一、B7.1胞外编码区的真核表达及其生物活性（论文文献综述）
孙志杰[1]（2019）在《抗人CTLA-4抗体的制备及功能研究》文中研究说明细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）是表达于T细胞表面的一种抑制T细胞活化的负调节分子,在恶性肿瘤及一些自身免疫疾病的发生发展中发挥重要作用。肿瘤细胞可以利用CTLA-4实现免疫逃逸,CTLA-4的阻断剂如单克隆抗体能够重新激活免疫系统,达到抗肿瘤的目的。本研究旨在利用鼠源及人源抗体库技术获取靶向人CTLA-4的单克隆抗体。合成人CTLA-4胞外区基因,扩增得到胞外区基因片段,插入大肠杆菌表达载体pET28a,构建了编码人CTLA-4胞外区基因的重组质粒pET28a-CTLA4。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosseta（DE3）中,在IPTG终浓度为0.5 mmol/L、于37℃诱导4 h的条件下,实现了人CTLA-4胞外区重组蛋白的高效表达,表达产物主要为包涵体。对诱导温度、诱导时间及诱导剂IPTG终浓度三个因素进行了优化,确定重组蛋白在IPTG终浓度为1 mmol/L、于25℃诱导6 h的条件下表达量最高。利用高浓度尿素溶解包涵体蛋白,通过Ni2+亲和层析获得了纯度大于90%的重组蛋白。将包涵体蛋白复性成为可溶蛋白,制备了人CTLA-4胞外区基因重组抗原。利用人CTLA-4胞外区基因重组抗原对5只BALB/c小鼠进行了4次免疫。选取血清效价最高的小鼠分离脾脏,提取总RNA,逆转录成cDNA。以cDNA为模板分别扩增得到大小约300bp的抗体轻、重链可变区基因片段,利用重叠延伸PCR将轻、重链可变区基因拼接成大小约为750bp的单链抗体片段ScFv。将ScFv插入噬菌体载体pCANTAB-5E中,转化至大肠杆菌TG1,经PCR鉴定ScFv插入率约为93.5%,构建了库容量约为1.4×106的鼠源噬菌体单链抗体库。经过3轮富集筛选,获得2株针对人CTLA-4胞外区基因重组抗原的鼠源单链抗体基因。另一方面,利用人CTLA-4胞外区基因重组抗原,对大容量的人源噬菌体单链抗体库按照“吸附、洗脱、扩增”的顺序反复进行了4轮淘选。第4轮淘选完成后,经ELISA鉴定,获得24株阳性噬菌体克隆。对该24株阳性噬菌体克隆携带的抗体序列进行分析,其中21株噬菌体克隆携带的抗体基因完全一致,重复率达87.5%,提示其为能够与抗原特异性结合的人源单链抗体基因。利用PCR分别扩增得到大小为324 bp的轻链可变区基因和351 bp的重链可变区基因,构建重组质粒pABL-VL和293H-VH,利用共转染293 F细胞,成功表达了具有完整结构的全抗体。经Protein A亲和层析纯化,获得了纯度大于90%的人源单克隆抗体。利用ELISA、Western印迹鉴定,结果表明抗体具有良好的特异性。此外,还制备了针对人突触小体相关蛋白25（SNAP25）的鼠源单克隆抗体。利用大肠杆菌成功表达了SNAP25蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,制备杂交瘤细胞。经过两轮筛选获得12株针对SNAP25的阳性杂交瘤细胞株,同时鉴定了抗体亚型。选取与抗原结合活性最高的14号杂交瘤细胞株制备腹水单抗,经Protein G亲和层析纯化,最终获得一株纯度大于90%的单克隆抗体,可用于肉毒毒素的检测。
刘国强[2]（2018）在《靶向PD-1配体结合界面的单域抗体研制》文中进行了进一步梳理目的:PD-1/PD-L1是目前抗癌药物研发的明星靶点,截止到2018年3月,全球已经有5个抗PD-1/PD-L1的抗体药物上市,并取得了良好的临床疗效。靶向该通路的抗体药物通过阻断PD-1/PD-L1的结合,消除PD-1蛋白对抗原呈递信号的负向调控作用,恢复T细胞对PD-L1过表达的肿瘤细胞的识别杀伤能力,达到克服肿瘤免疫逃逸的目的。正常情况下PD-1胞外域接受配体提供的信号,负向调控T细胞的活化与增殖,避免T细胞过度活化导致的自身免疫性疾病。但该通路被PD-L1过表达的肿瘤细胞利用后,会促进肿瘤细胞的免疫逃逸。针对该通路的特点,本课题靶向PD-1与PD-L1结合的配体界面区设计了一种高亲和力的纳米抗体,通过阻断PD-1胞外域与PD-L1的结合,恢复T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:1.噬菌体展示技术淘筛高亲和力抗体通过生物信息学的手段,模拟PD-1与PD-L1的结合,确定胞外域与配体结合界面的氨基酸序列,并人工合成该段序列。从商用人单域抗体噬菌体展示库中经多轮ELISA淘筛获取对结合界面的高亲和力单域抗体。通过测序获得DNA序列后,翻译获得其氨基酸序列。2.单域抗体的真核表达系统构建（1）单域抗体氨基酸序列的优化:通过与同源人单域抗体比较,对可能发生突变的氨基酸进行修正。（2）真核表达目的基因的合成与载体构建取优化后的抗体序列,用毕赤酵母偏爱密码子优化,在该基因的前端加上MF-α分泌信号肽、在末端加上His tag与终止子、在两端加入酶切位点XhoⅠ与XbaⅠ,并人工合成该基因。通过PCR法扩增。与pGAPzα-A空载体双酶切后,用T4连接酶连接,并转化至E.coli JM109中。（3）毕赤酵母X-33高效表达株的构建与筛选提取重组质粒,线性化并电转化至表达宿主毕赤酵母X-33。通过菌落PCR与博来霉素（Zeocin）高抗性筛选获得阳性转化子,并通过表达鉴定获得高表达菌株。（4）真核表达系统表达产物的纯化与亲和力常数测定取发酵上清液,用过硫酸铵沉淀除去大部分杂质后,通过分子筛与镍柱进行纯化。纯化产物置换缓冲液后,用ELISA法检测,确定亲和力常数。（5）糖基化鉴定:取纯化后的产物用内切糖苷酶H（Endo H）鉴定糖基化。3.单域抗体的原核表达系统构建（1）原核表达目的基因的合成与载体构建取优化后的序列,在末端加入His与终止子、在两端加入pET21b载体上含有的Nde I、Hind III两个酶切位点人工合成后PCR扩增,并通过双酶切试验连接至pET21b上,热激法转化至E.coli DH5α。（2）E.coli BL21（DE）的高效表达株的构建筛选:提取重组质粒,同法转化至E.coli BL21（DE）中,用菌落PCR及表达鉴定的手法进行高表达筛选。（3）可溶性表达产物的纯化采用低温培养的形式诱导工程菌进行可溶性表达,同法确认表达形式,并用CM柱及镍柱对破菌上清进行纯化。3.活性鉴定取获得的纯化产物,与人PD-1蛋白共孵育,加至PD-L1蛋白过表达的肿瘤细胞中,用带FITC标记的His tag抗体做二抗,用流式细胞仪检测荧光。结果:1.噬菌体筛选结果成功获17株阳性菌株,通过测序分析16个阳性菌编码序列高度同源,16个阳性菌的编码的V区蛋白序列完全一致。成功淘筛到高亲和力的靶向PD-1配体结合界面的单域抗体。2.真核表达体系的构建结果将优化后的抗体命名为Nb:PD-1,成功获得Nb:PD-1的自分泌型毕赤酵母X-33高效表达株,该工程菌糖基化酶活力不足。并用CM柱与镍柱成功获得纯度较高的表达产物,通过内切糖苷酶确认发生里部分糖基化修饰。3.原核表达体系的构建结果成功获得Nb:PD-1的E.coli BL21（DE）高效表达株。成功构建了可溶性表达发酵体系,并成功获得纯度较高的表达产物。4.活性鉴定结果间接ELISA法测得真核表达的Nb:PD-1亲和力为106mol/L,原核表达的Nb:PD-1亲和力为105mol/L。获得的抗体经流式细胞仪鉴定有活性。结论:成功淘筛到靶向PD-1配体结合界面的单域抗体,并优化了该抗体的氨基酸序列。并成功构建了真核与原核两种表达体系,且成功获得了纯化较高的表达产物,初步鉴定了其具有活性与亲和力。本研究成功研制出靶向PD-1配体结合界面的单域抗体Nb:PD-1。
王常荣[3]（2013）在《黄伞中抗氧化成分的分离鉴定及其抗HIV-1作用机制研究》文中指出大型真菌作为天然活性成分的重要来源,其代谢产物种类丰富,具有多种独特的化学结构和生理活性。本实验以食用真菌为研究对象,围绕其抗氧化活性成分的分离纯化,抗HIV-1和免疫调节活性以及相关作用机制进行研究。本研究首先利用红细胞溶血和脂质过氧化抑制实验,对64株大型真菌的粗提物进行了抗氧化活性测定,确定以黄伞（Pholiota adiposa）子实体作为研究对象。然后利用乙醇提取、乙酸乙酯萃取、NKA大孔吸附树脂、Sephadex G-15和Sephadex LH-20分子筛凝胶层析以及高效液相色谱（HPLC）等层析方法,首次从黄伞中分离纯化得到三个小分子活性成分PB3、HEB和PC3-3。通过定性试验、质谱、红外光谱以及与相应标准品HPLC保留时间的比对,确定第一个成分为腺苷（adenosine, C10H13N5O4, PB3）,第二个成分为没食子酸甲酯（methyl gallate, C8H8O5, HEB）,第三个成分为甾体皂苷类化合物（steroidal saponins,PC3-3）。反应浓度为250μg/ml时,PC3-3和HEB对红细胞氧化溶血的抑制率为26.9%和82.4%,抑制脂质过氧化率达88.2%和17.3%,PC3-3和HEB分别在不同的体外检测体系中显示出极强的抗氧化活性。此外,HEB对超氧阴离子和DPPH自由基都具有较强的清除活性,250μg/ml浓度下清除率分别达到71.4%和85.6%。为了大规模筛选具有胞内抗氧化活性的化合物,本实验将具有氧化还原敏感性质的绿色荧光蛋白（redox-sensitive green fluorescent protein, croGFP）基因在大肠杆菌中进行表达,构建了能够通过GFP荧光强度水平定量表征细菌胞内氧化还原水平的检测模型。鉴于抗氧化与抗HIV-1之间的密切关系,进一步将croGFP基因在HIV-1病毒宿主细胞系TZM-BL中进行表达,TZM-BL细胞基因组内整合了HIV-LTR调控的荧光素酶基因luc序列,从而得到了通过GFP荧光强度表征胞内氧化还原水平、荧光素酶活性表征病毒LTR激活水平的抗氧化、抗HIV-1细胞检测模型。利用大肠杆菌胞内抗氧化筛选模型（E. coli-croGFP）,对具有体外抗氧化活性的真菌提取物进行再次检测发现,仅有包括黄伞、红菇、NK2100、猴头、褐孔菌和早北c滑在内的六种食用菌菌丝浸提物能够显示一定的胞内抗氧化活性,证明体外抗氧化成分并不一定能够进入细胞内发挥活性。