一、肝癌和肝硬化组织中凋亡信号蛋白的表达（论文文献综述）
石怡[1]（2021）在《PTEN相关ceRNA网络的构建及肝癌发病机制的初步研究》文中提出肝细胞癌（HCC）的恶性程度高,发病率高且存活率低,是全球范围内与癌症相关的死亡的主要原因之一。但是,肝癌发生的背后机制尚不是非常清楚。大量研究表明竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络在许多人类癌症的多种生物学过程中发挥关键作用。因此筛选ceRNA调控网络并研究其作用机制,对HCC的诊断和预后具有重要意义。在本研究中,利用生物信息学筛选出与磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）相关的ceRNA调控网络。通过相关性分析、Cox回归分析鉴定出HCC临床预后模型,并且利用免疫组化实验进行验证。运用甲基化分析和免疫浸润分析探讨预后模型在肝癌的发生和发展过程中的分子机制,为肝癌发生机制研究提供了新的方向和策略。具体研究内容如下:1.从TCGA数据库获得mRNA,lncRNA和miRNA的表达谱。总共在HCC样品和邻近的正常样品中筛选出3371个DElncRNA,422个DEmiRNA和8294个DEmRNA,而在PTENhigh和PTENlow表达的HCC样品之间鉴定出860个DElncRNA,54个DEmiRNA和1871个DEmRNA。然后,通过计算机分析将总共5个DElncRNA,4个DEmiRNA和372个DEmRNA纳入InRNA-miRNA-mRNA三重调控网络。此外,利用Cytoscape插件cytohubba,基于得分>2,筛选出三重调控网络中的十三个关键RNA。最后,通过生物信息学分析获得了与肝癌预后有关的DLEU2L-hsa-miR-100-5p/hsa-miR-99a-5p-TAOK1过度表达的ceRNA网络。2.通过相关性分析在ceRNA调控网络中鉴定了DLEU2L/TAOK1轴,并且利用Cox回归分析表明DLEU2L/TAOK1轴可能是肝癌临床应用中潜在的预后模型。运用GEO数据库和免疫组化实验对预后模型DLEU2L/TAOK1轴中的TAOK1进一步数据分析和实验验证,结果发现相比于正常组织,TAOK1在肝癌组织中高表达,与前面分析结果一致。3.甲基化分析表明DLEU2L/TAOK1轴异常上调可能是由于甲基化不足引起的。免疫浸润分析表明,DLEU2L/TAOK1轴可能对肿瘤免疫微环境的变化和肝癌的发展有影响。当前的研究构建了基于ceRNA的DLEU2L/TAOK1轴,可能是与HCC诊断和预后相关的新型重要预后因素。
陈凯[2]（2021）在《miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究》文中研究表明一、研究背景肝细胞性肝癌（HCC）是世界范围内最常见恶性肿瘤之一,目前在最致命肿瘤中致死率排名第二。在过去的几十年,针对肝癌已经有了众多治疗手段,如精准的肝段切除术,肝移植术,肝动脉栓塞化疗及肝癌射频消融术等,但是肝癌患者的预后仍然不令人满意,据统计,肝癌患者5年总生存率低于20%。肝癌起病隐匿,肿瘤进展快,容易复发和肝内转移都是导致肝癌预后较差的可能原因。因此,探究肝癌进展,转移的分子学机制有利于寻找潜在的肝癌治疗分子靶点,开发可能的早期肝癌诊断标志物对肝癌的系统治疗非常重要。微小RNA（miRNA）是以由一类进化保守的,由约22个核苷酸组成的非编码小RNA,微小RNA可结合在靶基因信使RNA（m RNA）的3?端的非翻译区（UTR区）通过降解信使RNA或抑制信使RNA翻译的方式发挥转录后调控作用。研究显示微小RNA几乎参与了肿瘤细胞发生发展的全部过程,包括细胞的干性,肿瘤发生,细胞的增殖,细胞的凋亡,细胞的迁移和侵袭,细胞的转移等等。也有越来越多的研究显示各种肿瘤中均有不同微小RNA的异常表达,包括肝癌。例如,miR-876被发现在胆管癌（CCA）中表达降低,并能通过抑制BCL-XL的表达诱导细胞的增殖;miR-589被发现在肝细胞性肝癌中表达增高并能通过STAT3信号通路来促进细胞的干性和化疗抵抗。然而,在肝细胞性肝癌中异常表达和对诊断或者预后有指示作用的miRNA仍然缺乏有待进一步研究。骨膜蛋白（POSTN）,也称为成骨细胞特异性因子2,是一大小为93.3k Da的细胞外基质（ECM）蛋白。POSTN能通过和众多其他蛋白如纤维结合蛋白,胶原蛋白及腱生蛋白等互相联系进而对细胞外基质进行改造。POSTN对胶原纤维的发生,细胞粘附,细胞迁移和上皮间质转换等都有重要作用。目前研究发现多种肿瘤中亦有POSTN的异常表达,包括头颈部肿瘤,肺癌,神经纤维瘤,乳腺癌,结直肠肿瘤及肝细胞性肝癌等,对肿瘤细胞的生存,上皮间质转换,血管生成和肿瘤微环境的形成都有重要作用。例如:研究发现胰腺癌细胞能刺激间质细胞分泌POSTN,进而促进肿瘤基质成绩和上皮间质转化进而促进肿瘤进展。然后,在肝细胞性肝癌中POSTN的表达及调控机制的研究尚少,有待进一步研究。在本文中,我们通过对TCGA数据库中异常表达的miRNA进行筛选,鉴定出了一异常表达的miRNA,即miR-876。我们还进一步探求了其细胞功能和对下游靶基因的调节机制。我们还在众多临床肝细胞性肝癌的临床组织标本中监测了miR-876和其靶基因POSTN的表达,分析了他们的表达和肝细胞性肝癌患者的临床病理参数和预后的关系。我们的研究提示miR-876及POSTN在肝细胞性肝癌中异常表达,可能作为一潜在的诊断性分子标志物和治疗靶点。二、研究方法1.分析49对肝癌及对应的癌旁样本的TCGA数据库,分析异常表达的miRNA,筛选出表达差异倍数最高的前20个微小RNA。2.收集了从2006年到2010年在西南医院肝胆科因患原发性肝细胞性肝癌而行原发性肝癌切除术的共计127例患者的组织样本,本研究说包含的所有病人术前均未接收放疗或者化疗。所有患者术后均定期性影像学（即超声或CT）即血液AFP检测。本研究团队及西南医院临床研究中心完成患者的预后随访,随访为结合到我院复查情况,定期（每2-3月）电话随访。3.采用实时定量PCR的方法检测了肝癌组织样本中miR-876和POSTN的表达水平;采用免疫组化（IHC）方法在原发性肝细胞性肝癌组织样本中检测了样本中POSTN及EMT标志物（E钙粘蛋白,N钙粘蛋白,波形蛋白）的表达情况,并在肝癌合并肝硬化样本中检测了POSTN的表达。4.采用Kaplan-Meier曲线分析（单因素）和Cox回归（多因素）方法分析了影响HCC患者预后的危险因素及独立危险因素,并进一步分析了miR-876和POSTN共表达对HCC预后的影响。5.采用了生物信息学及双荧光素酶报告基因实验研究了miR-876可能的调控靶基因,并进一步采用实时定量PCR及Western Blotting（WB）方法进行验证。6.Mi R-876的具体体内生物学行为在裸鼠实验中进行检测,最终成瘤效果以活体成像方式进行检测验证。7.采用WB方法分析了miR-876的表达对EMT标志物的影响,并在人肝星状细胞系LX-2中检测了纤维化蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,胶原蛋白-I的表达。采用transwell小室侵袭实验研究了miR-876对肝癌细胞系的侵袭能力的影响。三、研究结果1.通过对49对肝癌患者的TCGA数据库进行分析,我们筛选出了表达差异倍数排名前20的高表达及低表达miRNA,进一步筛选鉴定出miR-876。2.我们发现miR-876在肝癌细胞系及肝癌组织中低表达。首先,我们发现miR-876在人正常肝细胞系L02中表达高,而在肝癌细胞系SMMC-7721,Hep G2,Huh-7及HCC-LM3中表达较低;接下来我们在50对肝癌及癌旁样本中检测了miR-876的表达,发现miR-876在肝癌组织/癌旁组织的比率62%有降低,16%变化不明显,而仅有22%表达升高。3.miR-876的低表达和肝硬化、癌栓及肝癌TNM分期相关。我们在127例HCC组织样本中检测了miR-876的表达,分析了其表达水平和HCC患者临床病理参数的相关性。发现miR-876的表达和肝硬化（P=0.026）、肝癌癌栓形成（P=0.031）及TNM分期（P=0.021）相关。而和其他病理参数,如患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数量、乙肝、AFP水平、肝Child分级未发现显着相关性。我们还进一步在肝硬化及癌栓患者中检测了miR-876的表达水平,发现miR-876在肝硬化组织样本中表达较非肝硬化患者显着低（P=0.0294）,而其在有肝癌癌栓患者中表达亦显着低（P=0.0367）。4.miR-876抑制细胞侵袭、EMT及细胞纤维化。我们通过构建了miR-876过表达及干扰细胞株,通过transwell细胞侵袭实验发现过表达miR-876的肝癌细胞侵袭力减弱,而干扰miR-876后侵袭力增强,进一步通过WB实验发现过表达miR-876后N-钙粘蛋白及波形蛋白表达减弱,而干扰miR-876后E-钙粘蛋白表达亦减弱。在人星状细胞系LX-2中干扰miR-876表达后发现α-SMA及胶原蛋白-I表达减弱。5.miR-876靶向POSTN,并抑制其表达。我们通过生物信息学分析发现POSTN的3?UTR存在2个能与miR-876种子区结合的序列,进一步双荧光素酶报告基因实验发现野生型p GL3 POSTN荧光素酶质粒和miR-876共转染入293细胞后其萤火虫荧光信号/海肾荧光素酶荧光信号比值显着性降低,进一步WB实验证实当干扰miR-876后HCC细胞POSTN表达升高,而过表达组POSTN显着降低。我们进一步在127例肝癌临床组织标本中同时检测了miR-876和POSTN的表达,发现两者表达呈显着负相关,R值为-0.477,相关线性方程为y=-0.486x+0.394。6.miR-876通过POSTN抑制EMT及细胞纤维化。首先,我们发现过表达POSTN的肝癌细胞侵袭力增强,并促进了EMT标志物及纤维化标志物的表达。其次,我们在过表达POSTN的基础上转染了miR-876,发现共转染miR-876后抵消了侵袭力增加及EMT及纤维化标志物蛋白的表达。7.miR-876在体内动物实验下减弱HCC细胞肿瘤成瘤能力及抑制肿瘤进展。HCC细胞其miR-876过表达的HCC细胞被注入裸鼠肝包膜下,进行动物实验,1月后行活体成像检测,我们发现对照组（无干预的HCC细胞）成瘤数量多,活体成像荧光强度强,而实验组行miR-876过表达后,裸鼠原位肝脏成瘤明显减少,活体检测荧光信号弱,表明在体内实验条件下,miR-876能抑制HCC的成瘤及肿瘤进展。8.POSTN和肝组织EMT及肝硬化相关。我们进一步在127例肝癌组织中检测了POSTN的表达,发现同miR-876类似,POSTN表达和肿瘤数量、肝硬化、肝癌癌栓形成及TNM分期相关,而和其他临床标识物未发现明显相关性,进一步非参数检验验证了肝硬化或肿瘤癌栓组HCC患者的POSTN表达明显增高。IHC实验发现POSTN主要表达与肝癌间质,部分肝癌细胞亦有表达,POSTN高表达的样本N钙粘蛋白及波形蛋白表达增高,而E钙粘蛋白表达降低。而在肝癌伴肝硬化标本中发现POSTN亦有强表达。9.miR-876和POSTN和肝癌患者术后预后相关。进一步KM单因素生存分析发现肿瘤大小（P=0.037）、肝硬化（P=0.041）、肝癌癌栓状态（P=<0.01）、TNM分期（P=0.001）、miR-876低表达（P=0.022）及POSTN高表达（P=0.012）均是影响HCC患者预后的危险因素,多因素回归分析发现肝癌癌栓（风险比=2.530,95%CI区间=1.433-4.468,P=0.001）及POSTN的表达（风险比=1.717,95%CI区间=1.008-2.926,P=0.047）是影响肝癌预后的独立危险因素。进一步共表达分析提示miR-876低表达和POSTN高表达的HCC患者预后较之于miR-876低表达和POSTN高表达更差。四、研究结论综上所述,我们从公开的TCGA数据库中鉴定出了肝癌中一显着性低表达的miRNA,即miR-876。并探索了其对细胞的功能,即能抑制细胞侵袭,EMT和纤维化。而miR-876这些功能是通过调控POSTN的表达实现的。miR-876在体内动物实验下能抑制肝癌的成瘤及进展;我们还在众多肝癌临床标本中从m RNA及蛋白水平证明了miR-876和POSTN的异常表达和肝癌的EMT水平,纤维化水平及进展相关,而miR-876和POSTN的异常表达和HCC的预后相关,而联合miR-876和POSTN检测可能更好预测HCC的预后以及作为潜在的治疗靶点。
