一、Signaling for inducible Fas-resistance in primary B lymphocytes（论文文献综述）
李兆东[1]（2021）在《万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析》文中指出类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种慢性自身免疫性疾病,具有致残率高,治疗周期长,预后差和易复发等特点,常给患者家属和社会带来沉重负担。成纤维样滑膜细胞（rheumatoid arthritis-fibroblast-like synoviocytes,RAFLSs）是关节滑膜组织的重要组成细胞,其过度增殖可促进免疫细胞释放大量促炎因子,从而引发炎症反应,加剧RA病理进程。此外,关节腔内募集的促炎因子也会进一步激活RA-FLSs细胞。因此,抑制RA-FLSs细胞增殖或降低关节内促炎因子水平是治疗RA的一种有效手段。当前,药物治疗仍是RA的主要治疗方式,但由于化学合成药物的治疗不仅费用昂贵,且常伴有副作用,因此人们正积极寻找安全、有效和廉价的药物来治疗RA。近年来,中药以其具有的显着疗效和较少的副作用,在治疗RA方面已受到越来越多的关注。此外,中药可通过多成分、多途径、多靶点的方式参与RA的治疗过程。万通筋骨片是由25味中药组成的复方药,具有“祛风散寒、通络止痛”的功效,主要用于风湿和类风湿性关节炎等骨性疾病。由于其作用机理不明确,从而限制了它在国内外的推广和使用。因此,系统研究万通筋骨片在治疗RA中的作用和机制十分必要。首先,基于胶原诱导性关节炎（collagen-induced rheumatoid arthritis,CIA）大鼠模型,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎作用;其次,基于RA-FLSs细胞的生物学活性,我们研究万通筋骨片对RA的抗炎机制;随后,在万通筋骨片抗炎作用的基础上,我们利用高通量测序技术继续挖掘万通筋骨片的抗炎基因靶点;最后,我们利用16S rDNA高通量测序和代谢组学分析研究万通筋骨片对肠道菌群和血清代谢物谱的影响,拟挖掘参与万通筋骨片抗炎作用的靶点微生物群和靶点代谢物。因此,本研究不仅为万通筋骨片在临床上治疗RA提供了实验依据,促进了其推广和应用,而且也为中药治疗RA的机制研究建立了新的思路。第一部分万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎作用首先,为了确定万通筋骨片的安全给药浓度,我们进行了急性毒性实验,血常规检测和肝脾肾功能分析。其次,为了评估CIA大鼠模型的构建效果,我们检测了大鼠的足趾肿胀度,关节内TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平,关节的病理结构变化,以及滑膜组织中FLSs特异性标志蛋白（Vimentin）的表达水平。最后,为了研究万通筋骨片对RA的抗炎作用,我们连续灌胃给药14天和28天后,检测了CIA大鼠足趾肿胀度,炎性关节病理结构变化,以及关节腔和关节组织中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子水平。结果显示:万通筋骨片给药的安全有效浓度可设为150、300和600 mg/kg;CIA大鼠成模率>99.00%。当连续治疗14天时,各组CIA大鼠足趾肿胀度没有明显变化;当连续治疗28天时,300和600 mg/kg组的CIA大鼠足趾肿胀度明显降低。组织病理切片显示,连续给药14天和28天时,各组CIA大鼠的关节病理结构发生不同程度的改善,尤以600 mg/kg连续给药28天的治疗组CIA大鼠,病理结构改善效果最佳。关节腔内促炎因子的水平变化结果显示,在连续给药14天和28天时,各给药浓度均表现出不同程度的抗炎作用,尤以600 mg/kg连续给药28天的抗炎效果最佳。关节组织中促炎因子的水平变化结果显示,连续给药14天时,TNF-α和IL-1β促炎因子水平显着降低;连续给药28天时,TNF-α,IL-1β和IL-6促炎因子水平明显下调。这些结果说明,万通筋骨片对RA具有抗炎作用,且呈现一定的时间依赖性和浓度依赖性。第二部分万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎机制基于万通筋骨片的抗炎作用,本研究在细胞水平和动物水平继续研究万通筋骨片的抗炎机制。首先,为了确定万通筋骨片对RA-FLSs细胞增殖的影响,我们观察了RA-FLSs细胞形态变化,并应用乳酸脱氢酶活性测定,Ed U核酸标记以及免疫组化等实验技术检测RA-FLSs细胞数目变化和滑膜组织中Vimentin蛋白表达情况。其次,我们利用蛋白免疫印迹,免疫荧光和免疫组化等技术检测了MEK、p MEK、ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞及CIA大鼠滑膜组织中的表达水平。同时,我们还利用ERK1/2质粒转染等相关实验,进一步验证MEK/ERK信号通路在万通筋骨片抗炎过程的作用。最后,为了研究万通筋骨片是否通过诱导滑膜细胞凋亡的方式参与抗炎作用,我们检测了RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的蛋白表达水平,以及CIA大鼠滑膜组织中Bax,Bcl-2,caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表达水平。结果显示:药物处理24 h和48 h后,各组RA-FLSs细胞形态均发生改变,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,细胞形态变化较为明显。药物处理24 h后,各组RA-FLSs细胞数目无明显变化;药物处理48 h后,2 mg/ml、3mg/ml、4 mg/ml给药浓度可以显着抑制RA-FLSs细胞增殖。经药物处理24 h和48 h后,MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在RA-FLSs细胞中均呈现不同程度的降低趋势,尤以3 mg/ml和4 mg/ml药物浓度处理48 h,各蛋白表达差异最为明显。同时,过表达ERK1/2显着提升RA-FLSs细胞的增殖能力,而过表达ERK1/2的RA-FLSs细胞经3 mg/ml药物浓度处理后,细胞增值能力显着下降。同时,万通筋骨片可以下调MEK,p MEK,ERK1/2和p ERK1/2蛋白在滑膜组织中的表达。此外,药物处理24 h后,4 mg/ml药物浓度显着提高RA-FLSs细胞中caspase-3/9蛋白酶活性;药物处理48 h后,3 mg/ml和4 mg/ml明显上调caspase-3/9蛋白酶活性。我们还发现,药物处理24 h和48 h后,3 mg/ml和4mg/ml药物浓度显着上调cleaved-caspase-3蛋白表达,2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml药物浓度显着上调cleaved-PARP蛋白表达。同时,万通筋骨片可以上调滑膜组织中Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达以及下调Bcl-2和caspase-3蛋白表达。这些结果表明,万通筋骨片通过抑制RA-FLSs细胞增殖及诱导RA-FLSs细胞凋亡参与抗炎过程。第三部分基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对RA-FLSs细胞的影响,本研究针对药物处理后的RA-FLSs细胞进行RNA高通量测序分析。为了更加全面、准确的获得抗炎靶点,我们采用两种不同的分析方法进行筛选,即DESeq2差异分析以及STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析。DESeq2差异分析:通过DESeq2差异分析,拟筛选不同组别间的差异基因;针对这些差异基因,我们随后进行功能富集过滤和蛋白互作（protein-protein interaction,PPI）网络分析,并根据PPI网络中节点连接度筛选备用核心基因。STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析:基于药物处理组和未处理组之间的差异基因,我们拟筛选与时间序列具有相同表达趋势的基因。针对这些基因,我们进一步筛选具有相同表达模式的差异基因。随后通过功能富集过滤,权重共表达网络分析,PPI网络分析,以及节点连接度来筛选备用核心基因。最后,我们利用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹验证备用核心基因的表达模式,以便获得理想的抗炎靶点。结果显示:通过DESeq2差异分析,在不同比较组间,我们共获得184个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,且这些基因与细胞周期和同源重组等代谢通路密切相关。同时,基于PPI蛋白网络,我们共筛选出4个备选核心基因,即BRCA1,ATR,SMC3和BUB1。通过STEM时间序列和WGCNA权重共表达联合分析,我们共获得111个具有相同表达趋势和表达模式的DEGs,且这些基因显着富集于细胞周期和RNA转运等代谢通路。同时,基于WGCNA和PPI网络,我们共筛选出6个备选核心基因,即PNN,SMC3,EIF3A,BUB1,ATR和ORC4。此外,TTK,STAG2和THOC1也与细胞周期密切相关,因此TTK,STAG2和THOC1也作为备选核心基因。至此,共获得10个备选核心基因,即:BRCA1、ORC4、TTK、BUB1、SMC3、ATR、PNN、EIF3A、STAG2和THOC1。基因和蛋白验证结果显示,只有SMC3和BUB1的表达模式与测序结果一致。这些结果表明,SMC3和BUB1可能是万通筋骨片在RA中的抗炎靶点。第四部分基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片在类风湿关节炎中的抗炎靶点基于万通筋骨片对CIA大鼠的抗炎作用,本研究针对CIA大鼠粪便样本和血清样本,分别进行16S高通量测序分析和代谢组学分析,拟挖掘万通筋骨片抗炎作用的肠道菌群靶点和代谢物靶点。16S高通量测序分析:基于操作单元聚类和物种多样性分析,我们拟研究万通筋骨片对肠道菌群结构的影响;基于肠道菌群差异分析,我们拟筛选相对丰度较高的差异菌群。代谢组学分析:基于样本相关性和多元统计分析,我们拟研究万通筋骨片对血清代谢物谱的影响;基于差异代谢物筛选,功能富集过滤和差异代谢物表达分析,我们拟筛选理想的差异代谢物。16S高通量测序与代谢组学联合分析:基于top10差异肠道菌属和top20差异代谢物,我们进行联合分析,拟研究肠道微生物群与血清代谢物的关系,并验证或筛选肠道菌群靶点和代谢物靶点。结果显示:通过16S高通量测序分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的肠道菌群结构。在门水平上,拟杆菌、软壁菌和脱铁杆菌的菌群相对丰度得到显着改善。此外,拟杆菌与厚壁菌的菌群相对丰度比值（Bacteroidetes/Firmicutes）也恢复到正常水平。在属水平上,弧菌、巨型球菌和漫游球菌的菌群相对丰度下调至正常水平。通过代谢组学分析,我们发现万通筋骨片可以明显改变CIA大鼠的血清代谢物谱。其中,血清素、二硫化谷胱甘肽、N-乙酰神经氨酸、萘和血栓素B2等5种代谢物均有标准化的趋势,但不具有统计学差异。通过16S高通量测序与代谢组学联合分析,我们发现,弧菌、巨型球菌和漫游球菌都存在于top10差异肠道菌群范围内,且与这3种微生物群存在显着联系的代谢物包括5种。此外,考虑到代谢物鉴定过程中的假阳性,我们认为:在这5种代谢物中,只有微管素B是内源性代谢物。这些结果表明,万通筋骨片可能通过调节肠道菌群结构和血清代谢物谱发挥抗炎作用,且弧菌、巨型球菌和漫游球菌可能是万通筋骨片的抗炎靶点菌群;微管素B可能是万通筋骨片的抗炎靶点代谢物。