利用抗氧化、抗HIV-1细胞检测模型（TZM-BL-croGFP）,通过流式细胞仪和发光检测仪对细胞内的GFP荧光强度和Luc酶活性进行检测发现,活性氧刺激使细胞内氧化还原水平升高会直接激活HIV-1启动子LTR调控的下游基因表达,证实了氧化应激与HIV-LTR转录激活之间的直接关系。HEB能够有效地抑制双氧水诱导的胞内氧化应激,抑制率IC50达26.0μM；并且抑制了由于细胞内氧化水平升高引起的HIV-LTR激活,能够将200μM H2O2刺激指示细胞系产生的信号从18.2%降低到2%左右；HEB还能够抑制HIV-1假病毒感染TZM-BL细胞的复制增殖,其抑制率IC50达到11.9μM,证明了抗氧化剂HEB具有抗HIV-1活性。这两个胞内检测模型具有接近生理状态、成本低、操作简单快速、重复性好等优点,适合用于抗氧化、抗HIV-1活性成分的大规模筛选。’为进一步对HEB的抗氧化、抗HIV-1作用机制进行研究,本实验利用Western blot对细胞内核转录因子NF-κB活化情况进行检测发现,H202能够激活细胞内NF-κB活化,促进阻遏蛋白IκB降解,使NF-κB与IκB解离并进入细胞核内行使功能。天然抗氧化成分HEB能够有效抑制NF-κB的活化入核,并防止IκB降解,从而抑制H202引起的氧化应激导致的NF-κB信号途径活化,阻止NF-κB与HIV-1启动子LTR上的κB靶序列结合,抑制病毒复制转录。本研究发现,抗氧化成分HEB具有生物多效性,能够通过多个靶点抑制HIV-1病毒复制。与病毒感染2h完成进入过程后给药相比,HEB预保护能够更好地抑制HIV-LTR激活,证明HEB对病毒感染的进入过程具有一定的抑制作用,但又不仅限于此。进一步利用实验室已有的HIV-1三大关键酶活性检测体系进行实验发现,抗氧化剂HEB对HIV-1逆转录酶和整合酶活性都有不同程度的抑制作用,抑制率IC50分别达到80.1μM和228.5μM,并且在200μM浓度下对HIV-1蛋白酶的抑制率也达到17%左右。所以HEB对HIV-1生长周期中包括病毒进入、逆转录、整合和成熟蛋白加工在内的多个过程产生影响。细胞因子在免疫系统中作用十分重要,黄伞中的活性成分能够调节细胞因子的转录。通过小鼠腹腔给药体内实验,实时定量PCR检测脾细胞内细胞因子的mRNA变化情况,结果发现HEB能够显着提高IFN-γ的表达到两倍以上,同时下调Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达至50%左右,有利于调节艾滋病患者体内Th1/Th2型细胞因子失衡的状态。而PB3则通过提高细胞因子合成抑制因子IL-10的表达至约1.5倍,以及不同程度的下调包括IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6在内的多种细胞因子的表达,体现出较强的抗炎症作用。综上所述,本研究从抗氧化、抗HIV-1和免疫调节三方面对黄伞中的活性成分进行了检测,并且对其活性作用靶点和作用机制进行了研究,同时构建了两种新型抗氧化、抗HIV-1活性胞内检测模型,并对这两种活性之间的关系进行了研究和探讨。具有生物安全性和多效性的天然活性成分为克服HIV-1病毒耐药性提供了新的方向,也为开发新型抗艾滋药物奠定了基础,具有十分重要的研究意义和良好的应用前景。
李亚玲[4]（2013）在《鸡γ-干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物活性检测》文中进行了进一步梳理干扰素（Interferon, IFN）是一种具有多功效的细胞因子,对多种免疫细胞具有调节作用。由于毕赤酵母表达系统可实现高密度发酵,且其表达产物的生物活性接近天然蛋白,因此本研究将利用这一系统来表达鸡γ-干扰素（Chicken interferon gama, ChIFN-γ）,为ChIFN-γ的工厂化生产和临床应用打下基础。本研究将编码ChIFN-γ成熟肽的基因克隆至毕赤酵母穿梭表达质粒pPICZaA中,构建重组质粒pPICZaA-IFN-γ。将其线性化后,采用电穿孔法转化到毕赤酵母GS115细胞中。挑取单菌落,先利用YPDS-ZeocinTM平板筛选出高抗性克隆,再通过MMH、MDH平板和PCR方法筛选出2株His+Mut+表型的阳性重组菌株。重组菌株用甲醇诱导可表达出大小约为17kD的重组ChIFN-γ （rchIFN-γ）,与天然ChIFN-γ一致；Western blotting表明,rchIFN-γ可与研制的针对ChIFN-γ的特异性多抗血清相结合。经生物信息学分析,毕赤酵母表达的rchIFN-γ的等电点约为pH5.2,因此采用超滤浓缩、透析和DEAE阴离子交换层析来纯化表达产物。经SDS-PAGE鉴定,纯化产物的纯度约为70%。DF1-VSV系统检测结果表明,纯化后的rchIFN-γ具有较强的抗病毒活性,效价达10,240IU/mL。以rchIFN-γ为佐剂与H9亚型禽流感灭活疫苗联合免疫SPF鸡,研究rchIFN-γ是否对疫苗的免疫应答具有增强效果。经流式细胞术检测,使用rchIFN-γ试验鸡的外周血中CD4+T淋巴细胞相对百分含量以及CD4+/CD8+比值显着高于未使用rchIFN-γ的试验鸡（p<0.05）。通过血凝抑制试验检测疫苗免疫后试验鸡血清中的HI抗体水平,并于免疫后35天用H9亚型禽流感病毒进行攻击,检测各组鸡的排毒情况。结果表明：在疫苗接种后的第14天,使用rchIFN-γ试验鸡的HI抗体效价达到高峰,早于未使用rchIFN-γ的试验鸡达到高峰；且使用rchIFN-γ试验鸡的HI抗体效价显着高于未使用rchIFN-γ的试验鸡（p<0.05）；H9亚型禽流感病毒攻击后,使用rchIFN-γ的试验鸡排毒率显着低于未使用rchIFN-γ的试验鸡（p<0.05）。以上试验结果表明,rchIFN-γ在体内外均有良好的生物学活性,并可能作为疫苗佐剂在生产上得到应用。
陈俭[5]（2012）在《多西紫杉醇对H1N1流感疫苗免疫佐剂活性研究及其作用机理初步探讨》文中研究指明我们的前期研究发现紫杉醇能有效提高机体对模式抗原卵清白蛋白（OVA）的特异性体液免疫和细胞免疫应答。多西紫杉醇作为紫杉醇的衍生物,具有更好的水溶性和生物学活性。因此,用多西紫杉醇作为疫苗佐剂具有优越性。本研究以H1N1流感病毒裂解疫苗为抗原,小鼠为实验动物评价多西紫杉醇的佐剂活性,并初步探讨其作用机理。1.多西紫杉醇通过皮下注射途径免疫对H1N1流感病毒裂解疫苗的佐剂作用。将72只雌性Balb/c小鼠随机分成9组（n=8）,分别为生理盐水组、H1N1抗原组（10ng和100ng HA）、10ng H1N1抗原联合25、50、100和200μg多西紫杉醇佐剂组以及200μg铝胶佐剂组和100μg多西紫杉醇单独免疫组。所有小鼠间隔3周皮下免疫两次,二免后两周用间接ELISA方法测定血清特异性IgG、IgG亚类和总IgE,以及HI效价MTT法测定脾淋巴细胞转化水平；real-time PCR法测定HA刺激后的脾淋巴细胞内IFN-γ、1L-12、IL-4、IL-10、T-bet和GATA-3mRNA相对表达水平。结果表明多西紫杉醇能显着促进小鼠特异性Th1/Th2型免疫反应。当10ng抗原与多西紫杉醇联合免疫时,所诱导的IgG、IgG亚类和HI效价与100ng HA免疫组水平相当；多西紫杉醇增强了脾淋巴细胞对HA抗原、ConA （?）]LPS的刺激反应性,上调细胞因子（IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-10）和转录因子（T-bet、GATA-3） mRNA表达。另外,多西紫杉醇不会促进IgE的产生,而铝胶佐剂则显着高了IgE的水平。2.多西紫杉醇通过黏膜免疫途径对H1N1流感病毒裂解疫苗的佐剂作用。将40只雌性Balb/c小鼠随机分成5组（n=8）,分别为生理盐水组、2μgH1N1组、2μgH1N1联合100μg多西紫杉醇佐剂组、2μgH1N1联合5μg rCTB组以及100μg多西紫杉醇单独免疫组,各组小鼠间隔2周滴鼻免疫两次,二免后2周收集肠道组织、血清和黏膜冲洗液等样品,分别测定系统免疫和黏膜免疫相关体液免疫和细胞免疫指标。结果表明,多西紫杉醇与H1N1流感疫苗混合后免疫小鼠能使动物的的全身特异性免疫反应（血清IgG、IgA、IgG亚类、HI抗体滴度）和局部黏膜免疫反应（鼻、支气管黏膜冲洗液sIgA,十二指肠黏膜IgA+细胞、肺组织[FN-γ、IL-12、IL-4和IL-10mRNA表达、小肠上皮内淋巴细胞数）显着提高。另外,含多西紫杉醇的疫苗免疫小鼠后能使小鼠脾淋巴细胞对ConA、LPS和HA刺激反应升高。3.为探讨多西紫杉醇佐剂作用机制,分别从多西紫杉醇对巨噬细胞溶酶体、共刺激分子、细胞因子表达谱分析、NF-κB活化、基因调节功能microRNAs的表达以及Hsp90表达等方面的影响进行分析。0.01μM多西紫杉醇刺激巨噬细胞12h后胞内溶酶体数量显着增加；巨噬细胞CD80/CD86mRNA表达水平随多西紫杉醇刺激时间的延长而逐渐升高；多西紫杉醇诱导巨噬细胞分泌高水平的1L-13、IL-22、IL-2、IL-10、TNF-α、IL-4（?）IL-17；低剂量多西紫杉醇能在一定程度上激活NF-κB; miR-155、miR-150和miR-146a在多西紫杉醇刺激3h后出现显着上调表达；体内外试验均显示多西紫杉醇能诱导Hsp90表达增加。研究结果提示,多西紫杉醇很可能是通过增强抗原加工提呈途径而发挥其佐剂活性,同时多西紫杉醇所诱导的细胞因子及Hsp90在激发全身免疫应答过程中发挥重要作用,而这些效应的诱导与NF-KB信号通路的激活有关,部分microRNAs在基因表达调控中发挥重要作用。综上所述,多西紫杉醇对H1N1流感裂解疫苗皮下免疫和滴鼻免疫具有佐剂作用。多西紫杉醇和流感裂解疫苗混合注射免疫小鼠可显着提高小鼠血清特异性抗体水平,促进脾淋巴细胞产生Thl型（IFN-γ、IL-12）和Th2型（IL-4、IL-10）细胞因子,并且不会导致血清IgE水平上升。多西紫杉醇和流感裂解疫苗混合滴鼻黏膜免疫小鼠可促进全身免疫反应和局部黏膜免疫反应,提高了血清IgG、IgA、IgG亚类、HI效价显着升高,同时提高了鼻支气管黏膜冲洗液中sIgA水平、十二指肠黏膜IgA+细胞数量、肺组织中IFN-γ、IL-12、IL-4和IL-10mRNA的表达、小肠上皮内淋巴细胞数量。体外试验表明,多西紫杉醇的佐剂作用和抗原提呈细胞中NF-KB信号通路的激活有关,miR-155、miR-150和（?）miR-146a参与了前炎性细胞因子的表达调控。
