一、Hela细胞膜表面LDL受体运动追踪研究（论文文献综述）
唐颂颂[1]（2021）在《微纳米马达的运动控制及细胞马达的构建》文中研究指明微纳米马达是一类可将周围环境中能量转化为自身驱动力并获得自主运动的微型机器。微纳米马达的自主运动能力使其在环境治理、能源开发、生物检测和靶向递药等领域都有广阔的应用前景。但目前微纳米马达的应用大多停留在概念验证阶段,其在实际应用中依然面临一些阻碍,例如微纳米马达的运动控制和生物相容性。马达的运动控制是在动态环境中完成复杂任务的前提。马达自身的生物相容性决定了其在生物医学领域应用的前景。基于上述认识,我们设计了两种不同的混合动力马达,实现了马达的加速、减速及方向调转的运动控制。同时我们构建了两种细胞马达,改善马达自身及驱动燃料的生物相容性,并对细胞马达自身进行保护。具体内容包括以下四个方面:1.将具有光催化性的二氧化钛（TiO2）与具有催化性质的铂（Pt）整合到Janus微球上得到光/化学驱动的混合动力马达。马达表面的化学反应可以通过化学或光刺激进行调节,产生互相抵消的两种驱动力。反应参数的调节可以改变马达周围离子的局部浓度,进而改变主导的驱动力,产生可切换的推进模式,形成光学减速和方向调转的运动控制效果。中间的金（Au）层（在Pt表面下）直接决定了混合动力马达的推进机理和运动调控方式。内置的光学制动系统可以通过TiO2一侧的光催化反应“动态”控制光驱动力,以抵消Pt一侧产生的化学驱动力。这种化学/光驱动的混合动力马达的光学运动控制,对于设计智能微纳米机器用于微环境中的动态调控具有良好的应用前景。2.通过调换Au和TiO2在内外侧的位置,得到由Au和TiO2组成的光/超声驱动的混合动力微型碗状马达,具有与结构相关的光学运动和集群控制效果。碗状马达在超声场中朝着其外侧凸面方向运动。紫外光在过氧化氢的存在下激活了 TiO2表面的光化学反应,Au/TiO2系统在自电泳模式下驱动马达向TiO2一侧运动。当TiO2在碗状结构的内侧时,控制紫外光强度可以切换主导的运动模式,产生光学减速和方向调转的运动控制效果。当TiO2在碗状结构的外侧时,紫外光会提供加速效果。实验中对声流流动以及由离子在碗状结构不对称分布导致的自电泳流体流动进行了理论模拟。这种可调结构的光控行为还可对其超声场中的聚集体进行控制,对TiO2在内侧或外侧的马达分别产生群体的扩展或压缩的调控行为。这种与结构相关的运动控制为生物医学和环境应用领域中各种复杂的微观操作（如货物运输和药物输送）提供了良好的基础。3.将尿素酶不对称地修饰在血小板细胞的表面来制备由内源性酶驱动的Janus血小板微马达。尿素酶在血小板细胞上的Janus分布使溶液中的尿素被不均匀地分解,从而产生增强的扩散电泳驱动。尿素酶的细胞表面修饰对血小板表面的功能蛋白基本没有影响,使所得的血小板马达仍然保留着血小板固有的生物功能,包括对癌细胞和细菌的靶向作用。在负载抗癌药或抗生素的情况下,血小板马达在尿素燃料存在下的有效运动可有效增强它们与生物靶标的结合效率,进而提高载药马达的治疗功效。酶在血小板表面的不对称修饰会得到一种能够分解生物燃料获得自主运动的生物机器人系统。赋予生物细胞自主推进能力,并为这些细胞机器人负载各种功能部件,在开发多功能细胞微马达用于更广泛的生物医学应用方面具有广阔的应用前景。4.开发了一种具有金属有机框架（MOF）保护壳的多功能细菌微马达,能够保护细菌马达免受酶的降解。单宁酸的络合作用可将沸石咪唑酯骨架（ZIF-8）纳米颗粒包裹在大肠杆菌的表面。在优化条件下进行ZIF-8的包裹不会对细菌的运动造成影响。在溶菌酶存在的情况下,细菌马达仍能保持其原有的形状特性和运动性能,证明了 ZIF-8外骨骼对细菌马达的有效保护作用。这种细胞保护作用可以使载药的细菌马达在溶菌酶处理后依然能够进行动态药物递送,增强药物的治疗效果。用MOF包裹细菌可以得到多功能的细菌马达平台,可有效保护其自身免受环境中生物威胁的损害。这种设计可很好的促进生物混合马达的开发,以应用于多变复杂的环境来满足实际生物医学应用中的严格要求。
贺佳星[2]（2021）在《新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及改善其免疫微环境的机制研究》文中研究说明背景:宫颈癌是全世界最常见的妇科恶性肿瘤之一,其所致的死亡人数占女性癌症死亡总数的第二位。高危型人乳头瘤病毒（High risk human papillomaviruse,HR-HPV）是导致宫颈癌发生的主要原因。目前,宫颈癌的治疗取决于疾病的分期,局限于子宫的癌症的治疗以手术为基础,同时进行的放疗/化疗是局部晚期癌症的治疗标准。铂类-紫杉醇联合化疗,可能添加贝伐珠单抗是目前晚期宫颈癌的治疗选择,但它仅具有缓解目的。因此改善治疗现状,为患者带来生存获益是目前亟待解决的难题。蜂毒（Bee venom,BV）是一种生物毒素,主要有效成分包括蜂毒肽（melintin,MEL）、酶、生物活性胺等。文献报道MEL具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等生物学作用,近年来也发现MEL具有调节肿瘤免疫的作用。但MEL是否可抑制宫颈癌进展和调节宫颈癌免疫微环境及其具体机制尚不清楚。由于MEL的毒性、非特异性、易降解、有限的生物利用度和溶血等特点限制了其在癌症中的应用。我们前期构建了以MEL为主体的新型氨基酸融合肽UM-6并且进行了初步研究,发现UM-6不仅发挥了良好的抗肿瘤作用,同时又弥补了MEL的毒性、易降解和溶血等缺点。前期研究证实UM-6具有良好的抗宫颈癌作用,但作用机制尚不明确。目的:探究新型氨基酸融合肽UM-6抗宫颈癌的具体作用机制以及抗宫颈癌免疫的具体作用机制,为宫颈癌药物研发和治疗提供新方向。方法:1.新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及其作用机制研究1)UM-6对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响。用不同浓度的UM-6处理两种宫颈癌细胞系Hela和Caski细胞24、48h后,利用CCK8法来检测细胞活性,并计算出药物的IC50;通过平板克隆实验来检测UM-6对宫颈癌细胞增殖的影响。通过细胞划痕实验、细胞Transwell实验和三维（3D）肿瘤球体侵袭实验检测UM-6对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响。2)利用蛋白组学筛选出UM-6的重要通路PI3K-AKT信号和靶蛋白Eph A2,通过Western Blot、免疫荧光（IF）和q PCR进行验证蛋白和m RNA表达情况。3)UM-6抑制P-AKT和Eph A2相互作用从而介导Eph A2降解的研究。利用免疫共沉淀（CO-IP）和IF检测UM-6处理前后P-AKT和Eph A2的相互作用。应用AKT激活剂（SC79）和抑制剂（LY294002）进一步检测UM-6对Eph A2蛋白表达的影响。4)UM-6诱导Eph A2溶酶体途径降解的研究。通过蛋白生物合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）进行脉冲追踪分析以检测UM-6对Eph A2半衰期和稳定性的影响。IF和CO-IP检测UM-6对Eph A2蛋白亚定位的影响。Western Blot和IF检测UM-6对Eph A2泛素化和Eph A2相关的泛素化连接酶c-Cbl蛋白表达的影响。5)构建Hela细胞宫颈癌皮下荷瘤裸鼠模型,给予UM-6腹腔注射,监测肿瘤生长速度,瘤体体积大小和重量。Western Blot、免疫组织化学染色（IHC）和IF检测体内UM-6对P-AKT和Eph A2表达的影响。2.新型融合肽UM-6抗宫颈癌免疫及其作用机制研究1)UM-6对宫颈癌免疫的影响。构建小鼠宫颈癌U14细胞同源皮下荷瘤C57BL/6小鼠模型,给予UM-6腹腔注射,监测肿瘤生长。IHC和IF检测肿瘤移植物中UM-6处理后PD-L1、cleaved caspase 3（CCA3）和Ki67的表达水平,流式细胞术检测UM-6处理后杀伤CD8+T细胞和衰竭T细胞以及效应CD4+T细胞水平和Treg细胞的数量变化。2)Eph A2与宫颈癌中T细胞相关免疫检查点分子PD-L1的相关性。通过宫颈癌TCGA数据库中基因集合富集分析（GSEA）筛选了与Eph A2相关的T细胞相关免疫检查点分子。通过TIMER数据库研究了Eph A2与宫颈癌免疫抑制信号的相关性。通过Western Blot、流式细胞术和IF检测了Eph A2对T细胞相关免疫检查点分子PD-L1蛋白表达的影响。TCGA数据库和宫颈癌组织芯片IHC评估了Eph A2和PD-L1在宫颈癌中的表达和相关性。3)UM-6影响PD-L1表达的机制研究。Western Blot、流式细胞术和IF检测UM-6对PD-L1总蛋白和膜蛋白的表达情况。N-糖基化抑制剂Tunicamycin（TM）和UM-6共处理检测PD-L1糖基化改变。CHX脉冲追踪分析检测UM-6对PD-L1半衰期和周转率的影响。IF和CO-IP检测UM-6对PD-L1亚定位以及稳定性的影响。结果:1.新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及其作用机制研究1)UM-6有效抑制宫颈癌细胞系Hela和Caski的增殖、迁移和侵袭能力,呈剂量依赖性和时间依赖性,而对Ha Ca T细胞的增殖和毒性影响较小。2)在宫颈癌细胞系中UM-6下调了P-AKT和Eph A2的蛋白表达,但不影响Eph A2的m RNA水平。IF结果显示UM-6处理之前,Eph A2主要定位细胞膜,少数以点状模式定位在细胞质核周区,而UM-6处理后Eph A2表达发生了易位,多数阳性染色位于细胞质内,核周区偏多,而细胞膜表达显着减少。3)UM-6显着降低了Eph A2 Ser897位点的磷酸化水平以及Eph A2和P-AKT的相互作用。AKT抑制剂LY294002能够抑制Eph A2 Ser897磷酸化,AKT激动剂SC79显着增加了Eph A2 Ser897磷酸化并且恢复了UM-6介导的Eph A2 Ser897磷酸化抑制。4)UM-6导致Eph A2周转率显着增加,半衰期显着缩短。UM-6与蛋白酶体抑制剂MG-132或者溶酶体抑制剂氯喹（CQ）共孵育时,仅有CQ能较大程度的逆转UM-6诱导的Eph A2的降解。IF结果显示UM-6显着增加并且延长了Eph A2在早期内吞小体和晚期内吞小体的定位,而显着降低了Eph A2在循环内吞小体上的定位,同时增加了Eph A2在溶酶体的共定位。UM-6还显着增加c-Cbl的磷酸化和与Eph A2的相互作用从而增加Eph A2的泛素化以及Eph A2与多泡体ESCRT复合体的相互作用。5)UM-6抑制了肿瘤异种移植物的生长、体积和瘤重。并且UM-6治疗组显着减少了Eph A2和P-AKT的表达。2.新型融合肽UM-6抗宫颈癌肿瘤免疫及其作用机制研究1)UM-6明显抑制了小鼠U14移植瘤的生长,减少了肿瘤移植物PD-L1蛋白表达水平,而且还增加了抗肿瘤免疫的主要效应因子CD8+T细胞释放的颗粒酶B（GB）的数量。由于抗肿瘤免疫在肿瘤组织中伴随着凋亡,UM-6治疗组肿瘤组织中发生了强凋亡信号,并且增殖标记物Ki67表达也明显降低。流式细胞术结果显示UM-6增强了CD8+T细胞分泌IFNγ的功能,减少了衰竭PD-1+T细胞的比例。UM-6还增加了移植物中效应IFNγ+CD4+T细胞的比例,减少了Treg的数量。2)GSEA显示TCGA数据库中Eph A2和适应性免疫应答信号通路在宫颈癌中高度相关,并且该通路富集的蛋白中CD274（PD-L1）评分较高,并且Eph A2和PD-L1在宫颈癌中存在显着的正相关。TIMER数据库结果显示Eph A2与宫颈癌免疫抑制信号特征相关,如耗尽T细胞信号、效应Treg细胞信号。Eph A2过表达上调了PD-L1蛋白含量以及膜定位,而si-Eph A2沉默降低了PD-L1的蛋白表达和膜定位,并且显着增加PD-1与肿瘤细胞表面PD-L1的结合。Eph A2 Ser897可能也参与PD-L1和肿瘤免疫的调节。Westernblot和流式分析结果显示Eph A2 WT和Eph A2 S897D过表达明显增加了PD-L1总蛋白和膜蛋白的表达,而Eph A2 S897A过表达下调了PD-L1总蛋白和膜蛋白的水平。TCGA数据库和肿瘤组织芯片IHC结果显示宫颈癌组织中Eph A2和PD-L1在宫颈癌中的高表达,并且高Eph A2表达的患者在肿瘤中的PD-L1表达也会升高,并且Eph A2和PD-L1呈现明显的共定位。3)Westernblot和流式分析结果显示UM-6能够抑制PD-L1的总蛋白表达和膜蛋白表达,抑制了PD-1与肿瘤细胞表面PD-L1的结合。IF结果表明在对照组中PD-L1主要位于细胞膜上,UM-6处理后PD-L1细胞膜上的信号减弱,伴随着是胞质的点状染色模式增加。在进一步检测中发现未处理的细胞中大多数PD-L1在～45 k Da检测到,而UM-6处理后PD-L1发生了明显的带移,～45kda明显减少而～33 k Da的条带增加,证实了UM-6抑制PD-L1的糖基化。TM处理后导致PD-L1的大部分～45-k Da完全糖基化蛋白迁移到～33 k Da的非糖基化形式。而在UM-6和TM共处理的细胞中,PD-L1的分子量向非糖基化转移更为明显。CHX脉冲追踪分析显示UM-6诱导的～33 k Da非糖基化形式的PD-L1半衰期更短,有更快的周转率,MG132与UM-6共处理后～33 k Da的PD-L1表现出更多的泛素化。IF结果显示在对照组中PD-L1主要位于细胞膜上,而UM-6处理后PD-L1与内质网标记物HSP90B1共定位,未发现PD-L1与高尔基体标记物TGN46共定位,表明UM-6处理后非糖基化形式的PD-L1增多并且滞留在内质网中。Westernblot和CO-IP证实了UM-6能够降低STT3A的蛋白水平以及与PD-L1的相互作用,并且增加了PD-L1与内质网相关性降解途径（ERAD）组分的结合表明UM-6通过ERAD途径促进PD-L1降解。结论:1.UM-6体外和体内均抑制宫颈癌增殖和侵袭,具体作用机制主要是UM-6抑制PI3K-AKT信号通路介导的Eph A2 Ser897磷酸化,随后招募并磷酸化c-Cbl,诱导其与Eph A2相互作用导致Eph A2的泛素化增加,泛素化的Eph A2经ESCRT复合体识别并将其锚定到MVB表面,进而增加了Eph A2转运到溶酶体的数量,促进其在溶酶体中的转运和降解。2.Eph A2可能通过PD-L1参与宫颈癌的肿瘤免疫调节,PI3K-AKT/Eph A2/PD-L1是参与宫颈癌肿瘤免疫的一种新途径。Eph A2的封锁可能代表了免疫治疗难治性癌症的一种新的治疗途径。3.UM-6参与PD-L1/PD-1轴介导的宫颈癌免疫肿瘤微环境的调节。具体机制表现为UM-6抑制PD-L1的起始糖基化,阻碍了PD-L1从内质网向高尔基体的运输和进一步的成熟和折叠,导致PD-L1通过ERAD途径的蛋白酶体降解,最终阻止PD-L1的正确膜定位和与PD-1的相互作用,增加肿瘤对T细胞介导的杀伤作用的易感性,靶向肿瘤的免疫逃逸。