叶善平[3]（2021）在《miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究》文中研究说明背景:肝癌是国内外严重威胁人类健康的主要癌症之一,其发病率和死亡率在全球所有恶性肿瘤中排第六和第四,其中肝细胞性肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）占原发性肝癌的75%-85%,世界范围内每年可致75万患者死亡。HCC的发病率具有较大的地域异质性,大约有85%的HCC发生在发展中国家和欠发达地区,而其中有50%发生在中国。早期肝癌预后较好,但多数患者在首诊时已处于进展期,而这部分患者的发病率和死亡率比值接近100%。尽管近些年来HCC的治疗取得了一定的进展,但高复发率和高转移率使其预后仍不理想。因此,研究HCC的诱发因素及影响HCC侵袭和转移的过程,进而寻找肝癌的预后生物标记物及潜在治疗靶标是当下重要研究领域。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的,短而高度保守,长度约为18-25个核苷酸的小RNA,呈单链状,不能编码蛋白质,在有核生物中表达较广。miRNA在体内主要起调控作用,通过与m RNA的3’端非编码序列发生碱基配对而起抑制作用,从而实现在转录后阶段调控基因表达。自从第一个miRNA被报道以后,陆续发现并研究了许多miRNA,但对于理解肿瘤发生发展的机制仍是冰山一角。许多研究表明miRNAs与HCC的起病、侵袭、转移及预后关系紧密。其中部分miRNAs在HCC中高表达,起着癌基因的作用,部分miRNAs在HCC中低表达,起着抑癌基因的作用。miR-557是近年来新发现的miRNA,它在胰腺癌、三阴乳腺癌、肺癌中均呈低表达,作为肿瘤抑制基因参与肿瘤侵袭、转移等多种生物学过程的调控。而miR-557在肝癌中的生物学功能尚不清楚。我们首先通过生物学信息学发现miR-557在肝癌中低表达。因此,我们推测miR-557在肝癌的起病和进展中存在重要影响,其在肝癌中的功能和分子机制有待深入探索。据此,本课题首先检测了miR-557在肝癌组织及不同肝癌细胞中的表达水平,分析其与HCC患者临床病理参数及生存的关系;然后运用体内体外实验研究了miR-557对肝癌细胞株生物学行为的影响;再通过生物信息学预测并在实验中验证了miR-557通过靶向抑制RAB10的表达而影响肝癌细胞增殖、体内成瘤、迁移、侵袭、上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）、克隆形成的能力和影响细胞周期的分布;Wnt/β-catenin信号通路是HCC起病发展中极为重要的一条途径,研究表明许多miRNA影响HCC进展是通过Wnt/β-catenin信号途径实现的,最后我们初步探讨了miR-557能否调控Wnt/β-catenin信号途径。本研究具体包括以下三部分:第一部分:miR-557在HCC中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系;第二部分:探讨miR-557对肝癌细胞体内外生物学行为的影响;第三部分:miR-557通过靶向RAB10抑制Wnt/β-catenin信号的研究。第一部分:miR-557在HCC中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系目的:探讨miR-557在肝癌中的表达水平及其与患者临床病理特征及预后的关系。方法:1、生物信息学分析miR-557在HCC瘤组织中的表达。2、运用实时荧光定量PCR（Real Time Quantitative PCR,RT-qPCR）检测肝癌组织及对应癌旁非瘤组织中miR-557的表达水平。3、分析miR-557表达水平与HCC患者临床病理参数及生存之间的关系。4、运用RT-qPCR检测HCC细胞株和人正常肝细胞L02中miR-557的表达水平。结果:1、生物信息学分析GSE108724数据集发现,与癌旁非肿瘤组织相比,miR-557在HCC中低表达;分析GSE26323数据集发现,与原位HCC相比,肺转移性HCC中miR-557表达水平更低。2、miR-557在HCC瘤组织中的表达水平显着低于配对的癌旁非瘤组织。3、34例HCC组织标本中,miR-557在低分化患者中的表达水平低于中高分化患者,在>5cm的HCC患者中的表达水平低于≤5cm的HCC患者,在TNM III/IV的HCC患者中的表达水平低于I/II期HCC的患者,在低分化的HCC患者中的表达水平低于高中分化的HCC患者;miR-557低表达的HCC患者的总生存时间更短。4、相比正常肝细胞L02,miR-557在肝癌细胞株MHCC-97H、MHCC-97L、Huh7、Hep G2、SMMC-7721中表达均下调,其中MHCC-97H细胞表达最低,Huh7细胞表达最高。结论:miR-557在肝癌组织及细胞系中均呈低表达,且与患者恶性生物学特征及不良的预后显着相关。第二部分:探讨miR-557对肝癌细胞体内外生物学行为的影响目的:探讨干扰或促进miR-557的表达是否影响肝癌细胞的生物学行为。方法:1、在体外运用miR-557 mimics/mimic-NC或慢病毒Lv-miR-557/Lv-vector转染MHCC-97H细胞,运用inhibitors/inhibitor-NC或Lv-sponge-miR-557/Lvsponge-NC转染Huh7细胞,并用RT-qPCR验证转染效率。2、CCK-8实验、细胞克隆形成实验检测miR-557对HCC细胞增殖潜能的影响;划痕实验、Transwell实验检测miR-557对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响。3、RT-qPCR及蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测miR-557对HCC细胞上皮间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）的影响。4、运用流式细胞仪检测miR-557对HCC细胞周期分布的影响。5、裸鼠皮下成瘤实验检测miR-557对HCC细胞体内成瘤潜能的影响。结果:1、运用miR-557 mimics或Lv-miR-557可以显着升高MHCC-97H细胞中miR-557的表达水平,运用inhibitors或Lv-sponge-miR-557可以显着降低Huh7细胞中miR-557的表达水平,细胞可用于下一步实验。2、CCK-8实验、细胞克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验表明,上调miR-557表达后可抑制MHCC-97H细胞的增殖、迁移和侵袭能力,下调miR-557表达后可促进Huh7细胞的增殖、迁移和侵袭能力。3、与NC组相比,上调miR-557的表达水平后可增加MHCC-97H细胞中E-cadherin的表达而减少N-cadherin和Vimentin的表达;下调Huh7细胞miR-557的表达水平后则出现相反的结果。4、细胞周期实验表明,上调miR-557表达后可使MHCC-97H细胞的细胞周期阻滞在G0/G1期;下调miR-557可促使Huh7细胞的细胞周期从G0/G1向G2/M过渡。5、体内实验表明,上调miR-557表达后会抑制MHCC-97H细胞在裸鼠皮下成瘤的能力;下调miR-557后使得Huh7细胞的裸鼠皮下成瘤能力进一步加强。结论:上调miR-557的表达会抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭、上皮间充质转化、体内生长及诱导细胞周期阻滞在G0/G1期。抑制miR-557的表达则呈相反趋势。第三部分:miR-557通过靶向RAB10抑制Wnt/β-catenin信号的研究目的:探讨miR-557在肝癌中的潜在作用机制及下游信号通路。方法:1、通过在线生物信息学软件Targetscan、miRDB、mi Walk和miRTar Base初步预测了miR-557的靶基因。2、双荧光素酶基因报告实验验证miR-557与RAB10的靶向调控关系。3、在上调miR-557表达的MHCC-97H细胞和下调miR-557表达的Huh7细胞中,运用RT-qPCR和WB实验检测RAB10在m RNA和蛋白表达水平的变化。4、免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）检测肝癌组织及癌旁组织中RAB10蛋白的表达水平,RT-qPCR检测34例HCC患者癌组织和配对癌旁非瘤组织中RAB10 m RNA的表达水平,并分析与miR-557的相关性。5、共转染miR-557 mimics+pc DNA3.1-RAB10或miR-557 inhibitors+si RAB10,分析促进/干扰RAB10的表达能否逆转miR-557 mimics/inhibitors对HCC细胞生物学行为的影响。6、在上调miR-557表达的MHCC-97H细胞和下调miR-557表达的Huh7细胞中,运用WB实验检测Wnt/β-catenin信号通路中重要分子GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin、Non-p-β-catenin的变化。7、共转染miR-557 mimics+pc DNA3.1-RAB10或miR-557 inhibitors+si RAB10,运用WB实验检测Wnt/β-catenin信号通路中重要分子GSK-3β、pGSK-3β、β-catenin、Non-p-β-catenin的变化。结果:1、通过生物信息学软件Targetscan、miRDB、mi Walk和miRTar Base初步预测miR-557的靶基因为RAB10。2、双荧光素酶基因报告实验验证了miR-557能够靶向抑制RAB10的表达3、RT-qPCR检测miR-557表达上调的MHCC-97H细胞和miR-557表达下调的Huh7细胞中潜在靶基因的变化,其中RAB10变化显着,WB实验验证了RAB10的变化。4、IHC检测了34例HCC患者癌组织和配对癌旁非瘤组织中RAB10的表达水平,结果提示癌组织中RAB10的表达水平高于癌旁非瘤组织;RT-qPCR得出同样的结果,并与miR-557呈负相关。5、促进/干扰RAB10的表达能部分逆转miR-557 mimics/inhibitors对HCC细胞生物学行为的影响。6、上调miR-557的表达可减少GSK-3β磷酸化、增加β-catenin磷酸化和减少Non-p-β-catenin入核,从而抑制Wnt/β-catenin信号;下调miR-557的表达则出现相反的结果;促进/干扰RAB10的表达能部分逆转miR-557mimics/inhibitors对HCC中Wnt/β-catenin信号的影响。结论:miR-557通过靶向抑制RAB10的表达来调节Wnt/β-catenin信号通路的活性进而影响肝癌细胞的生物学行为。
周祥[4]（2021）在《TEM1通过GAS6/AXL通路调控肝纤维化的机制研究》文中指出肝纤维化是威胁人类生命健康的重大疾病之一,尤其在发展中国家的发病率更高。肝纤维化是是由酗酒、肥胖及病毒等各种致病因素引起的肝结缔组织增生的病理生理过程,主要表现为肝脏纤维瘢痕的产生和胶原沉积。若得不到有效抑制,肝纤维化会进展为肝硬化,并进一步发展为肝癌。因此,探索肝纤维化的发生发展机制以及研发抑制肝纤维化的治疗策略为当务之急。肿瘤内皮标志物1（TEM1）是在纤维化疾病中特异性高表达的膜蛋白,其在成纤维细胞中的高表达可促进纤维化疾病的发生发展。生长阻滞特异性基因6（GAS6）在肝纤维化进展中发挥重要作用,然而其表达调控机制不清。在本研究中,我们在前期发现TEM1可调控GAS6表达的基础上,深入探讨TEM1调控GAS6表达的分子机制,进一步明确TEM1在肝纤维化进展中的作用,并检测TEM1抗体IgG78对成纤维细胞生物学特性的影响及其用于治疗小鼠肝纤维化的效果,为肝纤维化的诊断和治疗提供潜在的靶点和策略。方法:（1）利用包含正常人肝组织和肝纤维化相关疾病（肝炎及肝硬化）的组织芯片,通过免疫组化染色检测TEM1的表达情况,并分析其与疾病严重程度的相关性。利用CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型,通过qRT-PCR和Western blot检测肝组织中TEM1的表达,并通过免疫荧光双染色分析TEM1是否表达于肝星状细胞。（2）在成纤维细胞中下调TEM1的表达,利用qRT-PCR和Western blot在m RNA和蛋白水平验证TEM1对STAT6和GAS6的调控作用。在成纤维细胞中下调STAT6的表达,检测其对GAS6表达的调控作用;利用双荧光素酶报告基因实验检测STAT6是否可结合于GAS6启动子并诱导其表达。在成纤维细胞中过表达或下调TEM1的表达,检测其对α-SMA表达的影响,明确TEM1在肝纤维化中的作用。在成纤维细胞中下调TEM1或GAS6的表达,利用Transwell实验检测其对细胞迁移的影响。（3）利用针对TEM1的人源性全抗体IgG78处理成纤维细胞,利用CCK8染色实验检测细胞增殖,利用Transwell实验检测细胞迁移,利用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,并利用Western blot检测TEM1、GAS6及纤维化相关蛋白α-SMA和COL1A1的表达情况。（4）利用IgG78治疗小鼠肝纤维化模型,利用天狼猩红染色和马松染色检测胶原纤维的水平,利用免疫组化染色检测STAT6、GAS6、α-SMA及COL1A1的表达情况。此外,利用ELISA检测血清中GAS6的水平,分析IgG78对肝纤维化的抑制效果并分析可能的分子机制。结果:（1）TEM1在人和小鼠肝纤维化组织中的表达水平高于正常肝组织,且TEM1的阳性表达与肝纤维化的严重程度呈正相关,提示TEM1是肝纤维化的重要标志分子。免疫荧光双染色结果显示TEM1与肝星状细胞的标志物GFAP、α-SMA和Vimentin存在共定位,提示TEM1主要表达于肝星状细胞。（2）在成纤维细胞中下调TEM1的表达,STAT6和GAS6的表达也下调;STAT6可直接结合于GAS6的启动子区而促进其转录;下调STAT6的表达,GAS6的表达也下调。在成纤维细胞中过表达或下调TEM1的表达,α-SMA的表达也相应上调或下调。在成纤维细胞中下调TEM1或GAS6的表达,可显着抑制细胞迁移。（3）使用IgG78处理成纤维细胞,可抑制细胞增殖和迁移,诱导细胞凋亡,引起细胞周期的G1期阻滞,还可抑制成纤维细胞中TEM1、GAS6及纤维化相关蛋白α-SMA和COL1A1的表达。（4）IgG78治疗后,小鼠的肝纤维化程度显着降低;免疫组化染色结果显示IgG78治可有效抑制小鼠肝组织中STAT6、GAS6及纤维化相关蛋白α-SMA和COL1A1的表达。此外,IgG78治疗后小鼠血清中GAS6的水平也明显下降。结论:TEM1在肝纤维化进程中的表达逐渐升高,且TEM1主要表达于肝星状细胞,是肝纤维化发生发展过程中的重要调控分子。TEM1可通过在肝星状细胞中调控STAT6的表达而间接调控GAS6的表达,从而激活GAS6/AXL通路,进而促进成纤维细胞的增殖、迁移和活化。TEM1抗体IgG78可下调成纤维细胞中TEM1的表达,抑制成纤维细胞的增殖、迁移,诱导细胞凋亡,并引起细胞周期的G1期阻滞,并可抑制纤维化相关蛋白α-SMA和COL1A1的表达。IgG78可抑制小鼠的肝纤维化,抑制小鼠肝组织中STAT6、GAS6及纤维化相关蛋白α-SMA和COL1A1的表达,并抑制小鼠血清中GAS6的水平。这些结果进一步明确了TEM1可作为肝纤维化的有效治疗靶点,而TEM1抗体IgG78可作为一种潜在的治疗肝纤维化的候选药物。
