一、抗新疆出血热病毒单克隆抗体识别病毒蛋白质的实验观察（论文文献综述）
王倩[1]（2021）在《云南蜱病毒的发现及其复合感染的流行病学调查研究》文中研究说明[背景]蜱是最早被确认可将病原体传播给人类的媒介节肢动物,是世界上仅次于蚊子的第二大传染病媒介,可以感染、传播和贮存的病原体包括病毒、细菌和原虫等,且通常会同时携带多种病原体。病毒是蜱传病原体的重要组成部分。目前,已经从蜱中发现了至少160种病毒,其中25%左右与人类和/或动物的病毒感染性疾病有关,主要以各种硬蜱作为传播媒介。其中,正内罗病毒隶属于布尼亚病毒目、内罗病毒科,是有包膜且基因组不连续（由大、中和小三段单股负链组成）的RNA病毒,其中一些会引起人类和动物严重疾病。Tamdy正内罗病毒至少包括五种不同型别,其在多种蜱中广泛分布,且被报道与人类疾病以及脊椎动物感染有关。此外,还有近年来报道的与蜱咬病人发热疾病有关、属于黄病毒科荆门病毒群的荆门蜱病毒（Jingmen tick virus,JMTV）和Alongshan virus（ALSV）两种蜱传分节段RNA病毒,以及致病性尚未明确的新发蜱病毒 South Bay Virus（SBV）和 Black-legged tick phlebovirus（BTPV）等。目前,对这些新型蜱传病毒的研究相对较少,因此,有必要对其进行探索和研究。自1982年以来,我国大陆已经发现了由近30种不同蜱类传播的33种新发蜱传病原体,其中立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫等细菌和原虫最为常见,感染后可分别引起人和动物立克次体病、无形体病、埃立克体病、莱姆病、蜱传回归热、巴贝西虫病以及泰勒虫病。此外,一种蜱可以同时携带和传播多种病原体,几种蜱媒疾病往往共存于同一自然疫源地。被复合感染的蜱类叮咬的人和动物的症状会更加复杂,预后更差。因此,新发蜱传病原体的流行及其复合感染将对人类和动物健康构成严重威胁。宏转录组学具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等优势,同时结合生物信息学工具,可以有效获得病毒的全基因组信息,还可以在保守的宿主基因背景下,无偏倚的量化病毒丰度,为揭示病毒的遗传多样性、挖掘新病毒、以及防控新发传染病等提供重要技术支持。当前,融合病原学（病原体特征及其致病性）、生态学（生态环境、传播媒介和宿主动物）全面、系统的自然疫源地调查研究已成为蜱媒病研究的发展趋势。我国蜱种丰富,蜱媒传染病的自然疫源地复杂、流行形势严峻,因此需要对其深入调查研究。[目的]1.对我国南方地区七个省/直辖市的蜱进行病毒组筛查,获得其携带的病毒谱,识别新病毒。2.获得新发现的蜱病毒的分离株,进一步研究其遗传特性和生物学特性,评价其对人类的感染性和致病性。3.了解不同地域、不同蜱种中,成功分离的新的蜱病毒以及其他多种新发蜱传病原体的感染与复合感染情况。[方法]1.蜱标本采集、鉴定:在我国不同地区选择有代表性的地理景观作为采样点,于2017～2019年在蜱活跃的高峰季节进行蜱类标本的采集。游离蜱采用拖旗法采集,寄生蜱则通过控制或者捕获家畜或野生动物后采集,之后对其进行形态学鉴定。2.宏转录组测序、分析:提取蜱标本的RNA并检测其浓度、纯度和完整性,之后构建宏转录组测序文库并测序。使用生物信息学分析软件,对测序产生的数据分别进行病毒基因组的发现和组装以及相对转录本丰度量化等。3.病毒分离培养、鉴定:将蜱标本分别接种到HUVEC、Vero 81和IDE8细胞上进行病毒分离,盲传三代后提取细胞培养物RNA进行高通量测序筛查。待获得病毒分离株后,对其全基因组进行测序,并运用生物信息学分析软件进行进一步的结构和功能预测、同源性分析、系统发育分析和重组分析;建立病毒检测方法和生长复制曲线;采用超薄切片电镜观察病毒的形态特征;通过间接免疫荧光实验和RNA荧光原位杂交实验观察病毒在不同细胞中的感染情况;同时通过间接免疫荧光实验对哨点医院收集的蜱咬病人双份血清标本进行病毒筛查。4.蜱携带病原体检测:将蜱标本研磨并提取其核酸;使用特异性引物,采用一步法荧光定量RT-PCR对蜱标本中的云南蜱病毒（Yunnan tick virus,YNTV）进行筛查,并通过一步法RT-PCR扩增YNTV的大、中和小三个片段;采用SYBRGreen荧光定量 RT-PCR 筛查蜱标本中的 Tacheng tick virus 1（TTV1）、Tamdy virus（TDYV）、JMTV、ALSV、SBV和BTPV 1～3;采用普通/半巢式/巢式PCR对蜱标本中的立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫进行检测;在Mega7.0软件中对测序产生的序列进行系统发育分析;采用卡方检验或Fisher确切检验比较不同地点以及不同蜱种中各种病原体的感染情况。[主要结果]1.宏转录组测序结果:本研究共构建了 93个测序文库,得到3473838929条原始reads,3362776236条高质量reads（cleanreads）以及28413469条平均长度为592 nt的contigs。其中有22930535条reads可以注释到病毒相关序列,且以未分类病毒为主,其余病毒共分为65个科。2.云南蜱病毒分离培养、鉴定结果:从云南剑川猛突血蜱幼蜱的HUVEC细胞培养物中分离到一株新的正内罗病毒,将其暂时命名为云南蜱病毒（YNTV）。①YNTV为负链RNA病毒,其基因组共分为大、中和小三个片段,其长度分别为12077nt、4489nt和2057nt,分别编码含有3255、1357和492个氨基酸的大蛋白、糖蛋白前体以及核衣壳蛋白·;②仅中片段具有信号肽和跨膜螺旋区,大、中和小片段中分别有6个、9个和1个潜在的糖基化位点,且大片段编码的氨基酸序列中存在Pre-Motif A以及Motif A～E 6个保守的motif;③同源性分析显示,YNTV与Tamdy正内罗病毒的核苷酸同源性（41.8%～68.0%）和氨基酸同源性（44.2%～63.2%）均高于其与其他正内罗病毒的核苷酸（29.3%～44.2%）和氨基酸（18.4%～32.2%）同源性,表明YNTV是一种新的Tamdy正内罗病毒型别;④YNTV与正内罗病毒代表株基于三个片段氨基酸全长序列的系统发育分析显示,其在进化上属于Tamdy正内罗病毒,且大片段和小片段均与2012年从我国豪猪血蜱中检测到的Wenzhou tick virus（WTV）处于同一进化分支,中片段则与我国西北地区蜱咬发热病人中分离的TTV1 QH1亲缘关系更近;⑤重组分析显示,YNTV大、中和小三个片段的全基因序列整体上均与WTV的同源性最高,但其大片段在6750～7000 bp以及8000～8250 bp的位置与TDYV和Songling virus（SGLV）的同源性更高,中片段在2700～3200 bp、小片段在625～850 bp的位置分别与TTV1和SGLV的同源性更高,表明YNTV分离株的三个片段均存在重组信号;⑥基于YNTV大片段和小片段建立的标准曲线分别为:x（大）=（39.99-y（大））/3.390和x（小）=38.48-y（小）)/3.152,其中y为Ct值,病毒载量为10x;⑦病毒生长复制曲线结果显示,YNTV在IDE8和C6/36两种细胞系中基本没有生长,在Vero 81细胞中生长缓慢并在接种后的第144 h即达到生长的平台期,但其可以在BHK-21和HUVEC两种细胞中迅速复制并在感染的第168 h达到生长的平台期,且YNTV的病毒载量变化趋势在五种受感染细胞的冻融物和培养上清中基本一致;⑧YNTV可引起HUVEC细胞产生致细胞病变效应,表现为细胞皱缩、变圆以及折光度增加,而在受感染的BHK-21和Vero 81细胞中则无CPE;⑨YNTV病毒颗粒为有包膜的球体,直径大约80～100 nm;⑩间接免疫荧光实验和RNA荧光原位杂交实验结果显示,YNTV能够有效感染HUVEC、BHK-21和Vero 81三种细胞;（11）牡丹江林业中心医院93例蜱咬病人的急性期和恢复期双份血清标本YNTV筛查结果为阴性,说明其均未感染YNTV。3.蜱传病毒检测结果:YNTV的总阳性率为1.34%,仅在广西和云南的卵形硬蜱、爪哇花蜱和猛突血蜱中检出,且蜱标本中测得的YNTV片段与该病毒分离株在进化树上聚集在一起,形成不同于其他Tamdy正内罗病毒的独立分支;JMTV的总阳性率为3.23%,在广西、重庆、贵州和黑龙江4省/直辖市的龟形花蜱、豪猪血蜱、爪哇花蜱、全沟硬蜱和微小扇头蜱中检出;在吉林省的嗜群血蜱中检测到1份 BTPV 1 阳性样本;TTV1、TDYV、ALSV、SBV、BTPV2 和 BTPV 3 六种病毒的检测结果均为阴性。4.蜱传细菌和原虫检测结果:共从8个省/直辖市的14种（豪猪血蜱和镰形扇头蜱除外）356只蜱（阳性率为47.85%）中检测到24种已知病原体（6种立克次体、4种无形体、4种埃立克体、3种螺旋体、3种巴贝西虫和4种泰勒虫）以及17种未定种病原体（4种立克次体、4种无形体、3种埃立克体、2种螺旋体和4种巴贝西虫）。立克次体、无形体、埃立克体、螺旋体、巴贝西虫和泰勒虫的平均感染率分别为33.87%、10.89%、2.15%、4.44%、1.75%和3.23%,且其在不同地点以及不同蜱种中的感染率差异均具有统计学意义。5.蜱标本中病原体的复合感染情况:采集的16种744只蜱中,共9种76只（10.22%）存在复合感染情况,龟形花蜱中的复合感染发生率最高,其次为嗜龟花蜱和猛突血蜱。有69只蜱同时携带两种病原体,另外7只蜱则同时携带三种病原体,以立克次体和无形体的复合感染最为常见。此外,在猛突血蜱中还存在YNTV与立克次体或/和无形体复合感染的情况,在龟形花蜱、全沟硬蜱和微小扇头蜱中存在JMTV与多种不同细菌/原虫复合感染的情况。[结论]1.我国南方地区蜱类携带的病毒种类多样,且以未分类病毒为主。2.从云南的猛突血蜱中分离到一株新的Tamdy正内罗病毒,将其命名为云南蜱病毒（YNTV）,其基因组结构和功能与典型的正内罗病毒相似,且在其三个片段的全基因序列中均有重组事件的发生。3.YNTV具有正内罗病毒的典型形态特征;可以感染多种哺乳动物细胞系并在其中生长复制,且引起HUVEC细胞产生CPE,提示其具有潜在致病性。4.YNTV主要在我国云南和广西的蜱类中分布,卵形硬蜱、爪哇花蜱和猛突血蜱为其可能的传播媒介,且其可以与立克次体和无形体发生复合感染。5.我国蜱类中存在多种病毒、细菌和原虫的感染与复合感染,此外,还有一些潜在的新病原,反映了我国蜱类携带病原体的高度多样性和复杂性。[创新点]1.本研究从云南的猛突血蜱中分离到一株新的正内罗病毒,在未发现其可以感染人之前即对其相关特性进行了初步研究,为后续评价其致病性等奠定了基础。2.本研究对我国南方约一半省/直辖市地区内近10种蜱携带的病毒组进行了全面调查,为后续蜱传病毒的深入研究及蜱媒病毒性疾病的防控提供理论依据。3.本研究对我国3种不同动物地理区划内近20种蜱携带的9种新发蜱传病毒以及6种新发蜱传细菌和原虫的感染与复合感染情况进行了广泛筛查,为了解蜱媒传染病风险地域及制定相应精准防控策略和措施提供科学依据。