张华淼[3]（2021）在《基于侧链调控/修饰策略的细胞膜电位状态监测、线粒体长程追踪、细胞活性监测荧光探针》文中指出随着荧光学在基础理论和应用方面的稳步发展,荧光探针和荧光成像已经成为分子生物学,生物物理学,生物化学,临床诊断分析和环境化学不可或缺的工具。由于各个领域内技术的不断进步,从高压汞灯到能够稳定输出激光的激光器,从多层镀膜技术到衍射光栅,荧光显微镜在过去一个世纪以来经历了快速的发展,从早期宽场荧光显微镜到激光扫描共聚焦显微镜,再到如今打破了光学衍射极限的超分辨荧光显微镜。荧光显微镜的功能越来越强大,成像能力,分辨率越来越高。而荧光显微镜离不开荧光探针,荧光探针的开发和改良已经成为荧光成像技术发展的重中之重。早在上个世纪,就有人发现不同的侧链可以给荧光探针带来不同的透膜性,进而影响探针在细胞内的成像。但是侧链对荧光探针的影响并不止于此,调控/修饰侧链可以在不改变探针光物理性质的情况下,可控地改变荧光探针的亲脂亲水性,细胞内的交付能力以及靶向性等。而且侧链由于本身和细胞膜存在着疏水相互作用,也可以作为靶向基团来使用。本论文结合目前对于侧链的各种成功应用,以调控/修饰侧链作为荧光探针设计的主要手段开展了以下工作:（1）开发出了利用探针染色位置可视化区分细胞膜电位的正常状态和近零状态的探针。虽然细胞膜电位一般都维持在-60 mV左右,但是在某些特殊情况下,或者在某些特殊的细胞上,细胞膜电位会大幅度降低,趋近于零,这时的细胞膜电位被称为“近零膜电位”。目前区分这两种细胞膜电位状态的探针大都耗时耗力,需要繁琐的校准和复杂的数据处理。本论文通过在常用的咔唑荧光团上修饰以不同长度的烷基链,开发出了能够直接通过荧光图片点对点可视化区分细胞膜电位正常状态和近零状态的荧光探针。由于静电相互作用,它们在染色正常膜电位状态的细胞时染色细胞质,而在染色近零膜电位状态的细胞时染色细胞膜。该探针虽然是阳离子染料但是并不受线粒体膜电位的干扰。它们虽然不能和传统膜电位探针一样定量地检测细胞膜电位,但是它们避免了传统膜电位探针使用过程中的校准,数据处理等步骤。（2）大部分线粒体探针会在线粒体膜电位去极化时从线粒体上脱落,导致这些探针难以长程追踪线粒体。而目前的线粒体追踪探针都是利用化学反应将探针用共价键锚定到线粒体上。这样虽然可以长程追踪线粒体,但是会对线粒体内的蛋白质造成不可逆破坏,细胞毒性较大。本论文结合组内之前的研究通过侧链修饰策略,将NBD基团修饰在传统线粒体探针的侧链上,获得了能够不受线粒体膜电位影响的非反应型线粒体追踪荧光探针SP-NBD。NBD基团的引入显着增加了 SP-NBD的亲脂性,而且NBD的刚性平面结构增大了探针分子的整体刚性使得探针SP-NBD的透膜性大大下降。当线粒体膜电位降低甚至消失时,低的透膜性使得探针难以透过线粒体的双层膜结构,从而使其能够长程追踪线粒体。（3）目前设计细胞活性探针的策略已经有很多,其中最简单有效的设计策略就是监测细胞膜的通透性改变。因为不论在凋亡细胞还是坏死细胞上,细胞膜通透性都会大幅增加。这种设计策略的难点在于要调节探针的透膜性,使其无法穿过活细胞的细胞膜但是可以穿过死细胞的细胞膜。本论文通过侧链调控策略在化合物CPS的基础上进一步降低其透膜性得到了能够监测细胞活性的绿色荧光探针ECPS。该探针无法穿过活细胞的细胞膜;而在染色死细胞时,可以迅速穿过细胞膜同时染色细胞质与核仁。该探针的设计策略主要有两点:首先,正电荷与内负外正的细胞膜电位存在着相互作用,易使探针内在化进入细胞,为此,引入了可以中和正电荷并增加水溶性磺酸根。其次,长烷基链与细胞膜有着疏水相互作用,带有长烷基链的探针容易插入细胞膜,而细胞膜与细胞内部存在着物质交换,会导致探针的内在化。通过缩短长链,使得探针无法插入细胞膜内,只能游离在活细胞的外面避免了内在化。该探针可以在活细胞群落中快速标记出死细胞。随后,基于同样的设计策略,又设计合成了类似结构的红色细胞活性探针SQ。后续实验证明SQ有着和ECPS相同的性能,这一点又说明了该侧链调控策略的普适性。（4）目前的脂滴探针大都是通过提升探针亲脂性来靶向脂滴的脂质核心。但是在实验中本论文发现探针过高的亲脂性或许会适得其反。本论文在无靶向性的荧光染料BPAPY的基础上缩减了两个苯环并引入了一个羟基。最终得到了出色的脂滴探针BPANA。它的有机化合物疏水常数cLogP从BPAPY的7.13降到了 5.73。结合本课题组之前的工作,不难发现脂滴外膜是由单层的两亲性磷脂分子层构成,其中亲水端向外,所以过高的亲脂性可能会阻碍探针透过脂滴膜。此外,探针BPANA的荧光十分稳定,不受极性和粘度的影响,即便在水中,也不淬灭。这一特性意味着该探针点亮脂滴的原因只可能是它对脂滴出色的专一选择性。除此之外,BPANA的光稳定性好,细胞毒性低,是成像脂滴的有力工具。综上,本论文基于侧链调控/修饰策略设计并合成了一系列具备不同用途的功能性荧光探针。它们充分利用了侧链对荧光探针的亲脂亲水性,靶向性,透膜性的影响。这些探针虽然都是由传统的荧光探针改造而来,但是侧链的引入/修饰改变了它们的性质,使得它们可以在染色细胞时展现出区别于原型探针的性质。
贾玉峰[4]（2021）在《以免疫分子PDCD4为靶点的抗抑郁药物的设计、制备及作用研究》文中进行了进一步梳理研究背景抑郁症（Depression）是一种常见并且严重的神经障碍类疾病,临床表现为持续的情绪低落、思维迟缓和生活无意义感。而重症抑郁症患者甚至会产生自杀的倾向,严重危害人类健康。目前抑郁症的治疗主要以药物缓解为主,已有的抗抑郁药物（选择性5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）再摄取抑制剂、5-羟色胺-去甲肾上腺素（noradrenaline,NE）再摄取抑制剂）主要通过提升突触间隙兴奋性神经递质的浓度发挥抗抑郁作用。但普遍存在见效时间长、副作用大以及人群药物敏感性差异大等问题。因此,揭示新的抑郁症发病机制和寻找新靶标,对抗抑郁药物研发和疾病的治疗有重要价值。程序性细胞死亡因子4（programmed cell death 4,PDCD4）是一个重要的蛋白质翻译抑制因子。已有研究表明PDCD4直接或间接调控细胞约1/3蛋白的表达,参与细胞因子表达调控及细胞生长、代谢等多个过程。我们实验室长期从事PDCD4与疾病的关系和分子机制研究,已发现PDCD4可通过负向调控不同的靶分子参与肿瘤、脂质代谢（动脉粥样硬化和肥胖）等多种疾病的发生与发展。更重要的是最近我们意外发现PDCD4与抑郁症的发生密切相关:1)PDCD4在抑郁症病人海马脑区（hippocampus,HIP）高表达,慢性束缚应激（chronic restraint stress,CRS）诱导抑郁症时可上调小鼠HIP中PDCD4的表达;2)PDCD4敲除小鼠能够抵抗CRS诱导的抑郁样行为,而于HIP过表达PDCD4,小鼠可出现自发性抑郁样行为;3)分子机制探索中我们发现PDCD4主要通过结合蛋白质翻译起始因子4A（eukaryotic initiation factor4A,eIF4A）进而抑制脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）翻译的起始促进抑郁症的发展。这些结果表明PDCD4是诱导抑郁症发生的新基因,可能成为抗抑郁药物研发的新靶点并为新型抗抑郁药物的设计和研究奠定理论基础。本文的目的是在已有研究的基础上,以PDCD4为靶点、以PDCD4调控BDNF表达的分子机制为理论基础。利用小干扰RNA沉默PDCD4表达、利用干扰肽和小分子化合物干扰PDCD4与下游靶基因的相互作用。设计、筛选和制备相关药物并通过体外细胞模型和CRS诱导的小鼠抑郁模型,分析这些候选药物对PDCD4下游靶分子BDNF表达的影响以及在抑郁症治疗中的作用,为新型抗抑郁药物的研发奠定基础。本项目的研究内容包括以下三个方面:一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究;二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究;三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究。研究方法一、PDCD4特异性小干扰RNA（siPdcd4）制备、修饰及抗抑郁作用研究1.PDCD4小干扰RNA的制备及其对神经细胞BDNF表达影响（1）筛选PDCD4的特异性小干扰RNA（siPdcd4）,转染细胞,采用RT-PCR和免疫印迹检测siPdcd4的沉默效率;（2）脂质体法将siPdcd4转染至神经细胞,24h后免疫印迹检测其对PDCD4下游靶基因BDNF表达的影响。2.探究PDCD4小干扰RNA对小胶质细胞炎性细胞因子表达的影响（1）脂质体法将siPdcd4转染至小胶质细胞,24h后添加LPS和ATP刺激,收取不同时间梯度的细胞培养上清和总RNA;（2）RT-PCR和ELISA检测siPdcd4对小胶质细胞炎性细胞因子（IL-6、IL-1β）表达的影响。3.siPdcd4神经靶向修饰和干扰效率检测（1）合成狂犬病毒糖蛋白靶向运输多肽（RVG-9dR）;（2）体外将Cy5荧光素标记的siPdcd4（Cy5-siPdcd4）进行神经靶向运输修饰（RVG/Cy5-siPdcd4）;（3）RVG/Cy5-siPdcd4处理神经细胞,高内涵成像检测红色荧光信号在细胞内的分布;（4）RVG/Cy5-siPdcd4处理神经细胞48h后,RT-PCR和免疫印迹检测神经细胞中PDCD4表达变化。4.神经细胞mTORC1失活时RVG/siPdcd4对BDNF表达的影响（1）mTORC1特异性抑制剂rapamycin阻断神经细胞mTORC1信号通路,免疫印记检测不同时间梯度BDNF和PDCD4表达的变化;（2）RVG/siPdcd4沉默神经细胞内源性PDCD4,24h后,添加rapamycin阻断mTORC1信号通路,免疫印迹检测RVG/siPdcd4对BDNF表达的影响。5.检测RVG/siPdcd4能否跨过血脑屏障靶向入脑及对PDCD4和BDNF表达的影响（1）将50μg RVG/Cy5-siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内,6h、24h、48h、和72h分别通过小动物活体成像系统检测红色荧光在体内的分布;（2）RT-PCR和免疫印迹检测海马区和前额叶皮质PDCD4的沉默效率和BDNF表达变化;（3）RVG/siPdcd4浓度梯度实验,通过PDCD4的沉默效率和BDNF的表达变化确定体内实验最优RVG/siPdcd4使用浓度。6.行为学评价RVG/siPdcd4对CRS诱导的抑郁样行为的影响（1）慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型。将RVG/siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内,RT-PCR检测海马区和前额叶皮质中PDCD4的沉默效率,免疫印迹和ELISA检测海马中BDNF表达的变化;（2）ELISA检测海马和外周血中炎性细胞因子表达的变化,明确RVG/siPdcd4对抑郁症炎性水平的影响;（3）脑组织进行高尔基染色,通过神经元树突棘密度评价神经突触可塑性的改变;（4）通过悬尾实验、强迫游泳实验和蔗糖水偏好实验评价RVG/siPdcd4对小鼠抑郁样行为的影响。二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究1.筛选特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的氨基酸序列（1）构建 eIF4A-HA、PDCD4-FLAG 和 BDNF-GFP 过表达载体;（2）查阅文献和蛋白结构数据库找到PDCD4与eIF4A相互作用的关键氨基酸位点及主要作用结构域（氨基酸序列）;（3）利用分子克隆构建关键结构域（氨基酸序列）与GFP的融合蛋白表达载体;（4）通过免疫共沉淀和免疫印迹实验,筛选能够特异性干扰PDCD4与eIF4A结合并且上调BDNF的表达的结构域（氨基酸序列）;（5）将筛选的氨基酸序列与跨膜序列相偶联（N端）,合成相应的干扰多肽。2.干扰多肽对PDCD4与eIF4A结合的影响（1）免疫荧光实验检测干扰多肽的跨膜效率、细胞内稳定性以及与PDCD4蛋白的结合情况;（2）免疫共沉淀及双荧光分子互补实验,检测干扰多肽对PDCD4和eIF4A结合的影响。3.干扰多肽对BDNF表达的影响（1）将PDCD4-FLAG和BDNF-GFP共同过表达于HEK-293细胞,免疫印迹检测干扰多肽对BDNF表达的影响;（2）免疫印迹及ELISA实验检测干扰多肽对神经细胞BDNF表达的影响;（3）ELISA检测神经细胞培养上清中分泌性BDNF和炎性细胞因子表达的变化。4.神经细胞mTORC1失活时干扰多肽对BDNF表达的影响在原代海马神经元mTORC1信号通路完全阻断的情况下,免疫印迹检测干扰多肽对神经元内源性BDNF表达的影响。5.海马定点注射干扰多肽对CRS诱导的焦虑及抑郁样行为的影响（1）野生型4-6周龄C57BL/6J雄性小鼠,慢性束缚应激诱导抑郁模型;（2）根据小鼠冠状脑图谱,于海马脑区腹侧埋下微型给药管,免疫荧光检测干扰多肽在海马组织中的扩散情况;（3）于抑郁小鼠海马区定点注射干扰多肽,治疗完成后免疫印迹实验和ELISA检测BDNF表达的变化;（4）小鼠脑组织进行高尔基染色,统计分析海马神经元轴突树突棘密度,评价干扰多肽对神经突触可塑性的影响;（5）干扰多肽治疗结束后进行行为学检测,评价干扰多肽对小鼠焦虑及抑郁样行为的影响。三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究1.PDCD4配体小分子的筛选基于高斯过程的定量结构-活性关系回归预测（Gaussian process-based QSAR）在类药物生物源化合物文库中进行高通量虚拟筛选。根据与靶蛋白的主要结合位置,筛选在微摩尔水平上与PDCD4蛋白具有高或中等亲和力的小分子化合物。2.PDCD4配体小分子功能检测（1）免疫共沉淀实验检测PDCD4配体小分子对PDCD4与eIF4A结合的影响;（2）免疫印迹实验检测PDCD4配体小分子对神经细胞BDNF表达的影响;（3）将PDCD4-FALG和BDNF-GFP过表达载体共同转染至HEK-293细胞,免疫印迹检测PDCD4过表达时PDCD4配体小分子对BDNF表达的影响;（4）免疫印迹检测神经细胞mTORC1失活时PDCD4配体小分子对BDNF的表达影响。3.PDCD4配体小分子对CRS诱导的抑郁样行为的影响（1）慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型,将不同浓度的PDCD4配体小分子通过腹腔注射至小鼠体内。免疫印迹实验和ELISA检测抑郁小鼠海马和前额叶皮质BDNF表达的变化;（2）脑组织进行高尔基染色,通过神经元轴突树突棘密度评价神经突触可塑性的变化;（3）对小鼠进行行为学检测评价PDCD4配体小分子对抑郁样行为的影响。结果一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究前期研究结果显示抑郁症患者海马区PDCD4表达升高,于海马区过表达PDCD4后野生型小鼠出现自发抑郁样行为。而PDCD4敲除小鼠则完全抵抗慢性束缚应激导致的抑郁行为的产生,提示PDCD4是治疗抑郁症的重要靶点。为此,本部分利用PDCD4小干扰RNA干扰中枢神经系统PDCD4的表达,研究其抑郁症的治疗效应。（一）siPdcd4干扰效率检测及其对PDCD4下游靶基因表达的影响（1）首先通过对PDCD4的mRNA核酸序列进行分析,从核酸数据库筛选、合成了 PDCD4小干扰RNA（siPdcd4）,并通过细胞学实验证明能有效沉默PDCD4的表达。（2）siPdcd4对BDNF表达的影响:通过脂质体法将siPdcd4转染至神经细胞,免疫印迹实验检测siPdcd4对下游靶基因BDNF表达的影响。结果显示siPdcd4沉默PDCD4后可明显上调神经细胞BDNF的表达。（3）siPdcd4对炎性细胞因子表达的影响:PDCD4不仅可抑制BDNF,而且可负向调控促炎性细胞因子的表达。因此,我们进一步探究siPdcd4对小胶质细胞炎性细胞因子表达的影响,结果显示siPdcd4能够明显抑制LPS和ATP刺激诱导的IL-6和IL-1β的表达。（二）siPdcd4神经细胞靶向修饰及特异性检测（1）siPdcd4神经细胞靶向修饰:为了解决siPdcd4静脉注射不能通过血脑屏障入脑的技术瓶颈,我们合成了嗜神经的狂犬病毒糖蛋白多肽（RVG-9dR）。已经证明RVG-9dR多肽的9个D-精氨酸通过电荷相吸与siPdcd4结合,能够对siPdcd4进行神经靶向修饰（RVG/siPdcd4）。另外,为了便于体内示踪,采用Cy5荧光素（红色）对siPdcd4进行了标记（Cy5-siPdcd4）,制备了既具有神经特异性又可示踪的RVG/Cy5-siPdcd4复合物。（2）RVG/siPdcd4神经细胞靶向的特异性检测:为了检测RVG-9dR修饰后的siPdcd4（RVG/siPdcd4）神经靶向特异性,我们用RVG/Cy5-siPdcd4分别去处理具有乙酰胆碱受体的神经细胞（SH-SY5Y、HT-22）和小胶质细胞（BV2）以及不表达乙酰胆碱受体的非神经细胞Hela。通过高内涵成像系统检测Cy5-siPdcd4在细胞的分布,结果显示,神经细胞SH-SY5Y、HT-22和BV2的细胞浆中均能够观察到带红色荧光的siPdcd4,而非神经细胞HeIa的细胞浆中无明显红色荧光信号。（3）沉默效率检测:RT-PCR和免疫印迹结果显示RVG/siPdcd4能够在转录和翻译水平沉默神经细胞SH-SY5Y、HT-22和BV2内源性PDCD4的表达,而对非神经细胞HeIa的PDCD4无明显沉默作用。