曹广明[6]（2012）在《一株地方株PRRSV分离鉴定及GP5基因疫苗研究》文中认为猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一种以引起各种年龄猪呼吸道疾病和母猪繁殖障碍为特征的传染病，其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），是危害养猪业的主要疾病之一。目前，世界上流行的PRRSV基因型主要有以LV株为代表的欧洲型和以VR2332株为代表的美洲型。自1996年，PRRSV在我国被分离得以来，在我国流行呈蔓延趋势。2006年我国部分地区还暴发了高致病性猪蓝耳病，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。试验分为两部分：1、PRRSV-SDDP株的分离鉴定及全基因组序列分析2009年在实验室临床病例诊断过程中分离得到一株猪繁殖与呼吸综合症病毒（SDDP株），参考美洲型代表株（VR-2332）及近几年国内分离得到的毒株设计了13对引物对其全基因组进行了克隆测序、系统进化树分析。结果显示，SDDP-PRRSV株属美洲型PRRSV，与高致病性PRRSV代表株SX-1、JX143、JXA1的同源性在98.7-99.7%，非结构基因NSP2的变异性最大，与美洲代表VR2332存在90个核苷酸的缺失（位于NSP2核酸序列的1540-1542、1594-1680），这与2006年来分离得到的毒株相似。结构基因ORF6、7的相对保守。SDDP分离株与国内其他分离株相比呈现出一定的新特性，为高致病性蓝耳病的防治提供理论依据。2.不同分子佐剂对PRRSV-GP5核酸疫苗免疫效果影响的研究基因疫苗主要是由真核表达载体和保护性抗原基因构成的，与传统疫苗相比较，具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗同时存在抗体产生慢且水平低的问题，需要加入有效的佐剂才能克服这些缺点,国内外学者一直在探索进一步提高基因免疫效果的方法，其中在基因免疫表达载体中引入调节分子是其中重要的措施之一。试验中选取补体C3d、干扰素诱导蛋白10（IP-10），法氏囊三肽（BS），胸腺五肽（TP）作为分子佐剂与PRRSV的保护性抗原GP5构建到表达载体pcDNA3.1中，大量提取重组质粒，转染293T细胞，经间接免疫荧光证明重组质粒能在细胞内表达。重组质粒免疫小鼠，通过ELISA试剂盒检测小鼠体内抗体、IL-4和IFN-γ的水平，结果显示，抗体效价、IL-4和IFN-γ含量均比对照组高，在分子佐剂组中以pcDNA3.1-IP-10-GP5组的效果最好，与空白对照及PCDNA3.1-GP5组比较差异均显着（P<0.05）。证明该质粒可刺激机体产生较高的体液免疫和细胞免疫水平，IP-10分子佐剂能显着增强PRRSVGP5基因的免疫效果。
李文秀[7]（2011）在《重组人ICOS胞外区原核表达载体的构建及表达》文中认为本实验构建了重组人ICOS胞外区的原核表达载体,进行了重组ICOS蛋白的表达与纯化,并将其作为抗原免疫小鼠。根据GenBank基因库中ICOS胞外区基因序列设计引物,用RT-PCR法从人T淋巴瘤细胞Jurkat的总mRNA中扩增出ICOS胞外区单链基因,并运用重叠延伸PCR技术扩增出ICOS胞外区双链基因,将ICOS胞外区双链基因插入到原核表达载体pET-28a中,对重组质粒进行鉴定。转化E.coli BL21（DE3）, IPTG诱导表达目的蛋白。通过包涵体变复性纯化目的蛋白,并通过Western blot鉴定目的蛋白。后将目的蛋白作为抗原免疫小鼠。结果获得ICOS双链基因大小为757 bp,构建的重组表达载体中目的基因序列完全正确。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析和Western blot鉴定表明目的蛋白在E. coli BL21 （DE3）中高效表达,相对分子质量约为31KD,与预期结果相符。免疫小鼠后得到较高的抗血清效价。检测结果表明：成功地构建人重组ICOS胞外区的原核表达载体,并实现了在大肠杆菌中大量表达。为下一步制备抗ICOS单链抗体奠定了基础。
卫娜[8]（2011）在《鹅白细胞介素2受体α链与白细胞介素18特性的初步研究》文中研究指明白细胞介素2受体αlpha链（IL-2Rα）作为白细胞介素2（IL-2）的特异性受体链,是T细胞活化的特异性表面标志,在IL-2发挥生物学功能的过程中具有重要的作用;白细胞介素18（IL-18）是一种具有广阔应用前景的新型免疫佐剂和免疫治疗剂,同时亦可促进免疫调节因子γ-干扰素（IFN-γ）和IL-2的表达,增强对机体的保护。参考鸡白细胞介素2受体αlpha链（ChIL-2Rα）和鸭白细胞介素2受体αlpha链（DuIL-2Rα）cDNA序列设计引物,分别利用3′RACE和5′RACE技术在国内外首次克隆了鹅白细胞介素2受体αlpha链的cDNA（GoIL-2Rα）。克隆的cDNA序列长1027bp,其cDNA编码一条由240个氨基酸组成的前体蛋白,该前体蛋白含有20aa残基构成的信号肽序列。预测的GoIL-2Rα蛋白与DuIL-2Rα同源性87.08%,与ChIL-2Rα同源性53.94%。GoIL-2Rα的10个半胱氨酸残基中,有8个对应位点在禽类同系物中完全保守。进化分析表明鹅和鸭的亲缘关系最近,和哺乳动物的亲缘关系比较远,显示出明显的种属差异。二级结构分析表明,GoIL-2Rα蛋白羧基末端含有24个氨基酸残基（217-240）构成的跨膜区。采用相同的方法克隆获得了鹅白细胞介素18的cDNA（GoIL-18）。克隆的cDNA序列长863bp,其cDNA编码一条由200个氨基酸组成的前体蛋白。经预测该前体蛋白无明显的疏水信号肽序列,也缺乏传统的N-糖基化位点,这点与哺乳动物类似。在哺乳动物中,有一个前导序列,通过IL-1β转换酶（ICE或者Caspase-1）在特定位点的切割使之称为有活性的成熟蛋白。将预测的GoIL-18前体蛋白序列与禽类及哺乳动物的序列进行比较分析,可知GoIL-18前体蛋白中含有30aa残基构成的前导序列。将GoIL-2Rα成熟蛋白胞外区的PCR产物亚克隆至原核表达载体pET-30a,构建重组表达载体pET-30a-mIL-2RαQ,转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,经IPTG诱导实现了GoIL-2Rα蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示,表达蛋白的分子量约为34kDa,表达量约为19.4%,可被anti-His单克隆抗体识别。可溶性分析表明,经pET-30a系统表达的GoIL-2Rα以包涵体的形式存在,表达的重组蛋白可经Ni2+柱进行纯化。以GoIL-18的cDNA为模板,PCR扩增GoIL-18成熟蛋白的编码区,并将此序列连入载体pET-30a中,构建pET-30a-mIL-18重组表达载体,转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,经IPTG诱导,在大肠杆菌中获得了表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示,表达蛋白的分子量约为28kDa,表达量随着诱导时间的延长而增加,约为23.3%-33.3%,可被anti-His单克隆抗体识别。可溶性分析表明,该蛋白以包涵体形式存在。为了便于检测GoIL-18蛋白的活性,对其在大肠杆菌中的表达条件进行优化,主要是改变诱导温度、降低IPTG的量及改变培养基成份,结果表明在诱导温度为25℃,培养基中添加1%甘氨酸,1%TritonX-100时,上清中有很少量的rGoIL-18蛋白。将GoIL-18成熟蛋白的编码区插入转移载体pFastBacHTB的多克隆位点,构建重组转移载体pFastBacHTB-mIL-18,转化DH10BacTM感受态进行体外重组,将鉴定正确的重组杆粒转染昆虫细胞（Sf9）,转染后Sf9细胞的形态观察和重组病毒DNA的提取鉴定表明,重组杆粒已转入Sf9细胞中,并且在细胞中获得了扩增。以纯化后的rGoIL-18原核表达产物为抗原制备阳性血清,对rGoIL-18在Sf9细胞中的表达进行鉴定。间接免疫荧光和Western blot鉴定结果表明rGoIL-18在Sf9细胞中获得表达。利用体外微量细胞病变抑制法定性检测刺激后淋巴细胞培养上清中IFN-γ的抗病毒活性,间接对两个系统表达的rGoIL-18的活性进行检测;利用MTS试剂盒检测两个系统表达的rGoIL-18对鹅脾淋巴细胞增殖的作用,结果显示: 1)诱导24h后所收集的细胞培养上清中检测不到IFN-γ的活性,48h和72h收集的培养上清中可检测到IFN-γ活性,没有检测到rGoIL-18蛋白对新城疫病毒的抑制活性; 2)利用两个系统表达的rGoIL-18均可促进淋巴细胞的增殖（P<0.01）,rGoIL-18作用48h时刺激指数最高,与其他时间相比,差异显着。将GoIL-2和GoIL-2Rα分别连入载体pCMV-Myc、pCMV-HA中,构建重组真核表达载体pCMV-Myc-IL-2、pCMV-HA-IL-2Rα,将两者共转染CHO细胞,通过提取细胞RNA进行RT-PCR鉴定及间接免疫荧光鉴定,两者在CHO细胞中获得了表达。利用免疫共沉淀研究GoIL-2与受体α在体外的相互作用,结果未出现预期的目的条带,表明GoIL-2与受体α的亲和力很低,利用免疫共沉淀实验无法研究两者间的相互作用。制备GoIL-2单克隆抗体,利用昆虫细胞表达的rGoIL-2蛋白鉴定出具较高活性的单克隆抗体,用分泌该单克隆抗体的细胞株制备腹水并进行纯化,同时纯化实验室保存的兔抗GoIL-2阳性血清,以纯化后的腹水为捕获抗体,阳性血清为检测抗体初步建立检测GoIL-2的抗原捕获ELISA方法,对rGoIL-18刺激后的淋巴细胞培养上清中的GoIL-2含量进行检测,两个系统表达的rGoIL-18蛋白刺激淋巴细胞48h收集的细胞培养上清中均可检测出IL-2,与对照组相比差异极显着（P<0.01）,昆虫细胞表达的rGoIL-18蛋白刺激细胞72h收集的上清液中也可检测出IL-2,与48h相比差异显着。这说明rGoIL-18蛋白可促使淋巴细胞分泌IL-2。