白玲[2]（2021）在《CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究》文中提出背景:急性B淋巴细胞白血病（B-cell Acute lymphoblastic leukemia,B-ALL）的免疫治疗发展迅速,使复发难治B-ALL的有效率从30%提高到90%;但由于其副作用和疗效仍然有限而限制了其应用。因此,寻找减少毒副作用和延长生存期的新策略至关重要。TLR9激动剂作为一种免疫佐剂在抗肿瘤治疗中已显示出良好的安全性和有效性,其不仅具有免疫调节作用,对于肿瘤细胞也具有直接作用。它能够在增强抗肿瘤免疫的同时影响肿瘤的抑制性免疫微环境,从而促进免疫系统更好地识别肿瘤,实现“冷肿瘤”向“热肿瘤”的转变。然而,既往的研究主要集中在其免疫调节方面,而对于肿瘤的直接作用常被忽略,尤其是对于B-ALL的直接作用尚无报道。通过我们前期研究发现:TLR9激动剂能够抑制B-ALL增殖、诱导凋亡、促进细胞周期阻滞而清除B-ALL,但对于不同类型B-ALL的作用具有异质性。因此,明确TLR9激动剂在不同类型B-ALL患者中的作用及分子机制,可能有助于发掘TLR9激动剂治疗有效的生物标志物和患者特征,优化B-ALL的精准治疗。研究目的:1.明确TLR9表达与B-ALL患者临床病理特征及预后的关系;2.探索CpG 685对B-ALL的作用;3.探讨CpG 685诱导B-ALL细胞凋亡的分子机制,发掘治疗有效的关键生物标志物;4.寻找针对不同类型B-ALL的治疗策略以及CpG 685应用有效的预测标志物。研究方法：1.通过实时定量RT-PCR和流式细胞术检测TLR9的表达,应用统计学分析明确TLR9表达与临床病理特征及预后的关系;2.通过WST-1增殖实验、AnnexinⅤ/7-AAD凋亡检测和流式细胞术检测CpG 685在不同类型B-ALL中的作用,明确CpG 685对B-ALL细胞体外直接作用的差异;3.通过构建NCG B-ALL小鼠移植瘤模型,应用流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏和外周血中肿瘤负荷的变化和观察小鼠生存期,明确CpG 685对B-ALL细胞在体内的作用差异;4.通过有或无相关信号通路及关键分子抑制剂预处理,在CpG 685刺激后,应用Western Blot、蛋白纯化及免疫沉淀、免疫荧光共定位、染色质免疫共沉淀检测TLR9下游信号通路相关蛋白的表达和基因的作用位点;通过RT-PCR和实时定量RT-PCR明确通路涉及的mi RNA的表达情况;通过对其作用机制的探究,发掘CpG 685治疗B-ALL有效的预测生物标志物;5.通过Ficol密度梯度离心法分离临床样本中的外周血单个核细胞,在有或无CpG 685刺激后,明确基于细胞系发现的预测标志物在临床应用中的可行性;6.通过在BALB/C小鼠中构建肿瘤移植瘤模型,应用流式细胞术检测各种免疫细胞所占小鼠淋巴细胞的比例,明确CpG ODN对小鼠机体抗肿瘤免疫的调节情况。研究结果:1.相比于正常人的外周血单个核细胞,TLR9在B-ALL患者的外周血单个核细胞中高表达;并且,相比于TLR9低表达组,高表达组的B-ALL患者预后较好;2.CpG 685对B-ALL细胞的作用存在异质性。对于BLIN-1细胞,其能抑制增殖、诱导凋亡、促进细胞周期阻滞、上调共刺激分子及免疫调节分子、降低小鼠骨髓、脾脏和外周的肿瘤负荷、延长生存期;而对于Sup-B15细胞无明显作用;3.BLIN-1细胞中,CpG 685通过P38/P53/BAX信号通路,依赖C-MYC过表达诱导B-ALL细胞凋亡。过表达的C-MYC可以促进P53稳定,诱导P53磷酸化,增强BAX转录,并介导BAX激活相关构象改变。4.伊马替尼和CpG 685联合应用于Ph（+）B-ALL细胞逆转两药单独应用的耐药、降低小鼠肿瘤负荷、延长小鼠生存期;伊马替尼能促进BAX的激活,同时抑制C-MYC低表达的抗凋亡效应;而CpG 685通过下调mi R-21,上调PTEN,进而逆转了PI3K/AKT/m TOR通路过度激活所致的伊马替尼耐药;5.临床患者中,CpG 685可直接诱导PBMC C-MYC高表达且Ph染色体阴性的B-ALL患者的原代B-ALL细胞凋亡;6.CpG ODN能够促进B细胞、pDC细胞的增殖,抑制MDSC细胞增殖,进而增加NK细胞、T细胞的比例,促进CD8+T细胞的分化和增加Ⅰ型巨噬细胞/Ⅱ型巨噬细胞的比例,促进抗肿瘤免疫的激活。结论:1.TLR9的表达与B-ALL患者的预后相关;2.TLR9是B-ALL潜在的治疗靶点,CpG 685可通过P38/P53/BAX信号通路诱导B-ALL细胞凋亡,该过程依赖于C-MYC的高表达;3.C-MYC可能是协助预测CpG 685单药对B-ALL患者有效的预测标志物;4.而对于Ph（+）B-ALL,联合应用伊马替尼和CpG 685可逆转两药单独应用的耐药。该联合治疗不仅能直接诱导Ph（+）B-ALL细胞凋亡,还增强了B-ALL细胞的免疫原性,促进CD8+T细胞的识别。5.CpG ODN能够通过促进CD8+T细胞的分化和增加Ⅰ型巨噬细胞/Ⅱ型巨噬细胞的比例,激活抗肿瘤免疫。
锁星星[3]（2020）在《骨髓间充质干细胞N-Cadherin对MRL/lPR狼疮鼠成骨及造血的影响》文中提出目的:伴有全血细胞减少的系统性红斑狼疮（SLE）患者,目前临床缺乏有效治疗方法。本课题拟研究骨髓间充质干细胞（BMMSCs）N-钙黏蛋白（N-Cadherin）对MRL/lpr狼疮鼠成骨及造血的影响,为SLE全血细胞减少提供新的理论依据,为治疗提供新的靶点。方法:（1）qRT-PCR检测C57BL/6鼠和MRL/lpr鼠BMMSCs N-cadherin的mRNA表达差异;（2）qRT-PCR检测MRL/lpr鼠BMMSCs成骨诱导前后N-cadherin表达差异;（3）qRT-PCR检测C57BL/6鼠和MRL/lpr鼠BMMSCs成骨指标（Col1A1、ALP、Run2、OCN）的差异;（4）C57BL/6鼠和MRL/lpr鼠BMMSCs成骨诱导2周后qRT-PCR检测两组成骨指标的差异;（5）构建慢病毒,转染细胞,下调MRL/lpr鼠BMMSCs的N-cadherin的表达,流式筛选GFP绿色荧光阳性的细胞,采用qRT-PCR鉴定出低表达组;（6）取两组细胞（MRL/lpr小鼠BMMSCs,shRNA慢病毒侵染BMMSCs）成骨诱导2周,诱导为成骨细胞（OB）,qRT-PCR检测感染前后成骨指标的差异;（7）10只MRL/lpr小鼠,实验分组为2组,每组5只MRL/lpr小鼠,分别为尾静脉注射PBS狼疮鼠组、尾静脉注射N-Cadherin shRNA慢病毒感染后BMMSCs狼疮鼠组,20周龄处死,眼球取外周血,血细胞检测仪检测各组小鼠血常规差异。流式细胞术分析骨髓、脾脏细胞各系的比例,集落形成试验检测骨髓、脾脏集落形成数的差异。结果:（1）MRL/lpr狼疮鼠BMMSCs表面粘附分子N-cadherin mRNA的表达量明显高于对照组C57BL/6小鼠（P<0.05,n=5）;（2）MRL/lpr狼疮鼠BMMSCs成骨诱导2周后N-cadherin mRNA的表达高于对照组（p<0.001,n=5）;（3）MRL/lpr狼疮鼠BMMSCs的COL1（P<0.05,n=5）、RUNX2（P<0.001,n=5）的mRNA表达量低于C57BL/6小鼠;（4）狼疮鼠OB的（COL1、ALP、OCN）的mRNA表达量低于C57BL/6小鼠（P<0.05）,RUNX2（P<0.01）的mRNA表达量低于C57BL/6小鼠,（5）qRT-PCR结果显示:相比BMMSCs正常组和NC组,shRNAN组N-Cadherin的表达明显下降（p<0.001,n=5）;（6）两组细胞（MRL/lpr小鼠BMMSCs,shRNA慢病毒侵染BMMSCs）成骨诱导为OB,qRT-PCR检测结果显示:狼疮鼠OB的RUNX2的mRNA表达量较感染前明显增加（P<0.001,n=5）,COL1、ALP、OCN的mRNA表达量较感染前有增加趋势;（7）尾静脉注射移植结果显示:较PBS组,BMMSCs组WBC、RBC、HB、PTL计数均有所增加,但无统计学意义;骨髓和脾脏流式结果显示:较PBS组,BMMSCs组B220+B淋巴细胞（P<0.05,n=5）、CD138+浆细胞比例（P<0.05,n=5）下降,差异有统计学意义,较PBS组,BMMSCs组Ter-119+红系,CD3e+T淋巴细胞,CD11b髓系比例未见明显异常;骨髓集落结果显示:较PBS组,BMMSCs组CFU-pre-B（P<0.05,n=5）下降,差异有统计学意义;较PBS组,BMMSCs组BFU-E、CFU-GM未见明显异常;脾脏集落结果显示:较PBS组,BMMSCs组BFU-E、CFU-GM未见明显异常。结论:（1）MRL/lpr狼疮鼠BMMSCs表面粘附分子N-Cadherin的表达量明显高于C57BL/6小鼠;MRL/lpr狼疮鼠OB的N-Cadherin的表达高于对照组;（2）MRL/lpr狼疮鼠的成骨能力低于C57BL/6小鼠;（3）下调N-Cadherin后,MRL/lpr狼疮鼠OB的N-Cadherin表达较下调前明显下降,MRL/lpr狼疮鼠OB的成骨能力增加;（4）下调BMMSCs N-Cadherin可抑制MRL/lpr狼疮鼠骨髓、脾脏B淋巴细胞、浆细胞的产生,改善贫血。
刘逸煊[4]（2020）在《雷公藤红素改善Trex1-/-小鼠自身免疫性疾病》文中研究表明雷公藤红素是从中药“雷公藤”分离纯化而来的三萜类化合物,是雷公藤中最有效的生物活性物质之一。雷公藤红素对各种慢性疾病（包括炎症、癌症、关节炎和神经退行性疾病）均具有潜在治疗价值。但其作用机制尚不清楚。自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）、Aicardi-Goutie`res综合征（AGS）或其他干扰素异常症候等疾病都与DNA诱发的干扰素异常激活有密切关系。Trex1是一种主要的胞质核酸外切酶,可通过降解细胞质中的多余DNA来阻止内在自身免疫应答的启动。Trex1的缺乏会导致小鼠出现严重的自身免疫表型。因此,我们通过使用Trex1基因缺陷型小鼠,研究了雷公藤红素与DNA诱发的干扰素调控通路之间的关系。本研究在体内和体外实验中都证实了雷公藤红素是TBK1-IRF3活化和胞质核酸触发下游Ⅰ型干扰素IFN反应的有效抑制剂。此外,雷公藤红素处理Trex1基因缺陷型小鼠可显着改善其自身免疫疾病的表型,包括心肌炎、干扰素免疫反应和自身抗体产生,以及过度的T细胞活化。这些结果支持了雷公藤红素是治疗依赖于干扰素反应的自身免疫疾病的有效方法。
方迎[5]（2020）在《B细胞向浆细胞分化发育的分子机制研究》文中进行了进一步梳理背景:B淋巴细胞异常活化、增殖和浆细胞（PC）异常增多在系统性红斑狼疮等自身免疫疾病中起到非常关键的作用,深入探究浆细胞的异常增多的机制对于自身免疫疾病的诊治有着重要意义。为了探究浆细胞异常增多机制中的分子机制,我们使用LPS诱导的浆母细胞作为正常的浆母细胞,使用增殖性高的（瘤性）浆母细胞样SP 2/0细胞作为异常增殖的浆母细胞,通过RNA测序,我们筛选出了在增殖性高的SP 2/0细胞中低表达的Loc108168067,Gm40600和Itch三个基因。Loc108168067和Gm40600是两个功能未知的新基因,Itch是近期发现的一种E3泛素连接酶,研究显示其可能在浆细胞产生中具有重要功能。我们应用体外细胞过表达,小鼠体内过表达,小鼠体内敲除等方法对这三个分子进行研究,探索这三个基因是否涉及在B细胞向浆细胞的异常分化中发挥生物学功能,为自身免疫疾病的诊断及治疗提供更多可能思路。目的:对于基因测序筛选出的与浆细胞产生相关的基因Loc108168067,Gm40600,Itch,探究三个分子的生物学功能,深入了解B细胞向浆细胞分化发育的机制。方法:1、使用RNA测序确定LPS诱导的浆细胞和SP 2/0细胞之间的基因表达谱,明确了Loc108168067,Gm40600是差异表达基因,但目前功能尚未明确。通过CCK-8检测法和FACS测定新基因对SP 2/0细胞增殖,细胞周期和细胞凋亡的影响。应用SP 2/0异种移植瘤小鼠模型评估新基因对肿瘤进展的影响。Western印迹和RNA测序分析用于评估Gm40600对mRNA和蛋白质表达的影响。2、选择Itch B细胞特异性基因敲除小鼠和Itch全细胞基因敲除小鼠共同研究Itch敲除在抗原驱动的B细胞反应中的作用,通过向体内注射绵羊红细胞和在体外给予LPS刺激脾脏B细胞,分析胸腺依赖抗原（TD）和非胸腺依赖抗原（TI）这两种不同抗原亚组对B细胞活化和抗体产生的影响。结果:1、我们发现LPS诱导的浆细胞表达较高水平的Loc108168067,而浆细胞样SP 2/0细胞表达较低水平的Loc108168067。Loc108168067过表达不影响SP 2/0细胞增殖,但通过G1/S阻断诱导细胞凋亡。在机理上,我们发现Loc108168067通过促进Trim21启动子激活诱导Trim21-CDKN1c表达以阻断G1/S周期。另一方面,我们还发现Loc108168067通过促进Myc启动子激活诱导Myc-IRF4-Blimp1表达上调细胞增殖/存活。因此,两个方面的综合效果导致Loc108168067对SP 2/0细胞增殖和异种移植瘤进展没有影响。这些结果表明Loc108168067具有许多不同的生物学功能。2、与LPS诱导的PC相比,SP 2/0细胞表达的Gm40600 mRNA水平非常低。Gm40600过表达通过诱导细胞凋亡,抑制SP 2/0细胞的增殖,进一步体内验证发现Gm40600过表达抑制SP 2/0异种移植小鼠模型中的肿瘤进展。Gm40600过表达降低了PC相关转录因子Blimp1和Xbp1的表达,从而抑制了Bcl2基因的转录,介导细胞凋亡。3、与野生对照组小鼠相比全细胞敲除Itch小鼠表现出全身多处皮肤损伤,淋巴结及脾脏肿大,抗体相关基因水平升高。而B细胞特异性敲除小鼠的淋巴结和脾脏只是比野生对照小鼠略大,B细胞活化和抗体产生情况无明显变化。敲除Itch可以促进包括LPS和绵羊红细胞（SRBC）诱导的B细胞活化和抗体产生,并且发现敲除Itch可以上调具有翻译起始因子活性的蛋白来促进抗原诱导的细胞因子产生。结论:1、Loc108168067分别通过促进Myc启动子和Trim21启动子激活诱导Myc-IRF4-Blimp1表达和Trim21-CDKN1c表达,彼此相互抵消,使得Loc108168067对SP 2/0细胞体外增殖和体内异种移植肿瘤进展没有影响。2、Gm40600通过减少Blimp1和Xbp1下调Bcl2转录,来诱导细胞凋亡,从而抑制SP 2/0的增殖和同种异体移植肿瘤的生长和进展。3、敲除Itch可以上调具有翻译起始因子活性的蛋白,来促进抗原驱动的B细胞应答,提示Itch可以成为自身免疫疾病患者新的治疗靶点。