以上结果表明,RVG-9dR多肽修饰的siPdcd4（RVG/siPdcd4）特异性进入神经细胞并且沉默PDCD4的表达。（三）RVG/siPdcd4逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用我们前期机制研究发现,抑郁症时脑内PDCD4表达升高是由于mTORC1活性降低导致PDCD4磷酸化-泛素化降解途径受阻的结果。故我们用mTORC1特异性抑制剂rapamycin去抑制海马神经元细胞HT-22和小胶质细胞BV2的mTORC1活性,建立模拟抑郁小鼠脑内变化的细胞模型。我们发现与体内结果一致mTORC1被抑制后PDCD4出现累积,BDNF的表达受到明显抑制。在相同的实验体系下,我们发现RVG/siPdcd4能够逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用。（四）RVG/siPdcd4能够跨过血脑屏障靶向入脑为了检测RVG-9dR能否携带siRNA跨过血脑屏障。我们将RVG/Cy5-siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内,通过活体成像系统进行体内示踪。结果显示6h时RVG/Cy5-siPdcd4已经由外周输运至脑组织但是进入剂量较少,此时Cy5-siPdcd4主要存在于小鼠的腹部。而24h时RVG/Cy5-siPdcd4则主要聚集于脑内,腹部无明显荧光。48h时脑内红色荧光依然存在但是与24h相比明显减弱。72h时脑内无可检测到的红色荧光信号。上述结果提示RVG/Cy5-siPdcd4能够跨过血脑屏障靶向入脑并且具有良好的稳定性。与此同时,在RVG/siPdcd4注射48h后通过RT-PCR和免疫印迹实验检测了海马和前额叶皮质中BDNF的表达变化。结果显示RVG/siPdcd4注射至小鼠体内通过沉默海马和前额叶皮质中的PDCD4上调BDNF的表达。（五）静脉注射RVG/siPdcd4可治疗慢性束缚应激诱导的抑郁症为了探究RVG/siPdcd4对抑郁症的治疗效果,慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型。诱导成功后通过尾静脉注射RVG/siPdcd4进行抗抑郁治疗:（1）RT-PCR和免疫印迹实验结果显示,RVG/siPdcd4能有效沉默抑郁小鼠海马和前额叶皮质中的PDCD4、降低促炎性细胞因子IL-6和IL-1 β表达并显着提升BDNF的表达;（2）脑组织高尔基染色实验结果显示,RVG/siPdcd4可增加海马神经元轴突树突棘的密度,改善神经突触可塑性;（3）行为学检测结果表明,RVG/siPdcd4能够降低悬尾实验、强迫游泳实验小鼠的不动时间,增加抑郁小鼠的蔗糖水偏好指数。以上结果表明,RVG/siPdcd4通过沉默PDCD4、抑制促炎细胞因子IL-6和IL-1β的表达、上调BDNF的表达和修复神经突触可塑性治疗CRS诱导的抑郁症。二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究前期机制的探索发现PDCD4通过结合eIF4A进而抑制BDNF的翻译促进抑郁症的发展。提示,如果干扰PDCD4和eIF4A的结合将解除PDCD4对BDNF的抑制作用进而治疗抑郁症。因此本部分根据PDCD4和eIF4A结合的位点筛选能够干扰二者相互作用的干扰多肽并对其抗抑郁作用进行研究。（一）eIF4A结合PDCD4关键序列的筛选通过分析已有的研究结果我们发现eIF4A的P56、K83、G137、T159和R360是eIF4A与PDCD4结合的关键氨基酸位点。根据氨基酸位点所在位置我们设计了4段可能结合PDCD4的序列,分别命名为eIF4A-Q、eIF4A-I、eIF4A-Ia和eIF4A-VI。为了验证各个氨基酸序列的功能,我们构建了 eIF4A-Q、eIF4A-I、eIF4A-Ia和eIF4A-VI与GFP的融合蛋白表达载体,采用免疫共沉淀和免疫印迹实验确定这些基序对PDCD4与eIF4A结合的影响。结果显示,eIF4A-VI干扰PDCD4与eIF4A结合的能力最强,并且能明显上调BDNF的表达。而eIF4A-Q、eIF4A-l和eIF4A-la虽然能够干扰PDCD4与eIF4A的结合,但是对BDNF的表达有明显的抑制作用。因此,eIF4A-VI成为后续研究的候选序列。（二）eIF4A-VI的跨膜修饰及其对PDCD4与eIF4A结合的影响由于PDCD4与eIF4A的结合主要发生于细胞浆内。为了使筛选的序列进入细胞发挥作用,将具有跨膜效应的9个精氨酸（9 Arginine）偶联在eIF4A-VI的N端,合成了具有跨膜特性的9R-eIF4A-VI干扰多肽。另外,为了证明9R-eIF4A-VI干扰多肽的特异性,我们将363号氨基酸由R363突变为Q363合成了突变多肽Mu-9R-eIF4A-VI作为对照。免疫荧光结果表明,干扰多肽能在1h内跨过细胞膜进入细胞浆并在细胞内能够稳定存在48h,进一步研究发现9R-eIF4A-VI干扰多肽与PDCD4蛋白存在明显的共定位。与此同时,免疫共沉淀与双荧光分子互补实验结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽能够显着干扰PDCD4与eIF4A的结合,但相同的突变多肽Mu-9R-eIF4A-VI却无此效应。以上结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽通过靶向PDCD4特异性干扰PDCD4与eIF4A的结合。（三）干扰多肽特异性上调BDNF的表达将PDCD4-FLAG和BDNF-GFP过表达载体按照3:1的质量比共转染于HEK-293细胞,6h后添加9R-eIF4A-VI干扰多肽,免疫印迹实验检测BDNF表达的变化。结果表明,9R-eIF4A-VI干扰多肽能够逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用,但相同浓度的Mu-9R-eIF4A-VI多肽对BDNF表达的上调作用消失。为了明确干扰多肽对神经细胞内源性BDNF表达的影响。不同浓度的9R-eIF4A-VI干扰多肽处理神经细胞（原代海马神经元、小鼠海马神经元细胞HT-22和小胶质BV2）。免疫印迹结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽能够显着上调神经细胞内源性BDNF的表达。与此同时,通过炎性细胞因子的表达水平评价了 9R-eIF4A-VI干扰多肽对神经细胞的副反应。ELlSA结果显示,9R-eIF4A-VI干扰多肽并不会诱发炎性相关细胞因子lL-6和IL-10表达上调。（四）干扰多肽逆转海马神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用在前期的工作中,我们在海马神经细胞系和小胶质细胞中用mTORC1活性抑制剂成功构建了模拟抑郁小鼠脑内变化的细胞模型。为了探究9R-eIF4A-VI干扰多肽对神经元BDNF表达的影响,我们用rapamycin去抑制原代海马神经元mTORC1的活性。我们发现与前期结果一致,mTORC1失活后PDCD4出现累积,BDNF的表达受到明显抑制。而9R-eIF4A-VI干扰多肽能够逆转原代海马神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用。（五）海马区注射干扰多肽能够缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为为了检测9R-eIF4A-VI干扰多肽对焦虑和抑郁样行为的影响。通过CRS诱导小鼠抑郁模型,模型构建成功后,通过脑立体定位将9R-eIF4A-VI干扰多肽定点注射至抑郁小鼠的海马区:（1）脑组织免疫荧光结果显示干扰多肽能够通过定位注射扩散至整个海马组织;（2）免疫印迹实验和ELISA结果显示干扰多肽能够显着上调抑郁小鼠海马中BDNF的表达;（3）脑组织高尔基染色结果表明干扰多肽通过增加神经元突触棘密度,改善神经突触可塑性;（4）行为学结果显示,干扰多肽治疗组小鼠在悬尾实验、强迫游泳实验中与CRS组相比不动时间明显减少。蔗糖水偏好实验中干扰多肽治疗组小鼠蔗糖水偏好指数明显高于CRS组。旷场实验和高架十字实验干扰多肽治疗组小鼠中央区的停留时间显着低于CRS组。以上结果表明,海马区定点注射9R-eIF4A-VI干扰多肽通过上调BDNF表达、改善神经突触可塑性,缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究尽管干扰多肽和siRNA药物有特异性高、免疫原性低等优势,但制备成本高、不能口服用药,将来临床应用会受到一定限制。为了克服这种不足,在本部分研究工作中,我们主要探索PDCD4配体小分子化合物治疗抑郁症的可行性（一）PDCD4配体小分子的筛选已有研究报道,通过高通量虚拟筛选从类药物小分子文库中筛选了 6种可能与PDCD4结合的小分子化合物。进一步研究发现,一种小分子化合物与PDCD4具有高亲和力,另一种小分子与PDCD4具有中等亲和力。模拟结果显示这两种化合物主要通过氢键和π-π键与PDCD4 C端MA-3结构域的氨基酸相连接,但是结合后的功能尚不清楚。故本课题选择这两种小分子为候选化合物（分别命名为ZHJ-204和ZHJ-690）检测其对PDCD4靶分子BDNF表达的影响。（二）PDCD4配体小分子对BDNF表达的影响（1）首先,我们检测了小分子ZHJ-204和ZHJ-690对神经细胞内源性BDNF表达的影响,结果显示10pM至1nM的ZHJ-204和ZHJ-690能显着上调HT-22和BV2 BDNF的表达,并且具有浓度依赖性;（2）神经细胞mTORC1失活体外抑郁模型结果表明,ZHJ-204和ZHJ-690能够解除rapamycin对BDNF的抑制作用,而且小分子ZHJ-204相较于ZHJ-690对BDNF的上调作用更为显着;（3）在PDCD4过表达模型中,我们发现小分子ZHJ-204和ZHJ-690能够逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用。以上结果表明,PDCD4配体小分子ZHJ-204和ZHJ-690能够上调BDNF的表达。（三）PDCD4配体小分子抗抑郁作用研究通过CRS诱导小鼠抑郁模型,诱导完成后进行配体小分子的干预治疗。我们将不同浓度的配体小分子通过腹腔注射至小鼠体内,对照组注射等量的生理盐水,每天注射一次共10次,治疗完成后进行抑郁行为学评价和脑组织生化标志物分析。（1）首先,我们检测了抑郁症相关脑区海马和前额叶皮质中BDNF表达的变化。免疫印迹结果显示,持续的CRS能够降低海马和前额叶皮质中BDNF的含量,而ZHJ-204（5mg/kg）的治疗能够显着上调抑郁小鼠海马和前额叶皮质中BDNF的表达。（2）行为学结果表明,ZHJ-204（5mg/kg）治疗组小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中不动时间与CRS组相比显着降低。蔗糖水偏好实验结果显示ZHJ-204（5mg/kg）治疗组小鼠蔗糖水偏好指数明显高于CRS组。以上结果表明,腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。结论1.神经靶向修饰的PDCD4小干扰RNA（RVG/siPdcd4）通过特异性沉默PDCD4、抑制促炎性细胞因子表达、上调BDNF表达、改善神经突触可塑性治疗CRS诱导的抑郁症。2.海马定位注射特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的9R-eIF4A-VI干扰多肽,通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。3.腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调海马和前额叶皮质中BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。创新性及意义1.我们首次将小核酸药物用于抑郁症的治疗,并且通过体外修饰解决了 siRNA神经靶向问题。并且发现经过脑内靶向修饰的siPdcd4（RVG/siPdcd4）通过静脉注射能够缓解CRS诱导的抑郁样行为,RVG/siPdcd4有可能成为新的抗抑郁药物。2.在多肽类抗抑郁药物的研究中,我们筛选并设计了能特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的9R-eIF4A-VI干扰多肽。体内实验证明海马定点注射9R-eIF4A-VI干扰多肽能够缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。进一步证明了 PDCD4促进抑郁症的分子机制并为抗抑郁药物的研究提供了新的策略,同时为干扰多肽类的抗抑郁药物的研发奠定了基础。3.在小分子类抗抑郁药的研究中,我们从类药物小分子文库中筛选了 PDCD4的配体小分子,并且证明了腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。我们的工作为研究新型小分子抗抑郁药物提供了前期工作基础。局限性1.RVG/siPdcd4药代动力学,药物安全评价等相关研究尚未完成。2.尽管脑内注射9R-eIF4A-VI干扰多肽显现出明显的抗抑郁效应,但外周用药的修饰和效应尚需进一步研究。3.虽然已经证明PDCD4配体小分子有一定抗抑郁作用,但仍需要对小分子化合物进行进一步的改造和修饰,以便提高其活性和成药性。
卢慈香[5]（2020）在《台湾人饮食习惯对高血脂之影响研究》文中进行了进一步梳理目的:本研究的目的在于分析中医师对高血脂患者采用单方或复方治疗的用药判断;其次是分析高血脂患者在治疗周期自我健康促进与饮食调整的具体作为。以及从治疗周期结束后的血液检验报告分析总胆固醇（Total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、三酸甘油脂（Triglyceride,TG）的降低程度。方法:使用较适合采取便利抽样方法选取中医师正在治疗中的个案病患作为研究对象,经向中医诊所进行参与研究意愿调查,并取得四家中医诊所及32位高血脂患者参与研究。并且采用文件分析法及内容分析法针对中医师之问诊纪录、病患在治疗期间之饮食纪录,以及在治疗周期结束后再以血液检验报告数值进行数据分析。结果:本研究共取得四所中医诊所及32位高血脂患者共同参与为期八周的治疗,经中医师诊断也多属于脾胃气虚、肝郁脾虚、肝肾亏虚、脾胃湿热、气血不足、血热、肝胆湿热等症状,不同中医师针对调理病患的高血脂症,其用药方略也不尽相同,除了有复方的天麻钩藤饮、柴胡疏肝汤、加味逍遥散、六味地黄丸、大柴胡汤、小柴胡汤之外,也有中医师开立生技中药「寿美降脂一号」的特殊用药;其次,在单方用药上则是有山楂、陈皮、决明子、鸡血藤、大黄、黄耆等。最后,中医师也根据病患的身体素质,开立竹叶石膏汤、骨碎补、干姜、保和丸、白芍、砂仁、冇骨消（Sambucus formosana Nakai）、补阳还五、续断、三黄泻心汤、川栋子、远志、茯神、茵陈篙汤、麦冬、枳实等单方及复方合并调理病患的其他病症。结论:高血脂患者的自我健康促进行为,加上为期八周的中医治疗成效上显示,仅有按时服用药物的患者,在胆固醇（TC）指数、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）指数、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）指数、三酸甘油脂（TG）指数都有下降,然而仅有按时服药的各项指数下降的趋势却不如患者具有积极运动者的指数变化。