陈小军[9]（2009）在《抗人CD33单链抗体及其与CD80胞外区融合蛋白的构建、表达及功能检测》文中研究说明背景:CD33是髓系细胞分化抗原,分子量为67KD,主要分布在髓系血细胞,特别是在分化的早期阶段。其胞内区含有免疫酪氨酸抑制基序（ITIM）,所以它可能具有通过募集信号分子来调节细胞的生长与分化等功能。CD33在90%以上的急性髓系白血病患者都有表达。在造血干细胞表面没有表达,在成熟的粒细胞和其他组织也没有表达,因此CD33成为髓系白血病治疗的良好靶点。有文献证实AML细胞表面免疫共刺激分子CD80表达低下或缺乏,是导致白血病细胞不能被机体细胞毒性T细胞（CTL）有效地识别杀伤,从而逃逸宿主免疫监视的重要原因之一,而T细胞也因缺乏第二信号而无能。因此可以利用CD33表面抗原作为AML白血病细胞的表面标记,构建CD80胞外区-抗人CD33单链抗体（ExCD80-CD33scFv）融合基因、表达融合蛋白,通过融合蛋白中抗人CD33scFv将CD80胞外区结合到AML白血病细胞表面,刺激肿瘤特异性CTL细胞活化,从而增强抗肿瘤免疫。目的:构建及表达抗人CD33单链抗体（CD33scFv）基因,并检测其生物活性;扩增CD80胞外区,构建ExCD80-CD33scFv融合基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白,进一步检测融合蛋白的生物活性。方法:HIM3-4是血研所研制的分泌鼠源性抗人CD33单克隆抗体的杂交瘤细胞,并已获得国际人类白细胞分化抗原协作组会议正式命名。我们利用RT-PCR技术分别克隆了抗人CD33单克隆抗体HIM3-4的轻、重链可变区基因,并利用短肽（Gly4Ser）3作为linker,通过overlap PCR方法组装成抗人CD33scFv。将获得的抗体基因克隆到具有强启动子的PET28a（+）载体上,应用IPTG诱导表达,纯化的表达产物经证明具有与靶抗原人类CD33特异结合的能力。CD80 DNA序列由王敏教授惠赠,我们通过另行设计带所需酶切位点的引物来扩增CD80胞外区,在此基础上,利用人血清白蛋白（HAS）第三结构域亲水性的403-427位氨基酸作为链间连接肽将抗人CD33单链抗体及人类细胞表面抗原CD80胞外区基因分别经酶切、纯化后克隆至原核表达载体PET22b（+）中,经IPTG诱导,在大肠杆菌内获得了融合蛋白的表达。融合蛋白的成功构建与表达,为下一步探讨血液肿瘤的免疫治疗机制奠定了基础。结果:1.通过RT-PCR方法,利用通用引物从HIM3-4杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因,分别为321bp和366bp,我们利用（GGGG）3为连接肽构建了抗人CD33基因工程单链抗体,并在PET28a（+）中得到表达,蛋白大小约为31KD,经复性后具有与人CD33结合活性。2克隆出CD80胞外区序列,大小为633bp。3利用大小为25Aa的链间链接肽,将CD80胞外区与CD33ScFv连为融合表达基因,并在PET22b（+）中得到表达,蛋白大小约为55KD,经复性后具有与人CD33抗原结合活性。结论:1.从HIM3-4杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因,经测序为功能性重排的抗体可变区基因。2用（Gly4Ser）3连接肽基因将VH、VL连接成scFv基因,并用表达载体PET28a（+）表达了scFv蛋白。3.扩增了人类ExCD80 cDNA序列,测序显示序列正确。4.构建了PET22b（+）-ExCD80-CD33scFv融合基因表达质粒,并在含有稀有密码子的宿主菌Rosetta（DE3）中获得了表达。并初步探讨了其生物学功能。
詹玉林[10]（2008）在《基因枪介导BMP-2基因转染促进兔桡骨骨折愈合的实验研究》文中提出目的:通过骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic proteins 2,BMP-2）基因转染以增加组织细胞BMP-2蛋白的分泌量,提高BMP-2蛋白在生物体骨折局部组织中的浓度,达到促进骨折愈合的目的已经成为现实。但是,如何提高质粒对于靶组织的转染效率、寻求一种高效、简便的转染手段,如何缩短鉴定转染是否成功的时间,以及在基因转染促进骨愈合的过程中,采用不同的转染时间、不同的转染频率和不同的转染剂量与促进骨折愈合效果之间的关系,一直未得到很好的阐明。本研究包括:1)建立稳定的、基因序列正确的、检测方便的、含有BMP-2基因的pIRES2-增强绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein, EGFP）-BMP-2真核表达质粒并检测其转染NIH3T3细胞的效率及转染后的生物学活性;2)从兔的股骨、胫骨中获得骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells, BMSCs）,培养、传代后使用pIRES2-EGFP-BMP-2质粒进行转染,以了解该质粒转染兔骨髓间充质干细胞的效率及转染后的生物学活性;3)探讨使用基因枪对兔桡骨骨折周围组织进行pIRES2-EGFP-BMP-2质粒转染、导入的有效性,并研究在不同时间、采用不同剂量、不同导入频率进行基因枪介导的BMP-2基因转染与兔桡骨骨折愈合之间的关系。方法:1)本课题第一部分:将BMP-2cDNA基因片段和pIRES2-EGFP载体两种质粒分别用EcoR I、BglⅡ作双酶切,采用T4DNA连接酶连接后,转化感受态大肠杆菌DH5α。扩增提取重组质粒pIRES2-EGFP-BMP-2,纯化处理后,用限制性核酸内切酶进行酶切、电泳鉴定,并送上海生工生物工程技术服务有限公司作测序鉴定。复苏NIH3T3细胞,传代、培养后采用LipofectamineTM2000转染试剂介导进行pIRES2-EGFP-BMP-2质粒转染NIH3T3细胞,转染24小时后取部分细胞在倒置荧光显微镜下观察结果。其余部分用含G418的DMEM培养液筛选后搜集细胞,进行BMP-2蛋白的western blot检测,对其转染效果进行鉴定。2)本课题第二部分:采用取自2只新西兰大白兔的新鲜股骨、胫骨标本,剪除骨骺端后,穿刺骨髓、抽取骨髓经离心后获取单个核细胞,传至第3代时进行Lipofectamine TM 2000介导的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒转染。转染24小时后取部分细胞在倒置荧光显微镜下观察结果。其余部分用含G418的DMEM培养液进行筛选,4周后搜集细胞,进行BMP-2蛋白的western blot检测。3)本课题第三部分:采用健康新西兰大白兔119只,随机分为7组,每组17只。采用耳缘静脉麻醉后,手术区域剔除毛发,强力碘消毒、铺无菌巾单,取左前臂背侧3厘米切口逐层切开,采用微创显露技术以尽量少干扰骨折周围组织,直至切开骨膜,显露桡骨中段,以线锯造成桡骨中段的横行骨折。所有动物模型制作均由同一位操作者完成。根据不同的组别施以干预措施。5μg组:手术造成骨折后立即给予5μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织;10μg组:手术造成骨折后立即给予10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织; 3天后10μg组:手术当时仅造成骨折,然后关闭手术切口。3天后再次沿原手术切口切开显露骨折部位,给予10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织;3天后0μg组:手术当时仅造成骨折,然后关闭手术切口。3天后再次沿原手术切口切开显露骨折部位,给予10μg pIRES2-EGFP空白质粒轰击骨折区及周围组织;14天后再次10μg组:本组大白兔在手术造成骨折后立即给予10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织,14天后再次沿原手术切口显露骨折,再给予同一部位一次10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒的轰击;14天后再次0μg组:本组大白兔在手术造成骨折后立即给予10μg pIRES2-EGFP- BMP-2质粒轰击骨折区及周围组织,14天后再次沿原手术切口显露骨折,再给予同一部位一次10μg pIRES2-EGFP空白质粒的轰击。对照组（0μg组）:手术造成骨折后立即给予不含BMP-2基因的10μg pIRES2-EGFP空白质粒轰击作为对照。各组于手术后1周时,随机处死2只实验动物,取骨折区周围软组织,行BMP-2蛋白的Western blot检测,观察BMP-2蛋白表达情况。术后4、6、8和12周进行X光片摄片观察骨折线变化、骨痂生长及骨髓腔再通情况,并在X光片提示骨折已经愈合（骨折线消失）时随机处死该骨折愈合组中2只动物,进行大体标本的观察。结果:1)重组质粒pIRES2-EGFP-BMP-2经EcoRI BglⅡ双酶切、电泳后,出现了1.2kbp和5.3kbp两条带,分别为BMP-2cDNA片段和pIRES2-EGFP载体片段,说明目的基因片段已连接到载体上;合成的质粒测序结果经NCBI中的BLAST软件分析,其核酸序列与Gene Bank中hBMP-2的mRNA序列（NM 001200）的编码序列相符,说明构建质粒的hBMP-2基因序列正确。经pIRES2-EGFP-BMP-2转染后的NIH3T3细胞在倒置荧光显微镜下观察显示增强绿色荧光蛋白阳性,Western blot检测显示在相对分子质量（Mr）为30×103处显现单一特异性条带,证明有BMP-2蛋白的表达。2 )从实验动物兔股骨及胫骨中成功获得了兔骨髓间充质干细胞, LipofectamineTM2000介导的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞24小时后,倒置荧光显微镜下显示转染后的兔骨髓间充质干细胞内可见绿色荧光蛋白的持续表达,绿色荧光蛋白分布于整个细胞,呈胞浆分布。Western blot检测显示转染后的兔骨髓间充质干细胞在相对分子质量（Mr）为30×103处显现单一特异性条带,说明有BMP-2蛋白的表达。3)经基因枪介导pIRES2-EGFP-BMP-2质粒转染的实验动物,在骨折后7天,实验动物骨折部位周围软组织的Western blot检测显示BMP-2蛋白表达阳性,并且量明显增多。