研制了日本血吸虫表膜蛋白二价多表位重组抗原疫苗,通过小鼠日本血吸虫病免疫保护试验评估疫苗所诱导的免疫保护效果,以期找出具有较好保护力的抗日本血吸虫病疫苗。应用荧光实时定量PCR分析Sj23和Sj-Tsp2基因在血吸虫童虫和成虫的表达情况,并利用生物信息学技术分析其抗原性和亲水性等特性,PCR扩增Sj23（EC1）、Sj23（EC2）、Sj-Tsp2（EC2）具有较高抗原性多表位的DNA片段,构建pET32a（+）-Sj23（EC1-EC2）和pET32a（+）-Sj-Tsp2（EC2）-Sj23（EC2）原核表达质粒,转化E.coli BL21（DE3）并用IPTG诱导表达融合蛋白,His柱亲和层析法纯化重组蛋白。蛋白印迹法（western blotting）分析该重组蛋白的免疫原性。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠4次后,各组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40±2条,感染6周后,经肝门静脉灌注法收集成虫和检测每克肝脏虫卵数,计算减虫率和肝脏减卵率。各组小鼠分别于免疫前、各次免疫后1周和剖杀时收集血清,ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平;荧光实时定量PCR技术分析目的基因在免疫后的转录变化水平。荧光实时定量PCR结果显示,Sj23和Sj-Tsp2基因在日本血吸虫各个时期都有转录,且在童虫期转录较高;免疫pET32a（+）-Sj-Tsp2（EC2）-Sj23（EC2）蛋白组收集的虫体为模板,与PBS空白组虫体的模板相比,Sj23和Sj-Tsp2基因在血吸虫转录都明显下降了,同时pET32a（+）-Sj23（EC1-EC2）组Sj23和Sj-Tsp2基因的转录也下降。构建的重组蛋白pET32a（+）-Sj23（EC1-EC2）和pET32a（+）-Sj-Tsp2（EC2）-Sj23（EC2）相对分子质量（Mr）分别为32.08kDa和37.5kDa。western blotting分析结果表明,该重组蛋白具有良好的抗原性。小鼠免疫保护试验结果显示: pET32a（+）-Sj23（EC2）组, pET32a（+）-Sj23（EC1-EC2）组和pET32a（+）-Sj-Tsp2（EC2）-Sj23（EC2）组分别获得27.66%,33.47%和41.66%减虫率和35.87%,55.31%和41.16%肝脏减卵率,与空白组相比都有显着差异（P<0.05）。间接ELISA试验结果表明,用重组蛋白免疫后小鼠血清特异性抗体都显着升高。本文在分析Sj23和Sj-Tsp2表达时相和生物信息学分析其特性的基础上,成功构建了2个日本血吸虫表膜蛋白的二价多表位疫苗,在大肠杆菌中成功表达并纯化得到具有较高抗原性的重组蛋白,在实验动物中诱导了显着的免疫保护效果,免疫机制研究表明疫苗的保护作用可能和其免疫诱导的高水平的抗体和转录下降有关。本文为抗日本血吸虫病多价多表位疫苗的研制成功探索了方法,结果证明具有潜在的应用价值。
王敏,李文桂[8]（2010）在《日本血吸虫Sj97疫苗研究进展》文中进行了进一步梳理日本血吸虫疫苗研制已作为我国防治该病的重要组成部分。副肌球蛋白是WHO提出的血吸虫疫苗较为理想的候选抗原之一,已用于日本血吸虫疫苗的研究。本文主要对日本血吸虫副肌球蛋白的概况、重组蛋白疫苗和DNA疫苗研究进展进行综述。
汪世平,陈秀春,高冬梅[9]（2009）在《我国血吸虫疫苗研究进展及应用前景》文中进行了进一步梳理血吸虫病疫苗研究一直是WHO/TDR热带病防治和我国血防研究的热点内容,近年来我国有关血吸虫病疫苗的研究取得了重要进展。随着蛋白质组学和分子生物学技术的发展,我国血吸虫病疫苗研究已发展到基因工程疫苗研制阶段。其中DNA疫苗已成为当前我国血吸虫病疫苗研究的主流方向。同时,新的有效疫苗抗原分子的筛选鉴定及其配伍与优化,混合疫苗、多价疫苗的构建及其与佐剂的联用,为提高疫苗免疫保护效果提供了新的途径。
童晶晶,沈际佳[10]（2009）在《血吸虫副肌球蛋白疫苗的研究进展》文中研究说明 血吸虫病（schiscosomiasis）广泛流行于亚非、南美等76个国家和地区。目前,全球约2亿人受感染。6亿人受感染威胁。近50年来我国在血吸虫病防治工作上取得了巨大成就。全国血吸虫发病率从解放前的0.81/10万下降至2007年的0.06/10万。但近几年钉螺感染率下降不明显或有反复,可能与水利工程设施的建设、洪水、气候变化等有关。农民和渔、船民感染率仍较高。目前治疗血吸虫病的常用药物为吡喹酮,另外还有环孢菌素A,青蒿素及其衍生物如蒿甲醚、