李瑜[2]（2021）在《内源性逆转录病毒Gag单克隆抗体制备及检测》文中提出1型糖尿病（Type 1 Diabetes,T1D）是一种好发于儿童和青少年时期的自身免疫性疾病,以胰岛β细胞永久性破坏为特征。目前对于触发T1D发生的自身抗原尚不清楚,尽管可用识别胰岛细胞抗原的抗体来协助T1D诊断,但针对这些抗原进行的免疫耐受治疗并未在临床上取得很好的疗效。为做好T1D的早期诊断,我们需要去寻找诱发T1D的自身免疫反应的始动抗原,进一步去探索T1D发生和胰岛损伤的病理机制,供于T1D的预防、早期诊断和确诊。内源性逆转录病毒（Endogenous retrovirus,ERV）是已整合到基因组的古老逆转病毒的残留物,包含Gag和Env。逆转录病毒元件可能作为新抗原使细胞致敏,从而触发自身免疫反应。课题组前期研究发现:来自于NOD小鼠胰岛的间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）可以释放高度免疫刺激的微泡（Microvesicles,MVs）或外泌体（Exosomes,EXOs）能够诱导自身反应性的B细胞和T细胞。重要的是,EXOs表达ERV Gag抗原。通过构建敲除Gag蛋白(GagKD)的EXOs,发现Gag是激活自身反应性T细胞的核心抗原。因此,Gag抗原很有可能是一种新的自身抗原。非肥胖型糖尿病小鼠（Non-obese diabetic mice,NOD）是一种能自发T1D的模型鼠,发病过程和病理变化与人患T1D过程相似,是T1D研究的重要模型鼠。通过对幼年NOD小鼠、发病前期NOD小鼠胰腺染色观察Gag抗原在胰岛中的表达,找寻Gag抗原与T1D发病的联系。主要得到以下结果:1)分析从NOD雌性小鼠胰岛中克隆出的命名为Gag 194的氨基酸序列,选取了Gag 194 193’-vsrlrgrrdppavdstts-210’多肽为靶点制备ERV Gag单克隆抗体;2)通过KLH偶联Gag多肽免疫小鼠,我们得到了5株单克隆抗体,分别是1F4C8、2D4C6、3C3B9、4D6B3、5F9E4,其抗体亚型均为Ig G2b;3)通过ELISA和蛋白质印迹实验（Western Blot,WB）检测抗体效价和特异性,我们观察到制备的5株单克隆抗体在特异性、敏感性和抗原谱上存在一定的差异。最后,我们选取了3株单克隆抗体（1F4C8、2D4C6、5F9E4）进行生物素化标记;4)通过免疫组织化学实验观察Gag抗原在NOD小鼠和T1D抗性的C57BL/6小鼠胰腺胰岛中的表达情况及与疾病发生的联系。我们使用幼年NOD小鼠、成年NOD小鼠、幼年C57BL/6、成年C57BL/6胰腺冰冻切片进行组织染色。观察到,3株单克隆抗体均能识别表达在NOD小鼠胰岛的Gag抗原,抗原的表达与NOD小鼠的年龄无关,而C57BL/6小鼠胰岛不表达Gag蛋白。另外,Gag抗原在胰岛中的分布多在β细胞区域,而浸润胰岛的淋巴细胞很明显并不表达该抗原。因此NOD小鼠胰腺表达ERV Gag抗原可能受其特异的基因型控制,并且在幼年时期就已经开始表达。以上结果为将来进一步研究Gag蛋白是否是始动抗原诱发自身免疫反应以及如何诱发自身免疫反应提供了新思路,制备的单克隆抗体为T1D的基础研究提供了至关重要的工具。
徐淮[3]（2019）在《抗猪繁殖与呼吸综合征病毒糖蛋白单克隆抗体的研制及多肽ELISA检测抗体方法的建立》文中认为猪繁殖与呼吸障碍综合征俗称蓝耳病,是目前认为猪最重要的传染病之一,每年给养猪业带来的巨大的经济损失。该病由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起,典型的临床症状主要表现为母猪的繁殖障碍,感染猪体温升高和呼吸道疾病。高致病性PRRSV毒株的感染可以引起更严重的临床体征,肺部病变和异常宿主免疫应答。根据基因组同源性差异,PRRSV已划分为PRRSV1和PRRSV2两个不同的种。该病的诊断主要包括病原学诊断和血清学诊断。本研究通过大肠杆菌系统表达了 PRRSV的糖蛋白GP3,GP4和GP5,通过免疫动物获得了针对GP3和GP5的多克隆抗体以及针对GP4的单克隆抗体,为PRRSV的结构蛋白功能的研究,建立检测PRRSV抗原方法奠定了基础。同时本实验尝试以多肽为包被抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,并优化反应条件,为PRRS的快速诊断和我国养猪业健康发展提供条件。1.PRRSV糖蛋白单克隆抗体的制备本研究首先合成了针对猪繁殖与呼吸综合征病毒RD2007株GP3,GP4和GP5的特异性引物,利用PCR技术从病毒RNA中扩增相关基因。成功构建了原核表达载体pET32a-PRRSV-GP3,pET32a-PRRSV-GP4 和 pET32a-PRRSV-GP5,将其转化入 BL21 感受态细胞,经IPTG诱导表达,对表达的菌体进行超声波破碎,取离心后的上清和沉淀分别进行SDS-PAGE分析,结果成功表达出大小分别约为40KD,30KD和30KD的目的蛋白。Western-blot 结果显示三个重组蛋白均与鼠抗 His 单抗反应,GP3 和 GP5 蛋白能与猪抗 PRRSV 多抗血清反应,表明其反应原性较好。纯化后的pET32a-PRRSV-GP3,pET32a-PRRSV-GP4和pET32a-PRRSV-GP5分别与佐剂乳化后免疫6-8周龄BALB/c雌性小鼠,三次免疫后测小鼠血清抗体效价,结果三种不同蛋白均能诱导小鼠产生特异抗体;对免疫效果最好的GP4免疫小鼠进行加强免疫,三天后取脾脏与骨髓瘤细胞进行融合,用感染PRRSV病毒的Marc145细胞板固定后作为检测抗原,对融合成功的杂交瘤细胞进行IFA筛选。阳性杂交瘤进行亚克隆,最后获得了针对PRRSV GP4蛋白的单克隆抗体,命名为PRRSV-GP4-1F11。2.PRRSV多肽ELISA抗体检测方法的建立以合成的多肽为包被抗原,建立PRRSV抗体检测的间接ELISA方法。对该方法进行优化,确定最佳多肽包被浓度,最佳血清稀释度,最佳封闭液和封闭时间,最佳一抗和二抗反应时间,最佳显色时间。通过优化条件后验证ELISA检测方法的特异性、可重复性。实验结果显示,该方法与PRRSV阳性血清反应,与其他常见猪病病毒（猪瘟病毒CSFV、猪伪狂犬病毒PRV、猪流行性腹泻病毒PEDV等）的多抗血清不反应,显示该方法特异性强。此外,此方法的批间和批内变异系数均小于10%,说明其具有良好的可重复性。用建立的间接ELISA检测方法分别检测133份送检猪血清,结果显示GP3/4-ELISA 阳性检出率为78.6%,GP5-ELISA 阳性检出率为81.6%。这些结果说明,不同包被蛋白在检测PRRSV抗体时有一定差异,对疫苗免疫效果和感染评价有一定指导意义。
赵冠宇[4]（2019）在《表达高致病性猪蓝耳病GP3、GP5基因DNA疫苗构建及实验免疫研究》文中研究指明猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）引起猪繁殖与呼吸综合征,其特征是易感猪生殖健康状况变差,死亡率升高,特别是在幼龄动物和呼吸系统疾病中。它是世界范围内猪肉生产国的重要疾病,导致母猪繁殖失败和仔猪呼吸道疾病,这会导致区域性疾病的发生和慢性经济损失。GP5蛋白分子量约为25kDa,含有中和抗原表位,通常认为中和抗体的产生与它密切相关。GP3是分子量约为28kDa的高度糖基化结构蛋白,通常认为它对可能影响蛋白的中和活性。该病毒具有已知最高的RNA病毒突变率之一,是开发保护性疫苗的主要障碍,DNA疫苗在疫苗生产中显示了较好的应用前景,可引起宿主产生体液免疫及细胞免疫的免疫应答反应,以达到预防和治疗疾病的目的。本试验以美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GD株GP3、GP5基因为研究对象,以pVAX1为载体,构建重组核酸疫苗质粒pVAX-N35HP,并对构建的质粒进行鉴定。将鉴定正确的核酸疫苗质粒pVAX-N35HP与佐剂A1、A2、A3、A4、A8联合使用,免疫分组为pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2、pVAX-N35HP+A3、pVAX-N35HP+A4和pVAX-N35HP+A8,对小鼠及健康仔猪的免疫效果进行评价。实验期间小鼠每周采血分离血清,检测中和性抗体、GP3和GP5抗体、IL-4及IFN-γ水平;处死后分离脾淋巴细胞进行T淋巴细胞亚群数量的检测。结果表明,pVAX-N35HP+A3组中和性抗体滴度最高,达到1:16,与商品化灭活疫苗抗体滴度相同;pVAX-N35HP+A3组IL-4水平达到165.74 pg/μl,高于商品化灭活疫苗组;IFN-γ水平达到342.67 pg/μl,高于商品化灭活疫苗组;淋巴细胞亚群检测结果显示,pVAX-N35HP+A1组具有最高CD3+CD4+T淋巴细胞百分数,为24.37%,略低于商品化灭活疫苗组;pVAX-N35HP组具有最高CD3+CD8+T淋巴细胞百分数,达到45.21%,高于商品化灭活疫苗组T细胞百分数。表明pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2和pVAX-N35HP+A3可引起小鼠较强的细胞免疫和体液免疫,具有良好的免疫效果。选择小鼠免疫效果较好的pVAX-N35HP+A1、pVAX-N35HP+A2和pVAX-N35HP+A3免疫仔猪,进行猪体免疫效果评价。免疫后仔猪每周前腔静脉采血,分离血清进行中和性抗体和细胞因子等检测,35天时无菌分离外周血淋巴细胞进行T细胞亚类鉴定,同时准备攻毒保护试验,攻毒毒株为PRRSV GD株,攻毒剂量2×105TCID50。攻毒后每天检测仔猪直肠体温,观察仔猪健康状态,14天后剖杀猪只,采集心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结和颌下淋巴结进行病毒载量检测,制作肺部组织病理切片。结果显示,pVAX-N35HP+A1组和pVAX-N35HP+A3组具有最高的中和抗体滴度,达到1:18,低于商品化灭活疫苗组,但统计差异不显着（p>0.05）;pVAX-N35HP+A1具有最高的IFN-γ水平,达到227.37 pg/μl,是pVAX-N35HP组1.22倍,但统计学差异不显着（p>0.05）,高于商品化灭活疫苗组,统计学差异显着（p<0.05）;pVAX-N35HP+A3组IL-4水平最高,为136.77 pg/μl,高于商品化灭活疫苗组,且统计学差异极显着（p<0.01）;pVAX-N35HP+A1组CD3+CD4+T淋巴细胞百分数为36.16%与商品化灭活疫苗组统计学无差异（p>0.05）;pVAX-N35HP+A3组CD3+CD8+T淋巴细胞百分数达到62.37%,略高于商品化灭活疫苗组,统计学无差异（p>0.05）;攻毒后每日观察仔猪状态,各免疫组体温及健康状态均好于阴性对照组;攻毒后14天,检测组织内病毒载量,肺部检测结果显示pVAX-N35HP+A1组最低,为2.14×103 copies/g,低于商品化灭活疫苗组,pVAX-N35HP组、pVAX-N35HP+A2组和pVAX-N35HP+A3组高于商品化灭活疫苗组但处于相同数量级。颌下淋巴结检测结果显示pVAX-N35HP+A1组最低,为7.25×103 copies/g,低于商品化灭活疫苗组。腹股沟淋巴结检测结果显示pVAX-N35HP+A1组最低,为8.70×103 copies/g,低于商品化灭活疫苗组。肺部病理切片结果显示各免疫组肺部结构均好于阴性对照组。pVAX-N35HP+A3可显着提高仔猪体内细胞免疫和体液免疫水平,强毒攻击时显示良好的保护效果,可作为预防和保护仔猪免受高致病性猪繁殖与呼吸综合征的候选疫苗,为未来的疫苗研制提供参考。