孙新锋[5]（2021）在《芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究》文中研究指明背景:原发性肝癌是一个全球性的健康问题,其中90%为肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）,是第二位致死性肿瘤,5年生存率仅为18%,HCC早期可选择肝移植、手术切除或射频消融等根治性治疗,中晚期化疗栓塞/放射栓塞和全身系统治疗是仅存的治疗方法。和大多数肿瘤一样,HCC中存在干性癌细胞,即癌干细胞（cancer stem cell,CSC）,是具有无限增殖和分化潜能的一类特殊细胞群,特别是在HCC的复发转移过程中起着关键作用。癌干细胞标志物是一种特异性的信号分子或蛋白质受体,是利用其鉴定癌干细胞最简单的方法。很多研究表明癌干细胞表面标记物是影响HCC固有耐药性和侵袭转移能力以及调节其干性的关键因素。随着对癌干细胞的深入研究,越来越多的癌干细胞标记物被发现,在体内成瘤实验中确证过,常见的有EpCAM、CD133、CD44及SOX4等癌干细胞表面蛋白,这些标记物在上皮癌变过程中具有一定的促进作用,它的活化和显着表达与肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度呈正相关。最近研究表明,HCC癌干细胞的存在是影响临床疗效导致HCC患者死亡的主要原因之一。中医药是中华民族传统文化与智慧的结晶,具有毒副反应少、多组分、治疗靶点多、减毒增效等特点,能够优化HCC治疗早已形成共识,导师在传承的基础上,创新和发展传统中医宏观气血辨证论治思想,对芪术抗癌方治疗HCC宏观和微观物质基础进行了一系列研究,本方以由黄芪、莪术、炒白术、柴胡、白芍、鸡内金及炙甘草等药物组成。前期临床研观察发现,该方可显着提高HCC患者临床疗效,明显改善生存质量、减少肿瘤的复发和转移并提高患者的生存率。进一步研究发现该方能阻止癌细胞转移、诱导HepG2细胞凋亡、p53蛋白表达及p21细胞周期调控等;并通过调节JNKs信号通路促进HepG2细胞凋亡、阻止裸鼠HCC转移,及逆转TGF-β诱导的肝癌细胞EMT和干性特征减少癌细胞迁移等。故系统深入研究HCC癌干细胞的侵袭转移机制以及寻求新的治疗方法,是提高疗效、改善预后及延长生存率的关键环节。通过对癌干细胞的起源、生物学特征及作用和机制初步的阐述,进一步研究HCC转移和复发机制,探讨中药阻止HCC进展的疗效机制具有重要意义。目的:芪术抗癌方可能会影响癌细胞干性标志物表达从而影响HCC复发和转移;据此,本研究拟在导师前期工作基础上,（1）通过对HCC患者外周血淋巴细胞（PBMC）进行癌干性标志物高通量测序以验证主要干性相关标志物基因及SOX4的表达;（2）建立芪术抗癌方处理HepG2细胞损伤模型,验证芪术抗癌方对肝癌细胞株干性标志物表达的影响。（3）建立肝癌原位小鼠动物模型,验证芪术抗癌方对干性标志EpCAM、CD133、CD44表达和对SOX4基因表达的影响。本研究结果,有望在肿瘤干性标志物方面初步阐释芪术抗癌方阻止HCC进展的疗效作用机制,为中药抗癌制剂的研发和广泛的临床应用提供理论和实验依据。方法:第一部分:收集正常对照人群、HCC患者血液标本,通过PBMC高通量测序及蛋白芯片表达,研究不同分期分级HCC患者之间干性标志及SOX4表达差异,并与正常对照人群进行对比分析。1.经医院伦理委员会批准依据我国《原发性肝癌诊疗规范》（2017年版）选择确诊为肝细胞癌患者,共80例,其中年龄在30岁至70岁之间,平均年龄51.2岁。根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期,80例HCC患者,根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期:其中0期5例,A期21例,B期14例,C期25例,D期15例;为了进一步区分HCC组癌干性基因表达,我们选取了正常对照组,随机入组50例正常人群作为对照组,同时对入组进行统计学分析。2.对入组者进行外周血单个核细胞（PBMC）提取A.使用量约5ml的EDTA抗凝真空采血管进行血液采集,上下颠倒与抗凝剂混合均匀后放入4℃冰箱保存,并在2小时内完成PBMC提取。B.对入组标本进行RNA提取与检测,包括Trizol法提RNA,Thermo试剂盒法进行细胞裂解、RNA萃取、RNA清洗、Elute RNA、RNA检测,对文库构建与质控,库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina 测序。C.数据对比分析:采用Subread软件中的FeatureCounts工具对基因进行表达水平的定量,FeatureCounts主要使用-Q 10-B-C参数,分别过滤掉比对质量值低于10的reads,非成对比对上的reads,比对到基因组多个区域的reads。3.随机抽取36例肝癌患者和对照组血浆标本进行蛋白数据进行分析,包括原始数据归一化,差异蛋白筛选,差异蛋白聚类等基础分析。第二部分:芪术抗癌方体外、体内实验研究1.芪术抗癌方对癌细胞干性标志表达影响的体外肝癌细胞研究通过体外实验,观察芪术抗癌方是否影响TGF-β1诱导的肝癌细胞干性标志物表达。利用TGF-β1诱导Huh7细胞干性表达,加入芪术抗癌方浸提液共培养,Western blot检测癌细胞干性相关蛋白表达水平,验证芪术抗癌方对癌细胞干性标志表达的影响。2.芪术抗癌方对癌细胞干性标志及SOX4基因表达影响的体内肝癌动物模型研究2.1肝癌原位模型造模小鼠肝包膜下种植SMMC7721-luc制备肝癌模型,4周后进行活体成像仪查看荧光情况来确认小鼠是否造模成功。2.2分组用耳标法将30只肝癌模型小鼠和5只空白小鼠进行编号,然后将肝癌模型小鼠随机等量分为5组（肝癌模型组、索拉非尼组、芪术抗癌低剂量、中剂量、高剂量组）。空白小鼠则做为对照组。2.3取材给药30天后用安乐处死小鼠,剪开小鼠腹部皮肤2cm,分离肌肉,取出小鼠肝脏、拍照。然后肝脏和肿瘤备用。2.4 HE染色及免疫组织化学染色2.5 PCR定量检测根据实验说明书从肝脏肿瘤组织中提取的总RNA,以RNA为模板,按照说明书配制逆转录反应体系,总体积为20μl,37℃,60min;98℃,10min,合成cDNA第一链,并收集备用;加入特定引物,在PCR反应条件下:94℃ 2min,94℃ 20s,58℃ 20s,72℃ 20s,40循环。PCR产物的特异性通过熔解曲线分析证实。基因表达相对定量与ΔΔCt方法实现（Ct值）。2.6肝癌组织标本进行Western Blot和免疫组化检测。结果:第一部分:收集健康对照组、肝细胞癌患者血液标本,通过PBMC基因测序及蛋白芯片表达,对比健康对照组与HCC、HCC不同分期组之间干性标志物基因、蛋白及SOX4基因表达。本研究中对纳入的80例HCC患者,根据巴塞罗那肝癌临床分期标准（BCLC）进行分期:其中0期5例,A期21例,B期14例,C期25例,D期15例;同时纳入50例健康人群作为对照组。通过采用RNA-Seq对HCC患者和正常健康对照组外周血淋巴细胞（PBMC）进行高通量测序,及生物信息学方法分析,发现在HCC患者和健康对照者验证队列中,使用qRT-PCR对9个干性基因表达进行验证对比发现,在两者组人群中都存在 CD13、CD24、CD44、CD47、EPCAM、CD133、SOX2、SOX4、CD90等基因表达,并且以CD13、CD24、CD44、CD47、CD133、SOX4表达更显着。对HCC巴塞罗那分期0-B期和C-D期,进一步进行RNA-Seq测序结果分层分析比较,发现在9个癌干性基因表达中,CD13、CD24、CD44、CD47、CD133、SOX4、EpCAM在两组中亦均明显表达,同时发现C-D级较0-B期HCC患者CD133基因表达更为显着,而EpCAM表达0-B期较C-D期患者基因表达有较为明显的表达,同时我们还发现在两组患者中具有同等水平的SOX4的表达。HCC患者和对照组的干性基因表达聚类图进一步分析发现,SOX4基因在HCC组呈现明显的高表达,同样HCC患者PBMC中CD24、CD47、CD13基因表达和健康对照组比较存在显着差异。通过HCC患者血浆蛋白芯片检测,发现HCC患者存在CD44、EpCAM基因高表达。本研究部分,通过RNA-seq技术及血浆芯片蛋白检测技术,确证人PBMC中存在部分干细胞标志物基因表达,通过进一步比较发现,CD133、CD44、EpCAM在肝癌患者中表达明显,且与分期呈现负相关,并发现癌细胞干性调节基因SOX4在HCC患者中高表达,提示,HCC患者PBMC中存在癌干细胞与疾病进展和不良预后相关。第二部分:通过体外、体内实验观察芪术抗癌方对癌干细胞中CD133、CD44、EpCAM及SOX4表达的影响,初步探讨在癌干细胞方面中医药治疗肝癌的作用。1.芪术抗癌方对Huh7肝癌细胞干性标志表达的影响我们体外研究发现,通过对TGF-β1诱导的癌细胞干性标志基因蛋白表达发现,芪术抗癌方干预Huh7肝癌细胞后,能抑制EpCAM和CD133表达,表明该中药复方可以在体外通过抑制癌细胞中EpCAM和CD133干性表达而阻止HCC进展。2.芪术抗癌方对肝癌动物模型癌细胞干性标志及SOX4基因表达的影响EpCAM、CD133、CD44、SOX4等细胞表面蛋白的活化和高表达与肿瘤的活性、侵袭能力和恶性程度呈正相关。我们已对HCC患者PBMC进行了高通量测序研究,发现EpCAM、CD133、CD44、SOX4等干性相关基因,在HCC患者PBMC中表达,及体外实验亦证实了芪术抗癌方可以抑制部分干性标志及SOX4基因表达。由此,我们进行了进一步体内实验研究,验证芪术抗癌方对HCC癌细胞干性标志及SOX4基因表达的影响,初步探索芪术抗癌方阻止HCC进展的疗效机制。我们对实验成功的肝癌原位小鼠动物模型进行分组和处理,并进行PCR、Western Blot及免疫组化染色研究分析,发现芪术抗癌方可以降低癌干细胞EpCAM、CD133和CD44,以及癌细胞干性调节基因SOX4在肝癌肿瘤组织中的表达,并且作用优于索拉菲尼,验证了我们的假设,芪术抗癌方可以通过影响癌细胞干性标志物表达从而阻止HCC进展,其疗效机制可能与调节SOX4基因表达相关。结论:在本研究中,首先通过对临床HCC患者PBMC进行RNA-seq及血浆芯片蛋白检测研究,发现了人PBMC中存在部分干细胞标志物基因表达,通过进一步比较发现,CD133、CD44、EpCAM在肝癌患者中表达明显,且与分期呈现负相关,并发现癌细胞干性调节基因SOX4在HCC患者中高表达,提示,HCC患者PBMC中存在癌干细胞与疾病进展和不良预后相关,而中医药可能通过调节SOX4基因影响干性标志表达。其次,通过体外实验研究发现芪术抗癌方可影响Huh7肝癌细胞中CD133、CD44、EpCAM干性标志表达。最后,我们通过对实验成功的肝癌原位小鼠动物模型进行分组和处理,并进行PCR、Western Blot及免疫组化染色分析研究,发现芪术抗癌方可以降低癌干细胞EpCAM、CD133和CD44,以及癌细胞干性调节基因SOX4在肝癌肿瘤组织中的表达,并且作用优于索拉非尼,验证了我们的假设,芪术抗癌方在体内外实验中能通过影响癌细胞干性标志物表达阻止HCC进展,其疗效机制可能与调节SOX4基因表达相关,为芪术抗癌方进一步深入的疗效机制研究提供了较好的临床及试验证据,为中医药在HCC治疗的临床广泛应用提供了研究依据。
