一、人源化BPVL1-GFP融合基因的构建以及在哺乳动物细胞中的瞬时表达（论文文献综述）
王文静[1]（2021）在《抗猫细小病毒基因工程嵌合抗体的表达与初步鉴定》文中研究表明猫细小病毒（Feline parvovirus,FPV）又名猫泛白细胞减少症病毒,病猫临床表现以高热、呕吐、腹泻、脱水以及循环血流中白细胞减少为特点。FPV的宿主包括家养和野生猫科动物（Feliformia亚目）和一些野生犬科动物（Caniformia亚目）,如浣熊和狐狸。因其感染性强致死率高被人们逐渐重视。目前临床针对FPV抗体治疗主要依赖于抗血清,市售的血清多是鼠源单克隆抗体（Monoclonal antibody,MAb）,虽有一定疗效但由于是异源性蛋白应用于体内易产生过敏反应,无法连续注射,治疗效果不佳。近年来,因其基因工程嵌合抗体可以在保留原鼠源抗体的亲和力和特异性基础上降低鼠源性单克隆抗体的免疫原性,并通过连接不同的恒定区基因从而改变抗体的效应功能等优势已发展为目前研究最多的基因工程抗体之一。本实验旨在通过哺乳动物细胞表达具有中和FPV活性的鼠-猫嵌合抗体,降低鼠源单克隆抗体在猫体内引起的免疫副反应。通过克隆具有FPV中和活性的MAb（4F6）的重轻链可变区基因及猫天然抗体（NAb）重轻链恒定区基因,通过重叠延伸PCR获得鼠-猫重组重轻链基因片段（CH/CL）,分别克隆至p FUSE-m Ig G1-Fc载体上,构建嵌合抗体表达载体（p MC-CH、p MC-CL）,菌落PCR鉴定正确后转染CHO-K1细胞,使用100μg/m L博来霉素（Zeocin）筛选,有限稀释法将其单克隆纯化后经双抗体夹心ELISA与Western-blot筛选出同时表达鼠-猫重组重轻链基因的细胞株（CHO-MC）,构建CHO-MC细胞系传代至15代,双抗体夹心ELISA测定不同代次细胞培养上清中的抗体效价,将纯化鉴定正确的鼠-猫嵌合抗体调整浓度为1mg/m L,间接ELISA检测嵌合抗体的效价,中和活性试验测定其对病毒感染细胞的中和活性。结果显示,鼠-猫嵌合抗体重轻链经SDS-PAGE分离大小分别为55 ku、25 ku,Western blot显示鼠源恒定区替换为猫源NAb的恒定区,双抗体夹心ELISA显示CHO-MC细胞系在传代至15代仍能稳定表达嵌合抗体,间接免疫荧光试验显示该嵌合抗体能够与抗猫Ig G和FPV特异性结合,ELISA及中和效价分别为1:1280（0.78μg/m L）和1:16（62.5μg/m L）。上述结果表明,本研究在保留了原猫细小病毒MAb 4F6中和活性的基础上,通过哺乳动物细胞表达出抗FPV的鼠-猫嵌合抗体,达到了减少抗体用于异种动物免疫源性的目的。
李江凡[2]（2021）在《高致病冠状病毒纳米抗体的构建与中和机制研究》文中研究说明冠状病毒传播速速快、感染后果严重,对人类生命健康构成持续的威胁。到目前为止,总共出现三次冠状病毒的暴发流行,其一是2003年由严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）引起的非典型肺炎,其二是2012年由中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）引起的中东呼吸综合征,其三是2019年由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的新冠肺炎（COVID-19）。遗憾的是目前仅针对SARS-CoV-2有上市疫苗,对SARS-CoV和MERS-CoV既无可用疫苗也无特效药。中和抗体的应用是预防和控制传染病非常有效的手段之一。冠状病毒刺突蛋白上的受体结合域（RBD）能够强烈地诱导机体产生保护性抗体,是抗体甚至疫苗研发的重要靶点。目前,针对SARS-CoV和MERS-CoV的单克隆抗体研究较多,包括人源抗体、鼠源抗体和人源化抗体等。纳米抗体作为目前已知的可结合抗原的最小抗体,保留了较高的抗原亲和力和特异性,具有分子量低、易于制备、免疫原性低、组织渗透力强等优点,可以用于多种疾病的治疗,具有广泛的应用前景。对MERS-CoV纳米抗体的研究极少,对SARS-CoV纳米抗体的研究尚属空白。因此,本研究以SARS-CoV和MERS-CoV的受体结合域为靶点,展开了对SARS-CoV和MERS-CoV特异性纳米中和抗体的研究。1、抗MERS-CoV纳米中和抗体研究。为了筛选MERS-CoV纳米中和抗体,使用MERS-CoV S1和S蛋白分别对MERS-CoV RBD特异性纳米抗体库进行了四轮筛选,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定出三株亲和力较高的抗体。然后,通过竞争性ELISA、生物膜层干涉实验等鉴定出识别位点与Nb MS10（Nb MS10为此前筛选到的一株抗MERS-CoV纳米抗体）不同的一株抗体M34,并利用原核表达系统和真核表达系统制备了抗体蛋白。利用生物膜层干涉技术测定了M34与MERS-CoV S1蛋白的结合亲和力（Kd=222 p M）,通过假病毒中和试验验证了该抗体的中和活性(IC50=15.2 ng/m L)。通过竞争性ELISA证实M34与DPP4受体竞争性结合MERS-CoV RBD。进一步又通过流式细胞术试验和细胞-细胞融合实验探究出该抗体通过阻断RBD与DPP4的结合而发挥作用。最后通过同源建模和分子对接预测了M34与MERS-CoV RBD结合的空间结构,结果提示M34可能通过其残基G54与RBD上的残基Y523形成氢键而相互作用。2、抗MERS-CoV双表位中和抗体研究。为了减小单一抗体的应用导致病毒逃逸突变发生的可能性,将上一部分筛选到的抗体与此前实验室鉴定的抗MERS-CoV特异性抗体Nb MS10通过一个短肽进行连接,构建了抗MERS-CoV双表位抗体,通过真核表达系统表达了该抗体。然后通过ELISA测定了该抗体与MERS-CoV S1的亲和力,利用生物膜层干涉技术测定了该抗体与MERS-CoV S1蛋白的结合亲和力（Kd=36 p M）,通过假病毒中和试验鉴定了该抗体的中和活性(IC50=11.1 ng/m L)。结果证实改造后的双表位抗体,其亲和力、中和活性等生物学功能没有降低,并且对D539A/N突变的假病毒也具有了中和能力。3、抗SARS-CoV纳米中和抗体研究。为了筛选SARS-CoV纳米中和抗体,以SARS-CoV RBD免疫羊驼,免疫后利用其外周血单个核细胞建立了噬菌体展示的纳米抗体库。分别以SARS-CoV RBD和S1为抗原对抗体库进行了四轮筛选,通过ELISA鉴定出了四株高结合力抗体,选择了其中结合力最高的S14进行了进一步研究。利用生物膜层干涉技术测定了S14与SARS-CoV S1蛋白的亲和力（Kd=143 p M）,通过假病毒中和试验验证了该抗体的中和活性(IC50=10.7 ng/m L)。通过竞争性ELISA证实S14与ACE2受体竞争性结合SARS-CoV RBD。进一步又通过流式细胞术试验探究出该抗体通过阻断RBD与ACE2的结合而发挥作用。最后通过同源建模和分子对接预测了S14与SARS-CoV RBD结合的空间结构,结果提示S14可能通过其残基S33和P99与RBD上的残基R449形成氢键而相互作用。4、抗MERS-CoV和SARS-CoV双特异性中和抗体研究。为了实现抗体功能的多样性,将上一部分筛选到的抗SARS-CoV抗体S14与抗MERS-CoV特异性抗体Nb MS10通过一个短肽进行连接,构建了抗MERS-CoV和抗SARS-CoV的双特异性抗体,通过真核表达系统表达了该抗体。然后通过ELISA测定了该抗体与MERS-CoV S1和SARS-CoV S1蛋白的结合力,利用生物膜层干涉技术测定了该抗体与MERS-CoV S1和SARS-CoV S1蛋白的亲和力（Kd分别为116和155 p M）,通过假病毒中和试验验证了该抗体的中和活性(IC50分别为7.00和13.7 ng/m L)。结果证实改造后的双表位抗体,其亲和力、中和活性等生物学功能没有降低,具有同时抗MERS-CoV假病毒和SARS-CoV假病毒的能力。本研究以MERS-CoV和SARS-CoV的RBD为靶点,借助噬菌体展示技术,通过四轮筛选,针对两种病毒分别筛选到一株高亲和力的纳米抗体。随后通过ELISA、生物膜层干涉技术、假病毒中和试验评价了他们的生物学功能,通过竞争性ELISA、流式细胞术实验、细胞-细胞融合实验探究了它们的中和机制。然后通过基因工程的方法,将识别不同表位的抗MERS-CoV纳米抗体连接,将抗MERS-CoV纳米抗体和抗SARS-CoV纳米抗体进行连接,分别构建了抗MERS-CoV双表位抗体以及抗MERS-CoV和抗SARS-CoV双特异性抗体,并同样通过ELISA、生物膜层干涉技术、假病毒中和试验评价了他们的生物学功能,结果显示,经改造后的抗体分别保留着连接前各部分抗体的生物学功能,证实改造是可行的,为发展抗MERS-CoV和抗SARS-CoV治疗药物奠定了基础,为发展多功能抗体提供了一种策略。
