一、流感病毒A HA(H3N2)基因真核表达载体的构建及序列分析（论文文献综述）
石晓娜[1]（2020）在《PB2蛋白576E对H3N2犬流感病毒哺乳动物适应性的作用及其机制研究》文中提出H3N2犬流感病毒（Canine influenza virus,CIV）是一种由禽流感病毒跨宿主传染至犬,可在犬间迅速传播的传染性呼吸道病毒,在亚洲多国以及美国的犬中广泛流行,易伴随继发性感染,对犬的健康造成极大危害。实验室前期研究发现两株在鼠上复制能力完全不同的毒株:一株禽源H3N2 CIV（A/canine/Zhejiang/01/2012）（简称为ZJ01）,鼠上复制良好,但无法感染禽;一株H3N2禽流感病毒（A/chicken/Shanghai/D6/2012）（简称为SHD6）,不感染小鼠。ZJ01-PB2被SHD6-PB2替换后,ZJ01病毒无法成功拯救;反之,将ZJ01-PB2替换到SHD6毒株之后,SHD6在鼠上复制能力从不感染变为复制良好。本研究重点阐明PB2对ZJ01病毒在哺乳动物中的适应性及作用机制。分别以ZJ01和SHD6为背景,通过聚合酶活性实验测定单、双基因替换后的聚合酶活性,结果显示,ZJ01-PB2是影响ZJ01病毒株聚合酶活性的关键基因。通过替换PB2基因的五个功能区测定聚合酶活性,结果发现,ZJ01 PB2蛋白的627-domain对聚合酶活性具有重要作用。对比ZJ01和SHD6的627-domain发现存在4个不同的氨基酸位点,通过单点突变测定聚合酶活性,结果表明,PB2蛋白576E可显着上调ZJ01和SHD6病毒的聚合酶活性,表明位于627-domain的576氨基酸位点是影响聚合酶活性的关键氨基酸位点。为验证PB2蛋白576E对ZJ01病毒复制的作用,通过反向遗传操作系统拯救到四株病毒:r-ZJ01、r-ZJ01-PB2-E576K、r-SHD6和r-SHD6-PB2-K576E。鼠的感染实验结果显示,与同背景下的病毒株r-ZJ01-PB2-E576K或r-SHD6-PB2相比,PB2蛋白携带576E的毒株r-ZJ01和r-SHD6-PB2-K576E在鼠上的复制能力显着提高。同时,通过测定r-ZJ01、r-ZJ01-PB2-E576K、r-SHD6和r-SHD6-PB2-K576E在不同宿主细胞（MDCK和CEF）中的生长曲线,结果表明,PB2蛋白576E可显着提高r-ZJ01或r-SHD6在MDCK上的复制能力,但PB2-576E/K对r-ZJ01或r-SHD6在CEF上复制能力无明显作用。这些结果表明,PB2-576E是影响ZJ01病毒株在哺乳动物细胞MDCK上复制的关键氨基酸位点。现有的研究表明宿主蛋白ANP32A可与流感病毒PB2蛋白627-domain互作从而调控流感病毒聚合酶活性。为鉴定PB2蛋白576E与宿主蛋白ANP32A是否存在互作,通过CO-IP实验进行了鉴定,结果显示,携带576E的PB2蛋白与不同宿主ANP32A的相互作用显着强于PB2-576K。进一步地,测定过表达不同宿主蛋白ANP32A对ZJ01和SHD6聚合酶活性的影响,结果表明,PB2-E576K使ZJ01的聚合酶活性显着下降,且过表达人或犬的ANP32A不能使ZJ01-PB2-E576K和SHD6的聚合酶活性升高。以上结果表明,哺乳动物源ANP32A只能识别PB2-576E,从而使得犬流感病毒ZJ01在哺乳动物细胞中具有较高的聚合酶活性。进一步说明PB2-576E与哺乳动物源ANP32A互作是上调ZJ01聚合酶活性的必要条件。综合上述,PB2-576E通过与宿主蛋白ANP32A互作调控ZJ01病毒在哺乳动物中的聚合酶活性,从而使该病毒在哺乳动物中具有较强的复制能力,为今后深入理解H3N2 CIV在哺乳动物的复制与适应机制奠定了基础。
付橙[2]（2019）在《MDA5基因在犬流感病毒感染中的作用和机制研究》文中研究表明犬流感（canine influenza,CI）是由正粘病毒科A型流感病毒属犬流感病毒（canine influenza virus,CIV）引起的一种犬属动物的接触性呼吸道传染病。主要引起犬的发热、咳嗽、打喷嚏、食欲减退、精神沉郁等临床症状,严重感染时可引起呼吸系统衰竭甚至死亡。犬虽然是CIV的天然宿主,但是由于流感病毒的高度变异性使其可以跨宿主传播,从而给人类的健康和生活带来潜在的风险。目前,已有犬感染CIV的研究报道,但是CIV在犬体内持续感染及导致犬死亡的机制尚不清楚。本研究首先采用二代测序技术,对感染H3N2和H5N1亚型的幼犬,分别在感染第三天和第七天,采集气管和肺脏组织,建立转录组和mi RNA数据库,并运用生物信息学技术对差异基因进行分析。结果发现,CIV感染幼犬后,共检测到455个mi RNA和22516个m RNA,通过生物学分析,发现这些基因主要参与免疫和信号传导相关的通路调节。此外,通过对不同感染组之间比较,联合H3N2和H5N1数据分析,共发现有151个差异表达的基因,这些基因与机体免疫反应有关,并参与调节细胞因子受体间的相互作用、A型流感病毒和RIG-I样受体通路,而且参与生物调节、信号传导和免疫系统等生物过程。天然免疫组成宿主的第一道防线来抵抗病原体的侵入,其中干扰素调节的天然免疫发挥重要作用。转录组学结果表明,CIV感染能影响Toll样受体和RIG-I样受体调节的天然免疫反应。MDA5是RIG-I样受体的一种,病毒感染宿主后,MDA5通过识别配体激活干扰素,使机体产生抗病毒反应。