周怡驰[6]（2021）在《柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究》文中研究指明中国是肝病大国,多种肝病高发,肝纤维化作为肝病研究和治疗的重要领域,越来越受到重视。肝纤维化是肝脏修复肝损伤引起的异常结缔组织增生和细胞外基质过度沉积的病理改变。肝纤维化存在于大多数慢性肝病中,是慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段,甚至可持续进展为肝硬化、肝癌,给患者生命健康带来严重威胁。研究肝纤维化的病因及发病机制、寻找有效的治疗靶点,对于阻止肝病的发展、维护患者的生命健康有很大的意义。近年来,肝纤维化的病理分子生物学机制、临床诊疗技术等取得了长足发展。但目前西医对于抗纤维化疗效尚不确切,缺乏有效的治疗手段。中医药治疗肝纤维化具有确切的优势,已有多种注册适应证为肝纤维化的中成药上市。柴芪益肝方由导师胡世平教授所创,是治疗慢性乙型肝炎肝纤维化的经验方,前期临床和实验研究发现对肝纤维化有较好疗效,但其作用机制尚不清楚。胡教授现任北京中医药大学深圳医院党委书记,广东省名中医,全国基层名老中医师承项目指导老师,深圳市地方级领军人才,获评“南粤最美中医”,从事中医药防治慢性肝病的临床与科研工作30多年,擅长中医、中西医结合治疗肝脏疾病,形成了独特的学术思想体系。目的结合临床回顾性研究、网络药理学预测和动物实验探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的疗效与作用机制,为该方的进一步开发应用提供依据,并分析总结导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想及其在柴芪益肝方组方思路中的应用。方法1、临床研究:通过回顾性研究方法,收集2018年1月1日至2021年2月3日期间在北京中医药大学深圳医院肝病科门诊及住院部诊断为慢性乙型肝炎患者的病例资料,并筛选出符合本研究标准的慢性乙型肝炎肝纤维化肝郁脾虚型患者。根据患者所服药物分为常规治疗组和CQYG组,收集所有患者治疗12个月前后的指标,包括主要指标:肝脏硬度值（LSM）、纤维化-4指数（FIB-4）、天门冬氨酸氨基转移酶和血小板比率指数（APRI）、乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量;次要指标:谷丙转氨酶（ALT）,谷草转氨酶（AST）,总胆红素（TBiL）,谷氨酰转酞酶（GGT）,白蛋白（ALB）,将所有检测指标进行治疗前后的组内与组间比较。2、网络药理学:检索 TCMSP、TCMID、Swiss Target Prediction、OMIM、Gene Cards等数据库,筛选CQYG治疗肝纤维化的活性成分和潜在作用靶点。借助Cytoscape软件和String数据库,分别构建“药物-成分-靶点-疾病”网络和蛋白互作PPI网络,并进行拓扑学分析,筛选关键药效分子和核心靶点。运用Autodock vina软件进行分子对接,并基于R语言对作用靶点进行GO和KEGG富集分析。3、动物实验:选取50只6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,随机抽取10只分别纳入空白对照组（CTL）、肝纤维化模型组（Model）、柴芪益肝方低剂量组（CQYG-L）、柴芪益肝方高剂量组（CQYG-H）和水飞蓟素治疗组（Silymarin）,共5组。四氯化碳（carbontetrachloride,CCl4）腹腔注射建立小鼠肝纤维化模型:除空白对照组外,其余各组小鼠腹腔注射含15%CCl4的橄榄油5ml·kg-1,每周2次,连续注射8周。从造模第1天起,柴芪益肝方低、高剂量组小鼠分别灌胃给予0.37 g·kg-1·d-1、0.74 g·kg-1·d-1的柴芪益肝方,水飞蓟素组给予100 mg·kg-1·d-1灌胃。实验结束,摘取所有小鼠肝脏、收集血清,对各组小鼠肝组织进行HE、天狼星红、Masson染色;用自动生化分析仪检测血清AST和ALT的含量;ELISA法检测肝组织中MDA、SOD、GSH-Px和Hyp水平;免疫组化法检测肝组织中α-SMA、Collagen I、Vimentin的表达;免疫荧光法检测肝组织中Ki67+和Lgr5+细胞;提取各组肝组织RNA和蛋白,Real-time PCR和Western blot分别检测肝纤维化小鼠肝组织中NF-κB、TGF-β/Smad、Wnt/β-Catenin信号通路相关靶标mRNA和蛋白表达。结果1、临床研究:共纳入符合标准的患者203人,其中,常规治疗组纳入101人,年龄最大者76岁,最小22岁,平均年龄（41.34±0.90）岁;CQYG组纳入102人,年龄最大者67岁,最小27岁,平均年龄（43.13±0.78）岁,两组年龄无统计学差异（P>0.05）,具有可比性。（1）无创肝纤维化指标（LSM、FIB-4、APRI）在两组患者自身治疗前后比较,以及治疗后的组间比较,均无显着性差异（P>0.05）,但两组治疗后LSM均较治疗前有降低趋势。（2）两组患者自身前后比较,乙型肝炎病毒（HBV-DNA）定量和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）治疗前和后均无显着性差异（P>0.05）;CQYG组较常规治疗组治疗后HBsAg显着性降低（P<0.05）,CQYG组治疗后HBV-DNA定量和HBsAg较治疗前均有下降趋势。（3）两组患者自身治疗前后血清肝功能指标（ALT、AST、GGT、TBiL、ALB）均在正常范围内,治疗后组间比较肝功能均无显着性差异（P>0.05）。2、网络药理学预测:共获得121种CQYG治疗肝纤维化的潜在活性成分和257个对应的作用靶点,并筛选出14种关键药效分子及28个核心靶点。点度中心性值前10的核心靶点和关键药效分子具有较好的结合活性。GO和KEGG结果主要涉及炎症反应、氧化应激、成纤维细胞增殖、内皮细胞增殖、调节脂质代谢活动、血管生成、肝再生等生物学过程及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等。3、动物实验研究:与模型组相比,CQYG各组和水飞蓟素组小鼠肝组织形态和胶原沉积较模型组改善,水飞蓟素组和CQYG-H小鼠血清ALT、AST水平均显着降低（P<0.01）;CQYG高剂量组肝组织MDA和Hyp的含量显着低于模型组（P<0.05）,SOD和GSH-Px含量显着高于模型组（P<0.05）;免疫组化结果显示,CQYG组和水飞蓟素组α-SMA、CollagenI、Vimentin阳性表达区域较模型组少;免疫荧光结果显示,柴芪益肝方组Ki67阳性细胞和Lgr5阳性细胞数量均较模型组有增多趋势;CQYG组肝组织中p-NF-κBp65、TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表达水平较模型组显着降低（P<0.05）;与模型组相比,CQYG-H 肝组织 CollagenI、TGF-β、TNF-α、IL-1βmRNA 的表达水平以及 Collagen I、α-SMA、TIMP-1、TGF-β、磷酸化 Smad2/3、Smad2/3、Smad4、Wnt3a、β-Catenin 蛋白表达均较模型组有不同程度降低,而MMP-9、Smad7蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。结论1、临床研究:柴芪益肝方加减联合常规治疗有降低慢乙肝肝纤维化患者肝脏硬度值、HBV-DNA和HBsAg含量的趋势,且在降低HBsAg定量上优于单纯常规治疗。2、网络药理学:柴芪益肝方可能通过槲皮素、白藜芦醇、山奈酚等活性成分作用于丝裂原激活蛋白激酶MAPK1/3/8、原癌基因酪氨酸激酶Src、激活子蛋白Jun等靶点,以及TNF信号通路、Th17细胞分化信号通路、IL-17信号通路、PI3K/Akt信号通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、Wnt信号通路、NF-κB信号通路等,调节肝脏炎症反应、氧化应激、细胞增殖、肝再生等生物学过程发挥治疗肝纤维化的作用。3、动物实验研究:柴芪益肝方能显着减轻四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化,其作用机制可能减轻氧化应激反应、抑制NF-κB介导的炎症信号通路,下调炎症细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β的释放,减轻肝脏炎症,并通过调节TGF-β/Smad、Wnt3a/β-catenin信号通路,抑制肝星状细胞的活化,调节MMP-9和TIMP-1活性平衡,减少细胞外基质α-SMA、Collagen I、Hyp的合成,促进ECM降解相关。4、“推陈致新”学术思想:导师胡世平教授“推陈致新”的学术思想核心在于顺应人体本身的正气祛邪之势和气血津液各自的新陈代谢过程,协助人体自然排邪,促进疾病向愈。在肝纤维化治疗上,通过“推陈致新”,加强气化动力、调节气机升降,使病理产物消除的同时,人体气血津液正常化生。
郑雅[7]（2021）在《基于网络药理学联合基因芯片数据探讨小柴胡汤治疗肝炎-肝硬化-肝癌的机制演变》文中指出研究目的:基于网络药理学联合基因芯片数据集探讨小柴胡汤治疗肝炎-肝硬化-肝癌的机制演变,为后续实验验证小柴胡汤治疗肝脏方面疾病的作用机理提供思路与线索。研究方法:1.在研究小柴胡汤治疗HB的网络药理学中,利用TCMSP数据库和Swiss Target Prediction数据预测平台对小柴胡汤活性成分的靶基因进行预测.利用GEO数据库下载HB相关的芯片数据集GSE114783,并使用GEO2R插件进行分析处理后筛选出DEGs;将小柴胡汤活性成分靶基因与HB的DEGs取交集。将小柴胡汤治疗HB的靶基因其输入STRING数据库中,构建小柴胡汤-HB组蛋白相互作用网络,再导入Cytoscape3.7.2软件中进行分析并筛选核心靶基因;利用DAVID 6.8和Omicshare平台对核心靶基因进行GO功能富集和KEGG通路富集。2.在研究小柴胡汤治疗LC的网络药理学中,利用TCMSP数据库和Swiss Target Prediction数据预测平台对小柴胡汤活性成分的靶基因进行预测。利用GEO数据库下载LC相关的芯片数据集GSE114783和GSE77627,并使用GEO2R插件进行分析处理后筛选出DEGs;将小柴胡汤活性成分靶基因与LC的DEGs取交集。将小柴胡汤治疗LC的靶基因其输入STRING数据库中,构建小柴胡汤-LC组蛋白相互作用网络,再导入Cytoscape3.7.2软件中进行分析并筛选核心靶基因;利用DAVID 6.8和Omicshare平台对核心靶基因进行GO功能富集和KEGG通路富集。3.在研究小柴胡汤治疗HCC的网络药理学中,利用TCMSP数据库和Swiss Target Prediction数据预测平台对小柴胡汤活性成分的靶基因进行预测。利用GEO数据库下载HCC相关的芯片数据集GSE101685和GSE25097,并使用GEO2R插件进行分析处理后筛选出DEGs;将小柴胡汤活性成分靶基因与HCC的DEGs取交集,将小柴胡汤治疗HCC的靶基因其输入STRING数据库中,构建小柴胡汤-HCC组蛋白相互作用网络,再导入Cytoscape3.7.2软件中进行分析并筛选核心靶基因;利用DAVID 6.8和Omicshare平台对核心靶基因进行GO功能富集和KEGG通路富集;利用Kaplan-Meier Plotter和GEPIA数据库在线识别核心靶基因的预后信息及鉴定基因表达水平。结果:1.在小柴胡汤治疗HB的网络药理学研究中,小柴胡汤活性成分通过TNF、AKT1、MAPK3、F2、MTOR、CAV1等核心靶基因,参与血管生成、血小板激活、T细胞协同刺激、肝再生、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等生物过程,调控乙型肝炎、丙型肝炎、肝细胞癌、非酒精性脂肪性肝病、TNF、T细胞受体、B细胞受体、NF-κB、PI3K-Akt、Jak/STAT等信号通路。2.在小柴胡汤治疗LC的网络药理学研究中,小柴胡汤活性成分通过VEGF A、AKT1、CYP2C9、PTGS1、CXCL2等核心靶基因,参与影响纤连蛋白结合、溶血磷脂酶活性、磷脂酶A2活性等分子功能;调节炎症反应、细胞增殖、血管内皮细胞迁移调控、磷脂酰胆碱酰基链重塑、葡萄糖代谢等生物过程。调控乙型肝炎、TNF、Toll样受体、IL-17、趋化因子、MAPK、RAS、NFκB、花生四烯酸代谢、亚油酸新陈代谢、脂肪细胞脂解信号通路、VEGF信号通路、血小板激活信号通路。3.在小柴胡汤治疗HCC的网络药理学研究中,小柴胡汤活性成分通过MYC、ESR1、CDKN2A、PTGS2、FOS、TLR4、CCL2等核心靶基因,参与炎症反应、雌二醇反应、氧化还原过程、脂质代谢过程、器官再生、肝再生、血管生成等生物过程,调控p53、癌症通路、乙型肝炎、肝细胞癌、TNF、T细胞受体、Toll样受体、MAPK、NFκB等信号通路。其中核心靶基因CDKN2A、CCNB1、CDK1、EZH2、CCNA2、G6PD、NQO1在肝癌组织中显着表达,且与患者预后不良相关。结论:本研究综合运用网络药理学结合生物信息学的分析方法,对小柴胡汤的活性成分、潜在靶基因及信号通路进行了系统分析,初步阐述了小柴胡汤可以抑制肝炎、肝硬化和肝癌中的炎症反应,在肝炎期,主要调控乙型肝炎信号通路、丙型肝炎信号通路、TNF等信号通路,具有较强抑制炎症和调控细胞增殖等作用;在肝硬化期,主要调控NFκB信号通路、花生四烯酸代谢、亚油酸新陈代谢、VEGF等信号通路,能够通过调节糖脂质代谢、免疫、血管新生起到治疗作用;在肝癌期,可以通过调节p53、肝细胞癌、肝再生等多条与癌症相关的通路来抑制肿瘤的进展;其中 CDKN2A、CCNB1、CDK1、EZH2、CCNA2、G6PD、NQO1在肝癌组织中显着表达,且与患者预后不良相关,可作为后续实验研究的着手点及药物开发的潜在靶点。为进一步开展小柴胡汤治疗肝脏方面疾病的实验研究提供了理论依据和方向。