王立珍[5]（2019）在《细胞穿膜肽TAT介导猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体Nb6抗病毒感染的研究》文中认为猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）是一种以猪繁殖障碍和呼吸疾病为特征的病毒性传染病,是目前造成全球养猪业巨大经济损失的重要传染病之一。该病由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起。PRRSV以高变性、免疫抑制、持续性感染及抗体依赖性增强为特征,现有疫苗的群体保护力较低,尚无有效的抗病毒药物。PRRSV非结构蛋白Nsp9是RNA依赖的RNA聚合酶,在不同毒株间高度保守,被认为是抗PRRSV药物的一个重要靶标。在先前的研究中,本实验室成功制备出一株PRRSV Nsp9特异性纳米抗体Nb6,并且证明细胞内表达的Nb6可以显着抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制。然而,由于纳米抗体不能有效穿过细胞膜,因此不能进入细胞达到抗病毒的作用。因此,制备安全、有效和无细胞毒性的细胞内递送系统对于提高Nb6的抗病毒活性至关重要。细胞穿透肽（cell penetrating peptides,CPPs）是一类含有约5-30个氨基酸的短肽,可以通过直接易位或内吞作用等方式进入细胞内,且不会引起细胞毒性。目前,CPPs已经被用作向细胞内递送各种货物的工具,例如质粒DNA,siRNA,蛋白质,病毒,成像剂和其他各种纳米颗粒等。TAT蛋白（HIV-1 trans-activator）是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）反式激活因子,是最早被报道的CPPs。目前已有关于TAT与纳米抗体融合蛋白在癌症治疗中的研究报道,结果表明其具有显着的抗癌效果,并有望被开发为新型抗癌药物。然而,关于CPPs在PRRSV防控中的应用尚未有研究报道。基于以上背景,本研究利用原核表达系统成功表达TAT-Nb6融合蛋白,对其穿膜及抗PRRSV功能进行验证,并对Nb6的抗病毒机制进行初步探索,为抗PRRSV纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。主要研究内容及结果如下:1.细胞穿膜肽TAT介导纳米抗体穿膜的研究本研究首先利用原核表达表达系统获得TAT-Nb6融合蛋白。通过Overlap PCR扩增获得TAT-Nb6基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-21b中,构建pET-21b-TAT-Nb6重组表达质粒。该重组质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞中,IPTG诱导后,获得以包涵体形式表达的TAT-Nb6融合蛋白。经Ni-NTA亲和层析柱纯化、复性和浓缩得到高纯度的TAT-Nb6,并通过ELISA方法验证了TAT-Nb6与PRRSV Nsp9重组蛋白具有很强的结合力。然后将TAT-Nb6分别加入到MARC-145细胞和PAMs细胞的培养基中,与细胞进行共孵育,并利用Western blot、间接免疫荧光和流式细胞术检测两种细胞内TAT-Nb6的量。实验结果表明,TAT能够介导纳米抗体Nb6进入两种细胞,并且呈时间和剂量依赖性。随后对细胞活性进行检测,发现TAT-Nb6浓度≤30μM时对两种细胞均没有细胞毒性。我们进一步验证了TAT-Nb6在猪体内的穿膜能力,免疫组织化学实验结果表明,TAT-Nb6在所有的收集的组织中都有分布。本部分研究结果表明,原核表达的TAT-Nb6融合蛋白不仅可以与PRRSV Nsp9重组蛋白发生互作,同时具有进入细胞的能力。2.TAT-Nb6抗PRRSV的研究本研究通过病毒感染实验来研究TAT-Nb6的抗PRRSV功能。结果表明,TAT-Nb6可以抑制PRRSV基因1型（GZ11-G1）与2型（SD16、JX-A1、GD-HD、VR-2332）毒株在MARC-145细胞系或原代PAM细胞上的增殖,并且呈剂量依赖性。同时发现TAT-Nb6对PRRSV的抑制效果在不同毒株间存在差异。为了初步探索Nb6抗PRRSV的机制,我们利用酵母双杂交技术寻找Nb6与Nsp9的结合区域。结果表明,Nb6与Nsp9互作位点位于Nsp9羧基端的两个不连续区域:Nsp9aa454-551和Nsp9aa599-646。进一步对Nsp9 aa 454-646氨基酸同源性进行分析,结果发现基因1型不同毒株间同源性达到92.2%-100%,2型毒株间达到92.7%-100%,而两种基因型之间同源性只有77.7-81.3%。综上所述,本研究成功表达了TAT-Nb6融合蛋白,该蛋白能够进入到PRRSV感染的细胞内,并发挥抗病毒作用,具有开发为抗PRRSV新型药物的潜力。同时对Nb6抗PRRSV的机制进行初步探索,为抗PRRSV纳米抗体药物的研发提供一定的理论基础。
郭恒西[6]（2014）在《出血热病毒与人蛋白质相互作用的初步研究》文中认为出血热（hemorrhagic fever）是危害人类健康的重要传染病，即流行性出血热，又称肾综合征出血热，是由病毒引起以鼠类为主要传染源的自然疫源性疾病。出血热的病原为病毒，属布尼亚病毒科的一个新属，称为汉坦病毒属。汉坦病毒的核酸为单链、负性RNA型，分大（L）、中（M）、小（S）三个不同片段，分别编码L蛋白、G1和G2蛋白、NP蛋白，其中L蛋白为多聚酶，G1、G2为包膜糖蛋白，NP为核蛋白。众所周知，病原体蛋白质与宿主蛋白质的相互作用是感染性疾病发生的基础，目前国内外已经开展了幽门螺杆菌、疱疹病毒、疟原虫、鼠疫菌、病毒性肝炎、流感病毒等病原体与宿主蛋白质的相互作用网络研究，而未见出血热病毒与宿主蛋白相互作用的报道，并且其致病机制尚不明确，因此开展出血热病毒与宿主细胞蛋白质相互作用网络研究对提高出血热的防治能力具有重要作用。利用酵母双杂交（Y2H）技术筛选人脾cDNA文库中与流行性出血热病毒AMRV H8205毒株的G2相互作用的蛋白质。共筛选到211个猎物，符合阅读框的177个，其回转验证阳率约为85%。与Y.pestis、EBV、HCV、H5N1的筛库数据均有不同程度的重合。核转录因子NF-κB（Nuclear factor-κB）是响应环境变化的一个至关重要的转录因子，是机体中重要的参与免疫调节与炎症反应的信号通路，参与机体的免疫调节、炎症反应、细胞黏附、生长、分化、凋亡等多个生物学过程。Ribosomal proteinS3（RPS3）是NF-kB的一个亚基并直接调节其特定的下游靶基因的转录。在G2蛋白筛库结果中，RPS3共筛到6次，通过外源免疫共沉淀以及GST-PullDown实验证明G2与RPS3存在蛋白质相互作用。GST-Pull Down实验确定G2与RPS3的相互作用结构域为RPS3（42-243aa）。报告基因实验结果表明G2增强NF-κB转录活性，Real-time PCR结果表明G2显着上调NF-κB通路中依赖于RPS3的下游靶基因的mRNA水平。干涉RPS3后，G2对NF-κB转录活性的影响消失，对其下游靶基因的上调作用也消失。同时G2能够增强RPS3与Imp-α/IKKβ的相互作用，促进RPS3的磷酸化和入核。综上所述，G2能够通过增强IKKβ对RPS3的磷酸化，进而促进RPS3的入核来激活NF-κB信号通路，影响其下游靶基因的表达水平。实验结果提示我们，RPS3在出血热病毒G2蛋白的致病过程中发挥着重要作用，这一发现在分子水平上对流行性出血热的预防和治疗提供了一种新的理论依据和思路。
肖跃强[7]（2014）在《兔出血症病毒遗传变异分析及抗原抗体检测方法的建立与应用》文中研究说明采用动物回归实验分离了4株RHDV毒株，命名为SQ-1、SQ-2、DB-1、BJ-1株，其中SQ-1株不能凝集人“O”型红细胞。克隆病毒VP60蛋白基因，核苷酸序列进化树分析显示，4毒株同属RHDVa变异群，其中SQ-2株位于RHDVa群进化树分支最底端，氨基酸序列进化树分析显示，SQ-2株病毒独立位于RHDVa进化树与原始毒株进化树分支之外，并位于最底端；序列同源性比对分析显示，SQ-1、SQ-2、DB-1、BJ-1株与其它毒株核苷酸序列同源性分别在89.5%-98.0%、91.4%-95.6%、90.2%-98.7%、89.7%-97.6%之间，氨基酸序列同源性分别在94.1%-99.3%、94.8%-96.5%、94.4%-99.5%、94.0%-99.3%之间；通过与血凝性、无血凝性毒株氨基酸序列分析比对发现，SQ-1株VP60蛋白第432、480位氨基酸残基可能对该毒株血凝特性产生一定影响；根据流行年代分析了RHDVa已经发生的变异流行趋势与未来可能的变异方向，304、305、414、425与432氨基酸位点已经演变，近期流行毒株开始出现13、237、299、309、324、346、348与351氨基酸位点变异；RHDVa与原始群毒株存在12个氨基酸残基差异及多个交互变异位点。根据已发表及本研究所克隆VP60蛋白的核苷酸序列，设计合成特异性引物，经反应条件的优化，建立了基于SYBR Green I荧光染料的RHDV Real-timeRT-PCR检测方法。通过敏感性、重复性、标准曲线建立等表明，该方法可检出的最低拷贝数为101，较普通RT-PCR敏感性高一个数量级。实际应用结果显示，Real-time RT-PCR方法检测阳性率为74.8%，而普通RT-PCR方法检测阳性率为65.5%。同时，建立了RT-LAMP检测方法，通过评价特异性、敏感性、检出时间以及临床应用等指标，证实该方法能够特异、敏感的检测RHDV感染，酶切扩增产物证实，该方法能够特异性的扩增；其敏感性高，可检出的拷贝数在102以上，而且临床检出阳性率较普通RT-PCR高；扩增反应可在30min内完成，缩短了检测耗时；动物攻毒试验证实，以上两种方法的检出阳性率均为100%。利用原核表达技术获得了RHDV重组截短的VP60蛋白，并以重组VP60蛋白为诊断抗原，建立了检测RHDV抗体的ELISA诊断方法，检测RHDV阳性血清的最低抗体效价高稀释比例为1:6400，并具有良好的特异性，批内、批间重复变异系数分别小于4.9%、6.9%，与血凝抑制试验（HI）的符合率为94.4%；检测河南、山东、河北等地采集的1710份兔血清样品，检测阳性率为81.5%。同样，利用原核表达体系表达VP60完整蛋白，纯化可溶性部分，利用胶体金标记技术，根据免疫层析原理，以胶体金标记的SPA（金黄色葡萄球菌蛋白A）作为探针，以纯化得到的VP60重组蛋白和纯化的兔IgG分别作为检测线和质控线的捕获试剂，研制并建立了RHDV抗体免疫胶体金快速检测方法。该方法特异性强，敏感性高，较血凝抑制方法高4倍；批间、批内重复均无差异性，临床应用显示，胶体金试纸条检测抗体阳性率为90.0%，而血凝抑制检测抗体阳性率为68.3%，大幅度提高了敏感性。综上，在分析4株RHDV分离毒株遗传变异趋势、进化来源与SQ-1株病毒丢失“O”型红细胞凝集特性诱因的同时，建立了RHDV抗原Real-time RT-PCR与RT-LAMP、抗体间接ELISA与免疫胶体金快速检测方法，通过与相应经典检测方法比对与临床应用，证明所建立的检测方法能够用于临床检测，具有良好的应用前景，为该病的防控提供了理论依据与技术保障。