为研究MDA5基因在CIV感染中的作用,首先对MDA5进行组织分布研究发现,结果发现MDA5主要分布在犬脾脏、肝脏和肺脏等组织中;进一步对MDA5基因结构进行研究,发现MDA5基因的蛋白序列与猫的同源性相近,结构预测发现犬MDA5主要由CARD结构域、RD结构域和DEx D/H解螺旋结构域组成。为验证MDA5发挥功能的区域,成功克隆出犬的MDA5全基因序列和MDA5的各个功能域序列（p3x FLAG-MDA5、p3x FLAG-MDA5-CARD、p3x FLAG-MDA5△CARD+RD、p3x FLAG-MDA5△RD和p3x FLAG-MDA5△CARD）,大小分别为:3087 bp、603 bp、2103 bp、2706 bp和2485 bp。运用IFA和Western Blot的方法对其进行表达验证。为探究犬MDA5基因对信号通路的调节作用,首先通过双荧光素酶实验,发现MDA5基因的CARD区能较强的激活IFN-β启动子（p<0.001）,并且MDA5主要是通过CARD区向下游传导信号。过表达MDA5的CARD区,发现MDA5介导的信号通路可以通过激活IRF3和NF-κB启动子向下游传导信号,且激活IRF3的能力更强。对MDA5进行特异性功能沉默后,机体细胞因子的产生降低,抗病毒活性减弱,而且流感病毒的复制能力增强,说明MDA5主要通过CARD区域抑制CIV病毒的复制。另外,MDA5的CARD区域能够显着激活另外两个模式识别受体LGP2和RIG-I的表达,且CARD区域能够激活RIG-I样通路及其下游的ISGs通路,促进抗病毒蛋白的表达和细胞因子的释放,从而发挥抑制病毒复制的功能。流感病毒蛋白和宿主之间的相互作用,决定了病毒在不同宿主中的适应性和致病性,而且病毒蛋白能够通过与宿主蛋白相互作用而逃避宿主免疫。为进一步探究MDA5基因对流感病毒的作用机制,本文通过Bi Fc和Co-IP实验,发现MDA5能够与v RNPs发生相互作用,而且PB2和NP与MDA5相互作用产生的Bi Fc信号主要定位在细胞核。此外,Bi Fc实验还发现MDA5能与流感病毒的NS1蛋白产生相互作用。NS1蛋白能够通过与ds RNA结合来抑制干扰素的表达,而且NS1蛋白能通过增强病毒蛋白的合成或者阻止细胞m RNA的翻译来影响病毒的复制。为探索NS1蛋白对MDA5的作用,首先验证NS1蛋白对v RNPs和MDA5相互作用的影响。分别共转染NS1和v RNPs基因,结果发现NS1对病毒v RNPs的表达没有明显影响。为进一步验证NS1蛋白对MDA5的作用,本文通过构建真核表达NS1基因并利用反向遗传技术,来分析NS1对MDA5所调节通路的作用。通过双荧光素酶实验发现,CIV的NS1蛋白能够拮抗MDA5的CARD区域对干扰素和IRF3启动子的激活作用,而且CIV的NS1蛋白对MDA5的CARD结构域调节的RIG-I通路和下游的ISGs基因也有拮抗作用。说明NS1能够通过MDA5基因来调节病毒的复制。综上所述,本文建立了高致病性H5N1和低致病性H3N2 CIV的转录组数据库;探究了H5N1 CIV和H3N2 CIV感染比格犬后在不同病程中,宿主m RNA和mi RNA表达谱的差异性,并对差异基因进行了信息学分析;发现了不同mi RNA与病症相关m RNA的相互关系,具有重要的生物学价值。此外,本文通过克隆犬的MDA5基因,并对MDA5基因的各个功能域验证,发现MDA5主要通过CARD区域发挥抗病毒功能,而且能与v RNPs产生相互作用。同时发现CIV能够通过NS1蛋白来拮抗MDA5调节的信号通路,以此来逃避天然免疫。本文为流感病毒的防控提供了理论支持,并为进一步研究流感病毒与宿主天然免疫的关系提供了思路。
郝小利[3]（2018）在《H9N2内部基因盒对H5亚型重配禽流感病毒致病力的影响及其机制研究》文中进行了进一步梳理S基因型H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）是当前的主流基因型,并以完整内部基因盒的方式频繁地为H7N9、H10N8和H5N6等致人感染的新型重配流感病毒提供全套内部基因。当前H5和H9亚型AIV在国内共同流行,使得两者极易发生自然重配,并且禽及人感染病例中均已出现了内部基因完全来源于H9N2的新型重配H5病毒。因此,为了评估此类重配病毒的生物危害,迫切需要探讨当前优势S基因型H9N2病毒的内部基因盒对不同进化分支H5病毒致病力的影响。S基因型H9N2病毒是在国内前期流行的H基因型骨架上先后引入了 G1-like进化谱系的M和PB2基因,即分别替换掉F/98-like进化谱系的M和PB2基因而形成的。然而,不同H9N2进化谱系的PB2和M基因对于重配H5病毒会产生什么样的生物学效应?其相关的分子机制又如何?本文研究了不同基因型H9N2内部基因盒对当前优势流行H5亚型AIV致病力的影响,并进一步探究了其致病力差异的分子机制和宿主因素。我们发现S基因型H9N2的全套内部基因能明显降低重配H5病毒对鸡和小鼠的致病力。但是,与S基因型相比,含H基因型内部基因盒的H5亚型重配病毒在鸡和小鼠中的毒力更弱。进一步地,我们发现含有G1-like M或G1-like PB2基因的重配H5病毒比含有F/98-like M或F/98-like PB2基因的重配H5病毒在SPF鸡和BABL/c小鼠上具有更强的适应性。