二、重组日本血吸虫副肌球蛋白诱导水牛保护性免疫的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组日本血吸虫副肌球蛋白诱导水牛保护性免疫的研究（论文提纲范文）
（1）日本血吸虫磷酸甘油酸激酶SjPGK基因的克隆表达及生物学特性的初步探索（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 第一篇 绪论 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 血吸虫病疫苗的研制 |
| 1.1 血吸虫疫苗研制的必要性和可行性 |
| 1.2 血吸虫病疫苗研究进展 |
| 2 血吸虫病疫苗研究的前景展望 |
| 2.1 疫苗研究面临的问题 |
| 2.2 展望 |
| 3 血吸虫体被的功能 |
| 4 磷酸甘油酸激酶的研究 |
| 4.1 糖酵解途径 |
| 4.2 磷酸甘油酸激酶的研究进展 |
| 5 结语 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第二章 日本血吸虫SJPGK基因的克隆和表达 |
| 摘要 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 SjPGK基因生物信息学分析 |
| 2.2 SjPGK基因克隆 |
| 2.3 SjPGK在不同时期虫体的表达分析 |
| 2.4 SjPGK在不同宿主来源虫体内的表达分析 |
| 2.5 SjPGK基因的表达与纯化 |
| 2.6 pET-28a(+)-SjPGK重组蛋白抗原性和免疫原性的鉴定 |
| 2.7 SjPGK蛋白在不同时期虫体内的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 日本血吸虫重组蛋白PET-28A(+)-SJPGK酶学活性研究 |
| 摘要 |
| 1 试验材料和试验方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组蛋白rSjPGK酶活性的测定 |
| 2.2 pH值对rSjPGK活性的影响 |
| 2.3 温度对rSjPGK活性的影响 |
| 2.4 重组蛋白rSjPGK动力学参数测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 小鼠免疫保护试验及SJPGK蛋白的组织定位 |
| 摘要 |
| 1 试验材料与试验方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 BALB/c小鼠血清抗pET28a(+)-SjPGK特异性IgG抗体的检测 |
| 2.2 BALB/c小鼠血清抗pET28a(+)-SjPGK特异性IgG1、IgG2a抗体亚型的检测 |
| 2.3 免疫保护效果 |
| 2.4 SjPGK蛋白在虫体内的表达定位 |
| 2.5 日本血吸虫表膜蛋白Western blot |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
（2）血吸虫疫苗的研究进展（论文提纲范文）
| 1 蛋白疫苗 |
| 1.1 谷胱甘肽—S转移酶 (GST) |
| 1.2 磷酸丙糖异构酶 (TPI) |
| 1.3 钙激活中性蛋白激酶 (calpain) |
| 1.4 副肌球蛋白 (paramysoin) |
| 1.5 肌球蛋白 |
| 1.6 血吸虫膜相关蛋白 |
| 1.7 血吸虫脂肪酸结合蛋白 (fatty acid binding protein, FABP) |
| 1.8 信号蛋白 |
| 1.9 性别相关蛋白分子 |
| 1.10 其他蛋白分子 |
| 2 核酸疫苗 |
| 2.1 单纯的DNA疫苗 |
| 2.2 多价复合DNA疫苗 |
| 3 混合疫苗 |
| 4 表位疫苗 |
| 5 佐 剂 |
| 6 结 语 |
（3）pcDNA3.1（+）-SjP14和SjGST真核表达载体的构建、鉴定及其保护作用研究（论文提纲范文）
| 中英文词汇对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验材料 |
| 阳性钉螺 |
| 实验动物 |
| 质粒、细胞株 |
| 引物 |
| 试剂及来源 |