胡金花[8]（2021）在《MiR-301a-3p靶向VGLL4促进肝癌细胞进展的分子机制》文中研究指明研究背景和目的:原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,我国是肝细胞癌高发国,发病率和死亡率均居世界首位。肝细胞癌（HCC）是肝脏中最常见的原发性癌症,也是全球癌症相关死亡的第三大原因。肝癌患者以手术切除为主的各种治疗手段总体效果均欠佳。临床上急需找到能扭转此现状的应对策略。因此,寻找新型的肝癌诊断、预后标志物及治疗靶标是目前肝癌研究邻域中的热点。本研究旨在探讨miR-301a-3p在肝癌中的临床意义、生物学功能,同时寻找miR-301a-3p的下游靶基因,明确miR-301a-3p促进肝癌细胞进展的分子机制,为提高肝细胞癌患者治疗效果,寻找新的肝癌治疗靶点奠定理论基础。方法:1、运用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）比较36例肝细胞癌患者术后新鲜肝癌组织及36例癌旁正常肝组织中miR-301a-3p的表达差异;然后再运用荧光实时定量PCR检测5株肝癌细胞系及1株肝正常细胞系中miR-301a-3p的表达水平;同时统计分析了miR-301a-3p表达水平与肝细胞癌患者临床病理特征之间的关系。2、运用瞬时转染技术,分别在SMMC-7721及Hep G2肝癌细胞系中抑制/上调miR-301a-3p表达水平。实验分组:对照组为Negative control组,实验组为miR-301a-3p mimics组及miR-301a-3p inhibitor组,并且运用qRT-PCR检测瞬时转染效率。3、运用CCK-8实验检测体外转染了miR-301a-3pmimic/inhibitor肝癌细胞系后miR-301a-3p表达对肝癌细胞增殖能力的变化。4、运用平板克隆实验检测体外转染了miR-301a-3pmimic/inhibitor肝癌细胞后miR-301a-3p表达对肝癌细胞化疗敏感性的变化。5、运用Transwell实验检测体外转染了miR-301a-3pmimic/inhibitor肝癌细胞miR-301a-3p表达后肝癌细胞侵袭能力的变化。6、运用荧光素酶报告实验检测miR-301a-3p的靶基因VGLL4及对转录因子TEAD转录活性的影响。采用qRT-PCR和Western blot检测转染了miR-301a-3p inhibitor/mimics对肝癌细胞VGLL4 mRNA及蛋白表达水平的影响。RT-PCR法检测miR-301a-3p对Hippo通路下游靶基因CTGF、CYR61mRNA表达变化的影响。7、开展一系列挽救实验,在Hep G2细胞中转染miR-301a-3p mimics和pc DNA3.1-VGLL4后,采用CCK-8实验检、平板克隆实验和Transwell实验进一步检测VGLL4能否削弱miR-301a-3p所诱导的肝癌细胞增殖、侵袭能力、化疗抵抗。结果:1、运用单因素分析提示MiR-301a-3p表达与肝癌患者的临床病理因素:与TNM分期（P=0.007）、肿瘤分化程度（P=0.031）有关,而与肝癌患者的性别（P=0.379）、年龄（P=0.149）、肿瘤直径（P=0.877）、HBs Ag（P=0.278）、AFP（P=0.642）无明显相关;在生物信息学网站Online Kaplan-Meier Plotter对372例肝细胞癌患者根据miR-301a-3p表达分为高低表达组。Kaplan-Meier分析结果,发现miR-301a-3p高表达组及低表达组的中位生存时间分别为36.5月和52.4月,有明显统计学差异（P=0.0194）,提示miR-301a-3p的表达水平与肝癌患者的预后密切相关其表达增高预示患者预后不佳。2、运用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测结果显示MiR-301a-3p在肝癌组织中较癌旁正常肝组织表达升高;在五株肝癌细胞（miR-301a-3p在SMMC-7721、MHCC-97H、HCCLM3、Huh-7、Hep G2）中相对表达量均高于对照组LO2细胞,分别P值为0.000、0.001、0.005、0.026、0.045,差异均有统计学意义（P<0.05）。3、通过转染miR-301a-3p inhibitor和miR-301a-3p mimics到肝癌细胞系中,再通过体外功能验证试验如CCK-8实验、平板克隆实验、Transwell实验,验证了MiR-301a-3p高表达可促进肝癌细胞的增殖、侵袭以及增加对化疗药物的抵抗性。4、VGLL4是MiR-301a-3p的靶基因。5、MiR-301a-3p通过靶向VGLL4促进转录因子TEAD的转录活性。6、CCK-8实验检、平板克隆实验和Transwell实验进一步验证转染了miR-301a-3p mimics+pc DNA3.1-Vectro肝癌细胞能削弱miR-301a-3p所诱导的肝癌细胞增殖、侵袭能力、化疗抵抗。提示VGLL4参与了miR-301a-3p促肝癌细胞进展的生物学过程。结论:MiR-301a-3p在肝癌组织及肝癌细胞系中存在过表达,并与肝癌患者的的临床病理因素如TNM分期及肝癌细胞分化程度及总生存相关,提示MiR-301a-3p表达可能成为肝癌预后的一个预测指标。MiR-301a-3p通过靶向VGLL4促进TEAD转录激活,与肝癌增殖、侵袭以及耐药密切相关,可能成为肝癌患者预后指标或新型治疗靶点。
肖遵强[9]（2021）在《槲皮素通过靶向人抗原蛋白R抑制肝癌进展的机制研究》文中进行了进一步梳理目的 研究槲皮素通过靶向作用于人抗原蛋白R（HuR）降低非编码RNA LINC01123的稳定性,并抑制肝癌细胞的增殖及转移的作用。进一步探索槲皮素抗肝癌的机制,为中药治疗肝癌提供新思路。方法1.使用不同浓度的槲皮素处理Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞,通过CCK-8试验,EdU试验,克隆平板实验,流式实验,证明槲皮素可以抑制肝癌细胞的增殖,并诱导肝癌细胞凋亡。2.使用不同浓度的槲皮素处理Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞,通过划痕实验,迁移实验,侵袭实验,证明槲皮素可以抑制肝癌细胞的迁移及侵袭性。3.建立裸鼠荷瘤模型,观察槲皮素是否可以在体内抑制肿瘤的生长。4.通过生信分析及临床资料分析,研究LINC01123在肝癌组织中的表达量与预后的关系。5.在Hep3B,HepG2和Huh7细胞中过表达或敲低LINC01123,通过CCK-8实验,EdU试验,transwell试验及建立裸鼠荷瘤模型,进一步证明LINC01123在体内及体外可促进肝癌的增殖转移。6.通过生信分析,RNA免疫共沉淀实验及双荧光素酶报告基因检测系统实验寻找LINC01123的靶点。7.通过生信分析及双荧光素酶报告基因检测系统实验寻找miR-34a-5p的靶点。8.通过TUFT1的挽救实验来证明LINC01123可通过miR-34a-5p/TUFT1轴促进肝癌的进展。9.通过生信分析,探究HuR与LINC01123表达量的相关性,通过RNA免疫共沉淀实验探究两者是否可以直接结合。10.在Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞中过表达或敲低HuR,检测LINC01123的RNA稳定性及表达量,探索HuR能否通过增加LINC01123的稳定性,促进LINC01123 的表达。11.通过生信分析,探索HuR是否是槲皮素的作用靶点。12.通过在Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞中过表达HuR,探索槲皮素是否通过靶向作用于HuR下调LINC01123的表达,从而发挥抗肝癌的作用。结果1.槲皮素可以通过剂量依赖的方式抑制Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞的增殖。2.槲皮素可以通过剂量依赖的方式抑制Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞的转移。3.槲皮素可以在体内实验中抑制肝癌的生长。4.LINC01123在肝癌组织中高表达,并与患者的不良预后相关。5.在Huh7细胞中敲低LINC01123的表达后,可以明显抑制Huh7细胞的增殖,侵袭及迁移,在HepG2及Hep3B细胞中过表达LINC01123可以促进HepG2,Hep3B细胞的增殖,侵袭及迁移。同时,LINC01123的沉默可以抑制体内实验中肝癌的生长。6.通过生信分析发现LINC01123与miR-34a-5p的表达量成反比,通过双荧光素酶报告基因检测系统和RNA免疫共沉淀实验可以证明LINC01123和miR-34-5p直接结合。7.通过生信分析发现miR-34-5与TUFT1的表达量成反比,通过双荧光素酶报告基因检测系统可以证明miR-34-5p和TUFT1直接结合。8.过表达miR-34-5p可以逆转LINC01123促进肝癌细胞增殖,迁移及侵袭的作用,过表达TUFT1可以逆转miR-34-5p抑制肝癌细胞增殖,迁移及侵袭的作用。9、HuR和LINC01123在肝癌组织中的表达量呈正相关关系,RNA免疫共沉淀实验证明HuR可以和LINC01123直接结合。10.在Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞中过表达或敲低HuR的表达量,可以同向调控LINC01123的表达量,敲低HuR可以降低LINC01123的稳定性。11.通过生信分析及分子对接,可以证明HuR是槲皮素的潜在作用靶点。12.在Hep3B,Huh7,MHCC97h细胞中过表达HuR,可以逆转不同浓度的槲皮素对Hep3B,Huh7,MHCC97h细胞的增殖抑制和转移抑制的作用。结论 本研究发现LINC01123在肝癌中高表达,与患者预后不良相关,并可通过调节miR-34a-5p/TUFT1轴促进肝癌细胞的增殖及转移。HuR可与LINC01123结合,增加LINC01123的稳定,并促进其表达。HuR作为槲皮素的潜在靶点之一,槲皮素可通过靶向HuR,降低LINC01123的稳定性并抑制肝癌细胞的增殖与转移。本研究首次发现了中药单体槲皮素通过作用于LncRNA治疗肝癌的机制,为中药治疗肝癌提供了新的思路。
刘皎皎[10]（2021）在《“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究》文中研究表明目的:采用随机对照临床试验（RCT）方法观察“补肾生髓成肝”法治疗晚期肝癌的临床疗效,并探究其改善肝癌肝再生微环境的疗效机制,为临床推广应用提供较高级别的循证医学证据。方法:1.采用随机分组法将2017年1月至2020年6月就诊于陕西省中医医院肝病科的入选晚期肝癌患者共126例,基于随机数字表法简单随机分成3组,即西医对照组42例（以下简称西医组）,采用西医综合治疗方案;补肾生髓成肝单独治疗组42例（以下简称中医组）,采用地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减治疗方案;补肾生髓成肝综合治疗组42例（以下简称中西医组）,采用西医治疗组方案基础上加上地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减。入选后有10例患者脱落（中医组6例,3例因失访脱落,3例因不能坚持治疗脱落;西医组4例,2例因异地就医不便退出,2例因不能坚持治疗脱落）,最终纳入统计分析病例资料的共116例,西医对照组（西医组）38例、补肾生髓成肝综合治疗组（中西医组）42组、补肾生髓成肝单独治疗组（中医组）36例。该研究通过湖北省中医院伦理审查,在中国临床试验注册中心（世界卫生组织国际临床试验平台一级注册机构）完成临床试验注册,注册号:Chi CTR-IOR-17011439。参与研究的患者均自愿签署了知情同意书。对比三组治疗3个月及治疗6个月的生存率及生存期,对比治疗前、治疗后3个月血常规、粪常规加潜血、肝功、血糖、血脂、肾功等指标,对比三组治疗前后的中医证候评分、生存质量评分,并对患者生存期的独立影响因素进行分析。2.依据治疗方案治疗3个月后分别收集中医组、西医组、中西组每组20名患者血清,共60份,正常人群血清18份。收集的血清-80℃冻存于陕西省中医医院肝病实验室。通过悬液芯片系统检测患者血清肝再生相关细胞因子粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Factor,G-CSF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白介素-6/8/18（Interleukin-6,IL-6,Interleukin-8,IL-8,Interleukin-18,IL-18）、血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF-BB）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Nnecrosis Factor-α,TNF-α）的含量,观察体现“补肾生髓成肝”的中药对这些细胞因子的影响。结果:（1）三组患者治疗前后生存率及生存期比较:治疗3个月及6个月后,中西医组、中医组和西医组生存率比较,有统计学差异（88.10%VS72.22%VS52.63%）、（71.43%VS58.33%VS34.21%）（P<0.05）。治疗后中西医组、中西组和西医组患者生存期比较,具有统计学差异（23.86±17.55VS20.08±19.86VS15.95±16.44）（P<0.05）。（2）三组患者治疗前后肿瘤大小比较:中西医组、中医组和西医组组间比较及前后测量时间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（3）三组患者治疗前后肝功指标比较:中西医组患者治疗后直接胆红素水平、间接胆红素水平、谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平较治疗前显着降低（P<0.05）,组间比较无统计学差异（P>0.05）。中医组治疗后胆碱酯酶水平较治疗前显着升高,组间比较不具有统计学意义（P>0.05）。