此外,进一步通过研究PB2和M基因的分子功能发现,G1-like PB2可通过增强RNP聚合酶活性和PB2蛋白的核输入效率,而G1-like M则通过增加球形病毒粒子比例和协助RNP核输出效率来增强重配H5病毒在动物模型中的生存力。最后,从宿主因素的角度,我们应用差异蛋白组探索了重配H5病毒致病性差异的分子机制,发现相比内部基因盒为H基因型的重配H5病毒（H5/H）,内部基因盒为S基因型的重配H5病毒（H5/S）介导的更强烈的先天性免疫应答可能与其在鸡模型上的高毒力相关。1.S基因型H9N2内部基因盒对H5亚型重配病毒致病力的影响S基因型H9N2流感病毒频繁提供全套内部基因给其它新型重配病毒,如H7N9、H10N8、H5N2及H5N6,对人类的健康和养禽业的发展构成巨大的威胁。但是,含S基因型H9N2病毒内部基因盒的重配H5病毒（H5/S）对鸡和小鼠的致病性和传播性的影响知之甚少。在本研究中,利用反向遗传技术获得4株H5亚型重配病毒,其外部基因来自不同流行分支的H5 HPAIV,而内部基因盒来自当前优势流行的S基因型H9N2病毒。我们发现重配病毒H5/S对SPF鸡和BABL/c小鼠的毒力相比各自的母本H5病毒均降低,且H5/S引起的平均死亡时间比各自母本H5病毒更长。与此相一致,H5/S的聚合酶活性、病毒在哺乳动物细胞和禽类细胞上的复制能力以及在鸡和小鼠肺脏的细胞因子应答能力均比各自母本H5病毒更低。此外,SPF鸡的传播效率试验结果显示所有H5/S病毒均具有直接接触传播能力但无气溶胶传播能力,并且H5/S病毒喉头排毒时间能持续到至少第7天。因此,以上结果表明S基因型H9N2病毒内部基因盒在致弱重配H5病毒对鸡和小鼠的致病性和延长排毒时间中扮演着重要作用,并且我们推测致弱的此类重配H5病毒在哺乳动物和禽类动物中可能更易流行。2.H9N2不同进化谱系PB2和M基因对重配H5病毒在禽类动物模型上致病性的影响及机制探索S基因型H9N2亚型AIV,自2010年以来,在我国已经发展成优势流行基因型,且频繁提供内部基因给新型重配病毒如H5N6、H10N8和H7N9等。S基因型病毒是在早期的H基因型病毒内部基因骨架上将F/98-like的M和PB2基因替换为G1-like的M和PB2基因而形成的。但是,这种不同进化谱系基因片段的替换是如何影响新型重配流感病毒的适应性目前还不清楚。在本研究中,我们发现相比较于H5/H,重配H5/S病毒在CEF细胞上和SPF鸡模型上显示出更强的毒力和复制能力。并且,G1-like PB2基因比F/98-like PB2基因赋予重配H5病毒更高的聚合酶活性和更强的核输入效率,而G1-like M基因比F/98-like M基因赋予重配H5病毒更多的球形病毒粒子和更有效的RNP核输出。因此,我们的结果表明含有G1-likeM和PB2基因的S基因型H9N2内部基因盒,优于含有F/98-like M和PB2基因的H基因型H9N2内部基因盒,更有助于重配H5病毒的适应,从而可以部分解释为什么S基因型频繁参与致人感染的新型重配病毒的出现。3.H9N2不同进化谱系PB2和M基因对重配H5病毒在哺乳类动物模型上致病性的影响及机制探索S基因型H9N2 AIV频繁为H5N6、H10N8和H7N9等感染人的重配流感病毒提供内部基因。S基因型的一个关键特征表现在早期的F/98-like M和PB2基因被G1-like M和PB2基因替代。但是,究竟何种H9N2内部基因组合对病毒在哺乳动物上的适应性提高有贡献目前还不甚清楚。在本研究中,我们发现含G1-likeM或G1-like PB2基因的重配H5病毒相比含有F/98-like M或F/98-like PB2基因的重配H5病毒在小鼠中具有更强的毒力和复制能力。与此相一致,重配H5病毒携带G1-llike M或G1-like PB2基因相比携带F/98-like M或F/98-like PB2基因在哺乳动物细胞上显示出更高效的复制能力和更高的病毒蛋白表达水平。并且,相比较于M基因,PB2基因的作用更关键。进一步的研究发现,相比F/98-like PB2和M,G1-like PB2基因赋予重配H5病毒更强的聚合酶活性和更高的PB2蛋白核输入效率,而G1-like M基因赋予重配H5病毒更多的球形病毒粒子和更高效的RNP核输出效率。因此,我们的结果表明H9N2病毒的G1-like M或G1-like PB2基因能赋予H5亚型重配病毒更强的适应性,从而可能增强新型重配病毒感染哺乳动物的能力。4.基于TMT技术研究含S和H基因型H9N2内部基因盒的重配H5病毒感染鸡肺脏的差异表达蛋白前期研究表明,含有S基因型或H基因型H9N2内部基因盒的重配H5病毒在SPF鸡中的致病性存在显着差异。含有S基因型的H5/S重配病毒对鸡表现为高致病性,而含有H基因型的H5/H重配病毒为低致病性。在本研究中,为了探究造成这种致病性差异的宿主因素,我们系统比较了 H5/S和H5/H重配病毒对鸡的毒力和感染鸡后的肺脏差异蛋白质组学。我们发现H5/S诱发鸡严重的肺损伤,而H5/H仅仅引起鸡肺脏轻微的损伤。通过TMT联合LC-MS/MS蛋白定量技术,首先,我们发现H5/S刺激宿主的差异蛋白数目明显多于H5/H。进一步差异蛋白生物功能分析结果表明,H5/S诱导宿主的先天性免疫应答相关生物学功能明显强于H5/H,其中包括炎症反应、杀死细胞和细胞因子反应等。与此相一致,KEGG通路分析进一步证实了 H5/S刺激宿主先天性免疫反应相关的通路多于H5/H,并对病毒的感染产生了广泛的生物学效应,其中包括NOD-like受体信号通路、MAPK信号通路、RIG-Ⅰ-like受体信号通路、Toll-like受体信号通路和A型流感感染等。此外,我们还发现H5/S所诱导的差异蛋白,RELA,参与了病毒感染反应中的许多重要通路。因此,我们的结果表明H5/S诱导的肺损伤相关的宿主先天性免疫应答反应可能有助于增加肺病变程度,从而增强重配病毒对鸡的毒力。