实验动物桡骨骨折愈合过程的X线4周、6周、8周、12周观察显示,5μg组、对照组（0μg组）较10μg组的骨折线消失时间延长、骨痂形成量差、骨髓腔再通时间延长;3天后10μg组与3天后0μg组相比,3天后10μg组骨折线消失时间缩短、骨痂形成量好、骨髓腔再通时间缩短:3天后10μg组与10μg组相比,在骨折线消失的时间、骨痂形成的质量及骨髓腔再通的时间上无明显差异;14天后再次10μg组与14天后再次0μg组相比,在骨折线消失的时间、骨髓腔再通的时间上无明显差异,但是在骨痂的形成质量上优于14天后再次0μg组及其他各组。结论:1)含有BMP-2基因序列的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒构建成功并具有转录活性。2)兔骨髓间充质干细胞可被真核表达质粒pIRES2-EGFP-BMP-2转染并能在骨髓间充质干细胞中翻译、表达产生BMP-2蛋白。3)含有BMP-2基因的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒可以被基因枪成功导入兔桡骨周围的组织细胞中,并可在其内翻译、表达BMP-2蛋白。使用基因枪将BMP-2基因导入兔桡骨骨折周围组织以促进骨折愈合时,可以明显缩短骨折的愈合时间、提高骨痂的生成质量、缩短骨髓腔的再通时间。分别采用0μg、5μg、10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒导入促进骨折愈合时,在骨折愈合时间、骨痂生成量、骨髓腔再通时间上,随导入质粒剂量的增加而效果逐渐明显。延迟于骨折当时3天进行10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒导入时,其在骨折愈合时间、骨痂生成量、骨髓腔再通时间上与骨折当时进行质粒导入没有区别。骨折当时、骨折后14天两次进行10μg pIRES2-EGFP-BMP-2质粒导入以促进骨折愈合时,骨折愈合时间、骨髓腔再通时间上与骨折当时、单次质粒导入没有区别,但是该实验组动物骨痂的生成质量得到了改善。
二、B7.1胞外编码区的真核表达及其生物活性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、B7.1胞外编码区的真核表达及其生物活性（论文提纲范文）
（1）抗人CTLA-4抗体的制备及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 0.1 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4) |
| 0.2 单克隆抗体 |
| 0.3 噬菌体抗体库技术 |
| 0.4 突触小体相关蛋白25(SNAP25) |
| 0.5 研究目的及意义 |
| 第1章 人CTLA-4 胞外区基因重组抗原的制备 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与试剂 |
| 1.2.1 菌株 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 主要溶液、培养基 |
| 1.2.4 主要仪器及耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 原核表达质粒的构建 |
| 1.3.2 重组蛋白的表达 |
| 1.3.3 重组蛋白表达条件的优化 |
| 1.3.4 重组蛋白的大量制备 |
| 1.3.5 重组蛋白的复性及鉴定 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 重组表达质粒的构建 |
| 1.4.2 重组蛋白的表达 |
| 1.4.3 重组蛋白表达条件的优化 |
| 1.4.4 重组蛋白的纯化 |
| 1.4.5 重组蛋白的复性及鉴定 |
| 1.5 讨论 |
| 第2章 鼠源噬菌体单链抗体库的构建及筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 动物、菌株、噬菌粒 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要溶液、培养基 |
| 2.2.4 仪器及耗材 |
| 2.2.5 引物合成 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 小鼠免疫 |
| 2.3.2 小鼠脾脏总RNA的提取及cDNA第一链的合成 |
| 2.3.3 单链抗体片段ScFv的制备 |
| 2.3.4 ScFv片段和噬菌粒载体pCANTAB-5E的酶切消化、连接 |
| 2.3.5 连接产物转化大肠杆菌TG1 |
| 2.3.6 噬菌体单链抗体库的富集筛选 |
| 2.3.7 噬菌体ELISA鉴定阳性克隆 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 小鼠血清效价 |
| 2.4.2 脾脏总RNA的提取 |
| 2.4.3 单链抗体片段ScFv的制备 |
| 2.4.4 抗体库容量 |
| 2.4.5 抗体库的富集筛选 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 人源噬菌体抗体库的筛选及抗体制备 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 菌株、细胞 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要溶液、培养基 |
| 3.2.4 仪器及耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 人源噬菌体抗体库的生物淘选 |
| 3.3.2 阳性噬菌体克隆的鉴定 |
| 3.3.3 真核表达质粒构建 |
| 3.3.4 细胞转染及全抗体表达 |
| 3.3.5 抗体的亲和纯化 |
| 3.3.6 抗体特异性检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 阳性噬菌体克隆分析 |
| 3.4.2 抗体真核表达质粒的构建 |
| 3.4.3 抗体的表达及纯化 |
| 3.4.4 抗体特异性检测 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 人突触小体相关蛋白25单克隆抗体的制备及初步鉴定 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 动物、质粒、菌株、细胞 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要溶液、培养基 |
| 4.2.4 仪器及耗材 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 SNAP25 抗原的制备 |
| 4.3.2 小鼠免疫及效价检测 |
| 4.3.3 细胞融合 |
| 4.3.4 阳性杂交瘤细胞筛选 |
| 4.3.5 杂交瘤细胞抗体亚型分析 |
| 4.3.6 腹水单抗制备及纯化 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 SNAP25 抗原的制备 |
| 4.4.2 小鼠血清效价 |
| 4.4.3 阳性杂交瘤细胞筛选 |
| 4.4.4 抗体亚型分析 |
| 4.4.5 抗体的纯化 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 溶液、培养基配制一览表 |
| 附录二 主要仪器与耗材一览表 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 |
（2）靶向PD-1配体结合界面的单域抗体研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 PD-1/PD-L1与肿瘤免疫逃逸 |
| 1.1.2 国内外PD-1/PD-L1研发现状 |
| 1.1.3 单域抗体 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 论文结构安排 |
| 1.5 研究路线 |
| 第二章 抗PD-1配体结合界面区单域抗体的筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.1.1 载体噬菌体 |
| 2.1.2 辅助噬菌体 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试验仪器主要仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 培养基与试液的配制 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 抗原配体的获取 |
| 2.3.2 单域抗体的筛选 |
| 2.3.3 单域抗体噬菌体库的扩增 |
| 2.3.4 辅助噬菌体KM13的准备(扩增、纯化) |
| 2.3.5 单域抗体噬菌体库/重组噬菌体的扩增、纯化、淘洗 |
| 2.3.6 单克隆噬菌体ELISA检测阳性克隆 |
| 2.4 试验结果与分析 |
| 2.4.1 抗原配体的获取 |
| 2.4.2 单域抗体的筛选结果分析 |
| 2.4.3 ELISA检测阳性克隆 |
| 2.4.4 阳性克隆的测序结果 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 第三章 Nb:PD-1真核表达系统的构建与表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 培养基与缓冲液配制 |
| 3.2.5 其他仪器与用具 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 靶向PD-1配体结合界面的单域抗体氨基酸序列优化 |
| 3.3.2 Nb:PD-1目的基因设计与合成 |
| 3.3.3 Nb:PD-1-pGAPZα-A的构建 |
| 3.3.4 毕赤酵母X-33-Nb:PD-1重组工程菌的构建 |