张良[6]（2020）在《WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究》文中提出第一部分WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究研究背景与目的:B细胞产生保护性抗体是机体体液免疫应答对抗病毒、细菌等微生物感染入侵的最重要机制之一,体液免疫应答形成的记忆B细胞和长寿命浆细胞是机体适应性免疫应答的核心,而该过程的产生依赖于生发中心B细胞免疫应答（Germinal Center B cell reaction）,活化的B细胞在此历经克隆增殖、体细胞超频突变、抗体类别转换、抗体亲和力成熟等过程,这些过程也需要与一类特殊的CD4辅助T细胞即滤泡辅助性T淋巴细胞（Follicular Helper T cell,Tfh）的相互作用。在急性LCMV病毒感染模型中,CD4辅助T细胞在不同的TCR信号、细胞因子、信号转导分子、核转录因子的调控下主要分化成Tfh细胞和Th1细胞,分别发挥辅助B细胞和CD8 T细胞的作用。Tfh的分化是一个多步骤的过程,涉及到DC细胞和活化T细胞间突触、TCR-MHCⅡ的相互作用,共刺激分子、细胞因子及信号转导分子对其主要转录因子BCL6的调控决定Tfh早期分化命运;早期分化的Tfh迁移至GC,在此处与GCB细胞间通过频繁的细胞接触、细胞因子、共刺激分子等相互作用进一步发育为GCTfh,在GC中Tfh和GCB间相互作用,既促进GCB免疫应答,也促进和维持GCTfh的分化和功能。急性LCMV病毒感染是研究CD4辅助T细胞分化、Tfh分化发育、生发中心B细胞免疫应答、抗体生成、Th1功能和免疫记忆的理想模型之一。Wiskott-Aldrich综合征（Wiskott-Aldrich syndrome,WAS）是一种少见的X-连锁隐性遗传性免疫缺陷病,该病由编码WAS蛋白（WASp）的WAS基因突变所致,WAS患儿易感染各种病原,包括病毒、细菌、真菌等。WASp仅在造血系统表达,是肌动蛋白多聚化和细胞骨架重塑的关键分子,通过细胞骨架依赖及非依赖途径在造血细胞分化、迁移,免疫突触形成,细胞信号传导中起重要作用,WASp缺陷可导致多种免疫细胞的功能异常,导致机体对病原体产生特异性抗体功能缺陷和细胞免疫应答缺陷。但目前WASp缺陷如何影响感染状态下CD4 T与B淋巴细胞的免疫应答的机制尚不十分清楚,本研究使用急性LCMV病毒感染WASKO小鼠为模型,探讨WASp缺陷对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响和可能的分子机制。方法:通过流式细胞术检测不同时间段急性LCMV病毒感染后WASKO和WT小鼠脾脏中CD4辅助T细胞中Th1和Tfh细胞亚群的比例、主要分化发育相关的共刺激分子、信号转导分子和主要的核转录因子,检测GCB发育、GCB亚群、GCB的主要核转录因子BCL6。利用四聚体技术检测抗原特异性Th1和Tfh细胞的比例。通过NP-KLH免疫小鼠后,检测小鼠脾脏记忆B细胞前体细胞比例,探讨抗原特异性GCB细胞的分化。通过WASKO/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证WAS蛋白缺陷在急性LCMV病毒感染时特异性T和B细胞免疫缺陷是否为固有存在。结果:WASKO小鼠在急性LCMV病毒感染条件下CD4辅助T细胞早期分化阶段出现IL2-CD25-STAT5轴信号转导障碍导致Th1细胞发育障碍,进而Tfh分化占优势;WASp缺陷影响Tfh进一步发育的主要功能分子BCL6和ICOS,导致GCTfh的发育障碍;WASKO小鼠GCB主要的核转录因子BCL6表达障碍,GCB暗区形成障碍;GCB细胞分化异常表现为GCB分化为多克隆性记忆B细胞前体细胞比例增高而分化成多克隆性记忆B细胞存在障碍;NP-KLH免疫条件下抗原特异性GCB分化为记忆B细胞前体细胞比例增加,但分化形成抗原特异性记忆B细胞存在障碍。WT小鼠GCB细胞内WASp呈现异质性表达的现象,并且BCL6的表达量与WASp呈正相关。结论:WASp作为肌动蛋白骨架蛋白调节因子通过多种途径参与了急性LCMV病毒感染中CD4辅助T细胞的早期分化命运、Tfh的发育和GCB免疫应答和记忆B细胞形成的过程。第二部分PI3Kδ过度活化对脾脏前体B细胞发育的影响研究研究背景与目的:活化的磷酸肌醇3-激酶δ综合征（Activated phosphoinositide 3-kinaseδsyndrome APDS）是一种由PIK3CD增功能突变（gain-of-function（GOF）mutation）引起的常染色体显性遗传性原发性免疫缺陷病,该基因编码磷酸肌醇3-激酶δ（PI3Kδ）的催化亚基p110δ。PI3Kδ是包含p110δ催化亚基和p85a调控亚基的异二聚体,催化产生磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸酯,PI3Kδ主要表达在白细胞中并在其增殖生存和激活中起重要作用。APDS患者临床主要表现为反复窦肺感染、支气管扩张、良性淋巴组织增生、疱疹病毒感染以及自身免疫性疾病,其免疫表型主要为高Ig M、低Ig G、CD4 T淋巴细胞减少、衰老耗竭性CD8 T淋巴细胞增加。目前研究阐明Tfh和GCB的异常导致患者出现低Ig G,但患者出现高Ig M血症的机制尚不十分清楚。在机体边缘区B细胞（marginal zone B cell,MZB）及B1细胞是产生Ig M的主要来源,患者和小鼠模型中均发现在B细胞亚群中MZB及B1细胞比例增加和滤泡B细胞的明显减少,且增多的MZB和B1与自身免疫性疾病和肺部感染易感性相关,但p110δ过度活化如何导致MZB和B1细胞增加的机制尚不清楚。早期B细胞在骨髓发育后进入脾脏进一步发育分化成熟,逐渐经历过渡性B细胞T1、T2阶段分化为成熟的滤泡B细胞和MZB,目前的研究表明在更早的T1B阶段即存在ADAM10阳性的细胞亚群为专职发育成MZB的前体细胞以及CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+的过渡性B细胞为专职发育成B1的前体细胞。本实验拟通过检测APDS小鼠脾脏前体B细胞亚群,探讨PI3Kδ过度活化是否在过渡性B细胞阶段即影响了专职的MZB前体细胞和B1前体细胞的分化进而导致B细胞的分化发育异常。方法:通过流式细胞术检测APDS小鼠和WT小鼠脾脏T1B、T2B、CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+B、ADAM10+T1B等B细胞各亚群的比例。通过APDS/WT骨髓嵌合体小鼠模型验证B细胞各亚群的发育分化异常是否为固有存在。结果:与WT小鼠相比,APDS小鼠脾脏成熟滤泡B细胞比例下降,CD19+B220+CD21+CD23-CD93-和CD19+B220+CD21+CD1d+CD93-MZB增加,CD19+B220low CD5+B1细胞增加,CD19+B220+CD21-CD23-CD93-的双阴性B细胞比例增加;APDS小鼠CD19+B220+Ig M+CD23-CD93+的T1B细胞比例增加,CD19+B220+Ig M+CD23+CD93+的T2B细胞比例下降;APDS小鼠脾脏B1细胞前体细胞CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+、MZB前体细胞ADAM10+T1B细胞亚群比例增高。结论:PI3K过度活化通过影响T1B细胞ADAM10的表达使得在T1B细胞阶段专职的MZB前体细胞分化增加是APDS小鼠MZB细胞发育增加而成熟滤泡B细胞发育减少的重要机制之一;PI3K过度活化在过渡性B细胞阶段导致脾脏前体细胞CD19+B220low CD5+Ig M+CD93+分化增加进而导致脾脏B1细胞的发育增加。第三部分一例RAC2基因自发突变患儿临床研究研究背景:RAC2蛋白（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2,RAC2）属于GTP酶的Rho超家族的成员,其主要表达于造血系统,作为中性粒细胞NADPH组成元件参与粒细胞ROS产生、作为分子开关通过调节GTP结合状态（活化状态）与GDP结合状态（失活状态）间的相互转换促发下游级联反应发挥免疫细胞骨架重排、细胞伪足形成、吞噬细胞黏附趋化吞噬功能、T淋巴细胞和B淋巴细胞的发育、迁移、活化及参与PAK1等多种信号通路信号传导发挥多种生物信息功能。RAC2基因突变病例极其罕见,既往报道RAC2基因突变方式包括常染色体显性失功能突变方式导致中性粒细胞功能严重障碍而表现为CGD的临床症状,部分患儿表现为T淋巴细胞的严重减少;以及常染色体隐性失功能突变方式导致CVID的临床表现;这两种遗传方式导致的RAC2蛋白的表达明显下降或缺失,为失功能（loss of function,LOF）的突变。随着基因测序技术的发展和广泛应用,目前逐渐有RAC2常染色体显性增功能突变方式导致RAC2蛋白活性增强（gain of function,GOF）的病例报道,此类患儿的临床表现各异,其粒细胞ROS活性增强,T淋巴细胞和B淋巴细胞严重减低,对于T淋巴细胞和B淋巴细胞严重减低的机制目前不清楚。本中心收治1例RAC2基因自发突变的患儿,该突变位点未见报道,临床主要变现为反复的肺部感染和支气管扩张,我们对其临床和部分免疫细胞功能进行了初步研究。研究方法:分离外周血单个核淋巴细胞及中性粒细胞,进行一代测序;通过流式细胞术检测患儿淋巴细胞亚群表型;通过CD3+CD28及PMA+离子霉素体外刺激检测T淋巴细胞增殖功能;通过鲁米诺放大化学发光法检测中性粒细胞ROS的产生;通过流式细胞术检测中性粒细胞肌动蛋白的表达情况;通过共聚焦显微镜观察中性粒细胞及T淋巴细胞极化状态;通过蛋白免疫印迹检测RAC2蛋白的表达情况;通过流式细胞术检测中性粒细胞和T淋巴细胞及B淋巴细胞凋亡;通过流式细胞术检测单个核淋巴细胞亚群RAC2的表达情况。结果:患儿为RAC2基因自发错义突变,患儿单个核淋巴细胞及中性粒细胞均存在此突变,其免疫表型为联合免疫缺陷,其T细胞增殖功能减低,粒细胞产生ROS功能增强,粒细胞肌动蛋白表达增强;患儿中性粒细胞及T淋巴细胞体外刺激时细胞actin和RAC2极化状态缺陷;患儿中性粒细胞RAC2蛋白表达增强;患儿中性粒细胞和淋巴细胞凋亡增加;患儿淋巴细胞中存在RAC2高表达亚群。结论:本研究发现一例罕见的RAC2基因自发突变,表现为增功能突变,免疫表型为联合免疫缺陷,其淋巴细胞及中性粒细胞功能均受影响。
赵萌萌[7]（2020）在《神经酰胺相关合成酶在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞调控白细胞介素-6生成中的作用》文中研究说明背景:类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是一种以慢性破坏性关节病变为特征的全身性炎性自身免疫病。以滑膜增生,炎症细胞浸润,血管翳形成为主要病理特征。RA患者的外周血和滑膜局部存在的复杂细胞因子及趋化因子网络使炎症环境持续存在。成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte,FLS）既是RA关节炎症损伤的效应细胞,也可导致关节软骨和骨的破坏。在关节靶向阶段,FLS与固有免疫细胞和适应性免疫细胞相互作用,产生大量炎性细胞因子,进而构建了RA关节中的促炎微环境,FLS与其相关的细胞因子在RA的发生中起到关键作用。其中IL-6作为发挥核心作用的促炎因子,通过与FLS及其他免疫细胞的相互作用,促进组织损伤、急性期反应及自身免疫反应,在RA的发病机制中发挥多种作用。IL-6R拮抗剂已经在临床反馈中取得非常好的疗效,调控IL-6信号转导途径被视为治疗RA的重要靶点。鞘脂类是细胞膜的重要组成部分,且与许多细胞功能息息相关。鞘脂类对IL-6的生成有调节作用,同时TNF-α及IL-1β等促炎性细胞因子可以影响鞘脂类的代谢。鞘脂类相互代谢是在许多酶的参与下逐步进行的。其中,神经酰胺是鞘脂类的核心,通过重组给定的信号体,在多种疾病和免疫调节中发挥诸多功能。神经酰胺打捞途径相关酶ASM（Acid Sphingomyelinase,酸性鞘磷脂酶）和GBA1（Acidβ-glucosidase 1,酸性β葡糖苷酶1）与肿瘤细胞生成IL-6相关,ASM/神经酰胺通过p38途径,在IL-6m RNA表达的稳定性中起独立的正向作用,从而使IL-6生成增加。且ASM通过调节IL-6的生成,参与肿瘤细胞的侵袭性病理生物学行为。而GBA1在乳腺癌细胞中则以GBA1-神经酰胺-p38δ途径与IL-6的生成负相关。因此本课题组推测神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1通过p38途径调控RAFLS生成IL-6,进而可能影响RAFLS的异常增殖、抗凋亡、迁移及侵袭能力,参与RA的疾病进程。