谢星[4]（2016）在《H3N2亚型犬流感病毒保护性单抗的制备及宿主microRNA对病毒复制的影响》文中研究表明H3N2亚型犬流感病毒（canine influenza virus,CIV）是一种在犬群中流行的能够引起犬咳嗽、高热、肺炎甚至死亡的高度接触性传染病。犬流感病毒不仅对犬类的生存和健康带来严重的危害,同时也给人类健康带来巨大的风险,如果能够制备针对犬流感病毒的有效单抗,并阐明犬流感病毒的感染机制,无疑将有效地促进对犬流感病毒感染的预防和控制。然而,目前却尚无针对H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体,亦没有研究该病毒的合适细胞模型。因此,本研究制备了针对H3N2亚型犬流感病毒的保护性单克隆抗体,并建立了永生化的犬细支气管上皮细胞作为研究犬流感病毒的细胞模型。另外,本研究还获得了原代犬细支气管上皮细胞和原代犬肺泡巨噬细胞感染H3N2亚型犬流感病毒后的microRNA差异表达谱,并对其中的3个microRNA的作用进行了研究,研究结果表明宿主细胞在被犬流感病毒感染后,能够通过改变microRNA的水平来影响病毒在细胞内的复制,研究结果有助于阐明犬流感病毒感染宿主细胞的分子机制。1. H3N2亚型犬流感病毒单克隆抗体的制备及相关特性分析在对H3N2亚型犬流感病毒A/Canine/Jiangsu/06/2010 （JS/10）株进行扩增和纯化的基础上,以全病毒作为免疫抗原皮内多点注射免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合及杂交瘤细胞的亚克隆,获得了7株能够分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,随后利用7株杂交瘤细胞制备了腹水并进行纯化,最终获得了 7株单克隆抗体,并对单克隆抗体的特性进行了分析。其中,单抗D7的中和效价达了 1:12800,并且对不同的H3N2亚型流感病毒株具有交叉反应性;Western blot鉴定结果表明,该单抗所针对的抗原表位位于相对保守的HA2片段。本研究制备的针对H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体,为该病毒的检测及其感染的治疗提供了物质基础,具有潜在的应用价值。2.单克隆抗体对不同H3N2亚型流感病毒株感染的保护作用为评估单克隆抗体D7对H3N2亚型犬流感病毒感染的保护作用,本研究以BALB/c小鼠为感染模型,评估了单抗D7对H3N2亚型犬流感病毒江苏分离株JS/10、广东分离株GD/12以及H3N2亚型猪流感病毒山东分离株SD/05感染的保护效果。将单抗D7预先给小鼠注射后,分别感染上述3种流感病毒,并以非相关单抗、单独病毒感染以及PBS作为对照,于病毒感染后第2、4、6、10和14天等5个时间点,分别测定小鼠体重,血液、粪便及不同脏器中的病毒载量,以及肺组织中的细胞因子（IFN-γ和TNF-α）水平。同时,对小鼠的肺、心、脑3种脏器进行组织病理学观察及免疫组化分析。实验结果表明,单抗D7对以上3株H3N2亚型流感病毒株的感染均起到了一定的免疫保护作用,其中对JS/10株的保护效果最好,表现为腹腔注射单抗D7后,较好的维持了感染小鼠的体重,降低了各脏器的病毒载量,并减轻了病毒感染对各脏器所造成的组织病理损伤,降低了与病毒感染相关的IFN-γ和TNF-α表达水平。本研究说明单抗D7对H3N2亚型流感病毒感染具有良好的防控效果。3. 永生化犬细支气管上皮细胞系的建立及其特征分析为深入研究犬流感病毒的致病机制,本研究分离并培养了原代犬细支气管上皮细胞（CBECs）,并在此基础上,将端粒酶（hTERT）基因以真核重组表达质粒（pEGFP-hTERT）的形式转入CBECs中,建立了永生化的犬细支气管上皮细胞系（hTERT-CBECs ）。特性分析表明,永生化的hTERT-CBECs保留了原代细胞的形态和功能特征;实时定量PCR（qRT-PCR）、增殖试验、核型分析、端粒酶活性检测以及Western blot等方法证实,永生化犬细支气管上皮细胞传至第50代,仍具有很强的端粒酶活性、延长的增殖寿命以及二倍体染色体特征;软琼脂分析和裸鼠体内致瘤性试验均表明,该永生化细胞系不具有致瘤性。本试验获得的原代犬细支气管上皮细胞及永生化犬细支气管上皮细胞系,为探讨犬流感病毒等呼吸道病原的感染机制提供了重要的生物材料。4. CIV感染犬原代细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞的microRNA表达谱分析分离培养了原代犬细支气管上皮细胞和原代犬肺泡巨噬细胞,并通过small RNA测序和microRNA基因芯片测序,获得了以上两种细胞在感染H3N2亚型犬流感病毒后的microRNA表达谱。