三组患者治疗前后白蛋白水平比较,具有统计学意义（P<0.05）;两两比较,中西医组及中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（4）三组患者治疗前后其他生化指标比较:三组患者治疗后血常规指标中白细胞水平、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板水平,中西医组、中医组与西医组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后肌酐水平比较,中西医组、中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（5）三组患者治疗前后中医证候评分比较:三组患者治疗前后中医证候评分以时间因素为源的主体内差异及以组别为源的主体间效应,具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后的中医证候评分均显着低于治疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组显着低于西医组的中医证候评分,差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）三组患者治疗前后生存量表积分比较:三组患者生理机能积分方面治疗后积分均显着高于治疗前,具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组与西医组的社会功能评分比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。三组患者在生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,有统计学意义（P<0.05）,且两两组间比较后中西医组与中医组、西医组的生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）HGF表达水平比较:西医组明显高于中西医组、中医组及正常人群组,差异具有统计学意（2255.17VS1097.76VS1072.39VS882.67）（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制HGF的过度表达。（8）IL-6表达水平比较:中医组、中西医组及西医组均低于正常人群组,且组间差异具有统计学意义（5638.03VS5166.45VS12842.5VS24559.34）（P<0.05）。中西医组、中医组IL-6表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制IL-6的过度表达。（9）IL-18表达水平比较:西医组、中西医组及中医组,比较差异不具有统计学意义（120.345VS82.61VS78.58）（P>0.05）,但均较正常人群组升高（75.165）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗同样可以促进IL-18的表达。（10）PDGF-BB表达水平比较:中医组相对中西医组、西医组降低,差异不具有统计学意义（4677.18VS6140.6VS5534.885）（P>0.05）。但中医组低于西医组及中西医组,且更接近正常人群组（4401.67）。提示单用“补肾生髓成肝”可以抑制PDGF-BB的过度表达。（11）TNF-α表达水平比较:西医组、中西医组、中医组及正常人群组比较差异具有统计学意义（735.955VS244.93VS573.46VS1037.25）（P>0.05）。中西医组TNF-α表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”可以更好的抑制TNF-α的过度表达。结论:“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌能够显着提高晚期肝癌患者3个月及6个月的生存率及生存期,改善晚期肝癌患者临床症状同时,改善患者各种生化指标。明显降低晚期肝癌患者的中医证候评分,提高患者的生存质量,为临床推广应用提供了较高级别的循证医学证据。“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌患者的疗效机制之一可能是通过抑制晚期肝癌患者HGF、PDGF-BB、TNF-α、IL-6的过度表达,同时升高晚期肝癌患者IL-18的表达,改善肝癌的肝再生微环境及其相关的炎症微环境、免疫微环境、血管新生微环境等。
二、肝癌和肝硬化组织中凋亡信号蛋白的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝癌和肝硬化组织中凋亡信号蛋白的表达（论文提纲范文）
（1）PTEN相关ceRNA网络的构建及肝癌发病机制的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略名词对照 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌的流行病学 |
| 1.1.1 肝癌的监测 |
| 1.1.2 肝癌的诊断 |
| 1.1.3 肝癌的发病率和死亡率 |
| 1.1.4 肝癌的生存率 |
| 1.1.5 肝癌的风险因素 |
| 1.2 竞争性内源性RNA(ceRNA)在肝细胞癌中的新兴作用 |
| 1.2.1 非编码RNA的特征 |
| 1.2.2 非编码RNA的在癌症中的作用 |
| 1.2.3 ceRNA假说的概述和组成 |
| 1.3 lncRNA介导的ceRNET通过调节HCC中的信号传导途径发挥功能 |
| 1.3.1 NF-κB信号通路 |
| 1.3.2 PI3K/AKT信号通路 |
| 1.3.3 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1.3.4 TGF-β信号通路 |
| 1.3.5 JAKs/STAT信号通路 |
| 1.4 lncRNA介导的ceRNET在肝细胞癌中的临床应用 |
| 1.4.1 LncRNA相关的ceRNET介导的肝癌早期检测和诊断 |
| 1.4.2 LncRNA相关的ceRNET介导的肝癌预后和复发 |
| 1.4.3 LncRNA相关的ceRNET介导的肝癌靶向治疗和用药 |
| 1.5 本课题的研究意义、研究内容和创新点 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 创新点 |
| 第二章 在肝癌中构建与PTEN相关的ceRNA调控网络 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验数据与方法 |
| 2.2.1 数据准备与处理 |
| 2.2.2 差异表达基因的筛选 |
| 2.2.3 肝癌ceRNA网络的建立 |
| 2.2.4 功能富集分析 |
| 2.2.5 肝癌生存分析 |
| 2.3 研究结果 |
| 2.3.1 验证肝癌中PTEN过表达的抑癌作用及预后价值 |
| 2.3.2 鉴定差异表达的基因(DEmRNA,DElncRNA和 DEmiRNA) |
| 2.3.3 lnRNA-miRNA-mRNA三重调控网络的构建 |
| 2.3.4 ceRNA网络的构建和验证 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 在肝癌患者中DLEU2L/TAOK1轴的识别及临床相关性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验数据与方法 |
| 3.2.1 相关性分析 |
| 3.2.2 建立特定的肝癌预后模型 |
| 3.2.3 验证TAOK1在HCC中的异常表达 |
| 3.2.4 统计分析 |
| 3.3 研究结果 |
| 3.3.1 预后模型的初建立 |
| 3.3.2 DLEU2L/TAOK1轴在肝癌患者中的临床意义 |
| 3.3.3 TAOK1 异常高表达的验证 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 肝癌预后模型DLEU2L/TAOK1的免疫组化分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验数据与方法 |
| 4.2.1 肝癌样本收集 |
| 4.2.2 主要耗材及试剂 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 TAOK1蛋白在Alb-Cmyc自发成瘤小鼠肝癌组织和正常小鼠肝组织中的表达 |
| 4.3.2 TAOK1蛋白在人肝癌和相应癌旁组织中的表达 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 预后模型DLEU2L/TAOK1轴参与肝癌分子机制的初步探讨 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验数据与方法 |
| 5.2.1 数据准备与处理 |
| 5.2.2 TAOK1的甲基化及表达分析 |
| 5.2.3 TAOK1的免疫浸润水平及表达分析 |
| 5.2.4 统计分析 |
| 5.3 研究结果 |
| 5.3.1 TAOK1异常过表达与基因组学的关系 |
| 5.3.2 TAOK1基因甲基化与表达的关系 |
| 5.3.3 肝癌免疫浸润与TAOK1表达的关系 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间主要成果 |
| 致谢 |
（2）miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCC中抑癌miR-876从TCGA数据库的筛选鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miR-876在HCC细胞及组织中低表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miR-876 的异常表达和HCC进展及纤维化相关 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 miR-876 抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 miR-876 靶向调控POSTN |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 miR-876 通过POSTN抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 POSTN高表达和HCC组织EMT及肝硬化相关 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 miR-876及POSTN的异常表达和HCC预后相关 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨膜蛋白(POSTN)的结构功能及其在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（3）miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文略缩词表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 肝细胞癌 |
| 1.1.1 肝细胞性肝癌的流行病学 |
| 1.1.2 肝细胞性肝癌的危险因素 |
| 1.1.3 肝细胞性肝癌的筛查 |
| 1.1.4 肝细胞性肝癌的诊断 |
| 1.1.5 肝细胞性肝癌的分期 |
| 1.1.6 肝细胞性肝癌的治疗 |
| 1.1.7 肝细胞性肝癌的生物学 |
| 1.2 microRNAs(miRNAs) |
| 1.2.1 miRNA概述 |
| 1.2.2 miRNA与 HCC |
| 1.2.3 miRNA-557与HCC |
| 1.3 上皮间充质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT) |
| 1.3.1 EMT概述 |
| 1.3.2 EMT和 miRNAs |
| 1.3.3 EMT和 HCC |
| 1.4 Wnt/β-catenin信号通路 |
| 1.4.1 Wnt/β-catenin信号通路概述 |
| 1.4.2 Wnt/β-catenin信号通路与HCC |
| 1.4.3 Wnt/β-catenin信号通路与miRNAs |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第2章 miR-557 在肝癌中的表达及其与患者临床病理特征及预后关系 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.3 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 miR-557在GSE108724 的表达情况 |
| 2.3.2 miR-557在GSE26323 的表达情况 |
| 2.3.3 miR-557 在肝癌细胞系中的表达情况 |
| 2.3.4 miR-557 在肝癌组织中的表达情况 |
| 2.3.5 miR-557 在肝癌组织中的表达水平与患者生存时间的关系 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第3章 miR-557 对肝癌细胞体内外生物学行为的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 统计学方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 mimics和 inhibitors可以显着影响miR-557 的表达 |
| 3.3.2 miR-557 抑制肝癌细胞增殖 |
| 3.3.3 miR-557 抑制肝癌细胞迁移和侵袭能力 |