本研究将采用RA患者外周血和FLS作为研究对象,深入探讨神经酰胺合成酶ASM和GBA1在RA中对IL-6的调控作用及其相关作用机制。第一部分:类风湿关节炎患者外周血中神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1的表达情况目的:研究神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1在RA患者外周血中的表达情况,以及与TNF-α、IL-6及其他临床指标进行相关性分析。方法:收集中国医科大学附属第一医院风湿免疫科住院符合2010年美国风湿病学会（ACR）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）修订的RA分类诊断标准的RA患者42例,以及同期年龄、性别匹配的健康对照15例。收集患者年龄、性别、病程、合并脏器受累情况、药物治疗史,肿胀关节数（SJC）、压痛关节数（TJC）、VAS评分、红细胞沉降率（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）、抗环瓜氨酸多肽抗体（anti-CCP）及临床常规实验室检查结果,评估疾病活动度（DAS28-ESR、DAS28-CRP、CDAI、SDAI）及关节骨侵蚀分级（双手X线平片）。应用ELISA法检测RA患者外周血清中的ASM和GBA1以及TNF-α、IL-6的水平。两组间的差异符合正态分布样本应用独立样本t检验,非正态分布数据应用Mann-Whitney秩和检验。血清中ASM和GBA与细胞因子TNF-α、IL-6以及各临床相关指标之间的相关性分析采用Spearman相关性分析（非参数相关性分析）。结果:42例RA患者中处于缓解及低疾病活动度（DAS28-CRP≤3.2）有4例（10%）,中度疾病活动度（3.2<DAS28-CRP<5.1）有13例（41%）,重度疾病活动度（DAS28-CRP≥5.1）25例（59%）,入选RA患者以中重度疾病活动度居多。RA患者组血清中的ASM和GBA1表达水平与健康对照组相比显着增高（p=0.0419,p<0.0001）。进行Spearman相关性分析,结果发现血清GBA1水平与IL-6（r=-0.4957,p=0.0008）呈负相关;与PLT（r=0.4625,p=0.002）和CRP（r=0.3946,p=0.0097）呈正相关;而血清ASM与GBA1、IL-6、TNFα以及PLT、ESR、CRP、RF、anti-CCP等临床相关指标无显着相关性。结论:RA患者外周血中神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1的表达水平升高,GBA1与IL-6的水平呈负相关。ASM和GBA1可能通过调控炎症的不同作用参与RA的发病。第二部分:神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中调控白细胞介素-6的作用目的:分离、培养及鉴定RAFLS;研究神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1对RAFLS产生IL-6以及增殖、凋亡、迁移及侵袭的调控作用。方法:10例符合诊断标准RA患者在骨科及运动医学科进行膝关节置换术后,留取滑膜组织标本,应用酶消化法获得原代FLS,采用免疫荧光检测FLS中Vimentin的表达情况进行鉴定。采用ELISA法检测RAFLS上清IL-6的水平,real-time PCR方法检测RAFLS中IL-6 m RNA的表达。采用CCK8法检测细胞增殖,采用流式细胞术（Annexin V/PI）检测细胞凋亡,应用划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。结果:体外分离、培养的原代滑膜细胞,传代至（P3-4）高表达Vimentin,鉴定为RAFLS。应用不同浓度IL-1β刺激RAFLS不同时间,各不同刺激时间组内,IL-1β2.5ng/ml和IL-1β10ng/ml组细胞上清中IL-6含量均较空白对照组有显着升高（p<0.05,p<0.0001）,选择2.5ng/ml诱导24小时作为刺激RAFLS的作用条件。托珠单抗（IL-6R拮抗剂）、地昔帕明（ASM抑制剂）、托珠单抗联合地昔帕明及托珠单抗联合环己烯四醇β环氧化物（GBA抑制剂）均可显着下调由IL-1β刺激RAFLS中的IL-6蛋白和m RNA表达（p<0.05、p<0.001或p<0.0001）;环己烯四醇β环氧化物可显着上调IL-1β刺激RAFLS中IL-6蛋白和m RNA表达（p<0.0001）;托珠单抗联合地昔帕明较单用托珠单抗组的IL-6蛋白和m RNA表达显着下降（p<0.05、p<0.0001）。托珠单抗、地昔帕明、托珠单抗联合地昔帕明均可显着抑制IL-1β诱导的RAFLS增殖能力（p<0.01、p<0.05、p<0.001）;而环己烯四醇β环氧化物则显着增加IL-1β诱导的RAFLS增殖能力（p<0.05）,各组药物对细胞凋亡无明显影响。托珠单抗、地昔帕明、托珠单抗联合地昔帕明均可显着抑制IL-1β诱导的RAFLS的迁移和侵袭能力（p<0.05）;而环己烯四醇β环氧化物则显着增加IL-1β诱导以及托珠单抗处理的RAFLS迁移和侵袭能力（p<0.05、p<0.0001）。结论:功能性ASM抑制剂可以下调RAFLS分泌IL-6及抑制RAFLS细胞增殖、迁移及侵袭功能,且功能性ASM抑制剂与IL-6拮抗剂伍用,可以协同抑制RAFLS分泌IL-6及RAFLS细胞增殖、迁移及侵袭功能。因此三环类抗抑郁药等功能性ASM抑制剂可能对RA的关节滑膜炎症有潜在的治疗作用,并可以与IL-6拮抗剂联合应用进行协同治疗。而GBA1抑制剂可以上调RAFLS分泌IL-6并增强RAFLS细胞增殖、迁移及侵袭功能,GBA1可能参与RA的疾病进程。第三部分:神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1通过p38通路在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中调控白细胞介素-6的生成目的:研究神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1调控RAFLS产生IL-6的分子机制。方法:采用原代分离培养并经过鉴定的P3-6的RAFLS进行实验。应用Western Blot法测定RAFLS MAPK信号通路中p38α、p38δ、ERK、JNK及蛋白磷酸化水平。构建针对人源GBA、ASM沉默慢病毒载体并转染RAFLS,应用Real-time PCR方法和Western Blot方法检验沉默慢病毒转染RAFLS后GBA m RNA、ASM m RNA和GBA和ASM的蛋白表达。采用ELISA法检测RAFLS上清IL-6的水平,real-time PCR方法检测RAFLS中IL-6 m RNA的表达。结果:地昔帕明、托珠单抗及地昔帕明+托珠单抗可以显着抑制IL-1β诱导的p38α、p38δ、ERK、JNK的磷酸化（p<0.0001）;地昔帕明+托珠单抗较托珠单抗组显着下调IL-1β诱导p38α、p38δ磷酸化水平（p<0.01、p<0.05）。而环己烯四醇β环氧化物则可以显着上调IL-1β诱导的p38α、p38δ、ERK、JNK的磷酸化（p<0.05、p<0.01、p<0.0001）。构建沉默慢病毒质粒转染RAFLS,与阴性对照感染组相比,LV-GBA及LV-ASM转染组相应m RNA及蛋白表达显着下降。GBA沉默病毒转染RAFLS可以显着上调IL-1β诱导细胞产生的IL-6蛋白和m RNA水平（p<0.001）;ASM沉默病毒转染RAFLS可以显着下调IL-1β诱导细胞产生的IL-6蛋白和m RNA水平（p<0.0001）。GBA沉默病毒转染RAFLS可以显着上调IL-1β诱导的p38α、p38δ、ERK、JNK的磷酸化（p<0.0001、p<0.01、p<0.05、p<0.01）;ASM沉默病毒转染RAFLS可以显着下调IL-1β诱导的p38α、p38δ、ERK、JNK的磷酸化（p<0.0001）。p38 MAPK抑制剂SB202190可以显着下调GBA和ASM沉默慢病毒载体转染RAFLS经IL-1β诱导细胞产生的IL-6蛋白和m RNA水平（p<0.0001）。结论:功能性ASM抑制剂和ASM沉默慢病毒均可以通过抑制p38活化进而下调RAFLS分泌IL-6,功能性ASM抑制剂和IL-6拮抗剂伍用可以协同抑制p38活化。GBA抑制剂和GBA沉默慢病毒可以通过激活p38通路进而促进RAFLS分泌IL-6。
赵云[8]（2020）在《内源性和外源性甲醛的生理与毒性效应及采用CRISPR对其毒性机制的研究》文中研究指明甲醛（formaldehyde,FA）在经济发展中具有重要地位,全球数百万人遭受着来自环境和职业方面的甲醛暴露。某些职业环境往往会产生高水平的甲醛,例如木材加工业和防腐行业及病理学实验室。汽车发动机、烟草烟雾、木质家具、地毯等家用材料所引起的较低水平甲醛环境暴露则使更多人的身体健康受到影响。此外,与一氧化氮（NO）,一氧化碳（CO）和硫化氢（H2S）类似,甲醛也能够通过多种生化途径内源性产生,并且在生物系统中可以发挥多种生理作用。作为一种普遍存在的环境污染物,甲醛引发的健康效应受到了人们的广泛关注。大量研究表明,甲醛可引发急性毒性和刺激性、氧化应激和炎症反应、遗传毒性、神经毒性、心血管效应和致癌性等多种毒性效应。有研究表明内源性甲醛在生理层面具有一定的心血管效应,可损伤血管内皮细胞,与动脉粥样硬化发病相关,且可以引起血管舒张。早期更有研究提出假说,内源性甲醛可能在机体中充当一种新型的气体信号分子。但仅有的相关研究非常有限,目前关于内源性甲醛的心血管效应仍然具有很大的空白,关于其作为气体信号分子的假说仍待探究。另一方面,甲醛已被国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer,IARC）归类为第Ⅰ类人类致癌物,可引发鼻咽癌。此外,甲醛被美国国家毒理学计划（National Toxicology Program,NTP）归类为髓性白血病原,与髓系白血病发病相关。然而关于甲醛致白血病的结论仍存在争议,因为许多经典的白血病原可以直接破坏骨髓中的造血干/祖细胞（HSC/HPC）,而甲醛作为最小且反应性极高的醛类,无法通过吸入暴露到达骨髓。最近的一项突破性研究表明,小鼠的肺部含有功能性的HSC/HPC,可以产生血细胞并在肺部和骨髓之间双向运输。因此,这一最新发现构成了本研究假说的基础,即吸入甲醛并非直接诱导产生骨髓毒性,而是在小鼠的肺和/或鼻中引发HSC/HPC毒性。前期一些研究采用酵母模型进行了功能性毒理基因组学筛选,鉴定出许多甲醛毒性调控的相关基因和细胞途径。尽管如此,目前尚不清楚人源细胞中进行甲醛毒性调控的特定基因、途径及作用机制。因此,本研究在对内源性和外源性甲醛的生理和毒性效应进行探究的基础上,进一步采用功能丧失性全基因组CRISPR筛选以鉴定K562细胞（人类白血病细胞系）对于甲醛毒性的调控机制。如下所示为本研究主体进行的三方面工作:（1）采用离体血管环灌流装置模拟人体内环境,本研究开展了关于内源性甲醛引发大鼠主动脉舒张作用及其可能机制的相关探讨。研究表明,甲醛对于大鼠主动脉血管环的舒张效应具有浓度依赖性。此外,采用甲醛处理大鼠离体主动脉环时,NO/cGMP途径显着上调。另一方面,甲醛使得大鼠主动脉环血管平滑肌上的大电导Ca2+激活的K+（BKCa）通道亚基蛋白α和β的表达增加。此外,甲醛对大鼠主动脉环进行孵育后可显着提升其ATP敏感的K+（KATP）通道亚基蛋白Kir6.1和Kir6.2的表达。反之,L型Ca2+通道（LTCC）亚基Cav1.2和Cav1.3的表达水平随着甲醛浓度的升高显着下降。本研究初步表明甲醛对血管收缩性的调节可能是通过对NO/cGMP途径的上调和对离子通道表达的调控（包括上调KATP和BKca通道的表达以及抑制LTCC的表达）实现的,而甲醛诱导血管舒张的深入机制仍需进一步探究。（2）为了检验上文中提到的甲醛致白血病新型假说,本研究采用骨髓和脾脏作为对照,成功地于小鼠肺和鼻中培养出红系爆发式形成单位（BFU-E）和粒性白细胞、巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）,并进一步表明在3 mg/m3甲醛吸入暴露或400 μM甲醛体外暴露均能减少小鼠肺和鼻中两种集落类型的形成。本研究第一次揭示了甲醛暴露能够损伤小鼠远离骨髓的器官肺和鼻中HSC/HPC,这表明小鼠的肺/鼻（而非骨髓）可能是甲醛暴露诱发白血病的靶标部位,而甲醛导致的小鼠肺和鼻中HSC/HPC毒性为甲醛吸入相关的白血病发生提供了潜在的生物学可能性,而深入的致病机制仍需进一步研究。（3）采用全基因组CRISPR筛选,本研究选取第8天和第20天作为两个时间点,评估了K562细胞对不同剂量甲醛（40、100和150μM）的敏感性和抗性的遗传决定因素,确定了多个候选基因在缺失之后能够增加细胞对甲醛的敏感性（例如ADH5,ESD和FANC家族）或抗性（例如FASN和KMD6A）。通路分析表明甲醛代谢和DNA同源修复（HR）途径在细胞对甲醛耐受中起主要作用,这与前人的研究结果相一致。采用通路分析,本研究进一步揭示了一碳代谢、脂肪酸合成和mTOR信号传导在调节甲醛的细胞毒性方面可能具有重要作用。这些新发现有待进一步验证以增强目前对于甲醛引起细胞毒性的理解。此外,本研究对CRISPR功能基因组学筛选在其他环境化学物质方面的应用具有一定的参考价值。综上所述,本研究通过实验证实了内源性甲醛在机体内可能充当另外一种气体信号分子。此外,本研究首次在小鼠肺和鼻中的造血干/祖细胞中培养出集落,并提出肺/鼻可能是甲醛引发白血病的靶标部位,从而为甲醛致白血病的生物学可能性提供了有力的证明。进一步,本研究采用CRISPR筛选从全基因组层面对甲醛引发细胞毒性中相关的易感基因和生物学途径进行探究,并从中发现了新的分子机制和途径,这也为今后深入了解甲醛毒性开辟出新的切入点。