分析结果表明,在原代犬细支气管上皮细胞和原代犬肺泡巨噬细胞中,分别检测到了421和292个microRNA （miRNA）的表达,其中差异表达倍数在2倍以上的miRNA分别有117个和71个。通过TargetScan、PITA和miRanda数据库对这些差异表达miRNA的靶基因进行预测,并在Gene Ontology和KEGG数据库中对这些靶基因的功能进行预测注释,结果表明这些差异表达miRNA主要参与抗病毒应答,凋亡应答和趋化因子细胞因子炎性应答等信号通路。另外,试验还通过qRT-PCR对测序结果进行了验证,结果表明qRT-PCR结果与测序结果中miRNA的表达水平变化趋势一致,说明测序结果较可靠。研究所得到的miRNA表达谱,为犬流感病毒致病机制的研究提供了重要信息。5.宿主细胞microRNA对H3N2亚型犬流感病毒复制的影响选择病毒感染后表达水平显着下调的3个miRNA: cfa-miR-125b、cfa-miR-151和cfa-miR-423a,并对其在细胞抵抗病毒感染中的作用展开研究。试验以永生化的犬细支气管上皮细胞（hTERT-CBECs）和犬巨噬细胞系（DH82）为基础,分别以腺病毒载体和慢病毒载体,构建了3个miRNA的稳定过表达和抑制细胞系,然后分析3个miRNA过表达或者表达被抑制后,对病毒在相应细胞中的复制能力进行评估,同时对感染细胞中病毒的NP和NS1表达水平进行检测。研究结果显示,cfa-miR-125b和cfa-miR-151的过表达能够促进病毒的复制,而当这两种miRNA的表达被抑制后,则会导致病毒复制能力显着下降,而cfa-miR-423a的过表达和抑制则对病毒的复制能力没有明显影响。同时qRT-PCR和Western blot检测结果也显示cfa-miR-125b和cfa-miR-151的过表达和抑制分别能够提高和降低NP和NS1的表达水平,并且这种现象在hTERT-CBECs和DH82细胞中均存在。此外,在上述两种细胞中,无论cfa-miR-423a过表达还是抑制都能抑制NP的表达水平,而对NS1的表达水平没有影响。本试验表明,当细胞受到H3N2犬流感病毒感染后,可以通过改变自身的miRNAs水平来调控病毒的复制。该研究有助于进一步阐明细胞对病毒感染的抵抗机制。
王军政[5]（2015）在《鸭源禽流感病毒的分离鉴定及其聚合酶活性研究》文中指出AIV分为多种血清亚型,目前已鉴定出有17种HA亚型和10种NA亚型。几乎所有亚型的AIV都可以感染禽类,能感染人的AIV主要为H1、H3、H5、H6、H7、H9和H10亚型,其中以H5亚型最为常见。由于宿主范围的限制,AIV很少感染人类。然而,近年来禽流感H5N1亚型造成人类感染的病例却不断增加。虽然到目前为止,持续的AIV感染人类的病例尚未见报道,但在环境和机体免疫的选择压力下,禽流感H5亚型的适应性突变和不断的抗原漂移现象,可能导致其跨越物种屏障,实现在人群中传播。因此,加强对新发H5亚型AIV致病性和传播力的研究,对防控AIV的大规模传播具有至关重要的作用。本研究采集病死鸭病料,常规处理后接种于10日龄SPF鸡胚,收取24-96h内死亡鸡胚尿囊液,进行血凝和血凝抑制实验、核酸鉴定及HA和NA基因序列分析。结果表明,该分离株为H5N5亚型,命名为A/Duck/Changchun/01/2010。HA和NA基因进化分析显示,该毒株属于新型H5N5流感病毒2.3.2.1系,主要在东亚地区流行。该研究结果为进一步研究鸭源H5N5禽流感病毒的分子进化提供了重要信息。为进一步研究该分离毒株的进化特点,设计并合成扩增核蛋白（NP）基因、聚合酶蛋白（PB2、PB1、PA）基因的特异性引物,对核蛋白（NP）、聚合酶蛋白（PB2、PB1、PA）RNA进行反转录,并进行PCR扩增,获得分离毒株PB2、PB1、PA、NP基因序列。同时利用生物信息学软件或在线分析软件分析其信号肽、跨膜区和疏水性,并预测潜在的糖基化位点和磷酸化位点。对比分析后发现,该毒株与我国南方水禽主要流行的AIV同源性较高。禽流感病毒PB2基因的第627位氨基酸和第701位氨基酸对于AIV跨种间传播起到重要作用,为了解该病毒聚合酶活性及PB2基因的第627位氨基酸和第701位氨基酸突变后引起聚合酶活性变化情况。利用点突变技术,针对实验中测定的聚合酶基因序列设计酶切位点,对四个质粒进行双酶切,将酶切后的产物与表达载体进行连接,连接后分别对PB2基因的1879位和2101位碱基进行点突变,使禽流感病毒PB2基因第627位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸,第701位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺。将聚合酶蛋白转染到293T细胞中,通过检测荧光活性值报告病毒聚合酶复合体的活性。结果表明,禽流感病毒A/duck/changchun/01/2010的聚合酶蛋白荧光值较低,PB2基因2101位碱基突变对聚合酶蛋白活性影响不大,PB2基因1879位碱基突变能提高聚合酶蛋白活性,两个碱基同时突变聚合酶蛋白活性明显提高。