| 3.3.4 miR-557 过表达和敲减均影响肝细胞癌的细胞周期分布 |
| 3.3.5 miR-557 抑制肝癌细胞EMT |
| 3.3.6 慢病毒稳转株的筛选及miR-557 对细胞克隆形成的影响 |
| 3.3.7 miR-557 对肝细胞癌克隆形成和裸鼠皮下成瘤的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第4章 miR-557 通过靶向RAB10 抑制Wnt/β-catenin信号的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 统计学方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 生物信息学预测miR-557 的靶基因 |
| 4.3.2 双荧光素酶报告实验验证miR-557与RAB10 的靶向性 |
| 4.3.3 miR-557 负性调控RAB10 的表达水平 |
| 4.3.4 RAB10 在肝癌组织中表达及其与miR-557 的相关性 |
| 4.3.5 促进或干扰RAB10 的表达会影响 miR-557对HCC细胞生物学行为的影响 |
| 4.3.6 miR-557 抑制肝细胞性肝癌Wnt/β-catenin信号通路 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 第5章 总结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 综述 MicroRNA 在肝细胞癌中的作用及其机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（4）TEM1通过GAS6/AXL通路调控肝纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 肝纤维化的研究现状 |
| 1.1.1 肝纤维化的发病机理 |
| 1.1.2 肝星状细胞的激活是引起肝纤维化的重要机制 |
| 1.1.3 靶向肝星状细胞用于治疗肝纤维化的研究进展 |
| 1.2 TEM1 参与纤维化疾病的研究进展 |
| 1.2.1 TEM1 分子及其在成纤维细胞上的表达情况 |
| 1.2.2 TEM1 参与纤维化疾病的研究进展 |
| 1.2.3 TEM1 促进纤维化疾病的分子机制 |
| 1.3 GAS6 参与纤维化疾病的研究进展 |
| 1.3.1 GAS6 分子及其受体 |
| 1.3.2 GAS6 参与纤维化疾病的研究进展 |
| 1.3.3 GAS6 可作为纤维化疾病的标志物 |
| 1.4 STAT6 参与纤维化疾病的研究进展 |
| 1.4.1 STAT家族成员及STAT6 |
| 1.4.2 STAT6 参与纤维化疾病的研究进展 |
| 1.4.3 STAT6 的激活与其他组织纤维化 |
| 1.5 总结 |
| 第二章 人和小鼠肝纤维化组织中TEM1 的表达分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 组织芯片和实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织芯片中TEM1 的免疫组化染色 |
| 2.2.2 小鼠肝纤维化模型的建立 |
| 2.2.3 石蜡切片的制作 |
| 2.2.4 天狼猩红染色 |
| 2.2.5 马松（Masson）染色 |
| 2.2.6 肝组织蛋白的提取及检测 |
| 2.2.7 Western blot |
| 2.2.8 免疫荧光染色 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 人肝炎和肝硬化组织中TEM1 的表达升高 |
| 2.3.2 腹腔注射CCl_4可诱导小鼠的肝纤维化 |
| 2.3.3 小鼠肝纤维化组织中TEM1 的表达增高 |
| 2.3.4 TEM1 与肝星状细胞的标志物GFAP、α-SMA和 Vimentin共定位 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 成纤维细胞中TEM1 可通过STAT6 调控GAS6 的表达 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要溶液配置 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 原代CAFs的分离 |
| 3.2.2 细胞培养 |
| 3.2.3 小干扰RNA的转染 |
| 3.2.4 过表达TEM1的LX-2稳转细胞系的建立 |
| 3.2.5 细胞总RNA的提取 |
| 3.2.6 细胞总蛋白的提取 |
| 3.2.7 BCA法测定蛋白浓度 |
| 3.2.8 qRT-PCR |
| 3.2.9 Western blot |
| 3.2.10 双荧光素酶报告基因检测 |
| 3.2.11 Transwell实验 |
| 3.2.12 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 TEM1 可在转录水平调控GAS6 的表达 |
| 3.3.2 TEM1 可在转录水平调控STAT6 的表达 |
| 3.3.3 STAT6 可在转录水平调控GAS6 的表达 |
| 3.3.4 STAT6 可直接结合于GAS6 的启动子区而促进其转录 |
| 3.3.5 TEM1 可调控成纤维细胞及肝星状细胞中α-SMA的表达 |
| 3.3.6 GAS6/AXL通路的抑制剂可抑制肝星状细胞中α-SMA的表达 |
| 3.3.7 下调CAFs中 TEM1或GAS6 的表达可抑制细胞迁移 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 IgG78 可抑制成纤维细胞的增殖、迁移及纤维化相关蛋白的表达 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞系和质粒 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要溶液配置 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 IgG78 的表达与纯化 |
| 4.2.2 流式细胞术检测IgG78与HFL-1 的结合能力 |
| 4.2.3 CCK8 实验检测细胞增殖 |
| 4.2.4 Transwell实验检测细胞迁移 |
| 4.2.5 流式细胞术检测细胞周期 |
| 4.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 4.2.7 Western blot |
| 4.2.8 ELISA检测上清中GAS6 的水平 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 IgG78的SDS-PAGE及其与TEM1 阳性细胞的结合情况分析 |
| 4.3.2 IgG78 可抑制HFL-1 细胞的增殖 |
| 4.3.3 IgG78 可抑制HFL-1 细胞的迁移 |
| 4.3.4 IgG78 可诱导HFL-1 细胞凋亡 |
| 4.3.5 IgG78 可引起HFL-1 细胞的G1 期阻滞 |
| 4.3.6 IgG78可抑制TEM1、GAS6及纤维化相关蛋白α-SMA和COL1A1的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 IgG78 可缓解CCl_4诱导的小鼠肝纤维化 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 细胞系和实验动物 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要溶液配置 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 IgG78 治疗实验 |
| 5.2.2 冰冻切片的制备 |
| 5.2.3 马松染色 |
| 5.2.4 天狼猩红染色 |
| 5.2.5 免疫组化染色 |
| 5.2.6 ELISA检测血清中GAS6 的水平 |
| 5.2.7 qRT-PCR |
| 5.2.8 Western blot |
| 5.2.9 免疫荧光染色 |
| 5.2.10 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 IgG78 治疗可抑制小鼠的肝纤维化 |
| 5.3.2 IgG78 可抑制小鼠肝组织中STAT6和GAS6 的表达 |
| 5.3.3 IgG78 可抑制小鼠肝组织中TEM1、α-SMA和 COL1A1 的表达 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间科研成果 |
（5）芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 肝癌研究概况 |
| 一、肝癌流行病学现况 |
| 二、肝癌病因研究 |
| 三、肝癌发病机制 |
| 四、肝癌的治疗现状 |
| 五、肝癌发生发展与肝癌干细胞的关系 |
| 六、肝癌干细胞与上皮间质转化(EMT) |
| 第二节 肝癌中医药基础理论的形成和发展及芪术抗癌方研究概况 |
| 一、肝癌的渊源及病因病机 |
| 二、肝癌辨证治疗 |
| 三、芪术抗癌方中医气血辨证治疗肝癌的理论依据 |
| 四、芪术抗癌方临床疗效、机制及微观物质基础研究 |
| 第二章 芪术抗癌方对肝癌干细胞的影响 |
| 第一节 临床研究 |
| 一、资料与方法 |
| 二. 数据分析结果 |
| 三、结论 |
| 第二节 体外、体内实验研究 |
| 一、芪术抗癌方对癌细胞的干性表达体外研究 |
| 二、芪术抗癌方对癌细胞干性表达体内研究 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文和参与课题情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（6）柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 中西医治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第一节 西医诊断和治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二节 中医药治疗肝纤维化的研究进展 |
| 第二章 柴芪益肝方治疗肝郁脾虚型慢性乙型肝炎肝纤维化的临床回顾性研究 |
| 前言 |
| 第一节 临床资料 |
| 第二节 分组与治疗 |
| 第三节 结果分析 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 第三章 基于网络药理学探讨柴芪益肝方治疗肝纤维化的作用机制 |
| 前言 |
| 第一节 资料与方法 |
| 第二节 结果 |
| 第三节 讨论与小结 |
| 第四章 柴芪益肝方对四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 第一节 材料与研究方法 |
| 第二节 指标检测 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论与小结 |
| 结语 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）基于网络药理学联合基因芯片数据探讨小柴胡汤治疗肝炎-肝硬化-肝癌的机制演变（论文提纲范文）
| 中英文缩略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 小柴胡汤治疗HB的网络药理学分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 小柴胡汤活性成分筛选与靶基因收集 |
| 1.2 HB基因芯片数据选取与DEGs的筛选 |
| 1.3 PPI网络构建与小柴胡汤治疗HB的核心靶基因筛选 |
| 1.4 小柴胡汤治疗HB核心靶基因的GO富集 |
| 1.5 小柴胡汤治疗HB核心靶基因的KEGG富集 |
| 2. 结果 |
| 2.1 小柴胡汤活性成分基本信息 |
| 2.2 HB的DEGs筛选 |
| 2.3 PPI网络构建与小柴胡汤治疗HB的核心靶基因筛选 |
| 2.4 GO功能富集分析 |
| 2.5 KEGG信号通路富集 |
| 3. 讨论 |
| 第二章 小柴胡汤治疗LC的网络药理学分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 LC基因芯片数据选取与DEGs的筛选 |
| 1.2 PPI网络构建与小柴胡汤治疗LC的核心靶基因筛选 |
| 1.3 小柴胡汤治疗LC核心靶基因的GO富集 |
| 1.4 小柴胡汤治疗LC核心靶基因的KEGG富集 |
| 2. 结果 |
| 2.1 LC的DEGs筛选 |
| 2.2 PPI网络构建与小柴胡汤治疗LC的核心靶基因筛选 |
| 2.3 GO功能富集分析 |
| 2.4 KEGG信号通路富集 |
| 3. 讨论 |
| 第三章 小柴胡汤治疗HCC的网络药理学分析 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 HCC基因芯片数据选取与DEGs的筛选 |
| 1.2 PPI网络构建与小柴胡汤治疗HCC的核心靶基因筛选 |
| 1.3 小柴胡汤治疗HCC核心靶基因的GO富集 |