张范[3]（2020）在《胃部SIDT1介导外源性microRNA吸收的机制》文中研究指明2012年,张琳等人发现,哺乳动物的血清和组织中都存在外源性植物mi RNA,进一步,外源性植物mi R168a可以与人或小鼠的低密度脂蛋白受体衔接因子蛋白1（LDLRAP1）m RNA结合,抑制肝脏中LDLRAP1的表达,从而调节血中LDL胆固醇的含量。越来越多的研究表明,食物中完整的植物mi RNA可以通过哺乳动物的消化系统吸收并跨界调控哺乳动物的基因表达。但食物中的mi RNA如何完整地通过哺乳动物胃肠道（GI）被吸收从而进入循环系统以及全身其他组织的机制仍然不清楚。在秀丽隐杆线虫中,系统性RNA干扰缺陷蛋白1（Systemic RNA Interference Deficiency,SID-1）具有将细胞外双链RNA（ds RNA）转运到细胞内的功能。研究表明,SID-1可能具有11个跨膜结构域,并以多聚体形式发挥作用。SID-1可转运不同长度的ds RNA和具有部分双链RNA结构的分子（例如mi RNA前体和hairpin RNA）。SID-1跨膜家族成员1（SIDT1）,作为哺乳动物中线虫SID-1的同源蛋白,也定位于细胞膜并介导细胞间mi RNA的转运以及细胞外小干扰RNA（si RNA）的吸收。基于以上发现,我们提出假设:SIDT1介导了哺乳动物对外源性mi RNA的吸收。在本研究中,我们对SIDT1基因敲除小鼠进行了研究。在SIDT1敲除小鼠上,高通量测序和定量PCR实验结果显示其体内植物mi RNA本底水平显着降低,并且其对食物中的植物mi RNA动态吸收能力也显着低于野生型小鼠。表明小鼠对食物中的或口服外源性mi RNA的吸收是SIDT1依赖的,即SIDT1蛋白对于外源性mi R哺乳动物消化道的吸收是必要的。进一步,我们发现SIDT1蛋白主要表达在小鼠胃部,进一步实验结果显示SIDT1蛋白定位在胃黏膜顶细胞的细胞膜上。我们对小鼠进行了幽门结扎手术,发现该手术后,野生型小鼠对灌胃mi RNA的吸收和未结扎组吸收无显着差别,而SIDT1敲除小鼠无明显吸收。幽门结扎手术实验表明胃是小鼠对食物中mi RNA吸收的首要器官。在体外,我们培养了原代胃黏膜上皮细胞,并模拟了胃的酸性环境,发现酸性刺激显着增强胃黏膜上皮细胞对培养液中mi RNA分子的吸收,而SIDT1敲除小鼠来源的胃黏膜上皮细胞对培养液中mi RNA分子无明显吸收,酸性刺激也不能增加其对培养液中mi RNA分子的吸收。这提示了消化道中,胃部的高度酸性环境对于SIDT1依赖性的mi RNA吸收至关重要。我们进一步在细胞模型上,通过提取外泌体并分析其中的植物mi RNA含量,发现酸性条件下野生型小鼠来源的原代胃黏膜上皮细胞吸收的植物mi RNA可以通过外泌体包裹释放到培液中。体外构建的荧光素酶报告实验证明这些外泌体中的植物mi RNA还具有生物学功能。最后,通过生物信息学预测,我们发现mi R2911可能靶向人或小鼠的转化生长因子β1（TGF-β1）基因,在四氯化碳（CCl4）诱导的肝纤维化小鼠模型上,TGF被认为是关键的分子。因此我们尝试了通过口服植物mi R2911下调TGF-β1基因来改善肝纤维化。经过4周的口服mi R2911治疗,在小鼠肝组织中植物mi R2911显着升高,肝组织中TGF-β1含量显着降低,病理学研究表明,肝纤维化的几个指标,包括羟脯氨酸,SMA Collegen-1以及天狼星红染色均显示肝纤维化显着改善。而在SIDT1敲除小鼠上,经过4周口服mi R2911后,在小鼠肝组织中植物mi R2911未见显着升高,且肝组织中TGF-β1含量未有明显降低,肝纤维化的几个病理学指标也无改善。通过静脉注射mi R2911绕开消化道吸收后,野生型小鼠和SIDT1敲除小鼠的肝组织中植物mi R2911显着升高,TGF-β1含量显着降低,病理学研究表明,肝纤维化的几个指标,包括羟脯氨酸,SMA Collegen-1以及天狼星红染色均显示肝纤维化显着改善。上述在体实验表明,SIDT1对于口服mi RNA的吸收是必要的。综上,我们的研究结果首次阐明了哺乳动物经消化道吸收外源性mi RNA的可能机制,即SIDT1蛋白介导了哺乳动物对外源性mi RNA的吸收;此外,我们发现了胃的新功能,胃直接吸收食物中的外源性mi RNA;低p H对SIDT1介导的外源micro RNA吸收具有促进作用,从生化角度解释了为什么哺乳动物能够完整的吸收利用外源的micro RNA;此外,口服micro RNA可经SIDT1介导吸收,为基于小RNA的药物开发提供了潜在方向。
周茜[4]（2019）在《HPV16治疗性mRNA纳米疫苗的制备及免疫原性研究》文中研究说明本研究制备了一种针对16型人乳头瘤病毒（HPV,human papillomavirus）的治疗性 mRNA 纳米疫苗（mRNA nanovaccine）。首先将HPV16的致癌基因E6E7合成,将其插入真核表达载体PVAX1,构建PVAX1-E6E7重组质粒。将其转化至大肠杆菌TOP10中扩大培养,提取质粒,经XbaI单酶切制备线性化的DNA模板,体外转录成E6E7 mRNA。用同样的技术路线构建PVAX1-GFP重组质粒,制备GFP mRNA。其次,由于无处不在的RNA酶,本研究构建了一种阳离子脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles,LNPs）,旨在保护mRNA疫苗不被降解,顺利进入细胞,经过溶酶体逃逸后抵达核糖体翻译抗原蛋白。首先以GFP mRNA作为报告基因摸索mRNA-LNPs保护递送系统的条件。通过倒置荧光显微镜观察发现GFP mRNA-LNPs在293细胞中的荧光表达量相比化学转染法显着增加。随后将E6E7 mRNA与LNPs自组装成HPV mRNA-LNPs纳米疫苗。通过ELISA检测发现,HPV mRNA-LNPs纳米疫苗在体外293细胞中的抗原表达量相比化学转染HPV mRNA的抗原表达量增强了 1.8倍。本研究通过动态光散射、电位、包封率等对纳米疫苗进行了探讨,HPV mRNA-LNPs纳米疫苗的粒径约为97 nm左右,PDI为0.137,电位为21mV、包封率为95.9%。随后,将E6E7致癌基因通过两端的BamhI和XhoI酶切位点克隆到Pet-28a表达载体上,构建Pet28a-E6E7,将其转入BL21菌株进行诱导表达,分别用不同浓度IPTG诱导E6E7融合蛋白,确定最佳诱导条件为:16℃,120rpm,O.1mMIPTG诱导20h。将诱导得到的包涵体蛋白进行变性再复性获得E6E7可溶性蛋白,通过Western Blot鉴定目的条带以及结合活性。结果表明,本研究纯化的E6E7融合蛋白具有良好的结合活性,为后续动物实验检测奠定基础。最后,构建治疗小鼠模型,比较LNPs、HPV mRNA-LNPs、HPV DNA-LNPs的肿瘤生长曲线、小鼠血清抗原特异性IgG抗体滴度、Th1型细胞因子TNF-α、IFN-y、和Th2型细胞因子IL-4的表达情况以及各组小鼠脾细胞T细胞亚群变化。结果表明:相对LNPs对照组,HPV mRNA-LNPs纳米疫苗组小鼠的肿瘤大小得到显着抑制（p<0.05）,抗体滴度升高,细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-4表达量均显着提高（p<0.01）。HPV mRNA-LNPs纳米疫苗组小鼠脾细胞CD4+T细胞和CD8+T细胞相对LNPs对照组均显着提高（p<0.05）。综上所述,本研究构建的HPV mRNA-LNPs纳米疫苗在小鼠体内产生了显着的肿瘤治疗效果,诱发了强烈的体液免疫以及细胞免疫应答。
宋兴磊[5]（2019）在《离子通道ASIC1a的膜表面标记与可视化研究》文中进行了进一步梳理酸敏感离子通道（acid-sensing ion channels,ASICs）作为中枢神经系统（central nervous system,CNS）主要的p H感受器能被胞外H+激活,通道开放介导阳离子内流。ASIC1a作为构成通道的主要亚基在CNS广泛表达,参与多种病理生理过程,如恐惧记忆、缺血性脑卒中和痛觉感受等。在大脑中,ASIC1a贡献多个脑区的突触传递和可塑性,并参与调节多种形式的学习记忆,但具体机制并不清楚。ASIC1a在树突棘中富集,神经元ASIC1a的膜表达受到组成型内吞的严格调控,脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）是突触可塑性的重要调节分子,同时也调节脊髓背角神经元ASIC1a的膜表达,提示神经元ASIC1a的膜转运在调节突触功能方面发挥重要作用。我们以ASIC1a的定位为切入点,通过对细胞膜表面通道分子进行标记和可视化系统观察膜表面ASIC1a在皮层神经元中的分布以及活性依赖的突触中ASIC1a的动态变化,探索ASIC1a的膜转运与突触活动之间的联系。人源ASIC1a（h ASIC1a）对于揭示p H在脑功能和脑疾病中的作用意义重大。我们通过在h ASIC1a胞外域不同柔性区插入标签序列筛选到了h ASIC1a-298HA299以及从噬菌体组合抗体库中筛选到了特异识别h ASIC1a胞外域的抗体Ab6-Ig G1。为了实时观测膜表面ASIC1a的动态变化,我们在胞外域插入p H敏感的GFP变体(h ASIC1a-298p Hluorin299),同时对Ab6-Ig G1进行荧光标记修饰（Ab6-Ig G1-Alexa488）。借助于膜标记工具、共聚焦和超高分辨显微镜,我们首次细致分析了膜表面h ASIC1a在神经元上的亚细胞分布以及精细突触定位,h ASIC1a聚簇分布在胞体和树突的细胞膜上,尤其富集于树突棘头部,呈现突触周（peri-synaptic）定位。利用钙成像、荧光漂白恢复（fluorescence recovery after photobleaching,FRAP）技术、全内反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescence microscope,TIRF）和单颗粒示踪（single-particle tracking,SPT）,结合体外活性刺激范式,我们发现chem LTP以ASIC1a依赖的方式诱导树突棘结构变化和钙活动的增强,从细胞水平验证了ASIC1a在突触可塑性中的关键作用。BDNF和chem LTP均能调节皮层神经元ASIC1a的膜表达,增强h ASIC1a靶向树突棘的正向膜转运,BDNF还能促进膜表面h ASIC1a的侧向运动;响应chem LTP刺激,树突棘中h ASIC1a发生由突触周到突触后（post-synaptic）的定位变化。在chem LTP诱导阶段,ASIC1a膜转运的变化从时程上先于AMPA受体;但在chem LTP表达阶段ASIC1a的膜转运出现相反的变化趋势,提示ASIC1a可能在LTP的诱导中发挥触发作用。综上,我们在静态及动态情况下对细胞膜表面h ASIC1a进行标记及可视化,为深入探索ASICs的定位-功能提供高效的工具支撑。利用这些工具,我们研究了兴奋性突触中h ASIC1a的精细定位和动态变化,发现了神经活动依赖的ASIC1a分子行为的改变,从膜转运的角度阐释了ASIC1a调节突触功能的新的分子细胞机制。