江一波[8]（2013）在《与PRRSV结合的受体SN氨基酸及其在PRRSV感染偏嗜性中的作用研究》文中提出猪繁殖呼吸综合征PRRS （Porcine reproductive and respiratory syndrome,又称蓝耳病）是由PRRSV （Porcine reproductive and respiratory syndrome virus）感染引起的,目前在世界范围内广泛流传,并且造成了感染猪繁殖障碍、免疫力低下、发病率和死亡率较高,给养猪业造成巨大经济损失,并带来肉产品安全及环境安全等隐患。PRRSV感染而导致猪免疫抑制及其免疫机制复杂,至今还没有防治PRRSV的有效药物与疫苗。PRRSV具有极强的宿主偏嗜性,只感染家猪和野猪,也不感染其它动物。目前在猪PRRSV主要感染猪宿主PAM （Porcine Alveolar Macrophage）肺泡巨噬细胞,也从该细胞中鉴定出来了有CD163, CD169（SN, Sialoadhesin）等受体分子。在猪的SN受体具有黏附病毒唾液酸分子,介导病毒感染细胞的能力,受体基因位点直接影响与PRRSV结合力,对PRRSV受体研究是致病机理和抗病机理研究的趋势之一。因此,本研究从PPRSV细胞受体SN基因角度,以受体分子与PRRSV相互作用为重点,分析受体SN基因与PRRSV结合的重要氨基酸位点,研究该位点在与PRRSV结合和在PRRSV物种感染偏嗜性中的作用,探讨受体和PRRSV的相互作用的机理,为抗PRRSV感染的防治药物研制提供分子靶标,为抗病分子育种提供参考。一、利用生物信息学预测与PRRSV结合的SN氨基酸位点:1、将鼠SN中PDB数据库所有SN蛋白模板和唾液酸的配体进行了结构重叠和比对,确定了在6.5A范围内对结合唾液酸最关键的氨基酸；明确了唾液酸分子衍生物都有差异,但是鼠唾液酸分子都有保守的Neu5Ac的母核,而且在不同的PDB（Protein Data Bank）模板中,该母核位置保守和其形成氢键相互作用的氨基酸也是保守的。2、根据猪SN基因cDNA及氨基酸序列,在Signal IP信号肽预测和蛋白结构功能Smart预测的网站上进行预测,参照PDB上鼠SN的模板结构,猪SN信号肽剪接位点可能在第19-20位氨基酸之间。3、利用Smart对SN蛋白的结构和功能进行预测,确定猪SN参与病毒唾液酸结合的功能区域为N末端的150个氨基酸以内的区域。4、利用糖基化预测网站和软件,预测猪pSN的S107, T3,T78等位点,在PRRSV感染的过程中可能发生了糖基化。5、根据猪SN和鼠SN的多序列进行比对和结构重叠的结果,R97,R105氨基酸在PRRSV感染的过程中可能发生侧链方向的改变,而且提供氢键以利于病毒唾液酸的结合。W106,W2氨基酸在结合唾液酸时,因为巨大侧链空间阻碍和方向不变,可能限制PRRSV的唾液酸母核结合SN时的方向。6、利用多序列比对和同源模建及分子动力学优化等,分别构建了猪SN和牛SN的蛋白结构模型；然后与PDB数据库中报道的鼠SN的蛋白结构模型进行了结构比对和重叠；再用Chimera软件构建分子突变体,最后观察猪SN、牛SN蛋白结构的变化。结果表明：猪SN蛋白分子表面形成一个明显的较深的孔洞,而牛的则不明显；将猪SN的S107突变为牛SN的V107时,猪SN的孔洞空间缩小,反之将牛SN的V107突变为猪SN的S107时,牛SN的孔洞空间略有增加,因此预测猪SN的S107在PRRSV结合时可能具有重要作用。7、通过比较分析猪SN的结构,发现猪SN相对于鼠和牛的SN有其特异性,其表面的107位点是特异的亲水氨基酸；在结合病毒唾液酸的过程中,很可能提供了氢键和一个特异的亲水区域以容纳病毒的唾液酸,从而增加了病毒和猪SN的结合能力,这也许是猪个体间存在PRRSV易感性或抗性差异、不同物种间（猪、牛、鼠等）存在PRRSV感染偏嗜性差异的原因之一。此外,猪SN的2,44,45,97,105,106,109等位点的氨基酸,都参与了亲水空间区域的形成。二、利用分子生物学技术分析和验证生物信息预测的PRRSV结合的重要SN氨基酸位点及其作用：1、为了研究生物信息学预测的SN受体氨基酸位点（3、78和107）与PRRSV相互作用,根据猪pSN受体和牛cSN受体（不结合PRRSV唾液酸）序列,利用pEGFP-N1载体和定点突变技术分别构建了猪和牛SN的2个野生型和4个突变体。它们包括2个野生型（pSN-GFP、cSN-GFP）、4个突变体（pSN-S107V-GFP, pSN-T3V-GFP, pSN-T78V-GFP和cSN-V3T-V78T-V107S-GFP）。2、利用pEGFP-N1载体分别构建了GFP和SN融合蛋白的表达载体,并在293T细胞中进行融合表达,利用采用超滤离心技术从细胞培养液中获得了纯度较高的6个SN-GFP融合蛋白（pSN-GFP、cSN-GFP、pSN-S107V-GFP, pSN-T3V-GFP, pSN-T78V-GFP和cSN-V3T-V78T-V107S-GFP）,用于在分子水平研究受体SN与PRRSV的结合力的研究。3、在SN-GFP载体的后端加上SN的跨膜片段M,分别构建了6个表达SN-GFP-M载体（pSN-S107V-GFP-M, pSN-T3V-GFP-M, pSN-T78V-GFP-M, cSN-V3T-V78T-V107S-GFP-M, pSN-GFP-M, cSN-GFP-M）和1个对照GFP-M载体,在293T细胞中表达7个SN-GFP-M融合蛋白,用于在细胞水平分析受体SN与PRRSV的相互作用的分析。4、利用WB （Western Blot）技术证明和鉴定了本研究所表达蛋白分别为6个SN-GFP融合蛋白、7个SN-GFP-M融合蛋白。5、分别利用FAR-WB （FAR-Western Blot）技术、ELISA（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）技术分析了SN-GFP蛋白和PRRSV的结合活性。分别分析了2个SN野生型融合蛋白（pSN-GFP、cSN-GFP）和4个突变体融合蛋白（pSN-S107V-GFP, pSN-T3V-GFP, pSN-T78V-GFP和cSN-V3T-V78T-V107S-GFP）与PRRSV的结合力,结果表明：猪野生型pSN-GFP蛋白的结合高于其它5种蛋白的结合,发生突变后的猪SN蛋白（pSN-S107V-GFP, pSN-T3V-GFP, pSN-T78V-GFP）的结合力都降低,特别是pSN-S107V-GFP蛋白结合力显着的下降；而牛野生型cSN-GFP蛋白不能与PRRSV结合,但发生突变（cSN-V3T-V78T-V107S-GFP）蛋白能与少量PRRSV结合。6、利用免疫细胞荧光技术,分析了SN-GFP-M蛋白和PRRSV的结合活性。在293T细胞中分别表达了6个带SN的跨膜片段M的SN-GFP-M和1个对照GFP-M蛋白,利用免疫细胞荧光技术,分别探讨了猪和牛SN野生型融合蛋白、3个猪突变体融合蛋白、1个牛突变体融合蛋白、1个对照GFP-M蛋白与PRRSV的结合力,试验结果与利用FAR-WB技术分析的结果相类似。7、以上所有结果表明猪SN基因中第T3、T78和S107氨基酸在与PRRSV结合中具有一定的作用,特别是S107位具有重要的作用。8、猪pSN野生型具有强的PRRSV结合能力,本试验将猪相应氨基酸替换成牛的氨基酸,猪pSN突变型pSN-T78V、pSN-T3V降低了结合PRRSV能力,pSN-S107V显着地降低了结合能力。而将牛SN进行cSN-V107S突变,将牛替换成了猪的氨基酸,生物信息分析显示可以恢复部分的结合PRRSV的能力；并且牛的突变体cSN-V3T-V78T-V107S-GFP在一定程度上也能与PRRSV结合,因此推测：这些位点在不同猪个体对PRRSV敏感性或抗性存在差异、不同物种对PRRSV感染偏嗜性中具有一定的作用。
杨杰[9]（2012）在《登革病毒EDⅢ蛋白的表达、纯化及其与ECV304细胞相互作用蛋白的筛选与鉴定研究》文中研究表明登革病毒（dengue virus, DENV）是黄病毒属（Flaviviridae）有包膜的单股正链RNA病毒，有四个血清型（DENV-14），以蚊虫为媒介，广泛流行于热带和亚热带地区。DENV感染所致的人类登革热（classical dengue fever, DF）和登革出血热/登革休克综合征（denguehemorrhagic fever/dengue shock syndrome, DHF/DSS）严重危害人类健康。全球有25～30亿人生活在流行区内，每年有1亿以上的人遭受感染，DHF病例约50万,死亡率5～20％，如治疗不及时可达50％。近年来，随着全球气候变暖、人口流动、生态环境恶化、蚊媒分布区域扩展等诸多原因，登革热流行的范围和频率不断增加，WHO已将DHF/DSS、肝炎、疟疾、结核列为全球流行最严重的传染病。我国海南、广东、广西、福建、浙江和台湾等地区也都是重点流行区域，多次发生DF，DHF/DSS的爆发流行。但时至今日，对DENV感染性疾病尚无特异的治疗手段，也无安全有效的疫苗问世。因此，对DENV的致病机理展开深入研究，并从中发掘有效的治疗策略和途径是当前病毒学研究的当务之急。DENV经蚊虫叮咬进入人体后，先在单核细胞系统（如树突状细胞，单核细胞等）和毛细血管内皮细胞（vascular endothelial cells, VECs）等靶细胞中增殖，经血流播散，引起疾病。血中高滴度的病毒可累及全身毛细血管内皮细胞，引起广泛微血管内皮功能障碍，血管通透性增加、出血和休克，介导DHF/DSS的发生。所以，人血管内皮细胞膜上必然存在着介导DENV感染的受体，但该受体迄今尚未阐明。因此，鉴定出血管内皮细胞膜上的DENV受体，对研究DENV的致病机理、研发受体特异性阻断剂等均具有非常重要的意义。DENV受体的研究很早就受到重视，研究的方法也有很多，其中病毒铺覆蛋白印迹技术（Virus overlay protein binding assay,VOPBA）是较为“经典”的一种病毒受体筛选技术，该方法是以Western blot为基础，将细胞膜蛋白转印至PVDF膜上与病毒颗粒进行孵育，利用病毒颗粒与受体蛋白特异性结合的特点，分离病毒受体。VOPBA方法在鉴别病毒受体中虽应用广泛，但也有一定的局限性，如由于与转印膜孵育的是完整病毒颗粒，个头相对较大，与转印膜上的潜在受体蛋白结合不稳定，易造成漏筛，所以如果利用DENV与受体结合的关键结构域——包膜E蛋白DⅢ区代替完整病毒颗粒进行VOPBA将更有助于病毒受体的筛选。本研究首先采用原核表达并纯化了DENV-2E蛋白DⅢ区（EDⅢ）蛋白，用于代替全病毒颗粒建立改良的VOPBA技术，并以人血管内皮细胞来源的ECV304细胞系为靶细胞进行DENV相互作用蛋白的筛选工作，对筛选到的候选蛋白进行质谱分析、Westernblot实验等进一步验证筛选蛋白，再通过免疫共沉淀（Co-IP）实验和激光共聚焦显微技术明确筛选蛋白与DENV-2EDⅢ蛋白的相互关系及与病毒的共定位情况；最后，用生物信息学的方法模拟筛选蛋白与DENV-2EDⅢ蛋白可能的结合方式和参与结合的残基，探讨筛选蛋白在DENV-2感染宿主细胞过程中的作用，为进一步揭示DENV的感染机制、研发受体特异性阻断剂奠定坚实的基础。其研究内容和结果主要包括以下几个方面：1. DENV-2EDⅢ蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备：①利用PCR从pV-DENV2-E质粒上扩增出EDⅢ基因；②通过酶切连接将EDⅢ基因亚克隆至原核表达载体pET22b+中，转化入大肠杆菌Rosetta（DE3） plysS；③对pET22b-ED Ⅲ/Rosetta工程菌进行表达，并对表达条件进行摸索，获得的工程菌表达产物经超声裂解后，EDⅢ蛋白质以包涵体的形式存在；④pET22b-ED Ⅲ/Rosetta工程菌表达得到的目的蛋白包涵体，经Ni-NTA亲和层析和阳离子交换层析两步纯化后，获得纯度达98％以上的目标蛋白，并对蛋白进行Western blot鉴定；⑤将纯化好的目的蛋白经透析法复性，并采用改良Lowry法进行蛋白质定量后，冻存备用；⑥为获得目的蛋白抗体，将目的蛋白分别免疫Balb/c和C57BL/6小鼠，得到相应抗体后加等体积甘油冻存备用。2.