| 3.3.5 Nb:PD-1蛋白的纯化及糖基化验证 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 氨基酸序列优化结果 |
| 3.4.2 目的基因设计与合成结果 |
| 3.4.3 Nb:PD-1的毕赤酵母X-33工程菌的筛选与产物表达 |
| 3.4.4 Nb:PD-1的纯化与糖基化验证 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 第四章 Nb:PD-1原核表达系统的构建与表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 主要材料和试剂 |
| 4.2.3 试验仪器 |
| 4.2.4 培养基与缓冲液 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 Nb:PD-1目的基因的设计与合成 |
| 4.3.2 载体质粒pET21b-Nb:PD-1的构建 |
| 4.3.3 E.coliBL21(DE3)-Nb:PD-1工程菌的构建 |
| 4.3.4 E.coliBL21(DE3)-pET21b-Nb:PD-1的可溶性表达 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Nb:PD-1基因大肠杆菌偏爱密码子优化与扩增 |
| 4.4.2 目的基因与表达载体双酶切及其胶回收 |
| 4.4.3 重组质粒pET21b-hTGF-β1的构建与转化 |
| 4.4.4 高表达菌株的筛选 |
| 4.4.5 可溶性表达 |
| 4.5 讨论与小结 |
| 第五章 亲和力常数测定与活性检测 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 细胞株 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 亲和力常数测定 |
| 5.3.2 抗PD-1单域抗体的结合活性分析 |
| 5.4 试验结果 |
| 5.4.1 亲和力常数测定结果 |
| 5.4.2 抗PD-1单域抗体的结合活性分析结果 |
| 5.5 讨论与小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）黄伞中抗氧化成分的分离鉴定及其抗HIV-1作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 前言 |
| 第一节 菇类的抗氧化活性 |
| 1.1.1 菇类抗氧化活性研究概况 |
| 1.1.2 黄伞的研究情况 |
| 第二节 氧化还原水平与NF-κB信号途径 |
| 1.2.1 氧自由基与氧化损伤 |
| 1.2.2 抗氧化剂 |
| 1.2.3 抗氧化活性检测方法 |
| 1.2.4 NF-κB信号途径在氧化应激中的作用 |
| 第三节 HIV-1与抗艾滋病药物 |
| 1.3.1 艾滋病及HIV的分子生物学 |
| 1.3.2 抗艾滋病靶点及药物研究现况 |
| 第四节 选题依据与研究意义 |
| 1.4.1 抗氧化与抗HIV-1之间的关系 |
| 1.4.2 抗氧化、抗HIV-1活性成分筛选模型 |
| 1.4.3 黄伞中天然活性成分的多效性 第二章 黄伞中活性物质的分离纯化及结构分析 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 2.3.1 64株大型真菌的抗氧化活性测定及实验菌株的选择 |
| 2.3.2 黄伞中活性成分的提取途径和方法 |
| 2.3.3 黄伞中小分子活性物质的分离纯化 |
| 2.3.4 黄伞子实体中活性物质的结构鉴定 |
| 第四节 分析与讨论 |
| 2.4.1 抗氧化活性的检测方法 |
| 2.4.2 黄伞子实体中活性成分的有效提取 |
| 2.4.3 黄伞子实体中活性物质的分析 第三章 胞内抗氧化、抗HIV-1检测模型的构建 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 3.3.1 表达具有氧化还原敏感性质GFP的基因工程大肠杆菌的构建 |
| 3.3.2 胞内抗氧化筛选模型E.coli BL21(pET-croGFP)的应用 |
| 3.3.3 细胞内抗氧化、抗HIV-1检测模型的构建 |
| 3.3.4 细胞内抗氧化、抗HIV-1检测模型的应用 |
| 第四节 分析与讨论 |
| 3.4.1 抗氧化成分筛选模型的比较 |
| 3.4.2 胞内抗氧化活性成分筛选模型的构建与应用 |
| 3.4.3 胞内抗氧化、抗HIV-1检测模型的构建与应用 |
| 3.4.4 黄伞中成分抗氧化与抗HIV-1活性之间的关系 |
| 3.4.5 天然活性成分的毒性评价 第四章 黄伞中抗氧化活性成分的抗HIV-1作用机制的研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 4.3.1 黄伞子实体抗氧化活性成分的作用机制 |
| 4.3.2 黄伞子实体活性成分的抗HIV-1作用机制 |
| 4.3.3 黄伞活性成分对SOD酶和细胞因子表达水平的影响 |
| 第四节 分析讨论 |
| 4.4.1 黄伞子实体抗氧化活性成分的作用机制 |
| 4.4.2 黄伞活性成分抗HIV-1作用靶点分析 |
| 4.4.3 活性成分对细胞因子表达的调节作用 第五章 结论与展望 |
| 第一节 结论 |
| 第二节 展望 参考文献 致谢 个人简历 |
（4）鸡γ-干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物活性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 干扰素的分类 |
| 2 干扰素的理化特性 |
| 3 干扰素的来源和受体 |
| 3.1 Ⅰ型干扰素的来源和受体 |
| 3.2 Ⅱ型干扰素的来源和受体 |
| 3.3 Ⅲ型干扰素的来源和受体 |
| 4 干扰素的分子结构 |
| 5 干扰素的信号传导 |
| 6 干扰素的生物活性 |
| 6.1 抗病毒活性 |
| 6.2 抗寄生虫活性 |
| 6.3 抗肿瘤活性 |
| 6.4 免疫调节活性 |
| 7 鸡Γ-干扰素作为免疫佐剂的研究概况 |
| 第二章 鸡Γ-干扰素在毕赤酵母中的表达、纯化及活性检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、菌株、实验动物、细胞系和病毒株 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 培养基及相关溶液的配制 |
| 1.4 分子生物学软件 |
| 2 方法 |
| 2.1 ChIFN-γ在大肠杆菌中的表达及多克隆抗体的制备 |
| 2.2 ChIFN-γ在毕赤酵母中的表达 |
| 2.3 rchIFN-γ蛋白的纯化 |
| 2.4 rchIFN-γ的免疫佐剂作用评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 ChIFN-γ的大肠杆菌中的表达及多克隆抗体的制备 |
| 3.2 ChIFN-γ的毕赤酵母表达 |
| 3.3 rchIFN-γ蛋白的纯化 |
| 3.4 rchIFN-γ蛋白的免疫佐剂作用评价 |
| 4 讨论 |
| 4.1 rchIFN-γ的毕赤酵母表达及纯化 |
| 4.2 rchIFN-γ的免疫佐剂作用评价 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）多西紫杉醇对H1N1流感疫苗免疫佐剂活性研究及其作用机理初步探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 图目录 |
| 表目录 |
| 英文缩写注释 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 甲型H1N1流感病毒危害及预防措施 |
| 2 免疫佐剂及其活性作用机制 |
| 2.1 常用免疫佐剂 |
| 2.2 黏膜免疫佐剂 |
| 2.3 佐剂活性作用机制研究进展 |
| 3 紫杉烷类化合物对机体免疫系统及免疫细胞的影响 |
| 本论文的主要研究内容、目的和意义 |
| 第二章 多西紫杉醇对H1N1流感疫苗皮下免疫佐剂活性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 试验动物 |
| 2.2 抗原与佐剂 |
| 2.3 试剂与仪器 |
| 3 方法 |
| 3.1 疫苗配制 |
| 3.2 分组与免疫 |
| 3.3 血清特异性IgG、IgG亚类和总IgE |
| 3.4 血清HI效价 |
| 3.5 淋巴细胞转化 |
| 3.6 细胞因子和转录因子 |
| 4 统计分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 血清特异性IgG抗体滴度 |
| 5.2 血清抗体亚类 |
| 5.3 血凝抑制(HI)效价 |
| 5.4 淋巴细胞转化水平 |
| 5.5 小鼠血清总IgE |
| 5.6 细胞因子mRNA表达水平 |
| 5.7 细胞转录因子mRNA表达水平 |
| 6 讨论与小结 |
| 第三章 多西紫杉醇对H1N1流感疫苗黏膜免疫佐剂活性研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 2.1 试验动物 |
| 2.2 抗原与佐剂 |
| 2.3 试剂与仪器 |
| 3 方法 |
| 3.1 分组与免疫 |
| 3.2 血清特异性IgG、IgA及IgG亚类 |
| 3.3 血清HI |
| 3.5 黏膜洗液中的sIgA |
| 3.6 肺组织IL-12、IFN-γ和IL-4、IL-10 mRNA |
| 3.7 小肠上皮内淋巴细胞(IELs) |
| 3.8 小肠黏膜IgA~+分泌细胞 |
| 3.9 淋巴细胞转化 |
| 4 统计分析 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 血凝抑制抗体效价 |
| 5.2 血清特异性IgG、IgA和IgG亚类 |
| 5.3 淋巴细胞转化 |
| 5.4 黏膜洗液sIgA |