刘敏[6]（2019）在《抗流感病毒PB2蛋白单链抗体的表达及其活性检测》文中进行了进一步梳理流感是由流感病毒引起的一种高度传染性疾病,给人类的健康带来了严重的威胁,针对流感病毒的预防和治疗一直是流感研究中关注的重点。在流感的防治中,单链抗体（scFv）因其分子量小、免疫原性低、穿透力强等优势而备受青睐。大肠杆菌因背景清楚、操作简单、成本低廉等优点而被用于制备scFv。但是由于scFv自身结构的原因,在大肠杆菌中表达的scFv主要以包涵体形式存在且表达量较低,这就极大地限制了利用大肠杆菌优势制备scFv的应用。因此,我们拟通过融合表达的方式在大肠杆菌中获得高表达量的可溶性scFv,建立一种基于大肠杆菌高效、廉价制备抗流感病毒scFv的方法。实验室的前期研究结果已经证实,超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）具有促进融合蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的性质。因此,我们构建了抗流感病毒H1N1亚型PB2蛋白scFv与sfGFP融合表达质粒,转入大肠杆菌中进行表达,纯化后在体外和细胞中验证了融合sf GFP的scFv的生物活性。结果表明,与单独的scFv相比,融合了sf GFP的scFv在大肠杆菌中的可溶性明显获得了提高。通过进一步优化诱导温度、时间、IPTG浓度等条件,得出最佳诱导表达条件是在18℃,0.1 m M IPTG下诱导表达16 h,并且1 L的细菌培养物可以获得约20 mg的sf GFP-scFv-His融合蛋白。从大肠杆菌中获得的sf GFPscFv-His经TEV酶酶切,Ni珠纯化后可获得纯化的scFv-His蛋白。Western-blot检测发现sfGFP-scFv-His比scFv-His具有更高的稳定性,这些结果表明sfGFP不仅促进了scFvs在大肠杆菌中的可溶性,也提高了scFvs的稳定性。本实验进一步检测了在大肠杆菌中表达的scFv的免疫学活性。Western-blot和ELISA实验结果表明,sfGFP-scFv-His能与PB2特异性的结合;血凝试验和Real-time PCR实验结果表明抗PB2蛋白的sfGFP-scFv-His和scFv-His都具有一定的抗流感病毒H1N1亚型的活性。这些结果表明,我们通过融合sfGFP在大肠杆菌中获得了可溶性的抗流感病毒H1N1亚型PB2的scFvs,并且该scFvs的活性和稳定性很好,对探讨scFvs在抗流感中的进一步应用奠定了坚实的理论基础,同时该研究还提供了一种可溶性表达具有生物学活性的单链抗体的模式,为大规模制备抗流感单链抗体奠定理论基础。
吴申杰[7]（2018）在《早老素及其古菌同源蛋白的生化研究与相互作用蛋白鉴定》文中提出早老素（presenilin,PS）是阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease,AD）发病中的关键致病基因,在早老素基因上目前已知有超过200个家族性阿尔兹海默症（Familial Alzheimer’s disease,FAD）致病突变位点。早老素是膜内天冬氨酸蛋白酶复合体γ-分泌酶（γ-secretase）的催化亚基,与其他三个组分Aph-1,Pen-2和nicastrin（NCT）一起组装为成熟的γ-分泌酶。γ-分泌酶对淀粉样前体蛋白（APP,amyloid precursor protein）具有切割活性,产生的?淀粉样多肽（Aβ）是病人脑内淀粉样沉淀的主要成分。本文的第一部分选取了早老素的古菌同源蛋白（presenilin archaeal homologue,PSH）作为研究对象,研究了其对底物APP C99的切割特性。我们发现,PSH与γ-分泌酶一样,可以将APP C99剪切成不同长度的Aβ42,Aβ40,Aβ38肽段,并且Aβ42/Aβ40的比例几乎与γ-分泌酶一致。针对γ-分泌酶的抑制剂可以特异性地抑制PSH对底物APP C99的切割。已知的γ-分泌酶活性调节剂同样可以调节PSH产生的Aβ42/Aβ40比例。抑制剂与PSH的复合物晶体结构鉴定出了抑制剂小分子结合于两个天冬氨酸催化残基之间。我们的工作表明,PSH可以精确表现出人源γ-分泌酶的APP的切割特征,是研究γ-分泌酶的酶学活性和开发筛选γ-分泌酶活性调节剂的有力工具。本文的第二部分工作直接以人源早老素PS1为研究对象,通过鉴定γ-分泌酶组分之外的PS相互作用蛋白,来研究PS潜在的其他致病途径。质谱分析暗示,进化上保守的膜蛋白Bax抑制蛋白-1（Bax-inhibitor 1,BI1）能够和PS1蛋白相互作用,我们将其命名为PS1-BI1复合物。BI1可以结合单独形式存在的PS1全长蛋白,而不与组装成熟的γ-分泌酶中的PS1结合。等摩尔浓度的PS1-BI1复合物对γ-分泌酶活性几乎不影响,而150倍摩尔浓度过量的PS1-BI1复合物可以抑制γ-分泌酶对底物APP C99的切割。荧光共定位分析显示,体内环境下的BI1和PS1蛋白结合在一起,而与γ-分泌酶相互分离。这些结果证明了BI1是PS1全新的相互作用蛋白,暗示了PS1作为γ-分泌酶活性组分之外的功能,为研究阿尔兹海默症提供了新的思路。
王梅子[8]（2017）在《家蚕二分浓核病毒基因中特征性加尾序列的研究》文中提出家蚕二分浓核病毒（Bombyx mori bidensovirus,BmBDV）是2012年国际病毒分类委员会（ICTV）新设立的二分DNA病毒科中的唯一病毒种。BmBDV是一种侵染家蚕中肠柱状细胞的病原,可引发家蚕罹患类似昆虫浓核症。其基因组由两条线性ssDNA分子组成（VD1;VD2）,并分别独立包装于不同的病毒衣壳中。VD1中分别编码主要衣壳蛋白（MCP）与DNA聚合酶（pPolB）的基因中3’端非翻译区部分相互重叠,形成了一个双功能加尾信号（BDVpA）,发挥着转录后修饰及有效终止蛋白表达的作用。在本研究中我们评估了这段简短的BDVpA序列对外源基因表达调控的影响。荧光显微技术检测可视化蛋白GFP的表达,定性分析BDVpA（63）与SV40polyA活性的强弱。构建以包含重叠区的BDVpA（63）为多聚腺苷酸化信号的gfp瞬时表达质粒（pT-p5-gfp-BDVp A（63）和pT-ie1-gfp-BDVp A（63））,并构建无polyA的gfp瞬时质粒作为阴性对照组。分别转染三种昆虫细胞（Hi5、BmN和Sf9）,荧光倒置显微镜观测细胞内的荧光。含有BDVpA（63）的转染组细胞中GFP正常表达,与SV40 polyA相比产生绿色荧光的细胞数量较多,亮度稍强。结果显示BDVpA（63）比SV40 polyA更有利于gfp报告基因在昆虫细胞内的表达。双荧光素酶报告系统检测萤火虫荧光酶的相对表达量,定量分析BDVpA（63）与SV40 polyA活性的强弱。构建以BDVpA（63）为多聚腺苷酸化信号的萤火虫荧光素酶质粒（pGL3-p5-BDVpA（63）,pGL3-ie1-BDVpA（63））。分别转染两种昆虫细胞（Hi5和BmN）,检测双荧光素酶的活性。与SV40 polyA相比,所有的转染组都是插入BDVpA（63）时外源蛋白的相对表达量较高。在Hi5细胞中,启动子p5和ie1调控下BDVpA（63）的倍活性分别是SV40 polyA的6.5和21.7倍;而BmN细胞中,倍活性分别为SV40 polyA的2.7和12.6倍。结果表明BDVpA（63）比SV40 polyA更易促进萤火虫荧光素酶基因的表达。real-time qPCR检测不同细胞系中不同启动子驱动下gfp mRNA的相对含量,分析比较BDVpA（63）对外源基因转录水平的影响。在gfp下游插入BDVpA（63）时,mRNA的相对含量与插入SV40 polyA相比都有所提高。在Hi5细胞中,p5和ie1启动子调控下插入BDVpA（63）后gfp mRNA的相对含量分别是插入SV40 polyA的2.8和4.9倍;而BmN细胞中,gfp mRNA的相对含量分别为插入SV40 polyA的1.7和3.6倍。因此BDVpA（63）融合于外源基因的下游,能促进外源基因的转录。双荧光素酶报告系统检测含有不同长度BDVp A的萤火虫荧光素酶的相对活性,分析鉴定BDVp A的核心功能区域。截取BDVpA的特征性序列,构建一系列以其为多聚腺苷酸化信号的萤火虫荧光素酶质粒。转染两种昆虫细胞（Hi5和BmN）,分析比较不同长度BDVpA的倍活性。插入AAUAAA结构域和GU富集区分别独立的BDVpA时萤火虫荧光素酶的相对活性比较弱。当同时含有这两个特征性序列的完整BDVpA（92、63、50、38）时萤火虫荧光素酶的相对活性都较高,其中BDVpA（50）的倍活性最强。因此,包含AAUAAA结构域、GU富集区及下游12 nts的BDVpA（50）,是本次研究中鉴定的核心功能区域。综上,BDVpA是一段有应用潜力的昆虫病毒特征性加尾序列,不但可在昆虫细胞系中促进多种外源基因的表达,而且可以增加质粒或病毒载体的装载量以缩减插入片段大小的限制。
刘晓光[9]（2017）在《赖氨酸巴豆酰化修饰：转移酶鉴定、功能及其与H3K4甲基化之间的交互调控研究》文中进行了进一步梳理组蛋白翻译后修饰是重要的表观遗传调控机制,其中赖氨酸乙酰化最广为人知,它在转录调控方面具有正向激活作用。最近的研究发现,除了乙酰化修饰外,组蛋白赖氨酸上还有许多脂肪酰化修饰,包括丙酰化、丁酰化和巴豆酰化等。赖氨酸巴豆酰化是一种被质谱鉴定发现在组蛋白上广泛存在的翻译后修饰,同时一些文献报道它在精子发生和失活X染色体激活基因表达等过程中可能具有重要作用,然而,关于它的催化酶及功能则研究甚少。我们的研究重点是赖氨酸巴豆酰转移酶的鉴定及功能研究。通过免疫荧光染色实验筛选,我们发现在已知的组蛋白乙酰转移酶中,CBP/p300和MOF都具有赖氨酸巴豆酰转移酶的活性。同时,为了探究赖氨酸巴豆酰化的进化保守性,我们进行了序列进化分析和实验验证,结果表明酵母中与MOF同源的乙酰转移酶Esa1同样负责催化酵母的组蛋白巴豆酰化修饰。乙酰转移酶能催化组蛋白乙酰化和巴豆酰化使得巴豆酰化的功能研究变得困难。接下来通过p300结合辅酶A的活性中心结构分析和大规模点突变筛选,我们构建了一类新型的CBP/p300突变体,该类突变体丧失了乙酰转移酶活性而保留了巴豆酰转移酶活性。重要的是,通过荧光素酶报告基因实验,我们发现这些CBP/p300突变体仍然具有不依赖于乙酰转移酶活性的促进转录功能。并且,与内源的CBP/p300相比,丧失了乙酰转移酶活性的该类CBP/p300突变体也能增强细胞的转录,它们不仅能增加靶基因启动子区的巴豆酰化修饰还能促进巴豆酰化特异识别蛋白DPF2的招募。总之,我们发现了 CBP、p300和MOF都具有巴豆酰转移酶活性,同时表明MOF是一个进化上保守的巴豆酰转移酶,并且首次用细胞内实验证明了 CBP/p300具有催化非乙酰化的脂肪酰化而促进转录的功能,因此也为将来研究非乙酰化的脂肪酰化在转录及其他生物学过程中的功能提供了新思路。此外,我们还进行了组蛋白赖氨酸脂肪酰化修饰识别蛋白的鉴定研究,发现了 WDR5蛋白特异性结合乙酰化或巴豆酰化的H3多肽,而WDR5是H3K4甲基转移酶MLL/SET复合体的关键蛋白亚基,暗示着WDR5可能作为乙酰化/巴豆酰化和甲基化交互调控的关键桥梁分子。进一步的细胞内实验表明,抑制去乙酰化酶活性而升高细胞组蛋白乙酰化/巴豆酰化修饰水平,会促进H3K4甲基化的发生,相反,敲低乙酰转移酶p300表达或用C646抑制其酶活会导致H3K4甲基化水平降低,这些表明细胞内乙酰化/巴豆酰化修饰对H3K4甲基化的维持是必须的。因此,研究WDR5如何参与脂肪酰化同甲基化之间交互调控的分子机制,将有助于我们揭示脂肪酰化和甲基化之间关联的重要生物学意义。