改良VOPBA方法筛选ECV304细胞上DENV相互作用蛋白：①利用差速离心的方法提取人血管内皮ECV304细胞各组分蛋白；②用纯化的DENV-2EDⅢ蛋白代替全病毒颗粒，建立了改良的VOPBA技术，并成功在ECV304细胞膜蛋白提取物中筛选到34,43和55kDa三个蛋白能与EDⅢ蛋白相互作用，质谱分析显示筛选到的43kDa蛋白为微丝（fibrous-actin，F-actin），55kDa蛋白为波形蛋白（vimentin）；③制备43kDa蛋白小鼠抗血清进行阻断改良VOPBA实验和Western blot实验，进一步证实选到的43kDa蛋白为actin；④利用Co-IP实验体外验证actin与DENV-2EDⅢ蛋白相互作用，提示DENV可能是通过包膜E蛋白Ⅲ区这样功能结构域结合actin的。3.43kDa actin蛋白在DENV感染过程中的作用：①激光共聚焦显微技术观察DENV-2感染不同时相点的人血管内皮ECV304细胞中微丝骨架的形态变化，感染第5min时，细胞微丝出现了解聚，较多的短F-actin积聚形成团块，从感染的第35mim～1h，部分应力纤维束开始恢复，主要分布在细胞膜下的皮质区，感染24h后，由于病毒的大量复制、病毒蛋白的堆积，又能再次引起F-actin的解聚以及应力纤维的消失，这提示我们DENV是通过改变actin来进入细胞的；②利用免疫荧光双染色进一步观察感染24,48和96h的ECV304细胞actin与DENV-2E蛋白的细胞定位情况，发现actin与E蛋白有明显的随感染时间逐渐增强的共存，提示除了进入之外，actin可能参与了DENV-2颗粒在细胞内的运输等其它感染过程。4. F-actin结合DENV-2EDⅢ的方式及结合残基的预测：①从PDB蛋白晶体结构数据库下载天然结构的F-actin和可溶性的DENV-2EDⅢ蛋白结构，采用ZDOCK软件将结构数据传输到浪潮天梭高性能服务器集群完成对actin和EDⅢ蛋白的分子对接，根据得分情况获得5个最佳结合的复合物结构；②采用KFC2软件对这5个复合物进行了结合残基的预测，分析了F-actin和EDⅢ蛋白结构中最可能发生相互结合的残基位点。综上所述，本研究用纯化的DENV-2EDⅢ蛋白代替全病毒颗粒，建立了改良VOPBA技术筛选人血管内皮细胞登革病毒相互作用蛋白，却意外发现作为细胞骨架的actin在DENV-2的整个感染过程中都起了非常重要的作用，参与病毒的进入、胞内运输及释放等过程。由于actin与EDⅢ蛋白在体外能发生相互作用，并与E蛋白在体内有随感染时间逐渐增强的共存，提示EDⅢ蛋白可能是病毒与actin相互作用的重要组分，并且我们利用生物信息学软件对actin与DENV-2EDⅢ蛋白可能的结合方式和结合残基进行了预测。这一实验结果为后续设计蛋白突变体深入研究两者相互关系，揭示DENV的感染机制提供了重要的实验依据。当然，DENV与actin相互作用的机制以及其中所涉及的信号调控通路还有待于深入研究。
闫果林[10]（2011）在《汉滩病毒结构蛋白线性B细胞表位的筛选和鉴定》文中研究说明肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）是由汉坦病毒（hantavirus，HTV）引起的以鼠类为主要传染源的一种自然疫源性疾病，又称流行性出血热（epidemic hemorrhagic fever，EHF），简称出血热。全球每年新发病例有90%左右在中国；死亡率在2%10%左右。该病在我国绝大多数省区流行，病情危急，危害很大。汉滩病毒（hantaan virus， HTNV）和汉城病毒（Seoul virus， SEOV）是我国HFRS的两种主要病原体。汉坦病毒感染可引起机体明显的适应性免疫应答。体液免疫应答强烈而持久；细胞免疫可能在免疫保护和免疫病理损伤两方面都有作用。汉坦病毒核蛋白是诱导体液免疫应答主要的免疫原，可在发病数天内引起抗体应答。因此，重组核蛋白常被用来检测患者血清中病毒特异性抗体的类型和水平，为HFRS的诊断提供依据。糖蛋白免疫原性较弱，糖蛋白特异性抗体出现稍晚，多在病程中后期。但是，一般认为汉坦病毒糖蛋白是诱导中和抗体产生的主要来源；而据报道，中和抗体出现的早晚与患者的病情及预后密切相关。人感染汉坦病毒后，血清病毒特异性IgG水平随时间延长不断升高，一般于恢复早期达到平台期；持续时间长，有时在病愈后数十年仍可检测到。抗体的产生离不开抗原特异性B细胞的活化、增殖、分化；抗原特异性B细胞接触并结合抗原是体液免疫应答的始动环节；而这离不开B细胞受体（B cell receptor, BCR）对抗原的有效识别。抗原与BCR相互识别、发生作用的结构叫做抗原决定簇（antigenic determinants），又称表位（epitope）。表位是抗原与抗体发生作用的主要部位，是抗体识别抗原的结构基础。研究汉坦病毒结构蛋白特异性抗体识别的B细胞表位对于深入认识病毒致病和抗体产生机制，中和抗体的免疫保护作用，以及研发新的诊断材料、亚单位疫苗等具有重要意义。目前，有关汉滩病毒结构蛋白B细胞表位的报道较少，尚缺乏系统的研究。本论文首次采用合成的重叠多肽对HFRS患者血清抗体识别的HTNV核蛋白（nucleocapsid protein，NP）线性B细胞表位进行了系统分析。把覆盖HTNV NP氨基酸全序列的70条重叠15肽包被于ELISA板，用间接ELISA法筛选了35例HFRS患者血清抗体识别的线性B细胞表位，并用竞争ELISA证实了患者血清抗体与抗原肽结合的特异性。发现HFRS患者血清抗体识别的线性B细胞表位主要在NP氨基端（aa1-117），其次为NP羧基端（aa361-429），在NP氨基酸序列的中部仅有数个线性B细胞表位。发现一些患者血清抗原肽特异性IgG水平在急性期可有不同的变化。同时，我们合成了覆盖HTNV GP氨基酸全序列的281条重叠15肽，利用间接ELISA和点杂交两种PepScan法对3D8、3G1、8G3这3株鼠源性中和抗体识别的B细胞表位进行表位作图。首先，将合成的281条重叠多肽分成28组，每10条肽为一组，混合后包被于ELISA板或者NC膜上，用上述3株单克隆抗体做粗筛；然后将与单克隆抗体呈阳性反应的混合肽中各组成肽分别包被ELISA板或NC膜继续用单克隆抗体反应，做细筛，从而确定各单克隆抗体识别的抗原肽。然后用竞争ELISA证实抗原肽与中和抗体结合的特异性。我们发现单克隆抗体3D8和8G3识别HTNV GP抗原肽881-KGFLCPEFPGSFRKK-895，而单克隆抗体3G1可能识别由数个线性肽组成的构象表位。由于原合成肽相邻肽间相差4个氨基酸残基，因此又追加合成了与881-KGFLCPEFPGSFRKK-895分别相差3个、2个、1个氨基酸残基的15肽。将这些肽包被于ELISA板或NC膜上与单克隆抗体3D8反应，进行单克隆抗体3D8识别线性B细胞表位的精细定位。我们发现单克隆抗体3D8与882-GFLCPEFPGSFRKKC-896反应最强烈。接着，用丙氨酸扫描突变法分析882-GFLCPEFPGSFRKKC-896这条抗原肽发挥主要作用的氨基酸残基，发现aa885C、aa896C是该抗原肽表位最关键的氨基酸残基，aa882G、aa883F、aa884L、aa893R、aa894K、aa895K对单克隆抗体3D8识别这个抗原肽表位也有重要影响。本论文首次系统分析了肾综合征出血热患者血清抗体识别的HTNV核蛋白线性B细胞表位，对具有中和作用的单克隆抗体3D8的B细胞表位作图确定了汉滩病毒糖蛋白上一个新的中和表位。这一结果不仅为深入探讨HTNV感染引起的体液免疫应答规律以及研制新型疫苗提供了理论依据，同时为搞清单克隆抗体3D8作为HFRS治疗性抗体的抗病毒感染机制提供了重要的实验依据。
二、抗新疆出血热病毒单克隆抗体识别病毒蛋白质的实验观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗新疆出血热病毒单克隆抗体识别病毒蛋白质的实验观察（论文提纲范文）
（1）云南蜱病毒的发现及其复合感染的流行病学调查研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 基于宏转录组学的新的蜱传病毒的发现 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器、耗材 |
| 2.4 生物信息学分析软件 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 蜱标本鉴定 |
| 3.2 蜱标本核糖核酸(RNA)提取与检测 |
| 3.3 蜱标本测序文库构建与测序 |
| 3.4 测序数据处理与分析 |
| 4 质量控制 |
| 5 结果 |
| 5.1 蜱标本采集情况 |
| 5.2 蜱标本RNA提取与检测结果 |
| 5.3 宏转录组测序结果 |
| 6 讨论 |
| 第二部分 云南蜱病毒的分离鉴定 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器、耗材 |
| 2.4 生物信息学分析软件 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 病毒分离培养 |
| 3.3 病毒全基因组测序 |
| 3.4 病毒全基因组序列分析 |
| 3.5 病毒检测方法建立 |
| 3.6 病毒生长复制曲线绘制 |
| 3.7 病毒形态观察 |
| 3.8 病毒多克隆抗体制备 |
| 3.9 病毒抗原片制备及间接免疫荧光实验 |
| 3.10 RNA荧光原位杂交实验 |
| 3.11 蜱咬病人血清标本IFA筛查 |
| 4 质量控制 |
| 5 结果 |
| 5.1 病毒分离培养结果 |
| 5.2 YNTV全基因组序列特征 |
| 5.3 YNTV结构和功能预测 |
| 5.4 YNTV基因组同源性分析 |
| 5.5 YNTV系统发育分析 |
| 5.6 YNTV重组分析 |
| 5.7 YNTV实时荧光定量RT-PCR标准曲线 |
| 5.8 细胞敏感性分析 |
| 5.9 YNTV的形态特征 |
| 5.10 YNTV在不同细胞中的感染情况 |
| 5.11 蜱咬病人血清标本IFA筛查结果 |
| 6 讨论 |
| 第三部分 云南蜱病毒与其他多种新发蜱传病原体复合感染情况的流行病学调查 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器、耗材 |
| 2.4 分析软件 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 蜱标本鉴定 |
| 3.2 蜱标本核酸提取 |
| 3.3 蜱标本YNTV检测 |
| 3.4 蜱标本中其他新发蜱传病毒检测 |
| 3.5 蜱标本中细菌和原虫检测 |
| 3.6 系统发育分析 |
| 3.7 统计学分析 |
| 4 质量控制 |
| 5 结果 |
| 5.1 蜱标本采集结果 |
| 5.2 蜱标本YNTV检测结果 |
| 5.3 蜱标本中其他新发蜱传病毒检测结果 |
| 5.4 蜱标本中细菌和原虫检测结果 |
| 5.5 蜱标本中各种病原体的复合感染情况 |
| 6 讨论 |
| 结论与建议 |
| 本研究的主要创新点与不足 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文 |
（2）内源性逆转录病毒Gag单克隆抗体制备及检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 1 型糖尿病 |
| 1.1.1 1型糖尿病的流行病学 |