李宁[6]（2020）在《外泌体膜荧光分析与成像方法的研究》文中指出外泌体是细胞主动分泌的具有膜结构的囊泡,大小约为30-150 nm。外泌体中含有宿主细胞来源的多种蛋白质、DNA、编码以及非编码RNA、脂质等物质,它与肿瘤的形成、生长、转移以及疾病的发生密切相关,因此外泌体已经成为肿瘤诊断和治疗相关研究的热点。然而,目前关于外泌体的膜结构快速精准分析检测技术十分有限,制约外泌体科研与临床研究,本论文提出以外泌体膜作为分析对象,开展了其荧光分析以及荧光成像方法的研究。（1）考虑外泌体的尺寸范围较宽,为实现精准分析,首先进行了外泌体分段分离技术的探索。本文尝试了多种分离技术,包括PEG沉淀法、尺寸排阻色谱法以及超滤法,最后确定方案为通过物理膜过滤的方式,在超滤法基础上实现了大小尺寸不同细胞培养基来源外泌体的分段分离。并且用绿色荧光蛋白（EGFP）对外泌体进行标记,通过受体细胞摄取EGFP标记的外泌体实验验证了 PEG沉淀法和超滤法分离的外泌体保持了正常的功能活性。这为外泌体相关研究提供了可用的实验材料。（2）目前外泌体常见的定量方法基于外泌体总蛋白含量分析,繁琐且容易受到各种杂质蛋白干扰。本文首次提出以外泌体膜上的脂质作为定量分析对象,建立了外泌体总膜脂质测定法（MLA）,具体策略为荧光分析技术结合两种荧光染料借助比率荧光分析来定量外泌体。该策略要求染料A是对外泌体膜敏感的特异性膜染料,染料B是对膜不敏感的水溶性染料,其作为与染料A搭配的内参染料。为此,从四种亲脂性膜染料PKH26、Mem-BDP、Mem-CA和Mem-SQAC中筛选出一种膜特异性染料Mem-SQAC作为染料A,其特点是具有高抗蛋白干扰能力、高抗脂蛋白干扰能力以及高荧光成像信噪比。从两种罗丹明类染料中筛选出磺酸罗丹明作为染料B。实际应用于MCF-7细胞、MCF-10A细胞、HeLa细胞培养基以及乳腺癌病人血清来源的外泌体定量分析,发现血清中含有外泌体的量较多,MCF-7细胞相比HeLa细胞、MCF-10A细胞更容易分泌外泌体。证明此定量方法具有快捷、方便、成本低等特点。这为快速、准确定量外泌体提供了可用的方法和工具。（3）外泌体的大小尺寸与其功能具有紧密联系,但目前缺少可行、准确测定其大小尺寸的成像方法。本文根据外泌体膜粘度与其膜曲率半径的联系,提出了通过测定外泌体膜粘度来评估外泌体大小尺寸的新策略。具体策略为高分辨率的荧光寿命成像（FLIM）结合膜特异性粘度敏感荧光探针Mem-BDP,通过测定外泌体膜上的荧光寿命值（局部粘度）来反映出外泌体的大小尺寸。首先对HeLa细胞和MCF-7细胞来源的大小尺寸不同外泌体样本（10-50、50-100和100-220 nm）用探针Mem-BDP染色标记后进行荧光寿命成像（FLIM）,建立外泌体大小尺寸和荧光寿命值之间的联系,结果表明外泌体的平均荧光寿命值（平均粘度）随着外泌体尺寸的增加而降低。其次应用此方法分别对两组肿瘤细胞和相对应正常细胞、不同种类乳腺癌病人血清来源外泌体进行了荧光寿命成像（FLIM）,结果表明来源于肿瘤细胞外泌体的平均荧光寿命值（平均粘度）高于对应的正常细胞;来源于不同种类乳腺癌病人血清中外泌体的平均荧光寿命值（平均粘度）存在差异性。这为外泌体大小尺寸的精准测定提供了可行的方法。（4）标记方法是影响外泌体单分子定位超分辨成像准确性的关键因素,本文提出优化外泌体超分辨成像准确性的新策略。具体策略为采用蛋白融合技术用荧光蛋白对外泌体进行内源性标记。首先构建了荧光蛋白融合外泌体标志性蛋白的重组质粒,来验证荧光蛋白对外泌体标记的可行性。其次比较了三种不同外泌体标记方法（膜染料、免疫荧光、荧光蛋白）在受体细胞摄取成像中的应用,结果表明荧光蛋白标记是最优标记方法,荧光蛋白标记具有成像结果准确、外泌体原始生物学活性不受影响等特点。最后通过光激活荧光蛋白（PAmcherry）对外泌体的标记,实现了细胞外和细胞内外泌体单分子定位超分辨成像。这为外泌体的无损、实时、可视化成像研究提供了可行的工具。
荆莹莹[7]（2020）在《小分子荧光探针在超分辨成像中的应用》文中研究指明细胞膜作为细胞与外界的屏障,在维持细胞的稳定、物质运输、信号转导等过程中发挥着非常重要的作用。细胞膜结构和膜组成分子的异常化是许多疾病发生的关键因素。因此,解析细胞膜表面分子的分布及组装机理对于理解其生理功能及病理过程至关重要。为了在亚细胞结构内实现对生物分子分布的认知,直接观测是最有效便捷的方法。然而,这些分子的尺寸大多数在衍射极限以下,普通光学显微镜不能满足要求。近年来发展的超分辨荧光显微技术突破了光学衍射极限,在研究细胞膜分布、解析生物结构、揭示分子相互作用等方面做出了巨大贡献。其中,直接随机光学重构显微镜（direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,dSTORM）由于较高的分辨率和便捷的操作而得到广泛应用。dSTORM技术基于单个荧光分子的定位,需要成千上万张原始图片来重构一张超分辨图像,因此,超分辨图像的质量与获得的定位点密度和定位精度密切相关。为了获得更准确的超分辨图像,需要探针的精确定位和高密度识别。理想的探针应该是小尺寸、单价态、高特异性以及对靶标较小的干扰。传统的探针,例如抗体,尺寸相对较大且为多价态,在识别目标分子时存在潜在的空间位阻与交联。近期出现的一些小分子探针为单分子标记开拓了一个新思路。我们利用dSTORM技术,结合小分子探针标记,对细胞膜上多种糖分子及膜蛋白的分布模式进行了研究,取得的主要研究结果如下:1.糖分子结构复杂且多样化,在标记时通常以凝集素作为探针,然而凝集素为多价态,在标记糖分子时容易引起交联。为了避免这一现象,我们选用适配体探针标记糖分子。以N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）为例,GalNAc是细胞膜上一种重要的O连接糖,传统识别GalNAc探针为大豆凝集素（SBA）,我们用一种特异性的适配体识别GalNAc,结合dSTORM技术,对GalNAc在细胞膜上的分布进行超分辨成像,并分别检测了适配体探针和凝集素的标记效率和识别特异性。结果表明,GalNAc在细胞膜上形成异质团簇,而且用适配体标记时形成的团簇比凝集素标记时具有更多的定位点,表明适配体在糖簇内具有更强的分子识别能力。此外,通过糖苷酶去除GalNAc,证明适配体比凝集素具有更好的特异性。这一工作表明适配体是标记膜糖分子的高效探针,可以提供更准确、更详细的糖分子的空间定位信息。2.Globo H是细胞膜上一种与癌症相关的糖分子,在多种癌症中过表达。目前为止,globo H在分子水平上的准确定位和详细分布形态仍不清楚。Globo H的抗体为一种IgM,不仅尺寸较大,而且较难获得。因此,我们利用适配体探针识别细胞膜上的globo H,并结合超分辨显微镜研究了 globo H的分布特征。通过分析发现globo H在癌细胞膜上形成大小不一的团簇,并且globo H的高表达和成簇分布是癌细胞上特有的,表明globo H可以作为潜在的癌症诊断标志物。另外,双色dSTORM成像显示globo H与另外两种癌症相关的糖分子唾液酸（sia）和N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）存在共定位关系,我们推测这些与癌症相关的糖分子可能在某些癌症过程中协同发挥作用。这一工作对以后研究细胞膜糖分子结构与功能的关系奠定了基础。3.上皮细胞粘附分子（EpCAM）是一种重要的I型跨膜蛋白,在细胞功能和肿瘤发生中起着至关重要的作用。然而关于EpCAM在细胞膜上的详细形态、分子化学计量学和组装机制的问题尚未阐明。我们利用一种小分子肽来识别EpCAM,并结合超分辨显微技术,研究了 EpCAM在细胞膜上的组装机理。与抗体标记相比较,肽标记的方法显示了高的标记效率和定位密度;同时我们发现EpCAM在细胞膜上组装成含有不同个数蛋白分子的团簇;双色dSTORM成像显示了 EpCAM在一定程度上与四跨膜蛋白CD9共定位,CD9基因沉默能明显削弱EpCAM的聚集程度,表明EpCAM可能定位在细胞膜上的四跨膜蛋白富集微结构域（TEM）;与此同时,通过细胞松弛素D和糖苷酶NAG处理证明细胞骨架和糖基化也是EpCAM成簇的关键因素。这一体系为以后膜蛋白纳米结构域的研究提供新的线索。4.核仁素（NCL）在细胞膜上作为一种受体蛋白,不仅在细胞膜上表达,而且广泛分布于细胞核与细胞质中。尽管NCL被发现具有多种生物功能,但是其在细胞各个组分中的分布形态尚未获得。此外,胞质内和核内的蛋白在用抗体标记时通常需要透化,透化这一过程对细胞膜和核膜都有一定程度的破坏,影响对蛋白的原位观察。因此,我们用一种特异性适配体AS1411标记NCL,利用dSTORM技术揭示了 NCL在核仁、核质和细胞质中的不同分布模式,并对NCL在癌细胞和正常细胞的不同细胞组分中的分布进行了比较。结果表明,AS1411可以渗透进细胞内识别胞质中和核内的蛋白,无需进行透化,并且定位点密度高于抗体;通过分析发现,NCL在核仁中定位密度最高,在细胞质中以簇形态分布;与正常细胞相比,NCL在癌细胞膜表面和胞质中表达上调并且形成更大的簇,暗示这种表达和分布的变化可能与细胞癌变过程密切相关。5.前列腺特异性膜抗原（PSMA）是细胞膜上一种重要的癌症标志物,不仅参与多种细胞活动,而且具有羧肽酶和叶酸水解酶的性质。因此,基于PSMA独特的酶性质发展出许多抑制剂。我们利用抑制剂具有高特异性的识别特点,发展了一种基于抑制剂的超分辨探针,用于PSMA的超分辨成像。小分子抑制剂探针显示出比抗体更高的标记密度和簇识别能力。通过数据分析,我们发现PSMA在细胞膜上以簇的形式分布;双色dSTORM成像显示出PSMA与叶酸受体的显着共定位,暗示了这两种蛋白可能在叶酸转运中起协同作用。这一研究有助于进一步理解PSMA的生物学功能。更重要的是,基于小分子抑制剂开发的荧光探针扩展了超分辨成像探针的领域。
郑波[8]（2020）在《热挤压3D打印构建大米淀粉-儿茶素复合物的消化性能及抗肥胖机理研究》文中认为随着经济的快速增长和疾病谱的不断演变,由于过度能量摄入和消耗不平衡导致的肥胖症与日俱增,已成为威胁人类健康和社会发展不可忽视的世界性公共卫生问题。而基于膳食干预理念设计具有个性化健康食品实现对肥胖的防御与治疗,已成为当今食品营养科学领域的研究前沿和热点。本论文考察了目前国内外对肥胖症营养干预研究的现状,及热挤压3D打印技术个性化营养食品定制的特点和发展趋势,提出利用热挤压3D打印协同儿茶素分子相互作用调控大米主要营养成分大米淀粉的消化性能和营养功能,深入系统研究所构建的大米淀粉-儿茶素复合物（3DP-REC）的抗酶解机理和抗肥胖机制,以期从新的视觉设计健康主食等淀粉类食品。研究具有前沿性和重要的科学意义,对热挤压3D打印技术应用于健康淀粉类食品的个性化定制及膳食干预防治肥胖起到积极的促进作用。采用现代结构表征技术和分子动力学模拟方法,阐明3DP-REC结构演变与抗消化性能的关系及其抗酶解机理。结果显示,热挤压3D打印可增加糊化大米淀粉的单螺旋结构、双螺旋结构、相对结晶度、纳米聚集体有序结构和表面短程有序结构,减少无定形结构,提高整体结构有序化程度;儿茶素分子的引入一方面通过疏水作用力进入直链淀粉螺旋空腔形成单螺旋复合物和V型结晶结构,及与淀粉分子发生氢键相互作用,导致形成新的双螺旋结构、纳米聚集体有序结构和局部排列致密结构等短程有序结构,进一步增加大米淀粉结构的有序化。结构有序化的提高即分子链排列更加致密能有效阻碍胰α-淀粉酶在淀粉分子中的迁移和结合,促进SDS和RS生成;另一方面3DP-REC无定形结构区域中儿茶素分子与淀粉分子形成结合力较弱的以π-π为主导、氢键为辅的相互作用,在消化环境中易发生解离,游离儿茶素与胰α-淀粉酶的Trp59位点发生结合,屏蔽淀粉与胰α-淀粉酶特异结合的正构活性位点,起到酶抑制剂的作用。可见,3DPREC的抗酶解机理为通过演变形成长程有序和短程有序结构及儿茶素解离成酶抑制剂,协同作用有效阻隔胰α-淀粉酶的降解,从而降低RDS含量,提高SDS和RS含量。结合脂质组学及肝脏转录组学等方法,从基因水平揭示不同儿茶素添加量（2.5%、5%和7.5%）的3DP-REC对高脂膳食肥胖受试鼠的抗肥胖作用机制。研究发现,3DPREC干预是通过调节肝脏糖脂代谢通路中关键基因的表达促进肝脏糖原生成和胰岛素分泌,促进脂肪酸β-氧化、肝脏胆汁酸合成、抑制脂肪酸合成及胆固醇合成来显着降低机体血糖水平,及通过降低血清磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、甘油三酯、神经酰胺、磷脂酰甘油、鞘胺醇等脂质合成改善血脂水平,从而有效抑制脂质沉积,抵御由高脂膳食引起的肥胖。此外,3DP-REC干预还可下调促炎关键基因改善肝功能代谢紊乱、炎症状态、氧化应激和由炎症引起的组织损伤。除血糖外其余的上述改善作用随3DP-REC中儿茶素含量增加而增强,3DP-7.5%REC的干预效果最佳,达到正常组水平。利用16S r RNA高通量测序等方法进一步探究3DP-REC干预对高脂膳食肥胖大鼠肠道微生态的影响及与抗肥胖的关系。结果显示,3DP-REC干预显着改善由高脂膳食引起的结肠组织损伤,通过促进胃肠道激素的表达及降低肠道中总胆汁酸水平能有效降低能量摄入和抑制脂质沉积,且干预效果存在对3DP-REC中儿茶素含量的依赖性;3DPREC干预还可促进肠道中如乳杆菌属和双歧杆菌属等有益菌的丰度,改善肠道菌群结构,尤其是通过促进产短链脂肪酸菌的生长繁殖显着提高肠道中丙酸和丁酸的含量,其中3DP-2.5%REC干预显着提高丁酸含量,3DP-5%REC干预显着提高丙酸含量;KEGG功能预测结果显示,3DP-REC干预可通过激活产热功能、调节蛋白质代谢通路等防止脂质沉积;对3DP-REC干预后差异菌群变化与机体生理代谢指标的相关性分析发现,3DPREC进入结肠后通过有效抑制Romboutsia等有害菌的生长代谢,促进Veillonella、Butyricicoccus、Ruminococcaceae、Bifidobacterium等产丙酸和丁酸有益菌的繁殖,实现对机体由高脂膳食引起的血脂紊乱、肝功能代谢异常和氧化应激损伤的改善。基于上述结果初步建立了“REC膳食干预-肠道菌群结构-肥胖相关代谢生化指标”的相互影响关系。融合TSE能量代谢监测及分子生物学方法,阐明3DP-REC对棕色脂肪组织产热功能的影响及调节能量代谢和抗肥胖作用的机制。研究表明,3DP-REC干预可显着促进棕色脂肪及米色脂肪组织中脂质分解相关关键酶和基因的表达和加快脂质分解速率,为线粒体提供能量从而显着提高UCP1蛋白的表达,激活棕色脂肪的产热功能,提高机体的能量消耗,增加静息状态下的基础代谢,改善由高脂膳食引起的胰岛素抵抗继而有效抵御脂肪沉积,降低机体体重和体脂肪含量,最终达到抗肥胖的效果。而其中干预促进室温下机体产热的效果随3DP-REC中儿茶素的含量增加趋势更为明显。上述研究表明利用热挤压3D打印协同儿茶素复合作用可有效调控大米淀粉的抗消化性能,所构建的3DP-REC具有很好的抗肥胖作用及营养功能,所获得的研究结果和提出的机理具有很好的学术价值,可望为实现个性化营养健康淀粉类食品的创制提供新的设计思路和理论指导。