罗龙龙[10]（2016）在《基于表位定向哺乳动物细胞抗体库筛选新型抗PD-1抗体》文中研究指明抗体药物是现代生物医药产业的主力军,其临床应用从最初的抗移植排斥逐步拓展至肿瘤、自身免疫疾病、抗感染、心脑血管疾病、眼科用药以及生物安全防控等重大领域。治疗性抗体的发展经历了多克隆抗血清、鼠源单克隆抗体、人源化抗体以及全人抗体四个阶段。人源化以及全人抗体是抗体药物发展的主流和趋势。在人-人杂交瘤技术、转基因小鼠、抗体库技术以及EB病毒转化人B淋巴细胞等全人抗体制备技术中,抗体库技术是目前最为常用的技术之一。噬菌体抗体库技术是目前抗体研发最广泛使用的技术。阿达木单抗（修美乐）是该技术平台下筛选获批的首个全人源单抗药物,并且连续几年（2012-2015）蝉联全球畅销药物排行榜之首。但是,与目前抗体药物规模化生产常用的哺乳动物细胞表达体系相比,噬菌体使用的原核表达系统缺乏精细的蛋白质折叠和修饰过程,从中筛选获得的抗体往往不能反映天然抗体的构象和翻译后修饰水平。因此,利用哺乳动物细胞系统展示天然构象和翻译后修饰的抗体具有实际的应用价值和前景。但是,受制于转染效率、培养体系等因素,哺乳动物细胞抗体库往往库容量较小（约106）,限制了其广泛应用。计算机辅助分子设计是近年来抗体优化筛选的一个新兴技术,利用计算机辅助分子设计针对特异性抗原表位设计人工抗体库,能在一定程度上提高抗体库中功能性抗体以及高亲和力抗体的比例。因此,利用计算机辅助分子设计结合哺乳动物细胞展示系统有助于在有限的抗体库容基础上,优化抗体库质量,提高抗体库筛选效率。肿瘤免疫治疗经历了漫长的探索和重大的挫折之后逐渐显现出良好的治疗效果并有望改变目前肿瘤的治疗策略。针对CTLA-4、PD-1/PD-L1等“免疫卡控点分子”的单抗拮抗剂以及基于抗体结构设计的新型CART技术在肿瘤免疫治疗领域突破性的疗效奠定了抗体在该领域的重要地位。程序性死亡受体-1（PD-1）是一类重要的免疫负性调控分子（也称“免疫卡控点分子”）,主要在激活的T细胞和B细胞中表达,通过与NK等细胞表面的PD-L1以及PD-L2配体结合,激活负调控信号,抑制免疫细胞的过度活化。大量的研究显示,多种肿瘤细胞表面高表达PD-L1分子,通过PD-1/pd-l1信号通路形成机体免疫耐受,逃避机体的免疫反应;特异性阻断pd-1/pd-l1信号通路,可以有效激活免疫系统杀伤肿瘤细胞。因此,pd-1/pd-l1成为肿瘤免疫治疗的热门靶标。国外制药巨头针对pd-1分子单抗药物研发展开了激烈的竞争,其中bms公司研发的nivolumab抗体获fda上市批准,应用于转移性恶性黑色素瘤、鳞状非小细胞肺癌、肾癌等多个肿瘤的临床治疗;除了单药使用外,nivolumab与其他靶向药物联合使用的临床试验正在开展,并取得良好的进展。但是,目前国内只有两家企业生产的pd-1抗体获得临床批文。因此,筛选具有自主知识产权的新型pd-1抗体具有重要的理论和实际意义。本论文构建了哺乳动物细胞展示系统,并以pd-1为靶点,借助计算机辅助分子设计设计获得了靶向pd-1抗体库,结合流式高通量筛选候选抗体;进一步建立体内外评价模型,合理评价候选抗体生物学活性。具体研究结果如下:1、哺乳动物细胞展示系统的构建及验证为了实现抗体在哺乳动物细胞表面展示、单一细胞表达单一抗体基因等抗体库筛选的基本原则,我们在frt-flp-in?定点整合系统的基础上,构建了抗体fab结构域膜表达载体pfrt/kigg1fabhtm;同时构建了全长抗体表达载体prt/kigg1,可实现与抗体库中筛选获得候选抗体进行快速对接表达。流式细胞以及激光共聚焦等实验显示,pfrt/kigg1fabhtm载体能够实现fab抗体在哺乳动物细胞膜表面展示。抗埃博拉病毒抗体、抗西尼罗河病毒抗体、抗pd-1抗体以及抗cd3抗体等多个抗体的瞬时表达结果结果显示,各抗体在全长抗体表达载体prt/kigg1上的瞬时表达量可达100μg/ml;利用该系统构建了抗pd-1抗体、抗cd3抗体等多个抗体稳定表达细胞株,规模化流加培养14天后抗体的表达量可达1.2g/l。提示,prt/kigg1载体是一套通用、高效的全长抗体表达载体。进一步,我们利用红、绿荧光蛋白验证frt-flp-in?体系是否能实现单一细胞表达单一抗体基因。研究结果显示,frt-flp-in?稳定转染体系下,每个细胞均只表达一种荧光蛋白基因;表明frt-flp-in?定点整合系统能够实现单个细胞表达单一目的基因。借助构建的哺乳动物表面展示系统,将抗pd-1阳性抗体mil75的fab结构域展示在cho表面,流式分析结果显示,pd-1-fitc与细胞的结合呈剂量依赖性,提示该展示系统可以借助facs实现高通量筛选。2、靶向pd-1抗体库构建及筛选利用分子模拟与对接搭建pd-1与pd-l1复合物空间结构,根据pd-l1与pd-1相互作用模式分析获得pd-l1参与识别pd-1分子关键氨基酸残基。进一步选用nivolumab抗体轻、重链可变区归属亚组（igkv3-11*01、ighv3-33*01）所对应的通用序列为模板进行合成抗体库的设计,在抗体模板可及性表面积较大的残基位点上引入一些与pd-l1关键残基理化性质相近的氨基酸突变,获得与pd-l1识别pd-1作用模式类似的靶向抗体库。借助前期构建的哺乳动物细胞展示平台,构建抗pd-1靶向抗体库,转化子计数和二代高通量测序结果显示,抗体库涵盖了轻链及大部分重链理论序列（实测序列多样性vs理论设计序列多样性,轻链96/96;重链7321/8640）的多样性。进一步利用流式分选技术对构建的细胞库进行3轮富集筛选,获得阳性克隆并进行测序获得候选抗体序列。对候选抗体序列进行序列比对分析,按照序列同源性以及主链碳原子均方根位移等参数将所测120个抗体序列分为10组,并从中筛选13个代表性序列。将13个代表性的抗体序列进行全长抗体表达,表达量结果提示13株抗体均具有较高表达水平（15.2μg/ml74.5μg/ml）。其中fv63（59μg/ml）、fv78（74.5μg/ml）表达量明显高于对照抗体mil75（28.7μg/ml）。特异性结合活性实验进一步筛选获得5株亲和力较好的抗体（1-4×10-10m）。借助生物信息学、结构生物学以及计算机辅助分子模拟技术对筛选获得的一系列抗体进行抗体空间结构稳定能、识别pd-1分子空间表位等进行理论评估,最终确定了两株的功能活性较好的候选抗体fv74、fv78。初步结果显示fv78表达量优于上市抗体mil75。3、靶向pd-1新抗体fv78生物学活性评价进一步对靶向pd-1新抗体fv78开展体内、外功能评价。实验结果显示,fv78特异性识别人pd-1分子,并与cd28家族其它成员（cd28、ctla4、btla、icos）不交叉;竞争elisa实验结果提示fv78能够有效阻断pd-1与pdl1或pdl2之间相互作用,半数效应浓度均为9.9μg/ml。体外pbmc活化模型以及dc-cd4+t混合淋巴培养实验模型中,fv78抗体能够有效激活t细胞释放ifn-γ。利用人外周血pbmc回输免疫缺陷型小鼠npg,构建移植物抗宿主疾病模型（gvhd）,合理评价抗PD-1抗体的免疫激活活性。结果显示,给予FV78抗体可以有效激活免疫系统,加重GVHD反应,加速小鼠死亡（MST,FV78 vs N.S=36 vs 41 days,P<0.05）;相对于阳性对照MIL75组,FV78抗体具有一定优效性（MST,FV78 vs MIL75=36 vs 39days,P=0.08）。综合体内外实验结果提示,靶向PD1新抗体FV78具有不弱于阳性抗体MIL75的体内外生物学活性。
二、人源化BPVL1-GFP融合基因的构建以及在哺乳动物细胞中的瞬时表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人源化BPVL1-GFP融合基因的构建以及在哺乳动物细胞中的瞬时表达（论文提纲范文）
（1）抗猫细小病毒基因工程嵌合抗体的表达与初步鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 基因工程抗体概述 |
| 1.1.1 基因工程抗体的类型 |
| 1.1.2 基因工程抗体的表达系统 |
| 1.1.3 基因工程抗体药物研究现状与发展前景 |
| 1.2 猫泛白细胞减少症概述 |
| 1.2.1 FPV基因组结构 |
| 1.2.2 FPV病病理学特征 |
| 1.2.3 FPV病病流行病学 |
| 1.2.4 FPV病病临床症状 |
| 1.2.5 FPV病诊断与防控 |
| 1.3 目的与意义 |
| 第二章 猫源化基因工程抗体表达质粒的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品与载体 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 试剂材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物设计与合成 |
| 2.2.2 猫外周血单个核细(PBMCs)总RNA的提取与反转录 |
| 2.2.3 猫天然抗体重、轻链恒定区基因扩增及纯化 |
| 2.2.4 鼠源单克隆抗体4F6 总RNA提取与反转录 |
| 2.2.5 鼠源单克隆抗体4F6 重、轻链可变区基因扩增及纯化 |
| 2.2.6 猫抗体重、轻链恒定区与MAb4F6 重、轻链可变区的T载体克隆 |
| 2.2.7 鼠-猫重组重、轻链基因扩增 |
| 2.2.8 重组质粒构建与鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 猫IgG重、轻链恒定区基因片段的扩增 |
| 2.3.2 鼠源单克隆抗体4F6重、轻链可变区基因片段的扩增 |