张雅君[9]（2020）在《磷酸化热休克蛋白27在肠上皮细胞炎症反应中的作用及机制研究》文中研究指明背景与目的:腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是以腹泻为主要临床症状的功能性肠道疾病,发病率高,症状反复,对患者影响较大。IBS-D发病机制目前尚不十分清楚,治疗以对症治疗为主,然其疗效不佳,研究IBS-D发病机制将对其治疗至关重要。肠道感染与肠道低度炎症在IBS-D的发病中起重要作用。核转录因子-kappa B（NF-κB）信号通路的激活是诱发肠道慢性炎症的一个重要因素,其参与调控细胞炎症反应及细胞增殖凋亡等多种生物学过程;前期研究发现IBS-D大鼠肠道黏膜中NF-κB表达升高,阻断NF-κB通路后,可缓解肠道黏膜屏障损伤,但NF-κB在IBS-D肠道炎症中的活性调节机制目前研究尚不明确。热休克蛋白27（HSP27）是一种高度保守蛋白质,其广泛存在于多种细胞中,能够提升机体对外界应激抵抗能力。研究显示HSP27主要通过磷酸化（p-HSP27）发挥作用,HSP27可通过抑制NF-κB通路的激活,进而抑制炎症反应,且前期研究中发现IBS-D患者肠道黏膜中HSP27表达升高,但HSP27在IBS-D中的作用及机制尚不清楚。本研究拟探讨HSP27表达及其磷酸化在体外模拟的IBS-D肠上皮细胞炎症反应中的作用及其与NF-κB信号通路的关系,为IBS-D肠黏膜炎症的发病机制提供理论依据,为该病的诊疗提供新的思路。方法:应用LPS处理Caco-2、NCM460两种肠上皮细胞,在体外模拟IBS-D肠上皮细胞炎症反应模型。应用HSP27磷酸化抑制剂KRIBB3抑制HSP27的磷酸化。siRNA-HSP27下调细胞内HSP27的表达。Western Blot实验检测细胞内HSP27、p-HSP27、p-IκBα及IκB-α的表达水平。ELISA实验检测细胞中IL-1β及IL-6的含量变化。应用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平,CCK8实验检测细胞增殖能力。利用SPSS22.0对结果进行统计分析。结果:1.LPS能促进肠上皮细胞内HSP27的表达及其磷酸化,KRIBB3显着抑制HSP27在细胞中的磷酸化。2.LPS诱导肠上皮细胞IL-1β及IL-6的表达;抑制HSP27磷酸化显着增强LPS介导的IL-1β及IL-6表达。3.LPS可诱导肠上皮细胞凋亡,抑制细胞增殖;抑制HSP27的磷酸化可促进LPS介导的肠上皮细胞凋亡及增殖抑制。4.LPS可促进IκB-α磷酸化及降解;抑制HSP27的磷酸化可增强LPS引起的IκB-α磷酸化,减弱IκB-α的降解。5.下调细胞中HSP27的表达对IκB-α与p-IκBα在肠上皮细胞内的表达无明显影响。结论:炎症可促进肠上皮细胞中HSP27的表达及其磷酸化,HSP27可通过其磷酸化抑制p-IκBα/NF-κB信号通路的激活及IL-1β、IL-6等炎性因子的表达,促进肠上皮细胞的增殖,抑制其凋亡,减轻IBS-D肠道黏膜炎症反应。p-HSP27/p-IκBα/NF-κB通路可能为IBS-D的治疗提供新的靶点。
李继刚[10]（2019）在《TIPE2在骨质疏松症患者中的表达及其在骨质疏松发病机制中的初步研究》文中研究说明[研究目的]随着全球人口的老龄化,骨质疏松症（osteoporosis,OP）的发生率逐年升高,目前已经是一种最常见的老年性疾病,其病理特征是以骨量减少和显微结构破坏为主要特点,从而导致骨强度下降,骨脆性增加,容易发生骨折。骨质疏松所致的脊柱或髋关节骨折的患者由于需要长期卧床,使得肺部感染与血栓栓塞等严重并发症的发生率明显增加,患者死亡率明显升高,造成了严重的社会和经济负担。目前骨质疏松症已成为全球关注的老年性疾病之一,流行病学资料调查显示,骨质疏松症患者发生脆性骨折的风险高达40%,中国目前已经成为世界上老年人口最多的国家,随着预期寿命的延长,骨质疏松症的发生率也呈逐渐上升趋势。因此,深入研究骨质疏松症的发病机制,明确其关键致病基因、寻找新型药物的治疗靶点对于骨质疏松症的早期诊断、治疗及新药研发均具有重要的研究意义。现已明确,慢性炎症与骨质疏松症的发生密切相关,炎症导致的破骨细胞过度活化造成骨转换失衡是其中的关键因素。慢性炎症产生的相关细胞因子能使破骨细胞前体细胞活化,导致骨吸收增多和骨形成减少,使病人罹患骨质疏松症和骨质疏松性骨折的风险明显增加,其主要机制就是炎症导致的OPG-RANK-RANKL体系的失衡。慢性炎症会产生大量的炎性因子,其中TNF-a、IL-1、IL-6等炎症因子均可刺激RANKL的大量表达,促进其与破骨细胞前体细胞表面的RANK结合,从而诱导多核破骨细胞的分化成熟,其中NF-κ B通路的激活则处于关键环节。因此,破骨细胞的分化依赖于RANKL诱导的NF-κ B激活。当NF-κ B信号通路被抑制后,破骨细胞形成的数量也明显减少,骨质侵蚀程度等关节炎表现也明显降低。相关研究已经证实NF-κ B不仅在炎症通路中起重要作用,也是破骨细胞分化成熟中的关键分子。TIPE2（tumor necrosis factor-a induced protein 8-like 2,TNFAIP8L2）与 TNFAIP8L（TIPE）、TNFAIP8L1（TIPE1）和 TNFAIP8L3（TIPE3）同属于 TNFAIP8家族,是近年新发现的一种重要的炎症和免疫自稳调节分子。在LPS诱导的炎症过程中,TIPE2功能主要是抑制核因子NF-κ B的活化以及蛋白AP-1的激活。而存在TIPE2基因缺陷的细胞会表现出对T细胞受体信号活化和Toll样受体的高反应性。TIPE2基因被敲除后的小鼠会出现多器官自发性炎症,表现为脾肿大、体重下降等,且炎症反应会不断加剧,最终导致死亡。TIPE2的表达失衡与系统性红斑狼疮、乙型肝炎、糖尿病肾炎等炎症性疾病密切相关。而TIPE2在骨质疏松症中的表达水平如何?是否与骨质疏松症的发生与发展存在相关性?目前仍不明确。在LPS诱导的炎症过程中TIPE2可影响NF-κ B的激活,但在破骨细胞活化过程中其是否调控NF-κ B信号通路?具体分子机制如何?目前尚无相关性研究。炎症过程中,RANKL-RANK激活NF-κ B引起破骨细胞过度活化,导致骨转换失衡,进而引发骨质疏松,我们根据文献及前期实验基础推测TIPE2在该过程中发挥了关键作用。本研究在前期基础上,利用多种分子生物学手段,将阐述TIPE2通过负调控NF-κ B通路影响破骨细胞活化,参与骨质疏松发生进程,并初步探讨其机制。[研究方法]一、检测TIPE2的表达水平,并与炎症因子、破骨细胞活化指标做相关性分析收集80名骨质疏松患者（35名骨折组,45名非骨折组）与90名健康对照者的一般资料,分别测定其腰椎及股骨颈的骨密度,并收集其外周血标本。采用电化学发光法检测骨代谢指标:骨吸收标志物β胶联降解产物（β-CTX）和骨形成标志物I型胶原氨基端前肽（P1NP）。采用ELISA法检测外周血中IL-1 β、IL-6、TNF-a等炎症因子的水平。采用Real-Time PCR和Western-blot法检测外周血单个核细胞中TIPE2基因与蛋白的表达情况,并通过Spearman相关性分析TIPE2表达水平与患者血清中IL-1 β、IL-6、TNF-α等炎症因子、BMD以及骨代谢标志物的相关性。使用Simple Logistic Regression、R0C分析计算AUC值分析TIPE2对骨质疏松症患者脆性骨折的预测功能。二、外周血单个核细胞转染TIPE2慢病毒后LPS刺激实验采用Ficoll密度梯度离心法分离骨质疏松患者及对照组外周血单个核细胞在DMEM中进行培养,转染TIPE2过表达慢病毒后用LPS刺激。ELISA法检测培养上清中IL-1 β、IL-6、TNF-a等炎症因子的水平,采用Real-Time PCR和Western-blot法检测NFκ B通路活化情况。三、建立体外细胞模型,研究TIPE2参与骨质疏松的初步机制采用二代自失活型慢病毒包装系统进行病毒包装构建TIPE2干扰慢病毒载体。获取小鼠骨髓单核巨噬细胞,并在体外进行分离、培养及扩增,绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测小鼠骨髓单核巨噬细胞表面抗原CD11b的表达。用TIPE2 siRNA慢病毒载体（TIPE2-si）分别转染小鼠骨髓来源单核巨噬细胞及RAW264.7细胞系为模型,Real-Time PCR检测病毒转染成功率。然后用RANKL刺激其向破骨细胞分化,TRAP染色检测破骨细胞活化程度;ELISA法检测上清中炎症因子（IL-1 β、IL-6、TNF-a）变化;Real-Time PCR检测破骨细胞活化指标TRAP、Mmp9、Cathepsin K、NFATcl 及 NF-κ B 信号通路活化关键基因 11-6、Birc3、Tnf-α、Cox-2等的表达水平;Western blot检测NF-κ B活化指标p65的磷酸化情况。[研究结果]一、TIPE2表达水平及其与炎症因子、破骨细胞活化指标、BMD的相关性1.结果显示:不管是mRNA还是蛋白水平,骨质疏松症患者的TIPE2表达水平显着低于健康对照者。更有意义的是,TIPE2 mRNA表达与血清中IL-1,IL-6和TNF-α等炎症因子水平呈负相关。以上结果表明,TIPE2可能参与骨质疏松症的发生发展过程,并通过抑制炎性细胞因子的分泌参与骨质疏松症的疾病进程。2.分析TIPE2和β-CTX及PINP之间的关系。结果显示TIPE2与β-CTX呈负相关。然而,TIPE2和PINP之间无明显统计学意义上的相关性。TIPE2与β-CTX之间的负相关性关系表明TIPE2可能通过抑制破骨细胞形成发挥其生物学功能。3.分析TIPE2与BMD之间的关系,结果显示,TIPE2与骨质疏松症患者腰椎（L1-L4）和股骨颈BMD值呈显着正相关,提示TIPE2可作为保护性因素参与骨质疏松症的疾病进程。4.利用Simple Logistic Regression方法观察其对骨质疏松症患者骨折的预测功能。结果发现骨折组的TIPE2表达显着低于对照组。更有意义的是,TIPE2具有显着的统计学意义用来预测骨质疏松症患者的骨折风险,TIPE2具有良好的AUC值来预测骨质疏松症患者骨折概率。5.外周血单个核细胞转染TIPE2慢病毒后LPS刺激实验将骨质疏松症患者的单核细胞在DMEM中培养,转染TIPE2慢病毒及对照病毒后用LPS刺激。结果显示,转染TIPE2后,培养上清液中的TNF-α、IL-1 户、IL-6等促炎细胞因子明显减少,Western blot检测结果显示NF-κ B通路活化明显减弱,表明TIPE2可抑制单核细胞对LPS刺激的敏感性。该结果进一步表明TIPE2表达水平下降可能是骨质疏松症的发病机制之一。二、体外细胞模型研究TIPE2参与骨质疏松的初步机制1.用TIPE2 siRNA慢病毒质粒（TIPE2-si）感染小鼠骨髓来源巨噬细胞及RAW264.7细胞系,然后用RANKL刺激后,TRAP染色显示破骨细胞活化明显增多。2.在小鼠骨髓来源巨噬细胞及RAW264.7细胞培养中,干扰TIPE2表达,然后用RANKL刺激,Real-Time PCR结果显示破骨细胞活化标志物Trap、Mmp9、Cathepsin K（Ctsk）、Nfatcl 和 NF-κ B 通路激活指标 11-6、Birc3、Tnf-α、Cox-2等基因表达明显上调。3.ELISA法检测培养上清中NF-κ B调控基因TNF-α、IL-1 β、IL-6等炎症因子出现明显上调现象。4.Western Blot法检测NF-κ B通路p65及p-p65变化,结果显示干扰TIPE2表达后p-p65明显上调。[研究结论]1.骨质疏松症外周血单个核细胞中TIPE2表达水平下降,且与IL-1,IL-6和TNF-α等炎症细胞因子、骨吸收标志物β-CTX呈负相关,TIPE2可能通过抑制炎症因子的分泌以及破骨细胞的活化参与骨质疏松的发生与发展。2.TIPE2表达水平与BMD呈正相关,可预测骨质疏松症患者骨折的风险。3.TIPE2可抑制LPS刺激骨质疏松症患者单核细胞引起的活化。以上结果表明TIPE2表达下降可能是骨质疏松症的发病机制之一。1.干扰TIPE2表达后破骨细胞活化明显增多,相关基因（Trap,Mmp9,Ctsk）,NF-κ B 调控基因（11-6,Birc3,Tnf-α,Cox2）均明显上调;NF-κ B 调控的TNF-α、IL-1 β、IL-6等炎症因子明显上调。2.破骨细胞活化过程中,干扰TIPE2表达后,NF-κ B通路活化的p-p65明显上调。以上结果表明TIPE2可通过负调控NF-κ B通路抑制破骨细胞的活化,参与骨质疏松的发病过程。