李德生[6]（2012）在《大熊猫源H1N1流感病毒的分离鉴定、全基因组序列分析、感染性克隆构建及疫苗研究》文中认为流感病毒（Influenza virus）属于正黏病毒科流感病毒属成员,可分甲、乙、丙三个型,其基因组由分节段单股负链的RNA组成。流感病毒广泛流行于世界各国,对养殖业造成了巨大经济损失的同时,对人类的健康也构成了潜在的威胁,因此,对流感病毒的研究在公共卫生上也有相当重要的意义。对此,本研究通过鸡胚接种、MDCK细胞培养、血凝及血凝抑制实验和RT-PCR等方法,首次从大熊猫鼻腔分泌物中分离并鉴定了一株既能在鸡胚上稳定传代又能在MDCK细胞上稳定产生细胞病变,即以细胞颗粒增多、肿胀、漂落为特征的大熊猫HINI亚型流感病毒,命名为A/Panda/Sichuan/01/2011（H1N1）。大熊猫流感病毒A/Panda/Sichuan/01/2011（H1N1）全基因克隆和序列分析本文根据GenBank报道的流感病毒H1N1亚型基因序列,对分离的流感病毒A/Panda/Sichuan/01/2011（H1N1）八个基因片段设计了包括全部基因组的8对引物,通过RT-PCR的方法扩增病毒全基因序列,扩增的PCR产物连接pMD18-T载体,转化DH5a感受态细胞,经质粒PCR鉴定出阳性克隆菌后送上海生工公司测序。测序结果通过GenBank的BLAST比对分析,同时使用MEGA5等生物信息学软件对测序结果进行序列同源性分析,并在此基础上建立了分子进化的系统发育树。测序结果发现,流感病毒A/Panda/Sichuan/01/2011（H1N1）的八个节段全基因组共13595bp,其中3’与5’末端有一段较短的保守序列；通过全基因组序列分析,发现本株流感病毒与2009H1N1流感病毒同源性较高,核苷酸序列同源性高达99%,结果表明,A/Panda/Si chuan/01/2011（H1N1）来源于2009H1N1人流感病毒。大熊猫流感病毒A/Panda/Sichuan/01/2011（H1N1）反向遗传技术的建立本文在大熊猫流感病毒A/Panda/Sichuan/01/2011（H1N1）全基因序列测序的基础上,将三个分段扩增的聚合酶基因连接成完整的基因,并根据序列信息设计八对包含全部完整基因的引物,同时引入酶切位点BspQI,通过PCR扩增出八个完整的基因,将PCR产物回收并磷酸化后连接pMD18-T,转化DH5a感受态细胞,挑选阳性菌落抽质粒酶切,回收酶切产物；同时使用BspQI对表达与转录载体PBD进行酶切。将二者电泳回收后使用T4DNA酶进行连接反应,将连接产物转化DH5a感受态细胞,挑选阳性克隆菌抽质粒酶切鉴定后,送上海生工公司测序并进行序列分析。酶切结果显示,在pBD载体中正确插入八个流感病毒基因片段；测序结果表明本次八质粒共转染系统的构建是成功的。将构建的八质粒共转染系统质粒重组菌扩大培养,进行质粒抽提并进行纯化和浓度的检测；同时在细胞瓶里培养293T细胞和MDCK细胞；将所得到的八个重组质粒通过共转染的方法转染到293T细胞,培养48h后收冻293T细胞培养物,将转染产物接种MDCK细胞扩大培养,待细胞产生明显的细胞病变后收冻细胞培养物。将MDCK细胞培养物的上清接种9日龄SPF鸡胚,72h后取尿囊液进行HA和HI实验,将呈阳性的样品通过电镜负染的方法观察病毒粒子。HA和Hl实验结果表明,转染产物在鸡胚尿囊液里得到增殖,产生了重组的病毒离子,通过电镜观察到流感病毒粒子存在。一系列的实验证明,本次反向遗传操作获得成功,为今后流感病毒的研究乃至这类病毒的研究提供了一个优越的操作平台。M2和HA基因融合表达重组质粒免疫效力研究将M2的C端与HA基因融合构建真核表达重组质粒pM2HA,该质粒可在细胞内转录表达；pM2HA免疫小鼠后,可以检测到M2特异性抗体,HI抗体效价与pCI-HA组差异不显着,而中和抗体稍高于后者但差异不显着;小鼠经致死剂量病毒攻击后,pM2HA组实验小鼠体重轻微下降,攻毒保护率达100%,在遭受中等剂量攻毒后能减轻肺脏病理损害程度；同时对于不同亚型的流感病毒也有一定免疫保护力。M2e与HA的联合应用为新型流感疫苗的研究提供了一条新的思路。
徐大伟[7]（2012）在《H9N2亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒的生物学特性研究及疫苗的初步研制》文中指出H9N2亚型禽流感病毒在全世界流行广泛,危害巨大。通常该亚型禽流感病毒为低致病性,感染禽类后不会引起大批死亡。但最近发现感染该亚型病毒的禽类死亡率很高,应用多聚酶链式反应（PCR）方法诊断,发现感染本病禽类脏器中同时存在H9N2亚型禽流感病毒和新发现的鸭坦布苏病毒。基于此问题,本研究分别对H9N2亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒的生物学特性进行了深入研究,并对预防这两种病毒的疫苗进行了初步探讨研究。为掌握我国H9N2亚型禽流感病毒流行株的生物学特性,本研究选取2003-2010年分离到的27株病毒进行了系统深入的研究。遗传演化分析发现我国H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化复杂,部分毒株PA和NS基因与H9N2亚型禽流感病毒参考序列的同源性均不高,表明这些基因可能来源于其它亚型的流感毒株,序列分析发现H9N2亚型禽流感病毒近期分离株的基因片段主要起源于Ck/Shanghai/F/98（H9N2）株。交叉血凝抑制实验及病毒中和实验表明近年来我国H9N2亚型禽流感病毒的抗原性发生了明显的改变。