| 1.1.2 1型糖尿病的发病过程及临床特点 |
| 1.1.3 1型糖尿病的免疫学研究 |
| 1.1.4 自身抗原的确定和自身抗体的早期诊断对1型糖尿病患者的重要性 |
| 1.2 1 型糖尿病与内源性逆转录病毒 |
| 1.2.1 内源性逆转录病毒 |
| 1.2.2 1型糖尿病与内源性逆转录病毒的联系 |
| 1.3 单克隆抗体与抗体工程 |
| 1.3.1 基因工程抗体与抗体工程 |
| 1.3.2 单克隆抗体的工业化生产 |
| 1.4 单克隆抗体的应用 |
| 1.4.1 单克隆抗体在生物化工中的应用 |
| 1.4.2 单克隆抗体在医学中的应用 |
| 1.5 研究目的 |
| 第二章 内源性逆转录病毒Gag单克隆抗体的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂与试剂盒 |
| 2.2.4 溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 ERV Gag 194抗原表位预测 |
| 2.3.2 偶联抗原肽 |
| 2.3.3 小鼠免疫 |
| 2.3.4 ELISA效价检测 |
| 2.3.5 融合 |
| 2.3.6 筛选 |
| 2.3.7 杂交瘤细胞的亚克隆 |
| 2.3.8 单克隆抗体的生产及纯化 |
| 2.3.9 单克隆抗体亚型鉴定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 内源性逆转录病毒Gag 194氨基酸序列 |
| 2.4.2 内源性逆转录病毒Gag蛋白结构分析和抗原多肽设计 |
| 2.4.3 第三次加强免疫小鼠血清ELISA效价检测结果 |
| 2.4.4 融合复筛结果 |
| 2.4.5 抗体效价检测结果 |
| 2.4.6 抗体亚型鉴定结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 Gag单克隆抗体的鉴定 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂及试剂盒 |
| 3.2.4 溶液的配制 |
| 3.3 实验步骤 |
| 3.3.1 ELISA检测 |
| 3.3.2 细胞实验 |
| 3.3.3 蛋白质印迹实验(Western blot) |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 ELISA检测结果 |
| 3.4.2 蛋白质印迹实验(WB)结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 内源性逆转录病毒Gag抗原在NOD小鼠胰腺中的表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与试剂 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验试剂及试剂盒 |
| 4.2.4 溶液的配制 |
| 4.3 实验步骤 |
| 4.3.1 免疫组织化学实验 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 免疫组织化学实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 英文缩略词表 |
（3）抗猪繁殖与呼吸综合征病毒糖蛋白单克隆抗体的研制及多肽ELISA检测抗体方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 PRRS概述 |
| 2 PRRSV病原学 |
| 3 病毒蛋白和功能 |
| 3.1 非结构蛋白 |
| 3.2 结构蛋白 |
| 4 临床症状 |
| 5 诊断方法 |
| 5.1 病原学方法 |
| 5.2 血清学方法 |
| 6 免疫反应 |
| 7 疫苗 |
| 7.1 活疫苗(MLV) |
| 7.2 灭活苗 |
| 7.3 DNA,亚单位或病毒载体疫苗 |
| 8 PRRSV单克隆抗体的研究进展 |
| 8.1 单克隆抗体技术的简介 |
| 8.2 PRRSV单抗的研究进展 |
| 9 多肽的研究进展 |
| 9.1 多肽概述 |
| 9.2 多肽药物 |
| 9.3 多肽疫苗 |
| 9.4 多肽用于检测 |
| 10 本研究的目的与意义 |
| 研究内容一 抗猪繁殖与呼吸综合征病毒糖蛋白抗体的研制 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞及病毒 |
| 1.2 生物材料及实验动物 |
| 1.3 试剂及耗材 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 PRRSV GP3,GP4,GP5基因的扩增 |
| 2.2 PRRSVGP3,GP4,GP5的克隆 |
| 2.2.1 目的片段的回收 |
| 2.2.2 回收产物与pGEM-T-easy的连接 |
| 2.2.3 连接产物转化感受态细胞DH5a |
| 2.2.4 阳性克隆的鉴定 |
| 2.3 表达载体的构建 |
| 2.3.1 目的基因和表达载体pET-32a的酶切及回收 |
| 2.3.2 回收产物与pET-32a的连接 |
| 2.3.3 重组质粒转化至BL21感受态细胞 |
| 2.3.4 阳性克隆的鉴定 |
| 2.4 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.4.1 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.4.2 菌体的超声波裂解 |
| 2.4.3 重组蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.4.4 WESTERN BLOT鉴定重组蛋白的反应性 |
| 2.4.5 IPTG诱导浓度的优化 |
| 2.4.6 重组蛋白的大量表达 |
| 2.5 重组蛋白的纯化 |
| 2.5.1 重组蛋白的纯化 |
| 2.5.2 包涵体的复性 |
| 2.6 抗体的制备 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PRRSVGP3,GP4,GP5基因扩增结果 |
| 3.2 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 3.3 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.4 诱导表达条件的优化 |
| 3.5 纯化蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 3.6 重组蛋白的WESTERN-BLOT分析 |
| 3.7 动物免疫 |
| 3.8 阳性杂交瘤细胞株的筛选 |
| 4 小结与讨论 |
| 研究内容二 PRRSV多肽ELISA检测抗体方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 多肽与猪血清 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 多肽选取 |
| 2.2 多肽ELISA的建立及条件的优化 |
| 2.3 特异性试验 |
| 2.4 批间及批内重复性试验 |
| 2.5 临床应用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 多肽序列分析结果 |
| 3.2 多肽ELISA方法的建立及优化 |
| 3.3 ELISA交叉反应性的试验 |
| 3.4 ELISA酶标板的重复性试验 |
| 3.5 临床初步应用 |
| 4 小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（4）表达高致病性猪蓝耳病GP3、GP5基因DNA疫苗构建及实验免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 猪繁殖与呼吸综合征概况 |
| 1.1 PRRSV结构 |
| 1.2 PRRSV流行谱系 |
| 1.3 PRRSV与抗体 |
| 第2章 PRRSV DNA疫苗研究进展 |
| 2.1 减毒(MLV)疫苗 |
| 2.2 灭活的PRRSV疫苗 |
| 2.3 DNA疫苗及亚单位疫苗 |
| 2.4 疫苗与中和抗体 |
| 第3章 DNA疫苗佐剂的研究进展 |
| 3.1 脂质体佐剂 |
| 3.2 DNA疫苗的分子佐剂 |
| 3.2.1 基于PRR激动剂的分子佐剂 |
| 3.2.2 基因趋化因子佐剂 |
| 3.2.3 共刺激分子的遗传佐剂 |
| 3.2.4 基于免疫信号分子的佐剂 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 高致病性猪蓝耳病核酸疫苗构建及鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 高致病性猪蓝耳病DNA疫苗小鼠免疫及佐剂效果评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 高致病性猪蓝耳病DNA疫苗猪体免疫效果及佐剂效果评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）细胞穿膜肽TAT介导猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体Nb6抗病毒感染的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究进展 |
| 1.1.1 PRRSV的概述 |
| 1.1.2 PRRSV分子生物学特征 |
| 1.1.3 PRRSV感染与机体免疫应答 |
| 1.1.4 PRRSV疫苗的研究进展 |
| 1.1.5 PRRSV非结构蛋白Nsp |
| 1.2 纳米抗体的研究进展 |
| 1.2.1 纳米抗体的概述 |
| 1.2.2 纳米抗体(VHH)的结构特征 |
| 1.2.3 纳米抗体的特性 |
| 1.2.4 纳米抗体在病毒中的应用 |
| 1.3 细胞穿膜肽研究进展 |
| 1.3.1 细胞穿膜肽的发现 |
| 1.3.2 细胞穿膜肽的穿膜机制 |
| 1.3.3 细胞穿膜肽的应用 |
| 1.4 本研究目的与意义 |
| 第二章 细胞穿膜肽TAT介导纳米抗体NB6穿膜的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 质粒、菌株与细胞 |
| 2.1.2 主要试剂耗材 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 构建原核表达载体pET-21b-TAT-Nbx和pET-21b-Nbx |
| 2.2.2 TAT-Nbx与Nbx重组蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化 |
| 2.2.3 TAT-Nb6重组蛋白活性鉴定 |
| 2.2.4 检测TAT介导Nb6进细胞 |
| 2.2.5 细胞毒性检测 |
| 2.2.6 TAT-Nb6在猪体内分布的研究 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 pET-21b-TAT-Nbx和pET-21b-Nbx原核表达载体的构建 |