| 1.4 小柴胡汤治疗HCC核心靶基因的KEGG富集 |
| 1.5 核心靶基因生存分析 |
| 2. 结果 |
| 2.1 HCC的DEGs筛选 |
| 2.2 PPI网络构建与小柴胡汤治疗HCC的核心靶基因筛选 |
| 2.3 GO功能富集分析 |
| 2.4 KEGG信号通路富集 |
| 2.5 核心靶基因生存分析 |
| 3. 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）MiR-301a-3p靶向VGLL4促进肝癌细胞进展的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-301a-3p在肝癌中的表达及其临床意义 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 MiR-301a-3p在肝癌组织与癌旁正常肝组织中的表达差异 |
| 3.2 手术患者临床病理资料 |
| 3.3 miR-301a-3p mRNA表达水平与肝癌临床病理因素之间的关系 |
| 3.4 miR-301a-3p的表达情况与肝癌患者预后之间的关系 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 miR-301a-3p在肝癌中的生物学功能研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 MiR-301a-3p在肝癌细胞系中的表达情况 |
| 3.2 miR-301a-3p inhibitor/mimics转染效能检测 |
| 3.3 miR-301a-3p体外功能的验证 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三部分 miR-301a-3p可调节肝癌细胞中的VGLL4 表达 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 RT-PCR检测转染miR-301a-3p inhibitor/mimics对肝癌细胞VGLLmRNA表达水平的影响 |
| 3.2 Western blot检测转染miR-301a-3p inhibitor/mimics对肝癌细胞VGLL4 蛋白表达水平的影响 |
| 3.3 miR-301a-3p对其靶基因VGLL4 的作用位点生物学预测分析 |
| 3.4 双荧光素酶实验证实VGLL4是miR-301a-3p的直接靶基因 |
| 3.5 双荧光素酶实验证实miR-301a-3p对转录因子TEAD转录活性的影响 |
| 3.6 RT-PCR法检测miR-301a-3p对 Hippo通路下游靶基因的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第四部分 miR-301a-3p靶向VGLL4 促进肝癌细胞进展的分子机制 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 CCK-8 法检测VGLL4 能否削弱miR-301a-3p所诱导的肝癌细胞增殖能力增强 |
| 3.2 Transwell 侵袭实验检测 VGLL4 能否削弱 mi R-301a-3p 所诱导的肝癌细胞侵袭能力增强 |
| 3.3 平板克隆形成实验检测VGLL4 能否削弱miR-301a-3p所诱导的肝癌细胞化疗抵抗 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 MicroRNAs 在肝癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）槲皮素通过靶向人抗原蛋白R抑制肝癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 中药单体槲皮素抑制肝癌细胞增殖转移的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 实验细胞系 |
| 2. 实验动物 |
| 3. 实验试剂及实验仪器 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. 细胞药物处理 |
| 3. 细胞增殖实验 |
| 4. 细胞迁移和侵袭实验 |
| 5. 细胞凋亡实验 |
| 6. 裸鼠荷瘤及给药模型的构建 |
| 7. 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1. 槲皮素可以抑制HCC细胞的增殖 |
| 2. 槲皮素可以诱导HCC细胞的凋亡 |
| 3. 槲皮素可以抑制HCC细胞的侵袭及转移 |
| 4. 槲皮素可以抑制体内HCC的生长 |
| 三、分析与讨论 |
| (一)中药治疗HCC的认识及发展 |
| 1. 中医对肝癌的认识 |
| 2. 肝癌的中医病因学研究 |
| 3. 肝癌的中医治疗思想 |
| 4. 肝癌常用的治疗方剂与中药 |
| 5. 中药可改善HCC患者症状及预后 |
| 6. 中药可改善化疗药物的副反应 |
| 7. 中药治疗HCC的分子机制 |
| 8. 中医治疗HCC的挑战 |
| (二) 槲皮素的肝脏保护作用和抗肿瘤机制研究 |
| 1. 槲皮素广泛存在于抗肿瘤中药且安全低毒 |
| 2. 槲皮素对肝脏具有多重保护作用 |
| 3. 槲皮素治疗HCC的机制 |
| 四、小结 |
| 第二部分 槲皮素靶向人抗原蛋白HuR调控LINC01123治疗肝癌的机制研究 |
| 第一章 长链非编码RNA LINC01123通过调节miR-34a-5p/TUFT1轴促进肝癌细胞的增殖和侵袭 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| (二)实验方法 |
| 1. 临床样本的收集分析 |
| 2. 细胞转染 |
| 3. 组织或细胞的RNA提取 |
| 4. 荧光定量PCR |
| 5. 细胞增殖实验 |
| 6. 细胞迁移和侵袭实验 |
| 7. 蛋白样品制备及免疫印迹实验 |
| 8. 双荧光素酶报告基因检测系统实验 |
| 9. RNA免疫共沉淀分析 |
| 10. 裸鼠荷瘤模型的构建 |
| 11. 生物信息学分析 |
| 12. 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1. LINC01123在HCC组织中表达上调,与患者的预后不良相关 |
| 2. LINC01123促进HCC细胞增殖和侵袭 |
| 3. LINC01123沉默抑制了体内HCC的生长 |
| 4. LINC01123通过海绵吸附作用,靶向结合miR-34a-5p |
| 5. LINC01123可通过miR-34a-5p/TUFT1轴促进HCC进展 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 第二章 HuR可增加LINC01123的稳定性并促进其表达 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 生物信息学分析 |
| 2. 细胞转染 |
| 3. HuR敲低的细胞系中LINC01123半衰期的测定 |
| 4. RNA免疫共沉淀分析 |
| 5. 细胞RNA的提取 |
| 6. 荧光定量PCR |
| 7. 蛋白样品制备及免疫印迹实验 |
| 8. 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1. HuR在HCC组织中高表达,与LINC01123的表达量呈正相关关系 |
| 2. LINC01123与HuR存在潜在的结合可能 |
| 3. HuR能增加LINC01123的稳定性,并单向促进LINC01123的表达 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 第三章 槲皮素靶向HuR作用于LINC01123抑制HCC的增殖与转移 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 生物信息学分析 |
| 2. 细胞药物处理 |
| 3. 细胞RNA的提取 |
| 4. 荧光定量PCR |
| 5. 细胞增殖实验 |
| 6. 细胞迁移及侵袭实验 |
| 7. 细胞凋亡实验 |
| 8. 蛋白样品制备及免疫印迹实验 |
| 9. 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1. HuR是槲皮素的潜在作用靶点 |
| 2. 槲皮素通过靶向HuR下调LINC01123的表达并抑制HCC的进展 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 学术成果 |
| 致谢 |
| 文献综述 人抗原蛋白R与肿瘤耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（10）“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文名称缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察 |
| 1 一般资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 纳入标准 |
| 2.2 排除标准 |
| 2.3 剔除标准 |
| 2.4 退出标准 |
| 2.5 中止标准 |
| 2.6 观察指标:包括安全性观察指标和疗效性观察指标 |
| 2.7 疗效判断 |
| 3 治疗方法 |
| 4 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 三组患者基线资料比较 |
| 5.2 三组患者治疗前后生存率及生存期比较 |
| 5.3 三组患者治疗前后肿瘤大小比较 |
| 5.4 三组患者治疗前后生化指标水平比较 |
| 5.5 三组患者中医证候评分比较 |
| 5.6 三组患者生存质量评分比较 |
| 5.7 观察指标对患者疗效及预后的影响 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”对晚期肝癌患者生存率及生存期的影响 |
| 2 肝癌肝再生微环境及“补肾生髓成肝”的改善作用 |
| 3 “补肾生髓成肝”对患者中医证候评分及生存质量的影响 |
| 4 “补肾生髓成肝”对患者并发症及预后的影响 |
| 参考文献 |
| 第二部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的疗效机制研究 |
| 1 研究样本及方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验操作流程 |
| 2 统计学处理方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝再生相关细胞因子正态性检验结果 |
| 3.2 肝再生相关细胞因子在各组人群中表达的差异性 |
| 3.3 肝再生相关细胞因子表达水平之间的相关性分析 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”疗法相关研究进展 |
| 2 “补肾生髓成肝”改善肝再生微环境防治肝癌的疗效机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述一 肝癌微环境的研究现状 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中医药影响肝癌微环境的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中医证候评分量表 |
| SF-36 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
四、肝癌和肝硬化组织中凋亡信号蛋白的表达（论文参考文献）
- [1]PTEN相关ceRNA网络的构建及肝癌发病机制的初步研究[D]. 石怡. 湖南工业大学, 2021(02)
- [2]miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究[D]. 陈凯. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]miR-557通过靶向RAB10调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝癌进展的机制研究[D]. 叶善平. 南昌大学, 2021(01)
- [4]TEM1通过GAS6/AXL通路调控肝纤维化的机制研究[D]. 周祥. 延安大学, 2021(09)
- [5]芪术抗癌方对肝细胞癌干性标志物影响的研究[D]. 孙新锋. 广州中医药大学, 2021(02)
- [6]柴芪益肝方治疗肝纤维化的临床和实验研究[D]. 周怡驰. 北京中医药大学, 2021(01)
- [7]基于网络药理学联合基因芯片数据探讨小柴胡汤治疗肝炎-肝硬化-肝癌的机制演变[D]. 郑雅. 宜春学院, 2021(08)
- [8]MiR-301a-3p靶向VGLL4促进肝癌细胞进展的分子机制[D]. 胡金花. 南昌大学, 2021(01)
- [9]槲皮素通过靶向人抗原蛋白R抑制肝癌进展的机制研究[D]. 肖遵强. 浙江中医药大学, 2021(02)
- [10]“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究[D]. 刘皎皎. 湖北中医药大学, 2021