对BALB/c小鼠致病性实验说明我国H9N2亚型禽流感病毒对小鼠的致病能力呈现下降趋势,尤其是2006年后的病毒分离株在小鼠体内的复制能力明显低于早期分离株。挑取处在不同进化分支的4株H9N2亚型禽流感病毒对4周龄SPF鸡进行了鼻腔接种致病性实验,发现这些毒株主要在感染鸡的气管和肺脏中增殖,但不出现明显症状。根据上述抗原性分析结果,从H9N2亚型禽流感病毒分离株中筛选出一株病毒Ck/Shanghai/441/09（H9N2）（简称Ck441）进行了初步的疫苗（免疫学）研究。Ck441病毒尿囊液灭活后制备灭活（毒株）疫苗,免疫4周龄SPF鸡,免疫3周后,用Ck441和一株2011年H9N2亚型禽流感病毒分离株进行攻毒实验,发现免疫组鸡均不发病、不排毒,而对照组鸡100%排毒,表明Ck441是一株理想的疫苗候选株。为提高病毒株的在细胞上的增殖能力,把Ck441的HA和NA插入到pBD载体SapI酶切位点之间,分别拯救获得了4株重组病毒,通过鸡胚和细胞增殖实验,发现441HANA/PR8-mutNS在鸡胚和细胞上增殖滴度都很高,将该株病毒经鸡胚和细胞扩增、灭活后制备灭活疫苗并免疫SPF鸡,都能够达到100%的保护率。鸭坦布苏病毒是2010年4月以来引起鸭产蛋量下降、生长阻滞甚至死亡的新发鸭传染性疾病的病原,为获得此病毒对哺乳动物和鸡的致病信息,将鸭坦布苏病毒奉贤分离株（FX2010）人工感染BALB/c小鼠和SPF鸡。经肌肉和腹腔注射接种小鼠,各组织脏器均没检测到病毒；经鼻腔接种小鼠,FX2010病毒可在BALB/c小鼠的肺脏中复制增殖；脑内接种,BALB/c小鼠出现明显的临床症状,被毛逆立,体重下降,在小鼠的脑和肺脏中均可分离到病毒,随着接种病毒量的增加,小鼠体重下降更加明显；经8d后,脑内病毒含量仍然很高,而肺脏中的病毒含量明显降低。FX2010经肌肉和鼻腔接种2周龄SPF鸡,经鼻腔接种鸡体重增长明显减缓,肌肉接种体重变化与对照组无明显差异。病毒分离发现,经鼻腔和肌肉接毒的鸡在多个脏器均可分离到病毒；FX2010病毒经鼻腔接SPF产蛋鸡,实验组鸡排出绿色粪便,产蛋量呈现一过性下降,部分脏器能够检测到病毒。在感染鸡的整个实验过程中,未见鸡严重发病或死亡,表明该病毒对鸡呈现低致病性。为初步研制防控鸭坦布苏病毒病的DNA疫苗,将鸭坦布苏病毒E基因和密码子优化后E基因分别插入到真核表达载体pCAGGS,通过IFA和Western blot实验,证明两种重组质粒在真核细胞内都能表达具有免疫原性的E蛋白,而优化后的重组质粒较野生型的表达量更高。重组疫苗（毒株）质粒免疫小鼠后,用间接ELISA检测两种DNA疫苗免疫小鼠的血清抗体,发现密码子优化后E基因的质粒激发的抗体效价高于未优化质粒,该试验为DNA疫苗防治鸭坦布苏病毒病提供了初步研究数据。总之,本研究阐明了H9N2亚型禽流感病毒和鸭坦布苏病毒的部分生物学特性,初步研制了H9N2亚型禽流感的灭活疫苗和鸭坦布苏病毒病的DNA疫苗质粒。这些研究为H9N2亚型禽流感病毒病和鸭坦布苏病毒病的防治提供坚实的理论依据。
王斌[8]（2012）在《甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立及通用型猪流感疫苗基础研究》文中研究说明流感是人类面临的主要公共健康问题之一。流感病毒在进化过程中发生导致抗原性改变的突变（抗原漂移）或不同流感病毒之间发生基因重配而产生一种新的流感病毒（抗原转变）是其逃避宿主免疫系统、得以在感染群体之间传播的主要策略。2009年开始流行的猪源新型H1N1流感病毒（以下简称甲流病毒）导致了人类历史的第四次流感大流行,该病毒比普通季节流感病毒具备更强的传播能力,在流行过程中病毒又由人回传给了猪。虽然该病毒已不再呈大流行态势,但其与其他流感病毒发生基因重配可能会产生毒力更强的病毒,因此有必要建立准确、特异的病原学检测方法以及可以评价不同宿主群体感染状态的血清学诊断方法,以监测病毒的流行和传播规律,掌握其在不同宿主群体中的感染状况,继而帮助为下一次流感爆发做出预警。本研究从病原学和血清学两个方面分别建立了病毒及血清中和抗体的检测方法。首先利用构建的杆状病毒表面展示系统筛选到一株甲流病毒特异性的单抗,对单抗的表位进行鉴定后发现60KLRG63为表位的最小活性单元,同时该表位不能被全病毒感染的阳性血清识别,提示表位不是HA分子的优势表位,其所受的免疫压力要小于HA分子上的优势表位,故在病毒流行过程中不易发生变异,从而可保证单抗对病毒的有效识别；同时对抗原表位的保守性分析发现该表位是甲流病毒特有的,表明可以利用单抗特异地检测甲流病毒。结合兔抗HA蛋白多抗建立了抗原捕获ELISA方法,并对各个抗体的工作浓度进行了优化；敏感性试验表明所建立的方法比常规血凝试验至少敏感8倍；特异性试验表明用建立的方法检测不到人的季节性H1N1流感病毒及H1N1、H3N2猪流感病毒,对实验室感染样品的检测发现该方法与鸡胚病毒分离法具有较好的符合率,但不如病毒分离敏感。以上结果表明利用甲流病毒特异性的单抗建立的抗原捕获ELISA方法可以作为甲流病毒特异性的病原学检测的工具。将人工合成的甲流病毒A/Califorina/04/2009株HA基因连接至真核表达载体pcDNA3.1,该重组质粒与表达逆转录病毒相关元件的骨架质粒pHIT111及pHIT60共转染人胚胎肾细胞293T,构建了以鼠白血病病毒为核心、包装有HA蛋白的伪型病毒。