刘晓亭[9]（2020）在《新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究》文中提出目前医学水平和诊断技术得到了快速的发展,但癌症的发病率和死亡率仍然处在较高水平,是威胁人类健康和生命的重大疾病之一。癌症的早期诊断和精准治疗是决定癌症能否得到成功治愈的关键因素。近年来,肿瘤标志物的不断发现为癌症早期诊断提供了保障,细胞内肿瘤标志物种类较多,表达水平也有所差异,对于一些低表达丰度的肿瘤标志物需要建立更加灵敏的分析方法。另一方面,化学治疗作为癌症治疗的经典方法之一,但化疗通常会受到化疗药物低溶解性、强的毒副作用及耐药性等问题的制约,因此,需要开发具有特定功能的纳米载体进行化疗药物的递送。本论文致力于新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送方面的应用研究。通过对目前已报道的核酸纳米载体进行总结,发现随着核酸纳米载体研究的深入,仍然存在一些不足和挑战:（1）现有的核酸纳米载体多为细胞质递送化疗药物,耐药细胞中细胞膜上过表达的外排转运体会将细胞质中的药物重新泵出细胞,降低细胞内的药物浓度,限制化疗效果,因此,如何构建药物作用位点靶向的核酸纳米载体对于提高药物的作用效果具有重要意义;（2）在应对化疗过程中出现的药物耐受性的问题上,常用的策略是利用纳米载体避开外排转运体介导的药物外排,而直接抑制外排转运体的表达是一种更根本的策略来应对药物耐受性;（3）细胞内许多肿瘤标志物的表达丰度偏低,目前多数具有细胞成像和药物递送双重功能的核酸纳米载体输出方式为1:1式,极大的限制了检测的灵敏度和药物释放,构建具有信号放大特性的核酸纳米载体来实现活细胞内肿瘤标志物的灵敏检测及药物释放是一个关键问题。基于以上问题和挑战,设计了三种新型的核酸纳米载体用于活细胞内肿瘤标志物的成像及药物递送。本文主要分为以下五章内容:第一章为绪论部分,主要分析了癌症诊断和治疗上所面临的严峻挑战,介绍了用于核酸纳米载体设计的经典核酸结构单元、金纳米颗粒,概述了核酸纳米载体在癌症诊断与治疗中的研究进展,并以此为基础总结了目前核酸纳米载体在细胞成像和药物递送上存在的问题。第二章,构建了一种内源性刺激响应核靶向的纳米载体（AuNP-mRS-DSs）用于活细胞内MRP1 mRNA的成像和药物递送。纳米载体由三部分组成:（ⅰ）金纳米颗粒（AuNP）,用于装载DNA和淬灭荧光;（ⅱ）mRNA识别序列（mRS）通过金-硫键连接到AuNP表面,用于MRP1 mRNA的特异性识别;（ⅲ）可拆卸的亚单位（DS）,由Cy5标记的DNA连接链和核仁素识别基序（含AS1411适体）杂交而成,并通过DNA连接链连接到mRS上,用于装载阿霉素（Dox）、结合核仁素及荧光信号的输出。首先,纳米载体的核仁素识别基序靶向肿瘤细胞表面过表达的核仁素,然后整个纳米载体在核仁素介导的内化作用下进入细胞。随后,mRS特异性识别过表达的MRP1 mRNA,从而释放束缚的DS,被AuNP淬灭的Cy5荧光恢复。最后,利用核仁素从细胞质到细胞核穿梭的作用,DS靶向细胞核递送Dox。细胞内荧光成像可以实现耐药细胞和非耐药细胞的区分。此外,通过荧光成像可以观察到耐药细胞中释放的可拆卸亚单位的分布。与游离阿霉素（IC50>8.00 μM）相比,将 Dox 装载到 AuNP-mRS-DSs 后对 MCF-7/ADR细胞的IC50更低为2.20 μM,这表明利用核酸纳米载体载药对耐药的乳腺癌细胞具有极好的抑制效果。该纳米载体在癌症化疗敏感性预测和耐药性的规避上具有重要意义。第三章,构建了多功能分子信标（MBs）修饰的金纳米颗粒作为纳米载体（MBs-AuNP）,用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像。MBs-AuNP由两部分构成:（ⅰ）三种特殊设计的分子信标修饰到AuNP表面,用于结合耐药相关的mRNAs,装载Dox并输出荧光信号;（ⅱ）AuNP,用于装载MBs,介导MBs进入细胞并淬灭荧光。被细胞摄取后,MBs-AuNP与三种不同的耐药相关 mRNA（MDR1 mRNA、MRP1 mRNA 和 BCRP mRNA）杂交,通过抑制mRNAs的翻译过程来减少外排蛋白的表达,同时,被AuNP淬灭的荧光团远离金纳米粒,荧光恢复,实现mRNAs的原位成像。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和蛋白印迹结果表明,经MBs-AuNP处理后耐药肿瘤细胞内耐药相关mRNA和外排蛋白的表达均有所下降。与游离Dox相比,Dox-MBs-AuNP对HepG2/ADR（IC50:0.35 vs 1.06μM）和 MCF-7/ADR（IC50:2.78 vs>5μM）具有更好的细胞毒性。通过荧光成像分析可直接观察细胞内杂交事件并实现耐药和非耐药肿瘤细胞的区分。该纳米载体能够通过基因沉默来下调多种外排蛋白的表达,实现对沉默事件的原位监测,提供了一种从基因水平应对药物耐受性的策略。第四章,构建了一种端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体（tsDNA-AuNP）用于细胞内端粒酶的活性分析及药物递送。该纳米载体由三部分构成:（ⅰ）AuNP,用于装载DNA并淬灭荧光;（ⅱ）行走链,由端粒酶引物和含DNAzyme序列的发卡结构杂交而成,用于结合端粒酶及切割底物发卡;（ⅲ）含有DNAzyme切割位点的底物发卡,用于装载阿霉素并输出荧光信号。该纳米载体内化入胞后,端粒酶引物在端粒酶的作用下发生延伸,打开含DNAzyme序列的发卡结构,释放被封闭的DNAzyme序列,然后行走链沿着三维的轨道运动,在外加Mn2+的作用下切割含DNAzyme切割位点的底物发卡,输出荧光信号并释放阿霉素,随后进行下一轮的切割反应。该方法能够实现低至10个HeLa细胞中端粒酶活性的检测,通过荧光成像的方法能够实现肿瘤细胞和正常细胞的区分,此外,该核酸纳米载体也能够用于端粒酶抑制剂的筛选。第五章为结论部分,主要总结了本论文的创新点及前景展望。
李传亚[10]（2020）在《粘度响应型荧光探针研制及其分子结构对光物理性质和细胞靶向性的影响》文中进行了进一步梳理很多物理化学因素影响细胞的正常生理活动,比如:酸度（pH）、粘度、温度、极性等。其中粘度是细胞内微环境的一个重要因素,对维持细胞内正常的生命活动有重要作用。细胞含有细胞膜和细胞质,二者都具有一定的粘性。细胞膜粘度的变化与细胞很多生理过程有密切关系,可以直接影响膜结合蛋白的活性,甚至会导致多种疾病。例如:红细胞粘度过高会引起肝功能异常,白细胞膜粘度过高会引起加速自身衰老。细胞质粘度的异常会影响到心肺功能。溶酶体粘度的异常和炎症甚至癌症相关。脂滴粘度的异常意味着细胞内脂质分布不正常,会和脂质相关疾病（肥胖、脂肪肝等）有关。线粒体粘度异常（线粒体膜粘度的异常）会和帕金森疾病、糖尿病相关。因此监测线粒体、细胞膜等细胞器的粘度变化对生理学和病理学是有意义的。荧光探针具有原位、实时、无损和高信噪比等优点,对于监测细胞内微环境变化是一个非常好的工具。分子转子型探针对粘度十分敏感,当某些D-π-A结构的分子内旋转受到限制时会引起荧光的急剧增加。我们可以利用分子转子的这一特性设计转子型荧光探针,以此来研究细胞内粘度的变化。本论文的实际意义在于开发了粘度响应型系列荧光探针,并考察了刚性结构、侧链烷基链长度和取代基等要素对光物理性质和细胞靶向性的影响。我们分别选择了以三苯胺和9-苯基-咔唑为母体,然后通过Knoevenagel机理和吡啶盐偶联后增加共轭程度来设计、合成了 TAPI-n和PCPI-n系列探针。并对TAPI-1、TAPI-6和PCPI-1、PCPI-6四个探针分子的光学性质进行了研究。通过不同极性溶剂的荧光光谱实验可以发现:探针TAPI-1对粘度比较敏感,在粘度较大的甘油中荧光强度最大,在不同极性溶剂中荧光强度相差百倍;而探针PCPI-1对粘度也有响应在不同极性溶剂中荧光强度只相差几倍。值得注意的是,探针PCPI-1的荧光量子产率要远高于探针TAPI-1的荧光量子产率。通过对TAPI-n和PCPI-n系列探针分子在不同极性溶剂的紫外吸收光谱和荧光发射光谱测试后发现,单一性改变探针的侧链烷基链长度并不改变其最大吸收峰峰位、最大荧光发射峰峰位和荧光量子产率等光学性质。通过细胞染色和荧光成像后发现,TAPI-1、TAPI-6和PCPI-1、PCPI-6探针分子因为和带负电的线粒体膜电位静电相互作用而优先靶向线粒体。TAPI-12、TAPI-16、TAPI-18探针分别靶向线粒体、脂滴和细胞膜,而PCPI-12、PCPI-16、PCPI-18探针分别靶向线粒体、细胞膜和细胞膜。通过对羟基官能团的改造,设计、合成了 HOPI-18、MOPI-18和AOPI-18三个探针分子。通过细胞染色和荧光成像后发现,HOPI-18除了靶标细胞膜之外,还存在着严重的内在化现象;而探针MOPI-18和AOPI-18只靶标细胞膜。最后,红光探针具有较好的组织穿透性和较低的光损伤,更适用于在组织中成像。我们设计的以三苯胺为母体的TAPI-n红光荧光的探针,具有较好成像组织的潜力。总之,我们设计、开发了三类具有D-π-A结构的吡啶类阳离子盐荧光探针,并研究了刚性结构、侧链烷基链长度、取代基等要素对光物理性质和细胞靶向性的影响。
二、Hela细胞膜表面LDL受体运动追踪研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Hela细胞膜表面LDL受体运动追踪研究（论文提纲范文）
（1）微纳米马达的运动控制及细胞马达的构建（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写清单 |
| 1 引言 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 微纳米马达的驱动方式 |
| 2.1.1 化学驱动 |
| 2.1.2 光驱动 |
| 2.1.3 磁场驱动 |
| 2.1.4 超声驱动 |
| 2.1.5 混合动力马达 |
| 2.2 细胞马达 |
| 2.2.1 红细胞微马达 |
| 2.2.2 巨噬细胞微马达 |
| 2.2.3 中性粒细胞微马达 |
| 2.2.4 精子微马达 |
| 2.2.5 细菌微马达 |
| 2.2.6 微藻马达 |
| 2.3 本论文主要研究内容 |
| 3 化学/光驱动的混合动力马达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂耗材 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 TiO_2微米颗粒的合成 |
| 3.2.4 TiO_2/Au/Pt马达的合成 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 TiO_2/Au/Pt马达的结构表征 |
| 3.3.2 TiO_2/Au/Pt马达的驱动原理 |
| 3.3.3 TiO_2/Au/Pt马达在单个驱动模式下的运动分析 |
| 3.3.4 TiO_2/Au/Pt马达在双驱动模式下的运动分析 |
| 3.3.5 Au层在双驱动体系中的作用 |
| 3.4 本章总结 |
| 4 超声/光驱动的混合动力微型碗状马达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂耗材 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 微型碗状马达的合成过程 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 微型碗状马达的形貌表征 |
| 4.3.2 微型碗状马达在单个驱动模式下的运动 |
| 4.3.3 微型碗状马达双驱动模式下的光学运动调控机理 |
| 4.3.4 TiO_2-Au碗状马达的光学运动控制 |
| 4.3.5 Au-TiO_2碗状马达的光学运动控制 |
| 4.3.6 微型碗状马达群体的光学调控 |
| 4.4 本章总结 |
| 5 尿素酶驱动的Janus血小板马达用于动态靶向递药 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 仪器设备 |
| 5.2.3 Urease-biotin-Cy5的制备 |
| 5.2.4 JPL-motors的合成 |
| 5.2.5 non-JPLs的合成 |
| 5.2.6 JPL-motors的表征 |
| 5.2.7 模拟尿液的配置 |
| 5.2.8 JPL-motors与细菌及癌细胞的特异性结合的表征 |
| 5.2.9 尿素酶修饰对血小板与癌细胞特异性结合能力的影响 |
| 5.2.10 JPL-motors与细菌和癌细胞特异性结合的定量和效率分析 |
| 5.2.11 JPL-motors的药物负载和释放测定 |
| 5.2.12 负载DOX的JPL-motors体外抗癌效果的评价 |
| 5.2.13 负载Cip的JPL-motors体外抗菌效果的评价 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 JPL-motors的合成及表征 |
| 5.3.2 JPL-motors的运动特征分析 |
| 5.3.3 non-JPLs的合成、表征及运动分析 |
| 5.3.4 JPL-motors与癌细胞特异性结合能力的测定 |
| 5.3.5 JPL-motors的DOX负载和释放能力评估 |
| 5.3.6 负载DOX的JPL-motors体外抗癌效果的评价 |
| 5.3.7 JPL-motors与细菌特异性结合能力的测定 |
| 5.3.8 JPL-motors的Cip负载和释放能力的评估 |
| 5.3.9 负载Cip的JPL-motors体外抗菌效果的评价 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 含有金属有机框架保护外壳的细菌微马达用作动态递药 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 材料与试剂 |
| 6.2.2 仪器设备 |
| 6.2.3 ZIF-8纳米颗粒的合成 |
| 6.2.4 ZIF-8@E. coli微马达的合成及表征 |
| 6.2.5 ZIF-8@E. coli微马达的细胞存活率评估 |
| 6.2.6 ZIF-8@E. coli微马达的运动恢复评价 |
| 6.2.7 ZIF-8@E. coli微马达的细胞保护效果评估 |
| 6.2.8 穿过Transwell小室的细菌定量 |
| 6.2.9 载药ZIF-8@E. coli微马达的体外抗癌效果评估 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 ZIF-8@E. coli微马达的合成与表征 |
| 6.3.2 ZIF-8@E. coli微马达的运动性能评价 |
| 6.3.3 ZIF-8外壳对细菌马达保护效果的评价 |
| 6.3.4 负载DOX的ZIF-8@E. coli微马达的动态递药效果评价 |
| 6.4 本章小结 |
| 7 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学研究成果 |
| 学位论文数据集 |
（2）新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及改善其免疫微环境的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1 蜂毒和蜂毒肽研究进展 |
| 1.1 蜂毒肽(melittin,MEL)简述 |
| 1.2 MEL及其偶联物研究现状 |
| 2 宫颈癌及其免疫治疗的研究进展 |
| 2.1 宫颈癌简述 |
| 2.2 宫颈癌发病机制 |
| 2.3 宫颈癌的肿瘤局部免疫细胞亚群及肿瘤微环境改变 |
| 3 Eph A2 基因研究进展 |
| 3.1 Eph受体简述 |
| 3.2 EphA2 在癌症中的功能 |
| 4 PD-L1-PD-1 免疫检查点研究进展 |
| 4.1 PD-L1-PD-1 免疫检查点的基础生物学 |
| 4.2 在癌症中调控PD-L1 表达的具体分子机制 |
| 4.3 抗PD-L1-PD-1 治疗的前景和局限性 |
| 第2章 新型融合肽UM-6 抗宫颈癌进展及其作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2 实验流程 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 UM-6 抑制宫颈癌细胞的增殖 |
| 3.2 UM-6 抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移 |
| 3.3 UM-6 抑制宫颈癌细胞HPV E6/7 的蛋白表达 |
| 3.4 UM-6 抑制EphA2 Ser897 磷酸化和其与AKT的相互作用 |
| 3.5 UM-6 促进EphA2 向溶酶体的转运和降解 |
| 3.6 UM-6 介导的 EphA2 溶酶体的降解依赖于AKT介导的 EphA2 Ser897 磷酸化 |
| 3.7 UM-6 在体内抑制宫颈移植瘤的生长 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第3章 新型融合肽UM-6 改善宫颈癌免疫微环境及作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器及试剂 |
| 2.2 实验流程 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 UM-6 恢复宿主对肿瘤的免疫,增加了CTL活性 |
| 3.2 EphA2与PD-L1 在宫颈癌中呈正相关并调控PD-L1 的表达 |
| 3.3 EphA2和PD-L1 在宫颈癌中高表达,而这两种蛋白在宫颈癌中有高度相关性 |
| 3.4 UM-6 能够抑制PD-L1 糖基化 |
| 3.5 UM-6 能够抑制PD-L1的ER-Golgi易位 |
| 3.6 UM-6 可能通过内质网相关性降解(ERAD)途径下调PD-L1 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所获得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）基于侧链调控/修饰策略的细胞膜电位状态监测、线粒体长程追踪、细胞活性监测荧光探针（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 荧光简介 |