| 2.3.3 MAb4F6可变区基因和猫IgG恒定区基因的序列分析 |
| 2.3.4 鼠-猫重组重、轻链全长基因片段的扩增 |
| 2.3.5 重组质粒菌落PCR鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 重叠延伸PCR优点 |
| 2.4.2 哺乳动物表达系统表达载体 |
| 第三章 表达猫源化基因工程抗体哺乳动物细胞株的构建及初步鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞与病毒株 |
| 3.1.2 仪器设备 |
| 3.1.3 试剂材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 重组质粒pMC-C_H、pMC-C_L大量提取 |
| 3.2.2 CHO细胞复苏与培养 |
| 3.2.3 筛选同时表达鼠-猫重组重、轻链基因的细胞株 |
| 3.2.4 鼠-猫重组Ig G的SDS-PAGE及 Western blot鉴定 |
| 3.2.5 CHO-MC细胞系遗传稳定性鉴定 |
| 3.2.6 间接ELISA测定鼠-猫重组Ig G效价 |
| 3.2.7 鼠-猫重组Ig G间接免疫荧光(IFA)鉴定 |
| 3.2.8 鼠-猫重组Ig G对 FPV的中和活性测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 转染CHO-K1细胞单克隆细胞的筛选结果 |
| 3.3.2 纯化后鼠-猫重组IgGSDS-PAGE验证表达结果 |
| 3.3.3 纯化后鼠-猫重组IgG Western blot验证表达结果 |
| 3.3.4 CHO-MC细胞系遗传稳定性结果 |
| 3.3.5 间接ELISA测定嵌合抗体效价结果 |
| 3.3.6 鼠-猫重组IgG间接免疫荧光(IFA)鉴定结果 |
| 3.3.7 鼠-猫重组IgG对FPV的中和活性测定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）高致病冠状病毒纳米抗体的构建与中和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、冠状病毒 |
| 二、中东呼吸综合征冠状病毒 |
| 三、严重急性呼吸综合征冠状病毒 |
| 四、纳米抗体 |
| 第一章 抗MERS-CoV纳米中和抗体的构建与鉴定 |
| 引言 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细菌、噬菌体和质粒 |
| 1.1.2 细胞 |
| 1.1.3 蛋白质 |
| 1.1.4 主要试剂(盒) |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 MERS-CoV S1 蛋白特异性纳米抗体的筛选 |
| 1.2.2 MERS-CoV S蛋白特异性纳米抗体的筛选 |
| 1.2.3 抗MERS-CoV特异性纳米抗体的选取与制备 |
| 1.2.4 抗MERS-CoV特异性抗体的生物学功能评价 |
| 1.2.5 抗MERS-CoV特异性抗体的中和机制研究 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 抗MERS-CoV特异性纳米抗体的筛选和制备 |
| 1.3.2 MERS-CoV特异性抗体的生物学功能评价 |
| 1.3.3 MERS-CoV特异性抗体的中和机制研究 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 抗MERS-CoV双表位中和抗体的构建与鉴定 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 蛋白质 |
| 2.1.3 主要试剂(盒) |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 MERS-CoV特异性双表位中和抗体的构建与制备 |
| 2.2.2 MERS-CoV特异性双表位抗体的生物学功能评价 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 MERS-CoV特异性双表位中和抗体的制备 |
| 2.3.2 MERS-CoV特异性双表位中和抗体的生物学特征分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 抗SARS-CoV纳米中和抗体的构建与鉴定 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细菌、噬菌体、质粒 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 蛋白 |
| 3.1.4 主要试剂(盒)与耗材 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 SARS-CoV RBD-Fc蛋白特异性纳米抗体库的构建 |
| 3.2.2 SARS-CoV S1 蛋白特异性纳米抗体的筛选 |
| 3.2.3 SARS-CoV RBD蛋白特异性纳米抗体的筛选 |
| 3.2.4 SARS-CoV特异性纳米抗体的选取与制备 |
| 3.2.5 SARS-CoV特异性纳米抗体的生物学功能评价 |
| 3.2.6 SARS-CoV特异性纳米抗体的中和机制研究 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 SARS-CoV RBD特异性纳米抗体库的构建 |
| 3.3.2 SARS-CoV特异性纳米抗体的筛选及制备 |
| 3.3.3 SARS-CoV特异性纳米抗体的生物学特征分析 |
| 3.3.4 SARS-CoV特异性纳米抗体的中和机制研究 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 抗MERS-CoV和 SARS-CoV双特异性抗体构建与鉴定 |
| 引言 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 蛋白质 |
| 4.1.3 主要试剂(盒) |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 抗MERS-CoV和 SARS-CoV双特异性抗体的构建与制备 |
| 4.2.2 抗MERS-CoV和 SARS-CoV双特异性抗体的生物学功能评价 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 抗MERS-CoV和 SARS-CoV双特异性抗体的制备与鉴定 |
| 4.3.2 抗MERS-CoV和 SARS-CoV双特异性抗体的生物学功能评价 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A 部分试剂及培养基配方 |
| 附录 B 用于序列比对的2012-2019年MERS-CoV流行株GenBank编号 |
| 在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（3）胃部SIDT1介导外源性microRNA吸收的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景综述 |
| 第一节 外源性mi RNA跨界调控哺乳动物基因表达 |
| 一、micro RNA及其功能 |
| 二、外源性mi RNA经消化道被哺乳动物吸收并具有跨界调控作用 |
| 三、食源性mi RNA进入哺乳动物体内的机制研究进展 |
| 第二节 SIDT1 |
| 一、线虫系统RNAi现象和SID蛋白的研究进展 |
| 二、SID蛋白的研究进展 |
| 1.SID-1 |
| 2.SID-2 |
| 三、SIDT1和SIDT2 的研究进展 |
| 1.SIDT1 |
| 2.SIDT2 |
| 第三节 基于小核酸的肝纤维化基因疗法药物研究 |
| 一、TGF-β是肝纤维化基因疗法最重要的靶标 |
| 二、基于小核酸的肝纤维化的基因治疗现状 |
| 1.基于反义ODN的治疗 |
| 2.基于si RNA的治疗 |
| 3.基于mi RNA的治疗 |
| 4.基于诱饵ODN的治疗 |
| 三、展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验部分 |
| 第一节 SIDT1 介导小鼠对食物mi RNA的吸收 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.SIDT1 对外源mi RNA吸收具有必要性 |
| 全身性Sidt1 基因敲除小鼠的验证 |
| Sidt1~(-/-)小鼠对口服植物miRNA的动态吸收能力降低 |
| Sidt1~(-/-)小鼠对中药或食物中miRNA的动态吸收能力降低 |
| Sidt1~(-/-)小鼠肝脏中的外源miRNA本底水平降低 |
| 食物来源miR168a对于Sidt1~(-/-)小鼠肝组织中LDLRAP1 的跨界调控作用减弱 |
| 2.SIDT1 在胃介导mi RNA的吸收 |
| SIDT1 蛋白在胃肠道各器官组织匀浆的分布 |
| SIDT1 在消化道各器官组织切片的分布 |
| SIDT1 在胃粘膜组织细胞水平的分布 |
| SIDT1 在胃粘膜上皮细胞亚细胞水平的分布 |
| 外源mi RNA在胃肠道各器官组织匀浆的丰度分布 |
| 幽门结扎手术模型的建立与验证 |
| 幽门结扎实验定量研究胃部SIDT1 介导mi RNA吸收 |
| 荧光成像检验幽门结扎模型中胃部SIDT1 介导mi RNA吸收后的组织分布 |
| 3.胃酸对胃部SIDT1 介导的外源mi RNA吸收的影响 |
| 胃粘膜上皮细胞吸收外源性mi RNA体外模型的建立与验证 |
| 原代胃黏膜上皮细胞对酸性环境的耐受 |
| 体外实验发现酸性环境促进SIDT1 介导的mi RNA吸收 |