二、Signaling for inducible Fas-resistance in primary B lymphocytes（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Signaling for inducible Fas-resistance in primary B lymphocytes（论文提纲范文）
（1）万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 类风湿关节炎概述 |
| 1.2 类风湿关节炎发病机制 |
| 1.2.1 触发阶段 |
| 1.2.2 成熟阶段 |
| 1.2.3 靶向阶段 |
| 1.2.4 爆发性阶段 |
| 1.3 类风湿性关节炎现代药物疗法 |
| 1.3.1 传统DMARDs |
| 1.3.2 生物DMARDs |
| 1.3.3 小分子DMARDs |
| 1.4 肠道微生物群与类风湿关节炎 |
| 1.4.1 肠道菌群与免疫调节细胞 |
| 1.4.2 肠道菌群介导炎症性关节炎 |
| 1.4.3 肠道菌群介导类风湿关节炎治疗 |
| 1.4.4 益生菌 |
| 1.5 中草药对RA-FLSs细胞凋亡的影响及机制 |
| 1.5.1 RA-FLSs细胞凋亡 |
| 1.5.2 死亡受体介导的凋亡途径 |
| 1.5.3 线粒体依赖性凋亡途径 |
| 1.5.4 .NF-κB介导的凋亡途径 |
| 1.5.5 MAPK介导的凋亡途径 |
| 1.5.6 .其他凋亡途径 |
| 1.6 万通筋骨片研究进展 |
| 1.7 技术路线 |
| 第2章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂与耗材 |
| 2.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大鼠急毒实验 |
| 2.3.2 CIA大鼠模型建立 |
| 2.3.3 动物分组与给药 |
| 2.3.4 酶联免疫吸附试验 |
| 2.3.5 HE染色 |
| 2.3.6 免疫组化分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 万通筋骨片安全给药浓度 |
| 2.4.2 CIA大鼠模型 |
| 2.4.3 万通筋骨片对RA具有抗炎作用 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 万通筋骨片在类风湿性关节炎中的抗炎机制 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂与耗材 |
| 3.2.3 实验细胞与实验动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 万通筋骨片溶液配制 |
| 3.3.2 RA-FLSs细胞培养 |
| 3.3.3 细胞形态观察 |
| 3.3.4 RA-FLSs细胞增殖检测 |
| 3.3.5 蛋白免疫印迹分析 |
| 3.3.6 实时荧光定量PCR分析 |
| 3.3.7 细胞免疫荧光 |
| 3.3.8 质粒转染 |
| 3.3.9 Caspase-3/9蛋白酶活性检测 |
| 3.3.10 免疫组化分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 万通筋骨片乙醇提取物对RA-FLSs细胞的影响 |
| 3.4.2 MEK/ERK信号通路介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.4.3 万通筋骨片乙醇提取物促进RA-FLSs细胞凋亡 |
| 3.4.4 线粒体依赖性凋亡途径介导万通筋骨片的抗炎作用 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 基于RNA高通量测序挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验试剂与耗材 |
| 4.2.3 实验分析软件 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RA-FLSs细胞培养与分组 |
| 4.3.2 样品收集和准备 |
| 4.3.3 数据分析 |
| 4.3.4 实时荧光定量PCR |
| 4.3.5 蛋白免疫印迹 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 DESeq2差异分析 |
| 4.4.2 差异基因功能注释分析 |
| 4.4.3 KEGG富集通路提取及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.4 STEM时间聚类分析 |
| 4.4.5 权重共表达网络分析及功能富集分析 |
| 4.4.6 基因共表达网络分析及蛋白互作网络分析 |
| 4.4.7 核心基因筛选与验证 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 基于16S高通量测序和代谢组学联合分析挖掘万通筋骨片对RA的抗炎靶点 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验仪器 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 实验分析软件 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 16S rDNA扩增子测序 |
| 5.3.2 16S rDNA扩增子信息分析 |
| 5.3.3 代谢物提取 |
| 5.3.4 色谱条件 |
| 5.3.5 质谱条件 |
| 5.3.6 代谢物鉴定 |
| 5.3.7 肠道菌群与代谢物联合分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 万通筋骨片改变CIA大鼠肠道菌群结构 |
| 5.4.2 万通筋骨片作用特定肠道菌群 |
| 5.4.3 万通筋骨片改变CIA大鼠血清代谢物谱 |
| 5.4.4 差异代谢物筛选 |
| 5.4.5 靶点代谢物筛选 |
| 5.4.6 16S rDNA高通量测序与代谢物组学联合分析 |
| 5.5 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 附表 |
（2）CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 Toll样受体的免疫调控机制及其所介导的肿瘤细胞死亡方式 |
| 2.1 Toll样受体 |
| 2.2 基于TLRs的免疫调节机制 |
| 2.2.1 肿瘤微环境的免疫平衡 |
| 2.2.2 TLRs对抗原提呈细胞的免疫调节机制 |
| 2.2.3 TLRs对巨噬细胞的免疫调节机制 |
| 2.3 TLRs所介导的细胞死亡的作用机制 |
| 2.4 TLRs在肿瘤治疗中的临床试验研究 |
| 2.4.1 TLR2 相关的临床研究 |
| 2.4.2 TLR3 相关的临床研究 |
| 2.4.3 TLR4 相关的临床研究 |
| 2.4.4 TLR5 相关的临床研究 |
| 2.4.5 TLR7/8 相关的临床研究 |
| 2.4.6 TLR9 相关的临床研究 |
| 2.4.7 传统抗肿瘤治疗对TLR通路的影响 |
| 2.5 总结和展望 |
| 第3章 材料和方法 |
| 3.1 主要仪器设备 |
| 3.2 主要耗材 |
| 3.3 主要抗体列表 |
| 3.3.1 流式抗体列表 |
| 3.3.2 Western Blot抗体列表 |
| 3.4 主要试剂 |
| 3.5 临床样本 |
| 3.5.1 研究对象 |
| 3.5.2 纳入标准 |
| 3.5.3 排除标准 |
| 3.5.4 资料收集及分组 |
| 3.5.5 随访 |
| 3.6 细胞系及培养条件 |
| 3.7 CpG基序的单链脱氧寡核苷酸(CpG ODNs)的制备 |
| 3.8 RNA提取、逆转录条件 |
| 3.9 普通PCR和实时定量PCR |
| 3.10 主要引物序列 |
| 3.11 细胞凋亡测定 |
| 3.12 细胞周期测定 |
| 3.13 细胞表面及细胞胞内蛋白测定 |
| 3.14 蛋白印迹试验 |
| 3.15 蛋白纯化及免疫沉淀 |
| 3.16 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)检测 |
| 3.17 信号通路抑制剂 |
| 3.18 免疫荧光共聚焦显微镜成像 |
| 3.19 急性B淋巴细胞白血病NCG小鼠移植瘤模型的建立 |
| 3.20 CT26 小鼠皮下移植瘤模型的建立 |
| 3.21 小鼠全身免疫微环境的测定 |
| 3.22 统计学分析 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 TLR9在B-ALL患者PBMC中的表达情况 |
| 4.2 TLR9 的表达与B-ALL患者预后的相关性 |
| 4.3 B-ALL细胞系的选择及鉴定 |
| 4.4 TLR9 激动剂——CpG 685对B-ALL细胞系的体外效应 |
| 4.5 CpG 685 对小鼠肿瘤负荷和生存期的影响 |
| 4.6 CpG 685 诱导BLIN-1 细胞凋亡的分子机制 |
| 4.6.1 CpG 685 激活BLIN-1 细胞中的TLR9 下游信号通路 |
| 4.6.2 CpG 685 通过P38 MAPK信号通路诱导BLIN-1 细胞凋亡 |
| 4.6.3 CpG 685 通过JNK/C-MYC信号通路诱导BLIN-1 细胞凋亡 |
| 4.6.4 C-MYC过表达对CpG 685 诱导的BLIN-1 细胞凋亡至关重要 |
| 4.7 不同类型B-ALL对 CpG 685 具有异质性的影响因素 |
| 4.8 Sup-B15 细胞系对CpG 685 耐药的机制 |
| 4.9 联合应用CpG 685 和伊马替尼逆转单药耐药的分子机制 |
| 4.10 联合应用CpG 685 和伊马替尼对Sup-B15 移植瘤小鼠的肿瘤负荷和生存期的影响 |
| 4.11 CpG 685 对原代B-ALL细胞的反应性 |
| 4.12 CpG ODN对小鼠机体免疫状态的调控 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果及奖励 |
| 致谢 |
（3）骨髓间充质干细胞N-Cadherin对MRL/lPR狼疮鼠成骨及造血的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文中主要缩略词中英文对照 |
| 第一章 绪论 |
| 1.研究背景 |
| 1.1 SLE血液系统损害 |
| 1.2 SLE骨髓间充质干细胞(BMMSCs)损伤 |
| 1.3 N-钙黏着蛋白(N-Cadherin)在造血微环境中作用 |
| 2.研究目的 |
| 3.实验设计 |
| 第二章 正常小鼠和狼疮小鼠的N-CADHERIN及成骨能力表达差异 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验器材 |
| 2.1.3 实验试剂及耗材 |
| 2.1.4 实验试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠股骨原代BMMSCs的分离 |
| 2.2.2 BMMSCs的传代和培养 |
| 2.2.3 BMMSCs的冻存 |
| 2.2.4 BMMSCs的复苏 |
| 2.2.5 BMMSCs成骨诱导 |
| 2.2.6 Trizol法提取总RNA |
| 2.2.7 逆转录 |
| 2.3 统计方法 |
| 2.4 统计结果 |
| 2.4.1 BMMSCs表面粘附分子N-钙黏蛋白的表达 |
| 2.4.2 MRL/lpr狼疮鼠OB N-钙黏蛋白的表达 |
| 2.4.3 C57BL/6 小鼠和MRL/lpr狼疮鼠BMMSCs成骨指标的差异 |
| 2.4.4 C57BL/6 小鼠和MRL/lpr狼疮鼠OB成骨指标的差异 |
| 第三章 构建慢病毒载体转染MRL/LPR小鼠BMMSCS下调N-CADHERIN |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验器材 |
| 3.1.3 实验试剂及耗材 |
| 3.1.4 实验试剂配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 小鼠股骨原代BMMSCs的分离 |
| 3.2.2 BMMSCs的传代和培养 |
| 3.2.3 shRNA慢病毒构建 |
| 3.2.4 shRNA慢病毒侵染BMMSCs |
| 3.2.5 流式细胞仪筛选出绿色荧光阳性的细胞 |
| 3.2.6 qRT-PCR鉴定转染成功 |
| 3.3 统计方法 |
| 3.4 统计结果 |