| 部分试剂配制 |
| 实验主要仪器 |
| 方法 |
| SjP14 和 SjGST 基因真核表达质粒的构建和鉴定 |
| 重组质粒的转染和鉴定 |
| DNA 疫苗的制备及其免疫保护性的研究 |
| 统计学方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一（个人简历） |
| 附录二（致谢） |
| 附录三（综述） |
| 参考文献 |
（4）日本血吸虫重组表膜蛋白LHD-Sj23和SjTSP2免疫保护机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 血吸虫病疫苗的研究进展 |
| 1 血吸虫病疫苗的研制策略 |
| 1.1 虫源性疫苗 |
| 1.2 亚单位疫苗(基因重组抗原疫苗与核酸疫苗) |
| 1.3 表位疫苗 |
| 1.4 多价疫苗或多基因疫苗 |
| 1.5 “内影像”抗原——抗独特型抗体 |
| 2 血吸虫病疫苗研究的问题及展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 血吸虫表膜蛋白的研究进展 |
| 1 血吸虫表膜的结构与功能 |
| 1.1 血吸虫表膜的结构 |
| 1.2 血吸虫表膜的功能 |
| 2 一些重要的表膜蛋白 |
| 2.1 血吸虫23KD抗原 |
| 2.2 TSP分子 |
| 2.3 其他重要的膜蛋白分子 |
| 3 结语 |
| 参考文献 |
| 第三章 血吸虫感染的免疫应答 |
| 1 血吸虫感染的免疫学特点 |
| 2 血吸虫感染宿主的免疫应答 |
| 2.1 免疫应答的类型 |
| 2.2 宿主免疫应答的结果 |
| 3 血吸虫感染后的免疫调节 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第四章 日本血吸虫表膜蛋白重组抗原LHD-Sj23和SjTSP2免疫保护试验 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物与日本血吸虫尾蚴 |
| 1.2 工程菌种 |
| 1.3 实验试剂与主要仪器设备 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 基因重组抗原制备 |
| 2.2 重组蛋白免疫BALB/c小鼠试验 |
| 2.3 小鼠的攻击感染和减虫率,减卵率的计算 |
| 3 结果 |
| 3.1 诱导目的蛋白的表达与纯化 |
| 3.2 动物免疫保护试验结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第五章 日本血吸虫表膜蛋白重组抗原LHD-Sj23和SjTSP2免疫保护机制的初步研究 |
| 摘要 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 应用流式细胞技术对细胞免疫分析 |
| 2.2 应用酶联免疫法(ELISA)对体液免疫的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞免疫分析 |
| 3.2 体液免疫分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（5）日本血吸虫新基因SjNANOS和SjMSP的克隆、表达及其生物学功能初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 血吸虫疫苗的研究 |
| 1.2.1 血吸虫病疫苗研制的必要性和可行性 |
| 1.2.2 血吸虫病疫苗研制历史及现状 |
| 1.2.3 展望 |
| 1.3 血吸虫性别差异表达基因的研究进展 |
| 1.3.1 血吸虫性别特异性基因的研究进展 |
| 1.3.2 对血吸虫性别特异性基因研究的展望 |
| 1.4 RNAi 技术及其在血吸虫研究中的应用 |
| 1.4.1 RNAi 现象的发现 |
| 1.4.2 RNAi 现象的作用机制 |
| 1.4.3 RNAi 的应用与前景 |
| 1.4.4 RNAi 在血吸虫学研究上的应用 |
| 1.4.5 结语 |
| 第二章 日本血吸虫新基因SjNANOS和SjMSP的克隆及在童虫和成虫中mRNA的表达 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 SjNANOS、SjMSP 基因的克隆 |