| 1.2 荧光显微镜 |
| 1.2.1 荧光显微镜的结构 |
| 1.2.2 激光扫描共聚焦显微镜 |
| 1.3 荧光探针识别机理 |
| 1.3.1 分子内电荷转移（Intramolecular Charge Transfer，ICT) |
| 1.3.2 光诱导电子转移（Photoinduced Electron Transfer，PET) |
| 1.3.3 荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET) |
| 1.3.4 激发态分子内质子转移（Excited-State Intramolecular Proton Transfer，ESIPT) |
| 1.3.5 激基缔合物/复合物（excimer/exciplex) |
| 1.3.6 聚集诱导发光（Aggregation Induced Emission, AIE) |
| 1.4 侧链调控对荧光探针的影响 |
| 1.4.1 侧链对荧光探针透膜性的影响 |
| 1.4.2 侧链可作为第二靶向基团 |
| 1.5 细胞膜电位探针 |
| 1.5.1 细胞膜电位 |
| 1.5.2 细胞膜电位探针的研究现状 |
| 1.6 线粒体追踪探针 |
| 1.6.1 线粒体 |
| 1.6.2 线粒体追踪探针的研究现状 |
| 1.7 细胞活性探针 |
| 1.7.1 细胞活性 |
| 1.7.2 细胞活性荧光探针的研究现状 |
| 1.8 脂滴探针 |
| 1.8.1 脂滴 |
| 1.8.2 脂滴探针的研究现状 |
| 1.9 本论文的主要内容与创新 |
| 参考文献 |
| 第二章 荧光探针的合成与表征 |
| 2.1 细胞膜电位状态监测荧光探针 |
| 2.2 线粒体长程追踪荧光探针 |
| 2.3 细胞活性监测荧光探针 |
| 2.4 脂滴探针 |
| 第三章 基于侧链调控策略的细胞膜电位状态监测荧光探针 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 探针设计 |
| 3.3 实验装置与方法 |
| 3.3.1 紫外吸收光谱与荧光发射光谱 |
| 3.3.2 荧光量子产率的计算 |
| 3.3.3 细胞培养及染色 |
| 3.3.4 细胞毒性实验 |
| 3.3.5 荧光成像 |
| 3.4 探针的光物理性质 |
| 3.5 探针染色不同膜电位状态下的细胞 |
| 3.5.1 SiHa细胞的染色实验 |
| 3.5.2 Hela细胞与Fibroblast细胞的染色实验 |
| 3.5.3 其它染料染色不同膜电位状态下的细胞 |
| 3.6 与S-11348的复染实验 |
| 3.7 胞吞对探针染色跨膜运输的影响 |
| 3.8 对照分子CPS的染色实验 |
| 3.9 消除线粒体膜电位后的染色实验 |
| 3.10 与线粒体探针的复染实验 |
| 3.11 细胞膜电位恢复实验 |
| 3.12 探针染色条件的研究 |
| 3.13 光稳定性实验 |
| 3.14 细胞毒性实验 |
| 3.15 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于侧链修饰策略的线粒体长程追踪荧光探针 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 探针设计 |
| 4.3 实验装置与方法 |
| 4.3.1 紫外吸收光谱与荧光发射光谱 |
| 4.3.2 荧光量子产率的计算 |
| 4.3.3 细胞培养及染色 |
| 4.3.4 细胞毒性实验 |
| 4.3.5 荧光成像 |
| 4.4 探针的光物理性质 |
| 4.5 探针SP-3的细胞染色实验 |
| 4.6 探针SP-NBD的细胞染色实验 |
| 4.7 探针SP-3染色消除线粒体膜电位的SiHa细胞 |
| 4.8 探针SP-NBD染色消除线粒体膜电位的SiHa细胞 |
| 4.9 探针SP-NBD动态监测线粒体自噬 |
| 4.10 光稳定性实验 |
| 4.11 细胞毒性实验 |
| 4.12 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 基于侧链调控策略的细胞活性监测荧光探针 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 探针设计 |
| 5.3 实验装置与方法 |
| 5.3.1 紫外吸收光谱与荧光发射光谱 |
| 5.3.2 荧光量子产率的计算 |
| 5.3.3 细胞培养及染色 |
| 5.3.4 细胞毒性实验 |
| 5.3.5 荧光成像 |
| 5.4 探针的光物理性质 |
| 5.5 活细胞染色实验 |
| 5.6 固定细胞染色实验 |
| 5.7 探针ECPS同时染色活SiHa细胞与固定SiHa细胞 |
| 5.8 探针ECPS选择性染色活SiHa细胞群落中的死细胞 |
| 5.9 探针ECPS在活细胞与固定细胞上的跨膜运输 |
| 5.10 探针ECPS染色H_2O_2诱导的凋亡细胞 |
| 5.11 侧链调控策略的普适性 |
| 5.12 探针SQ同时染色活SiHa细胞与固定SiHa细胞 |
| 5.13 探针SQ在活细胞群落中选择性染色死细胞 |
| 5.14 探针SQ染色H_2O_2诱导的凋亡细胞 |
| 5.15 原位光谱 |
| 5.16 光稳定性实验 |
| 5.17 细胞毒性实验 |
| 5.18 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 通过官能团的简单修饰得到脂滴探针的初步探索 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 探针设计 |
| 6.3 实验装置与方法 |
| 6.3.1 紫外吸收谱与荧光发射谱 |
| 6.3.2 荧光量子产率的计算 |
| 6.3.3 细胞培养及染色 |
| 6.3.4 细胞毒性实验 |
| 6.3.5 荧光成像 |
| 6.4 探针的光物理性质 |
| 6.5 探针的活细胞染色实验 |
| 6.6 探针的固定细胞染色实验 |
| 6.7 探针BPANA与尼罗红的复染实验 |
| 6.8 探针BPANA染色油酸处理的SiHa细胞 |
| 6.9 探针BPANA染色二甲苯处理的SiHa细胞 |
| 6.10 探针BPANA的适用性研究 |
| 6.11 原位光谱测试 |
| 6.12 光稳定性实验 |
| 6.13 细胞毒性实验 |
| 6.14 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 总结与展望 |
| 7.1 论文总结 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 有待开展的工作 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文、专利、获奖情况 |
| 附录 |
| 附件 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）以免疫分子PDCD4为靶点的抗抑郁药物的设计、制备及作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 一、程序性细胞死亡因子4 |
| 二、抑郁症 |
| 三、抗抑郁药物 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 一、材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究 |
| (一) PDCD4小干扰RNA (siPdcd4)上调神经细胞BDNF的表达 |
| (二) PDCD4小干扰RNA抑制小胶质细胞IL-6和IL-1 β的表达 |
| (三) RVG-9dR多肽携带siRNA特异性进入神经细胞 |
| (四) RVG/siPdcd4特异性沉默神经细胞PDCD4上调BDNF的表达 |
| (五) RVG/siPdcd4逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用. |
| (六) RVG/siPdcd4抑制小胶质细胞IL-6和1L-1 β的表达 |
| (七) RVG-9dR携带siPdcd4跨过血脑屏障靶向入脑 |
| (八) RVG/siPdcd4靶向沉默海马和前额叶皮质PDCD4的表达 |
| (九) RVG/siPdcd4逆转CRS对海马和前额叶皮质BDNF的抑制作用. |
| (十) RVG/siPdcd4抑制CRS诱导的IL-6和IL-1β的表达 |
| (十一) RVG/siPdcd4通过修复神经突触可塑性缓解CRS诱导的抑郁样行为 |
| 二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究 |
| (一) PDCD4结合eIF4A关键序列的筛选与设计 |
| (二) eIF4A-VI通过干扰PDCD4与eIF4A结合上调BDNF的表达 |
| (三) 9R-eIF4A-VI干扰多肽靶向结合PDCD4 |
| (四) 干扰多肽特异性干扰PDCD4与eIF4A的结合 |
| (五) 干扰多肽逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用 |
| (六) 干扰多肽显着上调神经细胞BDNF的表达 |
| (七) 干扰多肽逆转神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用 |
| (八) 海马区注射干扰多肽显着逆转CRS对BDNF的抑制作用 |
| (九) 干扰多肽通过修复神经突触可塑性缓解CRS诱导的抑郁样行为 |
| 三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究 |
| (一) PDCD4配体小分子的筛选 |
| (二) PDCD4配体小分子上调神经细胞BDNF的表达 |
| (三) PDCD4配体小分子逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用 |
| (四) PDCD4配体小分子逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用 |
| (五) 腹腔注射小分子ZHJ-204显着上调抑郁小鼠BDNF的表达 |
| (六) 腹腔注射小分子ZHJ-204缓解CRS诱导的抑郁样行为 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间主要科研成果及获得荣誉 |
| 附件一 英文文章1 |
| 附件二 英文文章2 |
| 附件三 综述 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 免疫印迹原始结果 |
（5）台湾人饮食习惯对高血脂之影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 饮食习惯 |
| 第二节 高血脂 |
| 第三节 高血脂之中医方剂 |
| 第二章 研究设计 |
| 第一节 观念性研究架构与研究方法 |
| 第二节 研究对象与抽样方法 |
| 第三节 临床研究实施步骤 |
| 第四节 数据分析方法 |
| 第三章 研究成果 |
| 第一节 研究个案背景分析 |
| 第二节 临床问诊与投药方剂分析 |
| 第三节 病患自我健康促进与饮食调整分析 |
| 第四节 治疗成效差异分析 |
| 第四章 结论 |
| 第一节 研究结论 |
| 第二节 研究意涵 |
| 第三节 研究限制 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1:中医师参与研究意愿调查表暨同意书 |
| 附录2:高血脂患者参与研究意愿调查表暨同意书 |
| 附录3:中医诊所治疗高血脂症问诊及用药纪录 |
| 附录4:高血脂患者日常饮食习惯纪录表 |
| 附录5:在校期间发表论文 |
| 附录6:致谢 |
| 附件 |
（6）外泌体膜荧光分析与成像方法的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 外泌体的生物形成、释放、细胞摄取 |
| 1.1.2 外泌体组成 |
| 1.2 外泌体的分离纯化方法 |
| 1.2.1 超速离心法 |
| 1.2.2 尺寸排阻色谱法 |
| 1.2.3 聚合物沉淀法 |
| 1.2.4 超滤法 |
| 1.2.5 免疫亲和分离法 |
| 1.2.6 微流控芯片法 |
| 1.3 外泌体的定量方法 |
| 1.3.1 BCA蛋白定量法定量 |
| 1.3.2 纳米颗粒跟踪分析仪定量 |
| 1.3.3 小颗粒流式细胞仪定量 |
| 1.3.4 纳米流式检测装置定量 |
| 1.4 外泌体在肿瘤诊断与治疗中的研究进展 |
| 1.4.1 外泌体在肿瘤诊断中的应用 |
| 1.4.2 大小不同外泌体在肿瘤诊断中的作用 |
| 1.4.3 大小尺寸不同外泌体的测定 |
| 1.4.4 外泌体在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.5 外泌体相关成像研究进展 |
| 1.5.1 有机染料标记的外泌体成像研究 |
| 1.5.2 荧光蛋白标记的外泌体成像研究 |
| 1.5.3 免疫荧光标记的外泌体成像研究 |
| 1.5.4 外泌体内容物标记后的成像研究 |
| 1.6 外泌体膜的检测分析 |
| 1.7 研究思路 |
| 2 外泌体的分段采集方法 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 仪器与材料 |
| 2.2.1 仪器 |
| 2.2.2 试剂和材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 试剂配制 |
| 2.3.2 PEG法分离外泌体 |
| 2.3.3 尺寸排阻色谱法分离外泌体 |
| 2.3.4 超滤法分离外泌体 |
| 2.3.5 大小尺寸不同外泌体样本的分段分离 |
| 2.3.6 外泌体的动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)表征 |
| 2.3.7 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.3.8 蛋白免疫印迹 |
| 2.3.9 pCD63-EGFP重组质粒构建流程 |
| 2.3.10 细胞转染实验步骤 |
| 2.3.11 受体HeLa细胞摄取EGFP标记的外泌体实验 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 不同方法分离纯化的外泌体鉴定 |
| 2.4.2 标记外泌体的pCD63-EGFP真核重组质粒构建 |
| 2.4.3 pCD63-EGFP质粒转染HeLa细胞后稳定转染细胞系的筛选 |
| 2.4.4 受体HeLa细胞摄取绿色荧光蛋白(EGFP)标记的外泌体 |
| 2.4.5 三种不同外泌体分离纯化方法的比较 |
| 2.4.6 大小尺寸不同外泌体的分段分离 |
| 2.4.7 乳腺癌病人血清来源的外泌体的分离和鉴定 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 外泌体比率荧光定量方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 仪器与材料 |
| 3.2.1 仪器 |
| 3.2.2 试剂和材料 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 外泌体标准液的制备 |
| 3.3.2 BCA蛋白定量法标准曲线的制作 |
| 3.3.3 荧光染料母液的制备 |
| 3.3.4 最优染料A和最优染料B筛选的荧光光谱测定 |
| 3.3.5 膜染料染色后的外泌体共聚焦荧光成像 |
| 3.3.6 卵磷脂定量标准曲线的建立 |