| 5.5 小鼠肺组织细胞因子表达水平 |
| 5.6 小肠IELs |
| 5.7 小肠IgA~+分泌细胞 |
| 6 讨论与小结 |
| 第四章 多西紫杉醇佐剂活性作用机理探讨 |
| 第一节 多西紫杉醇对巨噬细胞溶酶体的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 试剂及耗材 |
| 2.3 主要设备 |
| 3 方法 |
| 3.1 细胞复苏 |
| 3.2 铺板 |
| 3.3 药物刺激、溶酶体探针标记及检测 |
| 4 结果 |
| 5 小结 |
| 第二节 多西紫杉醇对巨噬细胞共刺激分子CD80/CD86的影响 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 试剂及耗材 |
| 2.4 主要设备 |
| 3 方法 |
| 3.1 体外巨噬细胞的培养 |
| 3.2 药物刺激 |
| 3.3 CD80、CD86 mRNA表达检测 |
| 4 统计分析 |
| 5 结果 |
| 6 小结 |
| 第三节 多西紫杉醇刺激巨噬细胞细胞因子分泌 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 试剂与仪器 |
| 3 试验方法 |
| 4 统计分析 |
| 5 实验结果 |
| 6 小结 |
| 第四节 多西紫杉醇佐剂活性与NF-κB的关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 试剂及耗材 |
| 2.3 主要设备 |
| 3 方法 |
| 3.1 分组与处理 |
| 3.2 复苏细胞 |
| 3.3 药物刺激 |
| 3.4 SEAP(分泌型碱性磷酸酶)检测 |
| 4 统计分析 |
| 5 试验结果 |
| 6 小结 |
| 第五节 多西紫杉醇刺激巨噬细胞后胞内部分microRNAs变化分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞系与培养基 |
| 2.2 主要试剂与材料 |
| 2.3 主要设备 |
| 3 方法 |
| 4 统计分析 |
| 5 结果 |
| 6 小结 |
| 第六节 多西紫杉醇与热休克蛋白90的关系 |
| 1 引言 |
| 2 材料 |
| 2.1 细胞系 |
| 2.2 试剂及耗材 |
| 2.4 主要设备 |
| 3 方法 |
| 3.1 血清样品采集 |
| 3.2 细胞复苏 |
| 3.3 铺板 |
| 3.4 药物刺激 |
| 3.5 Western Blot检测 |
| 4 结果 |
| 4.1 血清中Hsp90水平 |
| 4.2 多西紫杉醇对巨噬细胞Hsp90的影响 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 研究展望 |
| 参考文献(References) |
| 附录 常用试剂配方 |
| 攻读博士学位期间主要的研究成果 |
| 致谢 |
（6）一株地方株PRRSV分离鉴定及GP5基因疫苗研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 PRRSV 生物学特征 |
| 1.1.1 PRRSV 基因组结构 |
| 1.1.1.1 主要结构蛋白（GP5、M和N蛋白） |
| 1.1.1.2 其他次要结构蛋白（GP2、GP3 和 GP4） |
| 1.2 PRRSV 遗传变异 |
| 1.2.1 结构蛋白编码区的变异 |
| 1.2.2 非结构蛋白编码区的变异 |
| 1.3 PRRSV 免疫学与致病机制的研究进展 |
| 1.3.1 体液免疫反应 |
| 1.3.2 细胞免疫反应 |
| 1.3.3 PRRSV 的致病机制 |
| 1.4 DNA 疫苗的研究进展 |
| 1.4.1 核酸疫苗的研究历史 |
| 1.4.2 核酸疫苗的组成结构 |
| 1.4.3 DNA 疫苗的免疫机制 |
| 1.4.4 核酸疫苗的优点及其不足 |
| 1.4.5 影响 DNA 免疫效果的主要因素 |
| 1.4.6 增强 DNA 疫苗免疫效果的策略 |
| 1.5 分子佐剂的选择 |
| 1.5.1 补体 C3d 研究进展 |
| 1.5.2 干扰素诱导蛋白 10（IP-10）研究进展 |
| 1.5.3 法氏囊三肽（BS）研究进展 |
| 1.5.4 胸腺五肽的研究进展 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和毒株 |
| 2.1.2 载体 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 2.1.7 RT-RCR 试验所用物品的准备和处理 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 PRRSV-SDDP 株全基因克隆测序及序列分析 |
| 2.2.1.1 病料的处理 |
| 2.2.1.2 细胞的培养及传代 |
| 2.2.1.3 盲传病毒 |
| 2.2.1.4 病毒的大量繁殖 |
| 2.2.1.5 病毒的 TCID50 的测定 |
| 2.2.1.6 间接免疫荧光试验（IFA） |
| 2.2.1.7 病毒 RNA 的提取 |
| 2.2.1.8 引物的设计 |
| 2.2.1.9 RT-PCR 检测 |
| 2.2.1.10 目的条带回收 |
| 2.2.1.11 制作感受态细胞 |
| 2.2.1.12 PCR 产物与 pEASY-T 的连接及转化 |
| 2.2.1.13 阳性克隆鉴定 |
| 2.2.2 重组表达质粒的构建及鉴定 |
| 2.2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2.2 目的基因的扩增、纯化及载体的双酶切、纯化 |
| 2.2.2.3 真核表达载体重组质粒的构建和鉴定 |
| 2.2.2.4 重组质粒的大量提取 |
| 2.2.2.5 重组质粒在 293-T 细胞中的表达 |
| 2.2.2.6 间接免疫荧光鉴定转染细胞 |
| 2.2.2.7 重组质粒免疫效果监测 |
| 2.2.2.8 ELISA 试剂盒检测 PRRSV-GP5 特异性抗体 |
| 2.2.2.8.1 操作步骤 |
| 2.2.2.8.2 试验结果的判定 |
| 2.2.2.8.3 小鼠血清中 IL-4 的检测 |
| 2.2.2.8.4 小鼠血清中 IFN-γ的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒分离结果 |
| 3.2 SDDP 毒株 TCID50的检测结果 |
| 3.3 间接免疫荧光试验结果 |
| 3.4 PCR 检测结果 |
| 3.5 序列分析结果 |
| 3.6 重组质粒的免疫效果研究 |
| 3.6.1 真核表达载体构建结果 |
| 3.6.2 重组质粒在细胞内的表达 |
| 3.6.3 重组质粒对小鼠的免疫效果 |
| 3.6.3.1 对小鼠体液免疫（抗体水平）增强结果 |
| 3.6.3.2 对小鼠细胞免疫（IL-4 和 IFN-γ的含量）增强结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PRRSV-SDDP 株全基因序列分析 |
| 4.2 不同分子佐剂对 PRRSV-GP5 免疫效果的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 研究生期间发表论文 |
（7）重组人ICOS胞外区原核表达载体的构建及表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 ICOS分子的研究进展 |
| 1.1 ICOS分子及其配体的结构及表达 |
| 1.1.1 ICOS分子结构及表达分布 |
| 1.1.2 ICOSL分子结构及表达分布 |
| 1.2 ICOS分子的生物学功能 |
| 1.2.1 ICOS分子对T淋巴细胞的作用 |
| 1.2.2 ICOS分子对B淋巴细胞的作用 |
| 1.2.3 ICOS分子对诱导细胞因子产生中的作用 |
| 1.2.4 ICOS分子对Th1、Th2细胞分化的作用 |
| 1.3 ICOS分子在病理机制中的作用 |
| 1.3.1 ICOS分子对自身免疫性疾病的作用 |
| 1.3.2 ICOS分子对器官移植急、慢性排斥反应的作用 |
| 1.3.3 ICOS分子对肿瘤免疫的作用 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第二章 重组人ICOS胞外区原核表达载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验材料和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Jurkat细胞培养 |
| 2.2.2 Jurkat细胞总RNA的提取及其cDNA的合成 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 感受态细胞的制备 |
| 2.2.5 目的片段ICOS胞外区的扩增及克隆测序 |
| 2.2.6 ICOS胞外区同源二聚体的扩增及克隆测序 |
| 2.2.7 ICOS胞外区同源二聚体原核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 Jurkat细胞总RNA的提取 |
| 2.3.2 目的片段ICOS胞外区的扩增及克隆测序 |
| 2.3.3 重组载体pMD18-T-ICOS-AB的PCR扩增及克隆测序鉴定 |
| 2.3.4 ICOS胞外区同源二聚体原核表达载体的构建及酶切鉴定 |
| 2.3.5 提取pET-28a-ICOS-AB质粒的测序结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 重组人ICOS胞外区的表达、纯化及免疫 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验材料和试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 目的蛋白的诱导表达 |
| 3.2.2 目的蛋白的纯化 |
| 3.2.3 Western blot鉴定 |