| 2.3.2 TAT-Nbx和Nbx重组蛋白的表达 |
| 2.3.3 TAT-Nbx和Nbx重组蛋白的纯化 |
| 2.3.4 包涵体TAT-Nbx和Nbx重组蛋白的复性与浓缩 |
| 2.3.5 TAT-Nb6重组蛋白活性鉴定 |
| 2.3.6 TAT介导Nb6穿膜的研究 |
| 2.3.7 孵育剂量对TAT-Nb6、TAT-Nb53穿膜的影响 |
| 2.3.8 孵育时间对TAT-Nb6、TAT-Nb53穿膜的影响 |
| 2.3.9 TAT-Nb6对细胞活性的影响 |
| 2.3.10 TAT-Nb6在猪体内的分布 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 TAT-NB6抗PRRSV功能的研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 病毒和细胞 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 TAT-Nb6与PRRSV自身编码的Nsp9蛋白的相互作用 |
| 3.2.2 检测TAT-Nb6与PRRSV自身编码的Nsp9蛋白在细胞内的分布 |
| 3.2.3 TAT-Nb6对PRRSV SD16毒株复制的影响 |
| 3.2.4 TAT-Nb6对不同PRRSV毒株复制的影响 |
| 3.2.5 纳米抗体Nb6与PRRSV Nsp9互作位点的研究 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 TAT-Nb6与PRRSV自身编码的Nsp9蛋白的相互作用 |
| 3.3.2 TAT-Nb6对PRRSV SD16毒株在M ARC-145细胞中复制的影响 |
| 3.3.3 TAT-Nb6对PRRSV SD16毒株在PAM中复制的影响 |
| 3.3.4 TAT-Nb6对不同PRRSV毒株复制的影响 |
| 3.3.5 Nb6与Nsp9互作位点的研究 |
| 3.3.6 PRRSV不同毒株Nsp9454-646同源性分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 全文总结 |
| 本研究创新点与下一步研究方向 |
| 创新点 |
| 下一步研究方向 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）出血热病毒与人蛋白质相互作用的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 目录 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 流行性出血热 |
| 1.2 酵母双杂交 |
| 1.3 核糖体及核糖体蛋白 |
| 1.4 NF-κB 信号通路 |
| 第2章 酵母双杂交筛选出血热病毒蛋白 G2 的人相互作用蛋白质 |
| 2.1 仪器、材料与方法 |
| 2.1.1 仪器设备 |
| 2.1.2 溶液配制 |
| 2.1.3 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 诱饵载体的构建 |
| 2.2.2 诱饵蛋白自激活活性检测 |
| 2.2.3 酵母细胞转化 |
| 2.2.4 正常成人脾脏 cDNA 文库质量控制及扩增 |
| 2.2.5 酵母细胞大规模高效转化 |
| 2.2.6 酵母双杂交文库筛选 |
| 2.2.7 猎物质粒的鉴定 |
| 2.2.8 回转验证 |
| 2.2.9 筛库数据分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 诱饵载体的构建及诱饵蛋白自激活活性检测 |
| 2.3.2 文库质量控制及扩增 |
| 2.3.3 G2 蛋白脾文库筛选 |
| 2.3.4 阳性克隆测序分析 |
| 2.3.5 G2 候选相互作用分子的回转验证 |
| 2.3.6 G2 候选相互作用蛋白质基因功能(gene ontology，GO)分析 |
| 2.3.7 G2 与其他病原体相同的人相互作用蛋白质 |
| 2.3.8 G2 与其他病原体共同的人相互作用蛋白质的 GO 分析 |
| 2.3.9 G2 特有的人相互作用蛋白质的 GO 分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 G2 通过与 RPS3 相互作用影响 NF-κB 信号通路 |
| 3.1 仪器与材料 |
| 3.1.1 仪器设备 |
| 3.1.2 溶液配制 |
| 3.1.3 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 常用细胞培养条件 |
| 3.2.2 细胞总蛋白的提取 |
| 3.2.3 核质分离 |
| 3.2.4 Western Blot |
| 3.2.5 提取 RNA |
| 3.2.6 Realtime-PCR |
| 3.2.7 构建重组质粒 |
| 3.2.8 转染 |
| 3.2.9 报告基因实验 |
| 3.2.10 免疫共沉淀 |
| 3.2.11 GST-Pull Down |
| 3.2.12 间接免疫(荧光共聚焦) |
| 3.2.13 电转 |
| 3.2.14 凝胶迁移阻滞实验(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA) |
| 3.2.15 统计学处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 G1、G2、NP 真核表达载体构建 |
| 3.3.2 报告基因检测病毒蛋白对 NF-κB 转录活性的影响 |
| 3.3.3 Real-time PCR 检测 G1、G2 对 NF-κB 下游靶基因的影响 |
| 3.3.4 G2 与 RPS3 存在蛋白质相互作用 |
| 3.3.5 G2 与 RPS3 相互作用结构域的确定 |
| 3.3.7 免疫荧光实验观察 G2 与 RPS3 的定位 |
| 3.3.8 G2 以依赖于 RPS3 的方式上调 NF-κB 转录活性 |
| 3.3.9 Real-time PCR 检测 G2 对 RPS3 介导的 NF-κB 下游靶基因的影响 |
| 3.3.10 核糖体蛋白RPS3Ser209影响NF-κB转录活性及其与DNA结合能力 |
| 3.3.11 G2 与 RPS3S209A 存在相互作用 |
| 3.3.12 G2 对 RPS3 磷酸化的影响 |
| 3.3.13 免疫荧光实验检测 G2 对 RPS3 入核的影响 |
| 3.3.14 核质分离实验检测 G2 对 RPS3 入核的影响 |
| 3.3.15 G2 对 RPS3 与 NF-κB 结合能力的影响 |
| 3.3.16 G2 对 RPS3 与 IKKβ/Imp-α相互作用的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）兔出血症病毒遗传变异分析及抗原抗体检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 兔出血症研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 临床症状 |
| 1.4 病理变化 |
| 第2章 RHDV 分子生物学、遗传生态学研究进展 |
| 2.1 RHDV 分子生物学 |
| 2.2 病毒生命周期 |
| 2.3 机体抵抗 RHD 的机制 |
| 2.4 遗传多样性/ RHDV 的进化 |
| 2.5 病毒与宿主共进化 |
| 2.6 防控与免疫 |
| 2.7 展望 |
| 第3章 兔出血症抗原抗体检测方法研究进展 |
| 3.1 血凝(HA)、血凝抑制(HI) |
| 3.2 间接血凝(IHA)、间接血凝抑制(IHI) |
| 3.3 免疫琼脂扩散试验（ID） |
| 3.4 对流免疫电泳 |
| 3.5 中和试验 |
| 3.6 免疫荧光技术 |
| 3.7 SPA 菌体免疫扫描电镜法 |
| 3.8 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 3.9 免疫电镜捕获双装饰法 |
| 3.10 实时荧光定量 RT-PCR 方法 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 RHDV 的分离与分子遗传变异特性分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果与分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 RHDV Real-time RT-PCR检测方法的建立与应用 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 RHDV RT-LAMP 快速检测方法的建立与应用 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 RHDV 抗体检测间接 ELISA方法的建立与应用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 RHDV 抗体检测胶体金免疫层析方法的建立与应用 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（8）与PRRSV结合的受体SN氨基酸及其在PRRSV感染偏嗜性中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 PRRSV研究现状 |
| 1.1.1 PRRSV在世界范围内的传播 |
| 1.1.2 PRRSV造成的危害和病毒分离 |
| 1.1.3 PRRSV的培养方法和鉴定 |
| 1.1.4 PRRSV的基因组与蛋白 |
| 1.2 PRRSV的受体研究 |
| 1.2.1 硫酸肝素(Heparin su1fate,HS) |
| 1.2.2 CD163分子 |
| 1.2.3 唾液酸粘附素(Sialoadhesin,SN) |
| 1.2.4 组织蛋白酶E或天冬氨酸酶E(Cathepsin E,CTSE) |
| 1.2.5 波形蛋白(Vimentin) |
| 1.2.6 PRRSV受体研究趋势 |
| 1.3 病毒免疫的相关研究 |
| 1.3.1 PRRSV的体液免疫 |
| 1.3.2 PRRSV的细胞免疫 |
| 1.3.3 PRRSV的免疫抑制 |
| 1.3.4 PRRSV的免疫调节 |
| 1.4 蛋白质分子结构的研究方法 |
| 1.4.1 蛋白质的结构在生命科学研究中的意义 |
| 1.4.2 蛋白质结构预测 |
| 1.4.3 分子动力学方法 |
| 1.4.4 分子动力学模拟常用软件 |
| 1.4.5 分子动力学蛋白模拟的基本步骤 |
| 2 研究目的与意义 |
| 3 试验材料与方法 |
| 3.1 生物信息学软件 |
| 3.2 试验材料和仪器 |
| 3.3 生物信息学方法 |
| 3.3.1 糖基化和信号肽预测 |
| 3.3.2 蛋白功能区域预测 |
| 3.3.3 同源结构比对 |
| 3.3.4 Desmond软件动力学分析 |
| 3.3.5 Chimera分子突变结构观察 |
| 3.3.6 Castp软件进行计算蛋白的Cavity |
| 3.4 试验技术 |
| 3.4.1 293T细胞培养 |