| 2.2.2 SjNANOS、SjMSP 基因的生物信息学分析 |
| 2.2.3 SjNANOS、SjMSP 基因的期别、性别差异表达分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 SjNANOS、SjMSP 基因的表达和重组蛋白的免疫保护效果评估 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组原核表达质粒pET28a(+)-SjNANOS、pET28a(+)-SjNANOS 的构建 |
| 3.2.2 SjNANOS 在大肠杆菌中的表达和重组蛋白的纯化 |
| 3.2.3 表达产物的抗原性分析 |
| 3.2.4 SjNANOS、SjMSP 重组蛋白的动物保护实验 |
| 3.2.5 特异性IgG 抗体检测 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章RNA 干扰日本血吸虫NANOS 基因的功能研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 RNA 干扰对雌雄虫发育及合抱的影响 |
| 4.2.2 RT-PCR 和免疫印迹分析 |
| 4.2.3 不同剂量dsRNA 分子抑制效果的比较 |
| 4.2.4 电穿孔法与浸泡法干扰效果的比较 |
| 4.2.5 荧光标记的siRNA 分子在虫体内的分布 |
| 4.2.6 SiRNA 分子体内干扰SjNANOS 基因 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（6）SIEA26-28 ku-scFv抗日本血吸虫病治疗性疫苗的免疫靶向作用及其效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一章 SIEA26-28ku-scFv原核高效表达质粒的构建、表达、纯化及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 SIEA26-28ku-scFv免疫靶向作用及其定位的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三章 SIEA26-28 ku-scFv治疗性疫苗抗病免疫效果的观察 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第四章 SIEA26-28ku-scFv治疗性疫苗抗病免疫机制的探讨 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 我国血吸虫病疫苗的研究进展 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间主要研究成果 |
| 附录 |
（7）抗日本血吸虫病二价多表位疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1 日本血吸虫疫苗研究进展 |
| 1.1 虫源性疫苗 |
| 1.2 基因工程苗 |
| 1.3 核酸疫苗 |
| 1.4 表位疫苗 |
| 1.5 抗独特性抗体疫苗(antiidiotype antibody vaccine) |
| 2 血吸虫病疫苗研究的问题和展望 |
| 2.1 疫苗研究面临的问题 |
| 2.2 血吸虫病疫苗研究展望 |
| 3 血吸虫体被蛋白的研究 |
| 3.1 体被蛋白结构 |
| 3.2 血吸虫体被的功能 |
| 3.3 体被一些重要的膜蛋白 |
| 3.4 结语 |
| 第二章 日本血吸虫pET32a(+)-Sj23(EC1-EC2) 和pET32a(+)-Sj23(EC2)-Tsp2(EC2)的构建、克隆与表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 日本血吸虫与尾蚴 |
| 1.3 文库、质粒及菌种 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 主要仪器设备 |
| 1.6 主要试剂配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 荧光实时定量PCR 检测Sj23(Genebank ID：BU717012)和Sj-Tsp2(Genebank ID:EF553319)基因的转录时相 |