| 四、小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 食物中的MIR2911 能够通过抑制TGF-β1 治疗CCl4 造模引起的小鼠肝纤维化 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1.mi R2911 在人和小鼠具有靶基因Tgf-β1 |
| 生物信息学预测mi R2911 靶向人和小鼠的内源性基因Tgf-β1 |
| 体外验证mi R2911 对人和小鼠Tgf-β1 的调控作用 |
| 2.口服外源miR2911 的方法可以SIDT1 依赖地治疗CCl_4模型小鼠的肝纤维化 |
| 四、小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 总结 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（4）HPV16治疗性mRNA纳米疫苗的制备及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 HPV的概述 |
| 1.1.1 HPV的结构、功能、生物学性质 |
| 1.1.2 HPV病毒的永生化 |
| 1.1.3 HPV病毒的致癌机制 |
| 1.2 HPV疫苗 |
| 1.2.1 HPV预防性疫苗 |
| 1.2.2 HPV治愈性疫苗 |
| 1.3 HPV治疗性疫苗的国内外研究进展 |
| 1.4 RNA疫苗 |
| 1.4.1 RNA疫苗的成分 |
| 1.4.2 非病毒载体技术传递mRNA疫苗 |
| 1.4.3 mRNA疫苗免疫治疗原理 |
| 1.5 本课题的研究意义 |
| 1.6 本课题的研究内容 |
| 1.7 本课题的技术路线 |
| 第二章 HPV治疗性mRNA疫苗的制备 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 目的基因片段的获得及表达载体的构建 |
| 2.3.2 TOP10感受态细胞的制备 |
| 2.3.3 目的片段的转化 |
| 2.3.4 重组质粒DNA的提取 |
| 2.3.5 重组质粒的线性化酶切及胶回收 |
| 2.3.6 体外转录成mRNA |
| 2.3.7 mRNA的纯化 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 目的基因测序结果分析 |
| 2.4.2 感受态效率测定 |
| 2.4.3 重组质粒线性化模板鉴定 |
| 2.4.4 mRNA的鉴定分析 |
| 2.4.6 核酸质量分析 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 mRNA疫苗保护递送系统的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 293细胞的传代培养 |
| 3.3.2 化学试剂转染293细胞 |
| 3.3.3 阳离子脂质体纳米颗粒的设计 |
| 3.3.4 LNPs的合成 |
| 3.3.5 LNPs与mRNA疫苗的自组装 |
| 3.3.6 纳米粒子转染293细胞 |
| 3.3.7 ELISA检测293细胞表达量 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 GFP显微镜镜检图 |
| 3.4.2 LNPs动态光散射分析 |
| 3.4.3 LNPs与HPV疫苗的络合分析 |
| 3.4.4 HPV纳米疫苗的粒径分析 |
| 3.4.5 HPV纳米疫苗的电荷、包封率分析 |
| 3.4.6 HPV纳米疫苗的SEM分析 |
| 3.4.7 ELISA检测结果 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 E6E7融合蛋白的原核表达纯化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 试剂材料 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 目的基因和表达载体pET28a的构建 |
| 4.3.2 BL21感受态细胞的制备 |
| 4.3.3 Pet28a-E6E7转入BL21 |
| 4.3.4 E6E7融合蛋白的BL21菌株表达 |
| 4.3.5 SDS-PAGE分析表达产物 |
| 4.3.6 目的蛋白的诱导条件优化 |
| 4.3.7 E6E7包涵体的变性和复性 |
| 4.3.8 BCA蛋白浓度的测定 |
| 4.3.9 WB检测融合蛋白结合活性 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 重组质粒测序鉴定 |
| 4.4.2 融合蛋白E6E7的BL21菌株表达 |
| 4.4.3 E6E7的最适诱导条件 |
| 4.4.4 BCA测定蛋白浓度 |
| 4.4.5 包涵体的复性分析 |
| 4.4.6 WB检测结果 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 HPV mRNA-LNPs纳米疫苗免疫原性研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.2.3 仪器设备 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 动物实验分组及免疫方案 |
| 5.3.2 ELISA检测小鼠血清IgG |
| 5.3.3 小鼠脾脏单个核细胞悬液的制备 |
| 5.3.4 ELISPOT检测 IFN-γ |
| 5.3.5 ELISA检测 IL-4、TNF-α |
| 5.3.6 FCM检测T细胞亚群 |
| 5.3.7 统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 肿瘤生长分析 |
| 5.4.2 小鼠血清抗体分析 |
| 5.4.3 小鼠细胞因子分析 |
| 5.4.5 T细胞亚群分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者和导师简介 |
| 附件 |
（5）离子通道ASIC1a的膜表面标记与可视化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 全文主要缩略词中英文对照表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 突触传递和可塑性与谷氨酸受体 |
| 1.2 酸敏感离子通道 |
| 1.3 酸敏感离子通道与突触传递和突触可塑性 |
| 1.4 关键科学问题与主要研究内容 |
| 1.4.1 关键科学问题 |
| 1.4.2 主要研究内容 |
| 1.5 研究意义 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 生化分子试剂 |
| 2.1.4 细胞培养相关试剂、药品和材料 |
| 2.1.5 抗体 |
| 2.1.6 主要溶液配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞系与原代神经元培养 |
| 2.2.2 细胞系培养 |
| 2.2.3 质粒构建与细胞转染 |
| 2.2.4 基于组合抗体库筛选策略制备h ASIC1a胞外域抗体 |
| 2.2.5 细胞膜表面h ASIC1a标记和免疫染色 |
| 2.2.6 甘氨酸诱导的化学LTP |
| 2.2.7 胚胎电转 |
| 2.2.8 组织免疫染色 |
| 2.2.9 免疫电镜 |
| 2.2.10 膜蛋白抽提和蛋白免疫印迹 |
| 2.2.11 膜片钳电生理记录 |
| 2.2.12 荧光漂白恢复 |
| 2.2.13 超高分辨成像 |
| 2.2.14 抗体修饰和单颗粒示踪 |
| 2.2.15 数据统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 ASIC1a贡献兴奋性突触结构和功能可塑性 |
| 3.1.1 ASIC1a与树突棘结构重塑 |
| 3.1.2 ASIC1a与突触钙活动 |
| 3.2 神经元质膜表面h ASIC1a标记与可视化 |
| 3.2.1 神经元上h ASIC1a的表达与分布 |
| 3.2.2 基于分子改造的h ASIC1a的膜表面标记 |
| 3.2.3 h ASIC1a在原代皮层神经元细胞膜上的亚细胞定位 |
| 3.2.4 针对h ASIC1a胞外域的抗体开发和h ASIC1a的膜表面标记 |
| 3.2.5 神经元细胞膜表面ASIC1a的动态可视化 |
| 3.3 BDNF与皮层神经元ASIC1a的膜转运 |
| 3.3.1 BDNF调控皮层神经元ASIC1a的膜表达 |
| 3.3.2 可视化 BDNF调控突触中h ASIC1a的动态变化 |
| 3.4 ASIC1a膜转运与LTP |
| 3.4.1 ASIC1a在兴奋性突触中的精细定位 |
| 3.4.2 LTP调控ASIC1a的膜转运 |
| 4 讨论 |
| 4.1 细胞膜表面功能性的ASIC1a的标记与可视化 |
| 4.2 神经元膜表面ASIC1a的亚细胞分布 |
| 4.3 神经活动依赖的突触中h ASIC1a的动态转运 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 文献综述——质子,酸敏感离子通道与突触活动 |
| 1 H~+来源、分布调节有关的过程 |
| 1.1 H~+来源 |
| 1.2 H~+分布 |
| 1.3 中枢神经系统p H动态调控的转运子和酶 |
| 2 质子与神经元的兴奋性 |
| 2.1 质子与突触递质释放 |
| 2.2 质子与缝隙连接 |
| 2.3 质子敏感的G蛋白偶联受体 |
| 2.4 H~+调节电压门控离子通道的电导 |
| 2.5 质子与配体门控离子通道的电导 |
| 3 酸敏感离子通道与突触功能 |
| 3.1 神经细胞所处的p H环境 |
| 3.2 H~+受体的发现与基本性质 |
| 3.3 ASICs总体表达和分布 |
| 3.4 ASICs在神经元中的亚细胞定位 |
| 3.5 ASIC与神经元生理状态 |
| 3.6 ASICs与突触功能 |