| 3.4.2 细胞接种病毒和收毒 |
| 3.4.3 病毒TCID50测定 |
| 3.4.4 猪和牛全血的提取 |
| 3.4.5 猪和牛全血中RNA的提取 |
| 3.4.6 反转录PCR |
| 3.4.7 受体SN基因前150个氨基酸目的片段的扩增和酶切 |
| 3.4.8 受体SN跨膜片段的扩增和酶切 |
| 3.4.9 受体SN目的片段的回收 |
| 3.4.10 受体SN目的片段连接入载体 |
| 3.4.11 载体的PCR检测 |
| 3.4.12 突变载体的构建 |
| 3.4.13 转化DH5大肠杆菌 |
| 3.4.14 质粒提取 |
| 3.4.15 PCR检测连接了目的片段质粒 |
| 3.4.16 质粒大量提取 |
| 3.4.17 细胞转染 |
| 3.4.18 细胞免疫荧光试验 |
| 3.4.19 蛋白纯化 |
| 3.4.20 WB和FAR-WB试验 |
| 3.4.21 ELISA用于病毒和GFP蛋白定量 |
| 3.4.22 PRRSV和SN-GFP相互作用分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 生物信息学预测结果 |
| 4.1.1 信号肽预测 |
| 4.1.2 糖基化预测结果 |
| 4.1.3 蛋白质功能域的预测 |
| 4.1.4 鼠和猪mSN蛋白结构比对和唾液酸配体结合位置分析 |
| 4.1.5 蛋白同源模型结构构建和多序列比对 |
| 4.1.6 分子动力学能量优化 |
| 4.1.7 蛋白模型质量的检测 |
| 4.1.8 模拟蛋白结构重叠 |
| 4.1.9 SN第107位点突变对SN蛋白结构功能影响的分析 |
| 4.2 受体SN基因位点与PRRSV结合力的分析 |
| 4.2.1 RNA提取及质量检测、cDNA反转录 |
| 4.2.2 受体SN基因N端150个氨基酸的cDNA片段SN的克隆、SN-GFP融合表达载体构建 |
| 4.2.3 受体SN基因N端150个氨基酸的cDNA片段点突变体的构建 |
| 4.2.4 受体SN基因N端150个氨基酸的cDNA片段点突变体的融合蛋白SN-GFP表达载体构建 |
| 4.2.5 受体SN基因跨膜cDNA片段的克隆、融合蛋白SN-GFP-M表达载体构建 |
| 4.2.6 融合蛋白表达载体的测序鉴定 |
| 4.2.7 细胞培养和病毒TCID50的测定 |
| 4.2.8 使用WB鉴定在293T细胞中表达的SN-GFP融合蛋白 |
| 4.2.9 利用FAR-WB技术分析SN-GFP蛋白和PRRSV的结合活性 |
| 4.2.10 利用ELISA方法分析SN-GFP蛋白和PRRSV的结合活性 |
| 4.2.11 利用免疫细胞荧光的技术分析SN-GFP-M蛋白和PRRSV相互作用的活性 |
| 5 讨论 |
| 5.1 受体SN\受体CD163和PRRSV感染的关系 |
| 5.2 表达的SN-GFP和SN-GFP-M蛋白功能独立 |
| 5.3 受体SN结合PRRSV唾液酸功能区的信息学确定 |
| 5.4 PRRSV唾液酸在PRRSV感染中的作用 |
| 5.7 糖基化和PRRSV感染的关系 |
| 5.8 可变氨基酸在PRRSV唾液酸结合中的作用 |
| 5.9 受体SN第R107位氨基酸在PRRSV结合中的作用 |
| 5.10 受体SN有受体其它氨基酸在PRRSV结合中的作用 |
| 6 总结 |
| 6.1 本研究的结论 |
| 6.2 本研究的特色与创新 |
| 6.3 本研究的不足与进一步研究内容 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表文章和申请专利 |
| 致谢 |
（9）登革病毒EDⅢ蛋白的表达、纯化及其与ECV304细胞相互作用蛋白的筛选与鉴定研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 前言 |
| 第一章 2 型登革病毒包膜 E 蛋白Ⅲ区的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 第一节 2 型登革病毒包膜 E 蛋白Ⅲ区在大肠杆菌中的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 2 型登革病毒 EDⅢ蛋白的纯化及多克隆抗体制备 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三节 纯化 EDⅢ蛋白及其多克隆抗体的生物学活性分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 EDⅢ 纯化蛋白与 ECV304 细胞相互作用蛋白的筛选与鉴定 |
| 第一节 改良 VOPBA 法筛选 ECV304 细胞 DENV 相互作用蛋白 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二节 43 kDa 候选蛋白的鉴定及生物信息学分析 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 登革病毒包膜 E 蛋白 Ⅲ 区 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表文章 |
| 附录 |
（10）汉滩病毒结构蛋白线性B细胞表位的筛选和鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、HFRS 及 HTNV 概述 |
| 二、HTV 诱导的免疫应答 |
| 1. HTV 诱导的体液免疫应答 |
| 2. HTV 诱导的细胞免疫应答 |
| 3. HTV 感染与固有免疫应答 |
| 三、B 细胞表位及研究方法 |
| 1. B 细胞表位研究方法 |
| 2. HTV 结构蛋白 B 细胞表位的研究 |
| 第一部分 HTNV 核蛋白线性 B 细胞表位的筛选和鉴定 |
| 实验一 PEPSCAN 法 HTNV 核蛋白 B 细胞表位作图 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 合成肽的溶解 |
| 2.2 间接 ELISA 检测患者血清抗 NP 合成肽的反应谱 |
| 2.3 间接 ELISA 检测单克隆抗体抗 NP 合成肽的反应谱 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 HFRS 患者血清抗体与 HTNV NP 合成肽反应谱 |
| 3.2 PepScan 数据处理 |
| 3.3 HTNV 特异性单克隆抗体与 HTNV NP 合成肽的反应谱 |
| 4 讨论 |
| 实验二 竞争 ELISA 证明患者血清抗体与合成肽反应的特异性 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 滴定实验 |
| 3.2 竞争 ELISA 预实验 |
| 3.3 竞争 ELISA 实验 |
| 4 讨论 |
| 实验三 HTNV 核蛋白抗原肽特异性血清 IgG 在急性期的动态变化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 终点滴定法确定 HFRS 患者血清抗原肽特异性 IgG 滴度 |
| 3.2 HFRS 患者不同时间点血清抗原肽特异性 IgG 变化 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 鼠源性 HTNV 中和抗体 3D8 识别线性 B 细胞表位 |
| 实验一 鼠源性中和抗体 3D8 识别 HTNV 糖蛋白线性 B 细胞表位的鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 合成肽的溶解和分装 |
| 2.2 间接 ELISA 行 PepScan 法 B 细胞表位作图 |
| 2.3 竞争实验证明抗体-抗原肽结合的特异性 |
| 2.4 点杂交法行 PepScan 法 B 细胞表位作图 |
| 3 结果 |
| 3.1 PepScan 法筛选含有阳性 B 细胞表位的混合肽 |
| 3.2 PepScan 法筛选含有 B 细胞表位的单条肽 |
| 3.3 竞争实验进一步证实单克隆抗体结合单条肽的特异性 |
| 3.4 阳性反应肽临近肽与单克隆抗体的反应性 |
| 3.5 竞争 ELISA 证实单克隆抗体 3D8 与 G221 结合的特异性 |
| 3.6 硝酸纤维素（NC）膜包被混合肽行 PepScan 法 B 细胞表位作图 |
| 3.7 NC 膜包被单个 HTNV GP 合成肽行 PepScan 法 B 细胞表位作图 |
| 4 讨论 |
| 实验二 鼠源性中和抗体 3D8 识别 HTNV 糖蛋白线性 B 细胞表位的精细作图 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 iELISA 法检测单克隆抗体 3D8 与 G221 周围肽的反应性 |
| 2.2 点杂交法观察单克隆抗体 3D8 与 G221 周围肽的反应性 |
| 2.3 ECL-ELISA 法观察单克隆抗体 3D8 与 G221 周围肽的反应性 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 丙氨酸扫描突变分析鼠源性中和抗体3D8识别的线性B细胞表位关键氨基酸残基 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 iELSA 法观察单克隆抗体 3D8 与丙氨酸替换肽的反应性 |
| 2.2 点杂交法观察单克隆抗体 3D8 与丙氨酸替换肽的反应性 |
| 2.3 ECL-ELISA 法观察单克隆抗体 3D8 与丙氨酸替换肽的反应性 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
四、抗新疆出血热病毒单克隆抗体识别病毒蛋白质的实验观察（论文参考文献）
- [1]云南蜱病毒的发现及其复合感染的流行病学调查研究[D]. 王倩. 山东大学, 2021(10)
- [2]内源性逆转录病毒Gag单克隆抗体制备及检测[D]. 李瑜. 江汉大学, 2021(01)
- [3]抗猪繁殖与呼吸综合征病毒糖蛋白单克隆抗体的研制及多肽ELISA检测抗体方法的建立[D]. 徐淮. 扬州大学, 2019(06)
- [4]表达高致病性猪蓝耳病GP3、GP5基因DNA疫苗构建及实验免疫研究[D]. 赵冠宇. 吉林大学, 2019(11)
- [5]细胞穿膜肽TAT介导猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp9纳米抗体Nb6抗病毒感染的研究[D]. 王立珍. 西北农林科技大学, 2019(08)
- [6]出血热病毒与人蛋白质相互作用的初步研究[D]. 郭恒西. 北京工业大学, 2014(03)
- [7]兔出血症病毒遗传变异分析及抗原抗体检测方法的建立与应用[D]. 肖跃强. 吉林大学, 2014(01)
- [8]与PRRSV结合的受体SN氨基酸及其在PRRSV感染偏嗜性中的作用研究[D]. 江一波. 华中农业大学, 2013(10)
- [9]登革病毒EDⅢ蛋白的表达、纯化及其与ECV304细胞相互作用蛋白的筛选与鉴定研究[D]. 杨杰. 第三军医大学, 2012(11)
- [10]汉滩病毒结构蛋白线性B细胞表位的筛选和鉴定[D]. 闫果林. 第四军医大学, 2011(05)