| 2.2 生物信息学分析 Sj23(Genebank ID：BU717012)和 Sj-Tsp2(Genebank ID:EF553319) |
| 2.3 Sj23(EC1-EC2) 和Sj-Tsp2(EC2)-Sj23(EC2)基因克隆与鉴定 |
| 2.4 pET32a-Sj23(EC1-EC2)/BL21, pET32a-Sj-Tsp2(EC2)-Sj23(EC2)/BL21 的诱导表达 |
| 2.5 融合蛋白pET32a-Sj23(EC1-EC2)/BL21, pET32a-Sj-Tsp2(EC2)-Sj23(EC2)/BL21的western blotting 鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 Sj23 和Sj-Tsp2 基因转录时相的荧光定量PCR 检测结果 |
| 3.2 PCR 扩增目的片段及构建质粒酶切鉴定 |
| 3.3 核酸序列比对 |
| 3.4 目的基因核苷酸序列推测氨基酸序列 |
| 3.5 诱导目的蛋白的表达 |
| 3.5.1 诱导表达pET32a-Sj23(EC1-EC2)/BL21 |
| 3.5.2 诱导表达pET32a-SjTsp2(EC2)-Sj23(EC2)/BL21 |
| 3.6 pET32a-Sj23(EC1-EC2)/BL21 和 pET32a-SjTsp2(EC2)-Sj23(EC2)/BL21 蛋白的纯化 |
| 3.7 表达产物抗原性的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 日本血吸虫体被蛋白重组抗原的免疫保护试验 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 工程菌株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫抗原制备 |
| 2.2 重组蛋白免疫BALB/c 小鼠试验 |
| 2.3 小鼠的攻击感染和减虫率，减卵率的计算 |
| 2.4 间接ELISA 方法检测小鼠血清特异性IgG 抗体水平 |
| 2.5 Real-time PCR 分析免疫后虫体目的基因转录 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 动物免疫保护试验结果 |
| 3.2 间接ELISA 检测小鼠血清IgG 水平 |
| 3.3 Real-time PCR 分析免疫后虫体目的基因转录 |
| 4 讨论 |
| 第四章 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（9）我国血吸虫疫苗研究进展及应用前景（论文提纲范文）
| 1 疫苗候选抗原分子的筛选与鉴定 |
| 2 DNA疫苗 |
| 3 鸡尾酒疫苗 |
| 4 疫苗佐剂 |
| 5 疫苗研究与我国当前血防控制传染源策略相一致 |
| 6 结语 |
四、重组日本血吸虫副肌球蛋白诱导水牛保护性免疫的研究（论文参考文献）
- [1]日本血吸虫磷酸甘油酸激酶SjPGK基因的克隆表达及生物学特性的初步探索[D]. 黄莉妮. 南京农业大学, 2012(01)
- [2]血吸虫疫苗的研究进展[J]. 罗四维,周秦. 微量元素与健康研究, 2011(04)
- [3]pcDNA3.1（+）-SjP14和SjGST真核表达载体的构建、鉴定及其保护作用研究[D]. 汪礼文. 安徽医科大学, 2011(11)
- [4]日本血吸虫重组表膜蛋白LHD-Sj23和SjTSP2免疫保护机制的初步研究[D]. 朱珠. 南京农业大学, 2010(06)
- [5]日本血吸虫新基因SjNANOS和SjMSP的克隆、表达及其生物学功能初步分析[D]. 王艳. 中国农业科学院, 2010(02)
- [6]SIEA26-28 ku-scFv抗日本血吸虫病治疗性疫苗的免疫靶向作用及其效果的研究[D]. 高冬梅. 中南大学, 2010(11)
- [7]抗日本血吸虫病二价多表位疫苗研究[D]. 李晔. 扬州大学, 2010(02)
- [8]日本血吸虫Sj97疫苗研究进展[J]. 王敏,李文桂. 中国病原生物学杂志, 2010(03)
- [9]我国血吸虫疫苗研究进展及应用前景[J]. 汪世平,陈秀春,高冬梅. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2009(05)
- [10]血吸虫副肌球蛋白疫苗的研究进展[J]. 童晶晶,沈际佳. 热带病与寄生虫学, 2009(03)