| 3.3.7 外泌体总膜脂质定量法(MLA)标准曲线的建立 |
| 3.3.8 外泌体样品浓度的测定 |
| 3.3.9 BCA蛋白定量法对外泌体样本进行定量测定 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 外泌体比率荧光定量法所需染料A的筛选 |
| 3.4.2 外泌体比率荧光定量法所需染料B的筛选 |
| 3.4.3 总膜脂质测定法(MLA)的建立 |
| 3.4.4 总膜脂质测定法(MLA)标准曲线的制作 |
| 3.4.5 比率荧光定量法测定生物样品来源的外泌体 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 大小不同外泌体的荧光寿命成像研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 仪器与材料 |
| 4.2.1 仪器 |
| 4.2.2 试剂和材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 膜特异性粘度敏感探针Mem-BDP的合成 |
| 4.3.2 粘度敏感Mem-BDP探针的光物理性质测定 |
| 4.3.3 细胞培养以及细胞培养基中外泌体的分离 |
| 4.3.4 外泌体的荧光寿命成像 |
| 4.3.5 总膜脂质测定(MLA)法标准曲线的制作以及样品测定 |
| 4.3.6 数据统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 膜特异性粘度敏感探针Mem-BDP的设计与合成 |
| 4.4.2 膜特异性粘度敏感探针Mem-BDP的粘度响应 |
| 4.4.3 大小尺寸不同外泌体的荧光寿命成像(FLIM) |
| 4.4.4 来源于肿瘤细胞和正常细胞外泌体的荧光寿命成像(FLIM) |
| 4.4.5 解释不同来源外泌体荧光寿命值的差异性 |
| 4.4.6 来源于乳腺癌病人血清的外泌体荧光寿命(FLIM)成像 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 外泌体基因编码改造以及超分辨成像研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 仪器与材料 |
| 5.2.1 仪器 |
| 5.2.2 试剂和材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 pCD63-PAmcherry真核重组质粒构建 |
| 5.3.2 细胞瞬时转染及稳定转染HeLa细胞系筛选 |
| 5.3.3 PAmcherry荧光蛋白标记外泌体的共聚焦荧光成像 |
| 5.3.4 膜染料和荧光蛋白共标记的外泌体与HeLa细胞孵育共聚焦成像 |
| 5.3.5 免疫荧光和荧光蛋白共标记的外泌体与HeLa细胞孵育共聚焦成像 |
| 5.3.6 光激活荧光蛋白PAmcherry标记外泌体的单分子定位超分辨成像 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 pCD63-PAmcherry真核重组质粒构建 |
| 5.4.2 荧光蛋白标记外泌体的共聚焦荧光成像 |
| 5.4.3 pCD63-PAmcherry真核质粒稳定转染细胞系的筛选 |
| 5.4.4 PAmcherry荧光蛋白标记外泌体的共聚焦荧光成像 |
| 5.4.5 膜染料和荧光蛋白共标记的外泌体与HeLa细胞孵育共聚焦成像 |
| 5.4.6 免疫荧光和荧光蛋白共标记的外泌体与HeLa细胞孵育共聚焦成像 |
| 5.4.7 光激活荧光蛋白PAmcherry标记外泌体的单分子定位超分辨成像 |
| 5.4.8 HUVEC细胞摄取PAmcherry标记外泌体的单分子定位超分辨成像 |
| 5.4.9 pCD63-EGFP瞬时转染的HeLa细胞荧光寿命成像 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 支撑信息 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（7）小分子荧光探针在超分辨成像中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 超分辨荧光成像技术 |
| 1.1.1 普通光学显微镜的分辨极限 |
| 1.1.2 常见超分辨成像技术的类型 |
| 1.1.3 超分辨显微镜的应用及发展 |
| 1.2 常规超分辨成像的荧光探针 |
| 1.2.1 荧光蛋白 |
| 1.2.2 荧光染料 |
| 1.3 新型小分子荧光标记探针 |
| 1.3.1 基因表达探针 |
| 1.3.2 非基因表达探针 |
| 1.3.3 有机合成探针 |
| 1.4 小分子荧光标记在超分辨成像中的应用 |
| 1.4.1 生物正交反应 |
| 1.4.2 活细胞超分辨成像 |
| 1.4.3 单分子示踪 |
| 1.5 本论文研究目的和意义 |
| 第2章 适配体标记用于细胞膜糖分子GalNAc的超分辨成像 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 玻片清洗 |
| 2.2.3 凝集素连接荧光染料 |
| 2.2.4 适配体染色 |
| 2.2.5 超分辨样品的制备 |
| 2.2.6 超分辨成像 |
| 2.2.7 定位精度的测量 |
| 2.2.8 SR-Tesseler簇分析方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 适配体标记用于GalNAc的超分辨成像 |
| 2.3.2 适配体探针与凝集素探针的定位精度 |
| 2.3.3 SR-Tesseler方法分析GalNAc在细胞膜上形成的簇 |
| 2.3.4 适配体探针的特异性 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 适配体标记用于研究癌症相关分子globo H的分布特征 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 凝集素与染料的连接 |
| 3.2.3 适配体标记 |
| 3.2.4 超分辨样品的制备 |
| 3.2.5 超分辨成像 |
| 3.2.6 Hopkins统计的随机性检验 |
| 3.2.7 基于坐标的共定位分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 适配体标记的globo H在MCF-7细胞膜上的超分辨成像 |
| 3.3.2 定量分析globo H形成的簇 |
| 3.3.3 Globo H在癌细胞和非癌细胞上的分布 |
| 3.3.4 Globo H与其他癌症相关糖分子的分布关系 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 小分子肽标记用于研究细胞膜EpCAM蛋白的组装机理 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 细胞培养 |
| 4.2.2 质粒构建与转染 |
| 4.2.3 siRNA敲除CD9 |
| 4.2.4 抗体和小分子肽标记 |
| 4.2.5 超分辨样品的制备 |
| 4.2.6 超分辨成像 |
| 4.2.7 图像重构 |
| 4.2.8 FRC分辨率测量 |
| 4.2.9 SR-Tesseler簇分析 |
| 4.2.10 簇到簇距离的测量 |
| 4.2.11 对相关函数分析 |
| 4.2.12 CBC共定位分析 |
| 4.2.13 互相关函数共定位分析 |
| 4.2.14 基于镶嵌的共定位分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 小分子肽标记用于EpCAM超分辨成像 |
| 4.3.2 定量分析EpCAM蛋白簇 |
| 4.3.3 EpCAM蛋白簇部分共定位于四跨膜蛋白CD9微区 |
| 4.3.4 肌动蛋白骨架与糖基化影响EpCAM蛋白的聚集 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 适配体AS1411用于核仁素的超分辨成像 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 抗体与染料的连接 |
| 5.2.3 适配体标记 |
| 5.2.4 抗体标记 |
| 5.2.5 超分辨样品的制备 |
| 5.2.6 超分辨成像 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 适配体AS1411用于超分辨成像 |
| 5.3.2 不同细胞组分NCL分布的差异 |
| 5.3.3 癌细胞和正常细胞NCL分布的比较 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 抑制剂探针用于研究PSMA在细胞膜上的分布模式 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 细胞培养 |
| 6.2.2 染料与抗体连接 |
| 6.2.3 样品制备 |
| 6.2.4 超分辨成像 |
| 6.2.5 图像重构 |
| 6.2.6 共定位分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 抑制剂探针用于PSMA的超分辨成像 |
| 6.3.2 抑制剂探针与抗体探针标记的比较 |
| 6.3.3 定量分析PSMA簇 |
| 6.3.4 PSMA簇与叶酸受体(FR)共定位关系 |
| 6.4 本章小结 |
| 第7章 论文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（8）热挤压3D打印构建大米淀粉-儿茶素复合物的消化性能及抗肥胖机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肥胖概述 |
| 1.1.1 肥胖产生的影响因素及危害 |
| 1.1.2 肥胖与能量代谢 |
| 1.1.3 肥胖与胰岛素抵抗 |
| 1.1.4 肥胖与血脂代谢 |
| 1.1.5 肥胖与肠道微生物 |
| 1.1.6 肥胖对其他生理功能的影响 |
| 1.2 肥胖的预防及营养干预 |
| 1.2.1 肥胖的治疗与预防 |
| 1.2.2 碳水化合物及其营养功能 |
| 1.2.3 淀粉的消化性能与营养功能 |
| 1.3 淀粉消化性能调控 |
| 1.3.1 淀粉酶与淀粉消化性能 |
| 1.3.2 淀粉多尺度结构与消化性能 |
| 1.3.3 淀粉多尺度结构修饰对其消化性能的调控 |
| 1.3.4 热挤压3D打印技术调控淀粉的多尺度结构 |
| 1.4 本论文的研究意义、研究目标和研究内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究目标 |
| 1.4.3 研究内容 |
| 第二章 热挤压3D打印协同儿茶素复合调控大米淀粉消化性能的机理研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 主要实验材料 |
| 2.2.2 主要实验仪器及设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 热挤压3D打印大米淀粉-儿茶素复合物的制备 |
| 2.3.2 热挤压3D打印大米淀粉-儿茶素复合物消化性能的测定 |
| 2.3.3 热挤压3D打印大米淀粉-儿茶素复合物螺旋结构的测定 |
| 2.3.4 热挤压3D打印大米淀粉-儿茶素复合物表面短程有序结构的测定 |
| 2.3.5 热挤压3D打印大米淀粉-儿茶素复合物结晶结构的测定 |
| 2.3.6 热挤压3D打印大米淀粉-儿茶素复合物表面分形及糊体系亚微观结构的测定 |
| 2.3.7 分子对接技术 |
| 2.3.8 分子动力学模拟 |
| 2.3.9 数据分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 热挤压3D打印大米淀粉-儿茶素复合物的消化性能 |
| 2.4.2 热挤压3D打印大米淀粉-儿茶素复合物的螺旋结构 |
| 2.4.3 热挤压3D打印大米淀粉-儿茶素复合物的表面分子短程有序化结构 |
| 2.4.4 热挤压3D打印大米淀粉-儿茶素复合物的结晶结构 |
| 2.4.5 热挤压3D打印大米淀粉-儿茶素复合物的分形结构 |
| 2.4.6 热挤压3D打印大米淀粉-儿茶素复合物糊体系的亚微观结构 |
| 2.4.7 大米淀粉-儿茶素复合物消化性能与多尺度结构的相关性分析 |
| 2.4.8 大米淀粉-儿茶素复合物与胰α-淀粉酶分子间相互作用的分子动力学模拟 |
| 2.4.9 热挤压3D打印协同儿茶素复合调控大米淀粉消化性能的分子机制 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 大米淀粉-儿茶素复合物对高脂膳食肥胖大鼠脂代谢及肝脏转录组的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器设备 |
| 3.2.1 主要实验试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器与设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 动物实验方案及饮食设计 |
| 3.3.2 样品采集及处理 |
| 3.3.3 组织切片观察 |
| 3.3.4 血清生化指标测定 |
| 3.3.5 血清脂质组学测定 |
| 3.3.6 肝脏组织中基因的表达量测定 |
| 3.3.7 肝脏转录组测序 |
| 3.3.8 数据分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 大米淀粉-儿茶素复合物对肥胖受试鼠体重的影响 |
| 3.4.2 大米淀粉-儿茶素复合物对受试鼠血糖的影响 |
| 3.4.3 大米淀粉-儿茶素复合物对受试鼠血脂的影响 |
| 3.4.4 大米淀粉-儿茶素复合物对受试鼠肝功能指标的影响 |
| 3.4.5 大米淀粉-儿茶素复合物对受试鼠氧化应激指标的影响 |
| 3.4.6 大米淀粉-儿茶素复合物对受试鼠组织切片的影响 |
| 3.4.7 大米淀粉-儿茶素复合物对受试鼠血清脂质代谢的影响 |
| 3.4.8 大米淀粉-儿茶素复合物对肝脏组织基因相对表达量的影响 |
| 3.4.9 大米淀粉-儿茶素复合物对受试鼠肝脏转录组的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 大米淀粉-儿茶素复合物对高脂膳食肥胖大鼠肠道微生态的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器设备 |
| 4.2.1 主要实验试剂 |
| 4.2.2 主要实验仪器与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 组织切片观察 |
| 4.3.2 肠道中短链脂肪酸的测定 |
| 4.3.3 胃肠激素水平测定 |
| 4.3.4 肠道中总胆汁酸水平测定 |
| 4.3.5 粪便脂质组学测定 |
| 4.3.6 肠道微生物检测 |
| 4.3.7 数据分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠结肠组织的影响 |
| 4.4.2 大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠肠道短链脂肪酸含量的影响 |
| 4.4.3 大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠胃肠激素水平的影响 |
| 4.4.4 大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠肠道胆汁酸及肠道脂代谢影响 |
| 4.4.5 大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠肠道微生物的影响 |