| 3.7 调节ASICs功能和转运的分子机制 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及学术论文和科研成果目录 |
（6）抗流感病毒PB2蛋白单链抗体的表达及其活性检测（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.1.1 禽流感历史 |
| 1.1.2 从禽流感到人流感 |
| 1.2 流感病毒的结构 |
| 1.2.1 PB1,PB2,PA蛋白 |
| 1.2.2 HA蛋白 |
| 1.2.3 NP蛋白 |
| 1.2.4 NA蛋白 |
| 1.2.5 M蛋白 |
| 1.2.6 NS蛋白 |
| 1.3 流感病毒的生命周期 |
| 1.4 抗体的发展过程 |
| 1.4.1 抗体的结构 |
| 1.4.2 抗体的发展 |
| 1.4.2.1 多克隆抗体 |
| 1.4.2.2 单克隆抗体 |
| 1.4.2.3 基因工程抗体 |
| 1.5 单链抗体 |
| 1.5.1 单链抗体的结构 |
| 1.5.2 单链抗体的表达系统 |
| 1.5.3 单链抗体的应用 |
| 1.6 绿色荧光蛋白概述 |
| 1.6.1 绿色荧光蛋白的结构及理化性质 |
| 1.6.2 绿色荧光蛋白的应用 |
| 1.6.3 超折叠绿色荧光蛋白概述 |
| 1.7 本文研究的目的与意义 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株,细胞和病毒 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 培养基配制 |
| 2.1.4 实验室常用溶液配制 |
| 2.1.5 实验设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.2 大肠杆菌的转化 |
| 2.2.2.1 大肠杆菌的快速转化 |
| 2.2.2.2 大肠杆菌的常规转化 |
| 2.2.3 重组载体的构建 |
| 2.2.3.1 PCR扩增目的基因 |
| 2.2.3.2 PCR产物检测与纯化 |
| 2.2.3.3 重组载体的筛选与鉴定 |
| 2.2.4 目的蛋白在大肠杆菌中的表达 |
| 2.2.5 大肠杆菌胞内的提取与纯化 |
| 2.2.5.1 提取目的蛋白 |
| 2.2.5.2 Ni-NTA纯化目的蛋白 |
| 2.2.6 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白 |
| 2.2.7 单链抗体的免疫学活性检测 |
| 2.2.7.1 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.7.2 酶联免疫吸附测定法(ELISA) |
| 2.2.8 细胞培养 |
| 2.2.8.1 细胞复苏 |
| 2.2.8.2 细胞传代培养 |
| 2.2.8.3 细胞冻存 |
| 2.2.9 病毒TCID50的测定 |
| 2.2.10 流感病毒HIN1感染A549细胞 |
| 2.2.11 培养基上清中流感病毒血凝效价的测定 |
| 2.2.11.1 1 %鸡红细胞悬液制备 |
| 2.2.11.2 血凝效价测定 |
| 2.2.12 感染病毒后A549 细胞中NP蛋白各RNA相对表达量的检测 |
| 2.2.12.1 RNA提取和反转录 |
| 2.2.12.2 Real Time PCR |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 抗PB2 蛋白单链抗体(scFv)表达载体的构建 |
| 3.2 scFv,sfGFP-scFv-His蛋白的表达 |
| 3.3 sfGFP-scFv-His表达条件的优化 |
| 3.3.1 sfGFP-scFv-His在不同温度诱导下的表达 |
| 3.3.2 sfGFP-scFv-His在不同浓度IPTG诱导下的表达 |
| 3.3.3 sfGFP-scFv-His在诱导不同时间下的表达结果 |
| 3.3.4 sfGFP-scFv-His和 scFv-His的纯化 |
| 3.4 sf GFP-scFv-His和 scFv-His稳定性检测 |
| 3.5 sf GFP-scFv-His的免疫学活性检测 |
| 3.5.1 流感病毒H1N1亚型PB2蛋白表达质粒的构建 |
| 3.5.2 流感病毒H1N1亚型PB2蛋白的表达与纯化 |
| 3.5.3 sfGFP-scFv-His对 PB2 蛋白结合活性的检测 |
| 3.6 sf GFP-scFv-His和 scFv-His抗流感病毒活性检测 |
| 第4章 讨论与展望 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）早老素及其古菌同源蛋白的生化研究与相互作用蛋白鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略词对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 早老素的发现与结构 |
| 1.1.1 早老素的发现 |
| 1.1.2 早老素与γ-分泌酶 |
| 1.1.3 早老素古菌同源蛋白PSH |
| 1.1.4 早老素/γ-分泌酶的结构 |
| 1.2 早老素的功能与致病机制 |
| 1.2.1 淀粉样沉淀级联假说 |
| 1.2.2 早老素假说 |
| 1.2.3 其他致病假说 |
| 1.2.4 早老素的功能多样性 |
| 1.2.5 早老素/γ-分泌酶相互作用蛋白 |
| 1.3 本文研究的主要目的与内容 |
| 1.3.1 PSH对底物切割的生化机制与结构基础 |
| 1.3.2 早老素相互作用蛋白的鉴定 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 常用配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分子克隆 |
| 2.2.2 蛋白质的表达与纯化 |
| 2.2.3 蛋白质的结晶与结构解析 |
| 2.2.4 酶切实验与活性检测 |
| 2.2.5 蛋白质质谱鉴定 |
| 2.2.6 荧光共聚焦显微技术 |
| 第3章 早老素古菌同源蛋白PSH的生化研究 |
| 3.1 PSH酶切反应体系的建立 |
| 3.1.1 PSH蛋白酶的表达与纯化 |
| 3.1.2 酶切底物APP C99 的序列设计 |
| 3.1.3 酶切底物APP C99 的表达与纯化 |
| 3.1.4 PSH具有切割APP C99 的γ-分泌酶活性 |
| 3.2 PSH在底物APP C99 上酶切位点的鉴定 |
| 3.2.1 PSH在底物APP C99 上的第一步切割位点 |
| 3.2.2 PSH在底物APP C99 上的最终切割位点 |
| 3.3 PSH与γ-分泌酶切割偏好性的比较研究 |
| 3.3.1 γ-分泌酶的表达与纯化 |
| 3.3.2 AlphLISA检测体系的建立 |
| 3.3.3 γ-分泌酶活性调节剂对PSH活性的调节 |
| 3.4 PSH上对应致病突变对酶切结果的影响 |
| 3.4.1 保守突变位点的选取 |
| 3.4.2 突变体蛋白的酶切结果比较 |
| 3.5 结合γ-分泌酶抑制剂JC-1的PSH晶体结构 |
| 3.5.1 抑制剂的筛选 |
| 3.5.2 PSH与抑制剂JC-1 的共结晶 |
| 3.5.3 JC-1 电子密度的确证 |
| 3.5.4 JC-1对PSH活性抑制的机制 |
| 3.6 结果小结 |
| 第4章 早老素相互作用蛋白的鉴定 |
| 4.1 早老素全长蛋白PS1 的纯化及质谱鉴定 |
| 4.1.1 PS1 蛋白的单独表达纯化 |
| 4.1.2 质谱结果的分析 |
| 4.1.3 潜在相互作用蛋白BI1 简介 |
| 4.2 PS1与BI1 的相互作用验证 |
| 4.2.1 PS1与BI1 在细胞内分布的一致性 |
| 4.2.2 PS1与BI1 的免疫共沉淀检测 |
| 4.2.3 基于分子筛检测PS1与BI1 在体外的相互作用 |
| 4.3 PS1-BI1 复合物的活性检测 |
| 4.3.1 PS1-BI1 的表达与纯化 |
| 4.3.2 体外条件下的PS1-BI1 不具备γ-分泌酶活性 |
| 4.3.3 单独BI1 蛋白的表达与纯化 |
| 4.3.4 BI1 对γ-分泌酶活性的影响 |
| 4.4 PS1与BI1 相互作用的生化特征 |
| 4.4.1 γ-分泌酶中的PS1 不能免疫共沉淀BI |
| 4.4.2 γ-分泌酶中的PS1与BI1 在细胞内具有不同的定位 |
| 4.4.3 若干PS1 上突变位点对PS1-BI1 相互作用影响的检测 |
| 4.4.4 PS2 能够免疫共沉淀BI |
| 4.4.5 PS1-BI1 样品的负染电镜观察 |
| 4.5 结果小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 早老素古菌同源蛋白PSH生化研究的总结及展望 |
| 5.2 早老素相互作用蛋白鉴定的总结及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（8）家蚕二分浓核病毒基因中特征性加尾序列的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 家蚕二分浓核病毒的研究概况 |
| 1.2 家蚕二分浓核病毒基因组VD1的结构特点 |
| 1.3 多聚腺苷酸化的研究 |
| 1.3.1 多聚腺苷酸化的形成过程 |
| 1.3.2 多聚腺苷酸化的调控机制 |
| 1.3.3 多聚腺苷酸化的生物学功能 |
| 1.4 多聚腺苷酸化信号的应用 |
| 1.5 立题依据及意义 |
| 1.6 主要研究内容及技术路线 |
| 1.6.1 研究内容 |
| 1.6.2 技术路线 |
| 第二章 BDVpA对可视化蛋白表达的影响 |
| 2.1 材料和试剂 |
| 2.1.1 菌株、质粒及细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂和溶液的配制 |
| 2.1.3 实验中所用的仪器设备 |