| 3.4.1 shRNA慢病毒侵染BMMSCs |
| 3.4.2 qRT-PCR检测shRNA慢病毒侵染成功 |
| 第四章 慢病毒转染前后MRL/LPR小鼠成骨能力变化 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验对象 |
| 4.1.2 实验器材 |
| 4.1.3 实验试剂及耗材 |
| 4.1.4 实验试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 BMMSCs的传代和培养 |
| 4.2.2 BMMSCs成骨诱导 |
| 4.2.3 qRT-PCR检测转染前后MRL/LPR成骨能力变化 |
| 4.3 统计方法 |
| 4.4 统计结果 |
| 4.4.1 shRNA慢病毒感染前后OB N-Cadherin的表达 |
| 4.4.2 shRNA慢病毒感染前后OB成骨指标的差异 |
| 第五章 各组小鼠移植后造血能力差异 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 实验器材 |
| 5.1.3 实验试剂及耗材 |
| 5.1.4 实验试剂配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1尾静脉注射移植实验 |
| 5.2.2 外周血提取 |
| 5.2.3 骨髓细胞流式细胞术 |
| 5.2.4 脾脏细胞流式细胞术 |
| 5.2.5骨髓细胞集落形成实验 |
| 5.2.6脾脏细胞集落形成实验 |
| 5.3 统计方法 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 移植后各组小鼠血常规的差异 |
| 5.4.2 移植后各组小鼠脾脏流式结果 |
| 5.4.3 移植后各组小鼠骨髓流式结果 |
| 5.4.4 移植后各组小鼠骨髓集落形成差异 |
| 5.4.5 移植后各组小鼠脾脏集落形成差异 |
| 第六章 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（4）雷公藤红素改善Trex1-/-小鼠自身免疫性疾病（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 1.雷公藤红素的结构、性质和功能 |
| 1.1 雷公藤红素的抗炎作用 |
| 1.2 雷公藤红素的抗癌作用 |
| 1.3 雷公藤红素的神经保护作用 |
| 1.4 雷公藤红素对肥胖的治疗作用 |
| 2.天然免疫与获得性免疫 |
| 3.先天免疫与核酸识别 |
| 4.研究意义及目的 |
| 第一章 Celastrol抑制了核酸诱导的IFNβ的释放 |
| 第一节 实验材料和方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 1.2.1 CCK-8 法检测Celastrol对免疫细胞活性的影响 |
| 1.2.2 Celastrol对核酸诱导的Ⅰ型干扰素释放的影响 |
| 1.2.3 Celastrol对外源核酸诱导的Ⅰ型干扰素m RNA表达的影响 |
| 1.2.4 ELISA检测Celastrol对Ⅰ型干扰素分泌的影响 |
| 第三节 小结 |
| 第二章 Celastrol抑制核酸诱导的TBK1-IRF3 活化 |
| 第一节 实验材料和方法 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 2.2.1 在小鼠巨噬细胞中Celastrol对 TBK1-IRF3 信号转导过程的影响 |
| 2.2.2 在THP1 细胞中Celastrol对 TBK1-IRF3 信号转导过程的影响 |
| 2.2.3 Celastrol对不同外源核酸诱导的TBK1-IRF3 信号转导过程的影响 |
| 2.2.4 Celastrol对 HT-DNA或 Poly(I:C)诱导的IRF3 入核的影响 |
| 2.2.5 在293T细胞中Celastrol对 TBK1-IRF3 信号转导的影响 |
| 第三节 小结 |
| 第三章 Celastrol治疗可缓解Trex1~(-/-)小鼠的自身免疫性疾病 |
| 第一节 实验材料和方法 |
| 3.1.1 动物实验 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 第二节 结果与分析 |
| 3.2.1 Celastrol在体外可抑制Poly(I:C)诱导的免疫激活 |
| 3.2.2 Celastrol抑制Trex1~(-/-)胚胎成纤维细胞的免疫激活 |
| 3.2.3 Celastrol可治疗Trex1~(-/-)小鼠心肌炎症 |
| 3.2.4 Celastrol可缓解Trex1~(-/-)小鼠肾脏炎症 |
| 3.2.5 Celastrol抑制Trex1~(-/-)小鼠系统性炎症 |
| 3.2.6 Celastrol抑制Trex1~(-/-)小鼠自身抗体 |
| 3.2.7 Celastrol抑制Trex1~(-/-)小鼠过度活化的T细胞 |
| 3.2.8 Celastrol抑制Trex1~(-/-)小鼠记忆T细胞的过度活化 |
| 第三节 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）B细胞向浆细胞分化发育的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述自身免疫病中B细胞信号通路的作用机制 |
| 2.1 B细胞在发育分化经历的选择作用 |
| 2.2 B细胞活化增殖分化为分泌抗体的浆细胞 |
| 2.2.1 滤泡外B细胞途径 |
| 2.2.2 GC相关B细胞反应 |
| 2.2.2.1 BCR |
| 2.2.2.2 BAFF受体 |
| 2.2.3 TLR |
| 2.2.3.1 TLR异常对B细胞分化发育选择的影响 |
| 2.2.3.2 对B细胞激活的影响 |
| 2.2.4 CD40-CD40L |
| 2.2.5 其他细胞因子 |
| 第3章 Loc108168067基因的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.1.1 细胞系 |
| 3.1.1.2 实验用动物 |
| 3.1.1.3 主要试剂 |
| 3.1.1.4 主要仪器 |
| 3.1.1.5 常用试剂的配制 |
| 3.1.1.6 引物设计 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.2.1 实验小鼠的处理及样品留取 |
| 3.1.2.2 细胞的培养 |
| 3.1.2.3 细胞转染 |
| 3.1.2.4 细胞的增殖、凋亡和周期实验 |
| 3.1.2.5 激光共聚焦 |
| 3.1.2.6 从细胞中提取总RNA |
| 3.1.2.7 将RNA反转录为cDNA |
| 3.1.2.8 Real-time Q-PCR |
| 3.1.2.9 蛋白质免疫印迹实验（Western blotting） |
| 3.1.2.10 双荧光素酶报告基因分析实验 |
| 3.1.2.11 异种移植瘤的小鼠模型的建立 |
| 3.1.2.12 统计 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 与LPS诱导的浆母细胞相比，SP 2/0细胞表达低水平的Loc108168067、Gm40600、和Itch分子 |
| 3.2.2 Loc108168067在LPS诱导的浆细胞中高表达，在SP 2/0细胞中低表达 |
| 3.2.3 Loc108168067过表达对SP 2/0细胞增殖没有影响，但通过G1 / S阻断诱导细胞凋亡 |
| 3.2.4 在SP 2/0异种移植瘤小鼠模型中，Loc108168067过表达不影响肿瘤进展 |
| 3.2.5 激光共聚焦测定Loc108168067在293T细胞过表达定位 |
| 3.2.6 核内Loc108168067促进Trim21和Myc启动子的活化 |
| 3.2.7 Loc108168067过表达可上调Myc及其相关的IRF4和Blimp1的表达 |
| 3.2.8 Loc108168067过表达可上调Trim21及其相关的CDKN1c表达 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 Gm40600基因的相关研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.1.1 细胞系 |
| 4.1.1.2 实验用动物 |
| 4.1.1.3 主要试剂 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 SP 2/0细胞表达低水平的Gm40600 mRNA |
| 4.2.2 Gm40600过表达可诱导SP 2/0细胞凋亡而抑制细胞增殖 |
| 4.2.3 激光共聚焦测定Gm40600在293T细胞过表达定位 |
| 4.2.4 Gm40600过表达降低SP 2/0细胞中Blimp1和Xbp1蛋白的表达 |
| 4.2.5 Gm40600过表达抑制SP 2/0异种移植小鼠模型中的肿瘤进展 |
| 4.2.6 Gm40600过表达抑制经LPS刺激的原代B细胞产生抗体 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 Itch基因敲除小鼠的研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.1.1 试验用动物 |
| 5.1.1.2 主要试剂 |
| 5.1.1.3 主要仪器 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.1.2.1 小鼠基因型鉴定 |
| 5.1.2.2 实验小鼠的样品留取 |
| 5.1.2.3 流式细胞术实验 |
| 5.1.2.4 酶联免疫吸附实验 |
| 5.1.2.4 免疫共沉淀及银染 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 Itch敲除小鼠的鉴定 |
| 5.2.2 相对于全细胞Itch敲除小鼠，B细胞特异性敲除Itch小鼠的症状较轻 |
| 5.2.3 小鼠B细胞特异性敲除Itch后对B细胞活化和抗体水平无明显影响 |
| 5.2.4 Itch在生发中心（GC）B细胞和浆细胞（PC）中的表达下降 |
| 5.2.5 敲除Itch可以促进抗原诱导的B细胞活化和抗体产生 |
| 5.2.6 敲除Itch通过上调具有翻译起始因子活性的蛋白质促进抗原诱导的细胞因子和抗体升高 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PI3Kδ过度活化对脾脏前体B细胞发育的影响研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 结论 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 一例RAC2基因自发突变患儿临床研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（7）神经酰胺相关合成酶在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞调控白细胞介素-6生成中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:类风湿关节炎患者外周血中神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1的表达情况 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 纳入标准 |
| 2.1.2 排除标准 |
| 2.1.3 收集临床资料 |
| 2.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法和步骤 |
| 2.3.1 受试者标本采集与保存 |
| 2.3.2 ELISA法检测受试者血清中ASM、GBA、TNF-α、IL-6的表达量 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 RA患者与健康对照受试者的临床资料 |
| 3.2 RA患者与健康对照受试者血清中ASM水平差异 |
| 3.3 RA患者与健康对照受试者血清中GBA水平差异 |
| 3.4 RA患者血清中ASM与GBA的相关性 |
| 3.5 RA患者血清中ASM与细胞因子IL-6、TNF-α及各临床相关指标的相关性 |
| 3.6 RA患者血清中GBA与细胞因子IL-6、TNF-α及各临床相关指标的相关性 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中调控白细胞介素-6的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法和步骤 |