| 3.2.4 小鼠免疫 |
| 3.2.5 间接ELISA检测纯化的抗原 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 目的蛋白表达的分析及鉴定 |
| 3.3.2 免疫后间接ELISA检测抗血清效价 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 附件 |
| 硕士在读期间研究成果 |
| 致谢 |
（8）鹅白细胞介素2受体α链与白细胞介素18特性的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 IL-2 受体的研究概况 |
| 1.1.1 IL-2R 的来源与发现 |
| 1.1.2 IL-2R 的结构 |
| 1.1.3 IL-2R 的生物学特性及调节 |
| 1.1.4 IL-2R 的信号转导途径 |
| 1.1.5 IL-2R 对IL-2 生物学功能的影响 |
| 1.1.6 IL-2Rα的特性分析 |
| 1.1.7 IL-2Rα在IL-2 研究中的作用 |
| 1.1.8 IL-2Rα在相关疾病研究中的应用 |
| 1.1.9 禽IL-2Rα链的研究进展 |
| 1.2 IL-18 的研究概况 |
| 1.2.1 IL-18 的发现与命名 |
| 1.2.2 IL-18 的分布 |
| 1.2.3 IL-18 的表达调控 |
| 1.2.4 IL-18 的分子结构及特征 |
| 1.2.5 IL-18 的受体及信号传导机制 |
| 1.2.6 IL-18 的生物学功能 |
| 1.2.7 IL-18 在治疗疾病方面的作用 |
| 1.2.8 IL-18 的活性检测 |
| 1.2.9 禽IL-18 的研究现状 |
| 1.3 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物和细胞 |
| 2.1.2 载体、质粒及菌株 |
| 2.1.3 引物设计 |
| 2.1.4 工具酶 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 抗体和主要耗材 |
| 2.1.7 主要溶液配制 |
| 2.1.8 主要仪器 |
| 2.2 鹅IL-2Rα和IL-18 基因克隆及序列分析 |
| 2.2.1 鹅IL-2Rα基因的克隆 |
| 2.2.2 鹅IL-18 基因的克隆 |
| 2.2.3 目的基因的序列分析 |
| 2.3 鹅IL-2Rα和IL-18 成熟蛋白基因原核表达载体的构建及表达 |
| 2.3.1 鹅IL-2Rα成熟蛋白胞外区基因原核表达载体构建 |
| 2.3.2 重组鹅IL-2Rα成熟蛋白胞外区在原核系统中的表达及纯化 |
| 2.3.3 鹅IL-18 成熟蛋白基因原核表达载体的构建 |
| 2.3.4 重组鹅IL-18 成熟蛋白在原核系统中的表达及优化 |
| 2.4 鹅IL-18 成熟蛋白基因在昆虫细胞中的表达及生物学活性检测 |
| 2.4.1 鹅IL-18 成熟蛋白基因重组转移载体的构建 |
| 2.4.2 重组杆粒的获得及鉴定 |
| 2.4.3 重组杆状病毒的获得 |
| 2.4.4 重组杆状病毒DNA 的PCR 鉴定 |
| 2.4.5 重组鹅IL-18 成熟蛋白在昆虫细胞中的表达及检测 |
| 2.4.6 重组鹅IL-18 诱导淋巴细胞产生IFN-γ |
| 2.4.7 重组鹅IL-18 促进鹅脾淋巴细胞增殖试验 |
| 2.5 鹅IL-2Rα链与IL-2 相互作用及IL-18 促淋巴细胞分泌IL-2 作用研究 |
| 2.5.1 鹅IL-2Rα链与IL-2 相互作用 |
| 2.5.2 重组鹅IL-18 促淋巴细胞分泌IL-2 作用 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 鹅IL-2Rα和IL-18 基因克隆及序列分析 |
| 3.1.1 鹅IL-2RαcDNA 基因的克隆 |
| 3.1.2 重组克隆载体的酶切及PCR 鉴定 |
| 3.1.3 鹅IL-2Rα序列分析 |
| 3.1.4 信号肽、跨膜区和糖基化位点分析 |
| 3.1.5 疏水性及高级结构分析 |
| 3.1.6 同源性分析和进化比较 |
| 3.1.7 鹅IL-18cDNA 基因的克隆 |
| 3.1.8 鹅IL-18 序列分析 |
| 3.1.9 鹅IL-18 同源性分析和进化比较 |
| 3.2 鹅IL-2Rα和IL-18 成熟蛋白基因原核表达载体的构建及表达 |
| 3.2.1 重组表达载体pET-30a-mIL-2RαQ 的构建及鉴定 |
| 3.2.2 重组鹅IL-2Rα成熟蛋白胞外区在原核系统中的表达及纯化 |
| 3.2.3 原核重组表达载体pET-30a-mIL-18 的构建及鉴定 |
| 3.2.4 重组鹅IL-18 成熟蛋白在原核系统中的表达及优化 |
| 3.3 鹅IL-18 成熟蛋白基因在昆虫细胞中的表达及生物学活性检测 |
| 3.3.1 鹅IL-18 成熟蛋白基因重组转移载体的构建 |
| 3.3.2 重组杆粒的获得及鉴定 |
| 3.3.3 重组杆状病毒的获得 |
| 3.3.4 重组杆状病毒DNA 的PCR 鉴定 |
| 3.3.5 重组鹅IL-18 成熟蛋白在昆虫细胞中的表达及检测 |
| 3.3.6 重组鹅IL-18 诱导淋巴细胞产生IFN-γ |
| 3.3.7 重组鹅IL-18 促进鹅脾淋巴细胞增殖试验 |
| 3.4 鹅IL-2Rα链与IL-2 相互作用及IL-18 促淋巴细胞分泌IL-2 作用研究 |
| 3.4.1 鹅IL-2Rα链与IL-2 相互作用 |
| 3.4.2 重组鹅IL-18 促淋巴细胞分泌IL-2 作用 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基因的克隆及分析 |
| 4.2 鹅IL-18 成熟蛋白的表达 |
| 4.2.1 原核表达系统 |
| 4.2.2 昆虫细胞-杆状病毒表达系统 |
| 4.3 鹅IL-18 生物学活性分析 |
| 4.3.1 体外微量细胞病变抑制法检测IFN-γ活性 |
| 4.3.2 淋巴细胞增殖试验 |
| 4.4 鹅IL-2α与IL-2 在体外相互作用 |
| 4.5 鹅IL-18 促淋巴细胞分泌IL-2 作用 |
| 4.6 本研究的创新之处 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（9）抗人CD33单链抗体及其与CD80胞外区融合蛋白的构建、表达及功能检测（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分:CD33scFv基因构建、表达及其生物活性检测 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 第二部分:ExCD80-CD33scFv融合蛋白的构建、表达及功能检测 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 综述三 |
| 附录Ⅰ.载体测序 |
| 附录Ⅱ.英文缩写词 |
| 附录Ⅲ.在学期间发表论文和会议报告 |
| 致谢 |
（10）基因枪介导BMP-2基因转染促进兔桡骨骨折愈合的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 pIRES2-EGFP-BMP-2 质粒的构建及其转染活性的测定 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 主要材料及试剂 |
| 1.2 pIRES2-EGFP-BMP-2 真核表达载体的构建与鉴定 |
| 1.3 脂质体介导的pIRES2-EGFP-BMP-2 转染和阳性克隆筛选培养 |
| 1.4 BMP-2 在NIH3T3 细胞内的表达 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 pIRES2-EGFP-BMP-2 质粒转染兔骨髓间充质干细胞及其表达活性的测定 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验动物、试剂与菌种 |
| 1.2 实验步骤 |
| 1.3 检测BMP2 在骨髓间充质干细胞内的表达情况 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 基因枪介导pIRES2-EGFP-BMP-2 质粒转染促进兔桡骨骨折愈合的实验研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.2 实验过程 |
| 1.3 观察方法及指标 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
四、B7.1胞外编码区的真核表达及其生物活性（论文参考文献）
- [1]抗人CTLA-4抗体的制备及功能研究[D]. 孙志杰. 辽宁大学, 2019(01)
- [2]靶向PD-1配体结合界面的单域抗体研制[D]. 刘国强. 广东药科大学, 2018(01)
- [3]黄伞中抗氧化成分的分离鉴定及其抗HIV-1作用机制研究[D]. 王常荣. 南开大学, 2013(06)
- [4]鸡γ-干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物活性检测[D]. 李亚玲. 扬州大学, 2013(04)
- [5]多西紫杉醇对H1N1流感疫苗免疫佐剂活性研究及其作用机理初步探讨[D]. 陈俭. 浙江大学, 2012(08)
- [6]一株地方株PRRSV分离鉴定及GP5基因疫苗研究[D]. 曹广明. 山东农业大学, 2012(02)
- [7]重组人ICOS胞外区原核表达载体的构建及表达[D]. 李文秀. 南京师范大学, 2011(05)
- [8]鹅白细胞介素2受体α链与白细胞介素18特性的初步研究[D]. 卫娜. 东北农业大学, 2011(02)
- [9]抗人CD33单链抗体及其与CD80胞外区融合蛋白的构建、表达及功能检测[D]. 陈小军. 中国协和医科大学, 2009(10)
- [10]基因枪介导BMP-2基因转染促进兔桡骨骨折愈合的实验研究[D]. 詹玉林. 新疆医科大学, 2008(03)