| 2.2 BDVpA序列分析与实验构思 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 外源gfp瞬时质粒的构建及鉴定 |
| 2.3.2 感受态的制备及转化 |
| 2.3.3 昆虫细胞的培养 |
| 2.3.4 昆虫细胞的转染与观察 |
| 2.4 结果及分析 |
| 2.4.1 外源gfp瞬时表达质粒 |
| 2.4.2 BDVpA对GFP表达的影响 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 第三章 BDVpA对荧光素酶表达的影响 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 菌株、质粒及细胞系 |
| 3.1.2 主要试剂和溶液的配制 |
| 3.1.3 实验中所用的仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 荧光素报告质粒的构建及鉴定 |
| 3.2.2 昆虫细胞的共转染 |
| 3.2.3 双荧光素酶活性的检测 |
| 3.3 结果及分析 |
| 3.3.1 评估BDVpA活性的报告质粒 |
| 3.3.2 BDVpA在不同启动子调控下的活性 |
| 3.3.3 BDVpA在不同细胞系中的活性 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第四章 BDVpA对转录水平的调控 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 菌株、质粒及细胞系 |
| 4.1.2 主要试剂和溶液的配制 |
| 4.1.3 实验中所用的仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 荧光定量PCR引物的设计及合成 |
| 4.2.2 昆虫细胞的转染 |
| 4.2.3 转染细胞总RNA的提取 |
| 4.2.4 转染细胞cDNA的合成 |
| 4.2.5 cDNA的real-timeqPCR反应 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.3.1 转染细胞总RNA的鉴定 |
| 4.3.2 不同细胞系中BDVpA对转录水平的影响 |
| 4.3.3 不同启动子调控下BDVpA对转录水平的影响 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第五章 BDVpA核心功能区域的鉴定 |
| 5.1 材料和试剂 |
| 5.1.1 菌株、质粒及细胞系 |
| 5.1.2 主要试剂和溶液的配制 |
| 5.1.3 实验中所用的仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 不同长度BDVpA报告质粒的构建及鉴定 |
| 5.2.2 昆虫细胞的共转染 |
| 5.2.3 双荧光素酶活性的检测 |
| 5.3 结果及分析 |
| 5.3.1 包含特征性序列且长度不同的BDVpA报告质粒 |
| 5.3.2 不同长度的BDVpA在不同细胞系中的活性 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 主要总结 |
| 6.2 工作展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 参与的研究项目 |
（9）赖氨酸巴豆酰化修饰：转移酶鉴定、功能及其与H3K4甲基化之间的交互调控研究（论文提纲范文）
| 内容摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 表观遗传学 |
| 1.1.1 组蛋白修饰及染色质重塑 |
| 1.2 赖氨酸甲基化修饰 |
| 1.2.1 赖氨酸甲基转移酶及其功能 |
| 1.2.2 赖氨酸去甲基化酶及其功能 |
| 1.2.3 赖氨酸甲基化识别蛋白及功能 |
| 1.3 赖氨酸乙酰化修饰 |
| 1.3.1 赖氨酸乙酰转移酶及其功能 |
| 1.3.2 赖氨酸去乙酰化酶及其功能 |
| 1.3.3 赖氨酸乙酰化识别蛋白及功能 |
| 1.4 赖氨酸脂肪酰化 |
| 1.4.1 赖氨酸脂肪酰化催化酶研究现状 |
| 1.4.2 赖氨酸脂肪酰化识别蛋白及功能 |
| 1.5 组蛋白修饰交互调控 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 赖氨酸巴豆酰转移酶鉴定及其转录功能研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 赖氨酸巴豆酰化在细胞内的特征 |
| 3.2.2 赖氨酸巴豆酰化动态变化及可能参与的生物学过程 |
| 3.2.3 过表达CBP/p300和MOF显着增加细胞内巴豆酰化水平 |
| 3.2.4 CBP/p300和MOF利用相同酶活中心催化乙酰化和巴豆酰化 |
| 3.2.5 p300-HAT能在体外催化巴豆酰化反应 |
| 3.2.6 敲低或抑制CBP/p300和MOF降低细胞内巴豆酰化修饰 |
| 3.2.7 酵母中MOF同源的乙酰化酶Esa1是酵母的巴豆酰转移酶 |
| 3.2.8 CBP-I1432G/p300-I1395G突变体具有偏向性酶活 |
| 3.2.9 CBP-I1432G/p300-I1395G突变体体外酶活 |
| 3.2.10 利用荧光素酶报告基因检测CBP/p300突变体转录共激活能力 |
| 3.2.11 在TGF-β通路中p300-I1395G转录激活并招募巴豆酰化识别蛋白 |
| 3.3 总结与讨论 |
| 第四章 组蛋白赖氨酸脂肪酰化和H3K4甲基化交互调控研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 脂肪酰化多肽pulldown鉴定结合蛋白 |
| 4.2.2 WDR5结合组蛋白修饰位点的特异性 |
| 4.2.3 WDR5可能通过特殊模式识别组蛋白脂肪酰化修饰 |
| 4.2.4 细胞内乙酰化对H3K4甲基化维持所必须 |
| 4.2.5 体外酶促反应 |
| 4.3 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）基于表位定向哺乳动物细胞抗体库筛选新型抗PD-1抗体（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 哺乳动物细胞抗体展示系统及抗体表达系统的建立 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 表达载体的设计、构建与鉴定 |
| 2.2 哺乳动物细胞展示系统的验证 |
| 2.3 全长抗体表达系统功能验证 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二部分 靶向PD-1 哺乳动物细胞抗体库的构建及筛选 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 PD-1 与PD-L1相互作用复合物空间结构 |
| 2.2 抗PD-1 抗体Nivolumab可变区特征分析 |
| 2.3 虚拟抗体库的设计 |
| 2.4 哺乳动物细胞抗体库的构建 |
| 2.5 哺乳动物细胞抗体库的筛选及抗体序列分析 |
| 2.6 抗PD-1 新抗体功能初步鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三部分 FV78抗体生物学活性评价 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 FV78抗体表达、纯化及鉴定 |
| 2.2 FV78抗体的功能鉴定 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 附录1 重组抗蓖麻毒素人源化单克隆抗体注射液（MIL50） |
| 1. 本人完成的工作 |
| 1.1 4C13药效学研究 |
| 1.2 C4C13亲和力成熟和稳定性改造 |
| 1.3 MIL50体内、外药效学研究 |
| 1.4 MIL50稳定性研究 |
| 1.5 临床申报资料的撰写 |
| 2. 阶段性成果 |
| 2.1 文章 |
| 2.2 专利 |
| 2.3 临床批件 |
| 3. 参考文献 |
| 附录2 重组抗埃博拉病毒单克隆抗体联合注射液（MIL77） |
| 1. 本人完成的工作 |
| 1.1 MIL77体外药效学研究 |
| 1.2 MIL77稳定性研究 |
| 1.3 MIL77临床申报资料撰写 |
| 1.4 埃博拉抗体优化组合 |
| 2. 阶段性成果 |
| 2.1 文章 |
| 2.2 临床批件 |
| 3. 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
四、人源化BPVL1-GFP融合基因的构建以及在哺乳动物细胞中的瞬时表达（论文参考文献）
- [1]抗猫细小病毒基因工程嵌合抗体的表达与初步鉴定[D]. 王文静. 中国农业科学院, 2021
- [2]高致病冠状病毒纳米抗体的构建与中和机制研究[D]. 李江凡. 军事科学院, 2021(02)
- [3]胃部SIDT1介导外源性microRNA吸收的机制[D]. 张范. 南京大学, 2020(12)
- [4]HPV16治疗性mRNA纳米疫苗的制备及免疫原性研究[D]. 周茜. 北京化工大学, 2019(06)
- [5]离子通道ASIC1a的膜表面标记与可视化研究[D]. 宋兴磊. 上海交通大学, 2019(01)
- [6]抗流感病毒PB2蛋白单链抗体的表达及其活性检测[D]. 刘敏. 湖北大学, 2019(05)
- [7]早老素及其古菌同源蛋白的生化研究与相互作用蛋白鉴定[D]. 吴申杰. 清华大学, 2018(04)
- [8]家蚕二分浓核病毒基因中特征性加尾序列的研究[D]. 王梅子. 江苏大学, 2017(05)
- [9]赖氨酸巴豆酰化修饰：转移酶鉴定、功能及其与H3K4甲基化之间的交互调控研究[D]. 刘晓光. 华东师范大学, 2017(05)
- [10]基于表位定向哺乳动物细胞抗体库筛选新型抗PD-1抗体[D]. 罗龙龙. 中国人民解放军军事医学科学院, 2016(08)