| 2.3.1 原代人RAFLS的分离与培养 |
| 2.3.2 人RAFLS的鉴定(免疫荧光检测) |
| 2.3.3 ELISA法检测RAFLS细胞上清中IL-6水平 |
| 2.3.4 Real-time PCR检测细胞中IL-6 mRNA表达 |
| 2.3.5 细胞增殖实验(CCK-8) |
| 2.3.6 细胞凋亡实验 |
| 2.3.7 细胞划痕实验 |
| 2.3.8 Transwell侵袭实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 膝关节滑膜组织来源RA患者的临床资料 |
| 3.2 人RAFLS的分离、培养与鉴定 |
| 3.3 IL-1β刺激人RAFLS产生IL-6 |
| 3.4 神经酰胺合成酶(ASM及GBA1)酶抑制剂对RAFLS产生IL-6生成的影响 |
| 3.5 神经酰胺合成酶(ASM及GBA1)酶抑制剂对RAFLS细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.6 神经酰胺合成酶(ASM及GBA1)酶抑制剂对RAFLS细胞迁移及侵袭的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三部分:神经酰胺相关合成酶ASM和GBA1通过p38通路在类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中调控白细胞介素-6的生成 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法和步骤 |
| 2.3.1 Western Blot法检测原代人RAFLS中各通路蛋白表达 |
| 2.3.2 构建针对人源GBA、ASM沉默慢病毒载体 |
| 2.3.3 人源GBA、ASM沉默慢病毒载体转染RAFLS |
| 2.3.4 Real-time PCR法验证RNA水平GBA及ASM基因的敲除效率 |
| 2.3.5 Western Blot法验证蛋白水平GBA及ASM基因的敲除效率 |
| 2.3.6 ELISA法检测慢病毒转染RAFLS细胞上清后中IL-6的水平 |
| 2.3.7 Real-time PCR法检测慢病毒转染RAFLS细胞中IL-6 mRNA表达 |
| 2.3.8 p38 MAPK通路抑制剂实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 神经酰胺合成酶(ASM及GBA1)酶抑制剂对RAFLS细胞中MAPK信号通路活化的影响 |
| 3.2 构建针对人源GBA、ASM沉默慢病毒载体并转染RAFLS |
| 3.2.1 构建慢病毒质粒载体 |
| 3.2.2 验证RNA水平GBA及ASM基因的敲除效率 |
| 3.2.3 验证蛋白水平GBA及ASM基因的敲除效率 |
| 3.3 GBA、ASM沉默慢病毒载体转染RAFLS对细胞产生IL-6的影响 |
| 3.4 GBA、ASM沉默慢病毒载体转染RAFLS对细胞中MAPK信号通路活化的影响 |
| 3.5 p38 MAPK通路抑制剂对GBA、ASM沉默慢病毒载体转染RAFLS细胞中产生IL-6的影响 |
| 4 讨论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 酸性鞘磷脂酶/神经酰胺在自身免疫性疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）内源性和外源性甲醛的生理与毒性效应及采用CRISPR对其毒性机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 甲醛的基本概述 |
| 1.1.1 甲醛的理化性质 |
| 1.1.2 甲醛的来源途径和生产应用 |
| 1.1.3 甲醛的暴露 |
| 1.2 甲醛对机体的健康效应 |
| 1.2.1 急性毒性 |
| 1.2.2 氧化应激与炎症 |
| 1.2.3 心血管效应 |
| 1.2.4 神经毒性 |
| 1.2.5 遗传毒性 |
| 1.3 甲醛暴露与癌症和白血病 |
| 1.3.1 甲醛的致癌性 |
| 1.3.2 甲醛致白血病作用 |
| 1.3.3 甲醛造血毒性的相关研究 |
| 1.3.4 甲醛暴露致白血病存在的争议 |
| 1.3.5 甲醛暴露致白血病的潜在机制假说 |
| 1.4 功能性毒理基因组学筛选 |
| 1.4.1 功能性毒理基因组学筛选方法在甲醛毒性研究中的应用 |
| 1.4.2 功能性CRISPR在毒理学相关的基因-环境互作研究中的应用 |
| 1.5 论文选题依据与研究内容 |
| 第二章 内源性甲醛的生理效应——血管舒张效应 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要实验设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要试剂盒和抗体 |
| 2.2.5 主要溶液配置 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 离体血管环灌流实验 |
| 2.3.2 大鼠主动脉组织处理 |
| 2.3.3 NO、sGC、cGMP和PKG和蛋白质含量检测 |
| 2.3.4 主动脉组织病理学检测 |
| 2.3.5 免疫组化实验 |
| 2.3.6 免疫荧光实验 |
| 2.3.7 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 甲醛对大鼠主动脉血管环的舒张作用 |
| 2.4.2 高浓度甲醛上调大鼠主动脉中NO/cGMP途径 |
| 2.4.3 甲醛致大鼠主动脉的舒张作用不通过cAMP和花生四烯酸途径介导 |
| 2.4.4 高浓度甲醛促进大鼠主动脉中BK_(Ca)和KATP通道亚基的表达 |
| 2.4.5 高浓度甲醛抑制大鼠主动脉中L型Ca~(2+)通道亚基的表达 |
| 2.4.6 低浓度甲醛增强大鼠主动脉中BK_(Ca)通道及K_(ATP)通道的Kir6.2亚基表达 |
| 2.4.7 甲醛对大鼠主动脉中BK_(Ca)和KATP通道的表达调控呈双相剂量效应 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 采用阻断剂对内源性甲醛舒血管效应可能机制的探究 |
| 2.5.2 内源性甲醛可能通过介导NO/cGMP途径达到血管舒张效应 |
| 2.5.3 相关离子通道在甲醛引发血管舒张过程中的表达 |
| 2.5.4 甲醛在相关离子通道表达调控上的双相剂量效应 |
| 第三章 甲醛暴露致小鼠肺和鼻中造血干/祖细胞毒性 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 主要实验设备 |
| 3.2.3 主要试剂和培养基 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 气态甲醛吸入暴露(体内实验) |
| 3.3.2 生物组织样品制备(体内实验) |
| 3.3.3 生物组织样品制备及甲醛处理(体外实验) |
| 3.3.4 髓系祖细胞集落培养 |
| 3.3.5 集落形成单位计数 |
| 3.3.6 数据统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 小鼠肺鼻部均成功培养出BFU-E和CFU-GM集落 |
| 3.4.2 甲醛体内吸入暴露减少了小鼠肺与鼻中BFU-E和CFU-GM集落的形成 |
| 3.4.3 甲醛体外暴露同样减少了小鼠肺与鼻中BFU-E和CFU-GM集落的形成 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 对HSC/HPC存在于小鼠的肺和鼻中的研究结果进行证实 |
| 3.5.2 体内和体外的甲醛暴露能够破坏小鼠肺和鼻中存在的HSC/HPC |
| 第四章 CRISPR筛选在甲醛毒性机理探究中的应用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验细胞 |
| 4.2.2 主要实验设备 |
| 4.2.3 主要试剂、培养基和试剂盒 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞活力测定 |
| 4.3.2 甲醛暴露 |
| 4.3.3 全基因组CRISPR文库 |
| 4.3.4 全基因组CRISPR筛选 |
| 4.3.5 下一代测序 |
| 4.3.6 生物信息学分析 |
| 4.3.7 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 使用全基因组CRISPR筛选出能够调控细胞对甲醛易感的候选基因 |
| 4.4.2 候选基因的功能性富集分析 |
| 4.4.3 甲醛代谢相关基因的丧失增加了细胞对甲醛的敏感性 |
| 4.4.4 DNA损伤和修复反应在调节细胞对甲醛的敏感性中具有重要作用 |
| 4.4.5 脂肪酸生物合成过程能够参与调控甲醛的细胞毒性 |
| 4.4.6 mTOR信号通路相关基因缺失的细胞对第20天的甲醛处理抗性增加 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 全基因组CRISPR筛选是研究甲醛毒性机制的有效方法 |
| 4.5.2 CRISPR筛选证实了先前已知的甲醛毒性调控相关的基因和途径 |
| 4.5.3 CRISPR筛选能够发现甲醛细胞毒性调控的未知基因和途径 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 主要英文缩略词 |
| 在校期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）磷酸化热休克蛋白27在肠上皮细胞炎症反应中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1. 肠易激综合征 |
| 2. HSP27 |
| 3. NF-κB信号通路 |
| 4. 早期工作基础及研究设想 |
| 5. 研究目的及创新性 |
| 第二章 磷酸化HSP27在肠上皮细胞炎症反应中的作用 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三章 磷酸化HSP27调节肠上皮细胞炎症反应的机制研究 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 成果 |
| 致谢 |
（10）TIPE2在骨质疏松症患者中的表达及其在骨质疏松发病机制中的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 研究背景 |
| 第一部分 免疫负调控分子TIPE2在骨质疏松症患者外周血中的表达及临床意义 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二部分 TIPE2在骨质疏松症发病机制中的初步研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述：TIPE蛋白家族在不同肿瘤和慢性疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 英文文章-1 |
| 英文文章-2 |
四、Signaling for inducible Fas-resistance in primary B lymphocytes（论文参考文献）
- [1]万通筋骨片对类风湿关节炎的抗炎机制研究及16S rDNA高通量测序和代谢组学分析[D]. 李兆东. 吉林大学, 2021(01)
- [2]CpG 685针对不同类型急性B淋巴细胞白血病的作用及其差异分子机制的研究[D]. 白玲. 吉林大学, 2021(01)
- [3]骨髓间充质干细胞N-Cadherin对MRL/lPR狼疮鼠成骨及造血的影响[D]. 锁星星. 江苏大学, 2020(02)
- [4]雷公藤红素改善Trex1-/-小鼠自身免疫性疾病[D]. 刘逸煊. 福建师范大学, 2020(12)
- [5]B细胞向浆细胞分化发育的分子机制研究[D]. 方迎. 吉林大学, 2020(08)
- [6]WAS蛋白在急性LCMV感染中对CD4辅助T细胞和生发中心B细胞分化的影响研究[D]. 张良. 重庆医科大学, 2020(01)
- [7]神经酰胺相关合成酶在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞调控白细胞介素-6生成中的作用[D]. 赵萌萌. 中国医科大学, 2020(02)
- [8]内源性和外源性甲醛的生理与毒性效应及采用CRISPR对其毒性机制的研究[D]. 赵云. 华中师范大学, 2020
- [9]磷酸化热休克蛋白27在肠上皮细胞炎症反应中的作用及机制研究[D]. 张雅君. 南方医科大学, 2020(01)
- [10]TIPE2在骨质疏松症患者中的表达及其在骨质疏松发病机制中的初步研究[D]. 李继刚. 山东大学, 2019(02)