| 4.4.6 大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠生理生化指标与肠道菌群相关性的分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 大米淀粉-儿茶素复合物对肥胖小鼠能量代谢及棕色脂肪调节作用的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器设备 |
| 5.2.1 主要实验试剂 |
| 5.2.2 主要实验仪器与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 动物实验方案及饲养 |
| 5.3.2 受试鼠活体脂肪和肌肉含量分析及代谢水平、能量支出监测 |
| 5.3.3 受试鼠低温造模、体温及体表温度测定 |
| 5.3.4 胰岛素耐量试验 |
| 5.3.5 取材及处理方法 |
| 5.3.6 血清中生化指标测定 |
| 5.3.7 脂肪组织形态学观察 |
| 5.3.8 脂肪组织基因表达量测定 |
| 5.3.9 免疫印迹试验 |
| 5.3.10 数据分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠体重及体脂比的影响 |
| 5.4.2 大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠胰岛素耐受性的影响 |
| 5.4.3 大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠血脂和血浆游离脂肪酸的影响 |
| 5.4.4 室温环境下大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠能量代谢的影响 |
| 5.4.5 大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠体温的影响 |
| 5.4.6 大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠脂肪组织形态学的影响 |
| 5.4.7 大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠i BAT和 ing WAT中产热相关基因及蛋白表达的影响 |
| 5.4.8 室温环境下大米淀粉-儿茶素复合物干预对受试鼠iBAT中脂代谢相关基因及蛋白表达的影响 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（9）新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩写 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 癌症的诊断与治疗 |
| 1.1.1 癌症的诊断 |
| 1.1.2 癌症的治疗 |
| 1.1.3 癌症的诊疗一体化 |
| 1.2 经典的核酸结构单元用于设计纳米载体 |
| 1.2.1 核酸适配体 |
| 1.2.2 脱氧核酶 |
| 1.2.3 分子信标 |
| 1.2.4 双链探针 |
| 1.3 金纳米颗粒 |
| 1.3.1 金纳米颗粒的理化性质 |
| 1.3.2 金纳米颗粒分布、代谢性质和毒理研究 |
| 1.3.3 金纳米颗粒在癌症诊疗中的应用研究 |
| 1.4 核酸纳米载体在癌症诊断和治疗中的研究进展 |
| 1.4.1 具有荧光特性的核酸纳米探针用于肿瘤细胞成像 |
| 1.4.2 核酸纳米载体在药物递送中的研究 |
| 1.4.3 基于核酸纳米载体的癌症诊疗一体化研究 |
| 1.5 本论文解决的科学问题及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 内源性刺激响应核靶向的纳米载体用于细胞内mRNA成像及药物递送 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 凝胶电泳实验 |
| 2.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及AuNP-mRS-DSs的制备 |
| 2.2.4 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量考察 |
| 2.2.5 特异性考察 |
| 2.2.6 杂交实验 |
| 2.2.7 细胞系及细胞培养 |
| 2.2.8 细胞内荧光成像实验 |
| 2.2.9 qRT-PCR对MRP1 mRNA进行分析 |
| 2.2.10 细胞摄取 |
| 2.2.11 阿霉素插入实验 |
| 2.2.12 细胞存活率考察 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 2.3.2 AuNP-mRS-DSs的表征 |
| 2.3.3 金纳米颗粒表面mRS-DS的修饰量及AuNP-mRS-DSs的特异性考察 |
| 2.3.4 AuNP-mRS-DSs的选择性考察 |
| 2.3.5 细胞内荧光成像 |
| 2.3.6 细胞摄取 |
| 2.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 2.3.8 细胞存活率考察 |
| 2.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 多功能分子信标修饰的金纳米颗粒作为纳米载体用于活细胞内耐药相关mRNA的协同抑制及原位成像 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂和仪器 |
| 3.2.2 凝胶电泳实验 |
| 3.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的合成及MBs-AuNP的制备 |
| 3.2.4 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.2.5 可行性与稳定性实验 |
| 3.2.6 细胞系及细胞培养 |
| 3.2.7 细胞内荧光成像 |
| 3.2.8 MDR1 mRNA、MRP1 mRNA和BCRP mRNA的相对表达水平分析 |
| 3.2.9 Western blotting实验 |
| 3.2.10 阿霉素插入实验 |
| 3.2.11 细胞毒性实验 |
| 3.2.12 统计学分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 3.3.2 MBs-AuNP的表征 |
| 3.3.3 金纳米颗粒表面分子信标的修饰量考察 |
| 3.3.4 可行性及稳定性考察 |
| 3.3.5 细胞内荧光成像 |
| 3.3.6 MBs-AuNP对细胞内耐药相关mRNA和蛋白水平的影响 |
| 3.3.7 纳米载体的载药量考察 |
| 3.3.8 细胞存活率实验 |
| 3.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 端粒酶特异性的DNAzyme驱动的DNA walker作为纳米载体用于活细胞内端粒酶活性分析及药物递送 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂和仪器 |
| 4.2.2 凝胶电泳实验 |
| 4.2.3 金纳米颗粒(AuNPs)的制备 |
| 4.2.4 tsDNA-AuNP的制备及其表面底物发卡修饰量的考察 |
| 4.2.5 细胞培养及HeLa细胞提取液的制备 |
| 4.2.6 HeLa细胞提取液中端粒酶活性检测 |
| 4.2.7 tsDNA-AuNP的稳定性考察 |
| 4.2.8 细胞内端粒酶活性的成像分析 |
| 4.2.9 TERT mRNA的相对表达水平分析 |
| 4.2.10 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.2.11 阿霉素插入实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 DNA序列设计的可行性验证 |
| 4.3.2 tsDNA-AuNP的表征 |
| 4.3.3 tsDNA-AuNP的可行性和稳定性考察 |
| 4.3.4 行走链与底物发卡修饰比例的考察 |
| 4.3.5 tsDNA-AuNP检测性能的考察 |
| 4.3.6 细胞内端粒酶活性分析的条件优化 |
| 4.3.7 不同细胞内端粒酶活性分析 |
| 4.3.8 端粒酶抑制剂的筛选 |
| 4.3.9 纳米载体的载药量考察 |
| 4.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 附录 |
| 附件 |
（10）粘度响应型荧光探针研制及其分子结构对光物理性质和细胞靶向性的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 绪论 |
| 引言 |
| 1.1 荧光简介 |
| 1.1.1 荧光现象 |
| 1.1.2 荧光探针技术 |
| 1.1.2.1 荧光过程 |
| 1.1.2.2 荧光光谱 |
| 1.1.2.3 荧光检测 |
| 1.1.2.4 荧光信号 |
| 1.1.2.5 背景荧光 |
| 1.1.2.6 多色标记 |
| 1.2 荧光分子设计原理 |
| 1.2.1 光诱导电子转移(Photoinduced Electron Transfer, PET) |
| 1.2.2 分子内电荷转移(Intramolecular charge transfer, ICT) |
| 1.2.2.1 分子内电荷转移(ICT) |
| 1.2.2.2 扭曲的分子内电荷转移(TICT) |
| 1.2.2.3 分子转子 |
| 1.2.3 荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET) |
| 1.2.4 激发态分子内质子转移过程(Excited-state intramolecular photon transfer,ESIPT) |
| 1.2.5 激基缔合物和激基复合物(Exciplex/excimer) |
| 1.2.6 聚集诱导荧光增强(Aggregation-induced emission, AIE) |
| 1.2.7 H-聚集体和J-聚集体(H-aggregation and J-aggregation) |
| 1.3 生理粘度与荧光粘度探针 |
| 1.3.1 细胞内粘度的生理功能及其作用 |
| 1.3.2 粘度的传统检测办法 |
| 1.4 粘度响应型荧光探针的研究进展 |
| 1.4.1 细胞膜粘度响应型荧光探针的研究进展 |
| 1.4.2 线粒体粘度响应型荧光探针的研究进展 |
| 1.4.3 脂滴粘度响应型荧光探针的研究进展 |
| 1.5 本论文的主要内容和创新 |
| 参考文献 |
| 第二章 探针的合成与表征 |
| 2.1 TAPI-n系列粘度响应型荧光探针的合成 |
| 2.1.1 TAQ合成: |
| 2.1.2 PI-n合成 |
| 2.1.2.1 PI-1 |
| 2.1.2.2 PI-6 |
| 2.1.2.3 PI-12 |
| 2.1.2.4 PI-16 |
| 2.1.2.5 PI-18 |
| 2.1.3 TAPI-n合成 |
| 2.2 PCPI-n系列粘度响应型荧光探针的合成 |
| 2.2.1 PC合成 |
| 2.2.2 PCQ合成 |
| 2.2.3 PI-n合成 |
| 2.2.4 PCPI-n合成 |
| 2.3 “HOPI-n”系列粘度响应型荧光探针的合成 |
| 2.3.1 PI-n合成 |
| 2.3.2 HOPI-n合成 |
| 2.3.3 MOPI-18合成 |
| 2.3.4 AOPI-18合成 |
| 第三章 刚性结构对三苯胺及咔唑粘度探针性能的影响 |
| 引言 |
| 3.1 粘度型荧光探针的设计思路 |
| 3.2 实验方法及其测试手段 |
| 3.2.1 光谱测试 |
| 3.2.2 荧光量子产率的测定 |
| 3.2.3 细胞培养和染色 |
| 3.2.4 细胞毒性测试 |
| 3.2.5 细胞荧光成像 |
| 3.3 探针体外光谱性质的测试及其对线粒体的选择性 |
| 3.3.1 探针的吸收、发射性能的测试 |
| 3.3.1.1 TAPI-n探针的吸收、发射性能的测试 |
| 3.3.1.2 PCPI-n探针的吸收、发射性能的测试 |
| 3.3.2 探针对不同比例粘度响应的测试 |
| 3.3.2.1 TAPI-n探针对不同比例甘油响应的测试 |
| 3.3.2.2 PCPI-n探针对不同比例粘度响应的测试 |
| 3.4 荧光成像线粒体 |
| 3.5 机理讨论 |
| 3.6 探针的细胞毒性 |
| 3.7 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 长烷基侧链对三苯胺及咔唑粘度探针性能的影响 |
| 引言 |
| 4.1 粘度探针的设计以及实验方法 |
| 4.1.1 探针的设计思路 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 光学性能的测试 |
| 4.2.1 探针TAPI-n性能的测试 |
| 4.2.2 探针PCPI-n性能的测试 |
| 4.3 探针TAPI-n和PCPI-n的细胞成像 |
| 4.3.1 探针TAPI-n的细胞成像 |
| 4.3.2 探针PCPI-n的细胞成像 |
| 4.4 探针的细胞毒性 |
| 4.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 改变官能团的萘吡啶盐系列粘度响应型荧光探针 |
| 引言 |
| 5.1 粘度探针的设计以及实验方法 |
| 5.1.1 探针的设计思路 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 光学性能的测试 |
| 5.3 探针HOPI-n、AOPI-18和MOPI-18的细胞成像 |
| 5.3.1 探针HOPI-1和HOPI-6的细胞成像 |
| 5.3.2 探针HOPI-18、AOPI-18和MOPI-18的细胞成像 |
| 5.4 毒性测试 |
| 5.5 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 论文内容小结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 有待开展的工作 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、Hela细胞膜表面LDL受体运动追踪研究（论文参考文献）
- [1]微纳米马达的运动控制及细胞马达的构建[D]. 唐颂颂. 北京科技大学, 2021(08)
- [2]新型融合肽UM-6抗宫颈癌进展及改善其免疫微环境的机制研究[D]. 贺佳星. 吉林大学, 2021(01)
- [3]基于侧链调控/修饰策略的细胞膜电位状态监测、线粒体长程追踪、细胞活性监测荧光探针[D]. 张华淼. 山东大学, 2021(10)
- [4]以免疫分子PDCD4为靶点的抗抑郁药物的设计、制备及作用研究[D]. 贾玉峰. 山东大学, 2021(11)
- [5]台湾人饮食习惯对高血脂之影响研究[D]. 卢慈香. 广州中医药大学, 2020(09)
- [6]外泌体膜荧光分析与成像方法的研究[D]. 李宁. 大连理工大学, 2020
- [7]小分子荧光探针在超分辨成像中的应用[D]. 荆莹莹. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [8]热挤压3D打印构建大米淀粉-儿茶素复合物的消化性能及抗肥胖机理研究[D]. 郑波. 华南理工大学, 2020
- [9]新型核酸纳米载体的设计及在肿瘤细胞成像和药物递送中的应用研究[D]. 刘晓亭. 山东大学, 2020(08)
- [10]粘度响应型荧光探针研制及其分子结构对光物理性质和细胞靶向性的影响[D]. 李传亚. 山东大学, 2020(11)