通过对伪型病毒感染细胞中报告基因表达产物的检测,证明伪型病毒可成功感染MDCK及293T细胞；同时其感染过程可被重组甲流病毒免疫的小鼠的阳性血清所阻断,表明该伪型病毒可模拟野生型病毒完成对宿主细胞的感染过程,提示该伪型病毒系统可作为一个特异性检测甲流病毒中和抗体的应用平台,从而为准确的评价机体感染状态或抗病毒药物筛选、疫苗评价等提供辅助工具。同时,本研究在缺少野生型病毒的条件下,利用公共数据库所登载的目的序列构建了与天然病毒具有相似感染特性的伪型病毒。因此理论上,其他相似的病毒表面膜蛋白也可根据本研究报道的方法构建伪病毒系统,而不依赖于某种特定病原的分离、鉴定。该方法特别对于高度危险性病原研究具有一定的意义。猪在流感病毒生态中扮演着重要的角色。由于猪的呼吸道上皮细胞同时具有人流感病毒和禽流感病毒的受体,使其极有可能成为新流感病毒的产生源头。控制猪流感（Swine influenza, SI）的发生和发展有助于减少流感病毒对人类的健康威胁。疫苗免疫是预防SI的有效手段。当前商品化的SI疫苗为包括Hl和/或H3亚型病毒的灭活疫苗。与人流感疫苗不同,SI疫苗并不会按照当年流行的优势毒株更换疫苗种子毒,由于流行毒株的抗原性变异,经常导致现有商品化疫苗无法对其提供有效免疫保护的情况。鉴于此,本研究尝试利用保守的SIV抗原组分构建具有广谱交叉保护效力的DNA疫苗。第一组DNA疫苗将H3亚型SIV共有的M2e及HA蛋白序列的编码基因连接至表达载体（MHa）;第二组在此基础上添加一个保守的T细胞表位（MNHa）,以增强疫苗诱导T细胞免疫应答的能力。通过基因枪免疫小鼠后发现,两组DNA疫苗能有效刺激机体产生体液免疫应答,同时MNHa比MHa诱导了更高水平的T细胞免疫应答。攻毒保护实验表明两组疫苗都能够对同源H3亚型处在不同进化谱系的病毒攻击提供完全免疫保护,提示增强的T细胞免疫应答对于同亚型病毒的交叉保护来讲可能不是必需的；而与MHa相比,MNHa提供了更显着的对于异源H1亚型病毒攻击的保护效力,用H1亚型病毒攻击小鼠后,MNHa免疫组小鼠肺脏内病毒滴度及组织病理学损伤显着低于MHa免疫组,表明T细胞免疫应答在提供异源毒株的交叉保护方面起到重要作用。本研究在通用型SI疫苗研究方面进行了有益探索,并为未来SI疫苗的研制提供了可借鉴的思路。
张博[9]（2011）在《H1N1亚型猪流感病毒分离鉴定、鉴别诊断及M2e重组质粒免疫效力研究》文中进行了进一步梳理猪流感（swine influenza, SI）是由猪流感病毒（swine influenza virus, SIV）引起的急性接触性呼吸道传染病。临床症状常见发烧、精神颓废、食欲减退、呼吸困难、咳嗽、流鼻涕、流产,并以高发病率和低死亡率为特征。猪流感是全球猪群常见疫病,虽不直接造成猪只大面积死亡,但是能严重削弱患病猪只健康状态和生产性能,延迟其上市,影响猪只的经济效益,同时其在猪只呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex, PRDC）中的重要地位已得到了广泛的认同,对养猪业的危害虽不及猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征,但仍不容忽视。高效、准确的检测技术和安全可靠的疫苗是防控SIV的关键,也是目前猪病研究的热点方向。本研究从四川境内某发病猪场分离鉴定了一株H1N1亚型猪流感病毒,建立了基于NSl基因编码蛋白可区别野毒和灭活疫苗的间接ELISA方法,研究了自行构建含猪流感病毒三个M2e拷贝多肽序列的相关生物活性,并分别以猪IL-18和伪狂犬病病毒VP22作为分子佐剂,研究了M2e重组质粒的免疫效力和佐剂对其的影响及其与HA融合联用时的免疫保护效果。1.H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定分别用鸡胚和MDCK细胞分离鉴定了A/Swine/Sichuan/37/2009 （H1N1）猪流感病毒,对其相关生物学特性进行了初步研究；通过对其HA及NA全基因序列的测序分析,发现分别与人源H1N1亚型流感（A/Gunma/07G002/2008和A/Guangzhou/665/2006）同源性很高,核苷酸序列同源性分别达99.4%和99.7%。遗传进化树分析该毒株很可能来自于近年来流行于人群的H1N1亚型流感病毒；基于A型流感病毒NS基因保守性序列建立的RT-PCR诊断方法,具备良好的敏感性和特异性,初步证明可以在临床上快速、准确检测猪流感病毒。2.猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立克隆猪流感病毒A/Swine/Sichuan/01/2006（H3N2）的NS1基因,通过对其的序列分析发现多个亚型毒株NS1基因同源性较高且存在6个较保守的抗原决定簇。利用克隆获得的NS1基因片段构建原核表达载体,经IPTG诱导获得高效表达,经SDS-PAGE电泳结果显示所表达的融合蛋白大小为43.5KD;Western-blotting结果显示,该蛋白可以与SIV阳性血清发生特异性的免疫反应,以NS1融合蛋白为包被抗原建立的间接ELISA方法有较高的特异性和敏感性,并能够区别野毒感染和灭活疫苗免疫猪只,证明通过NS1蛋白作为抗原建立鉴别ELISA诊断方法进一步开发成熟的试剂盒是可行的。3.M2e原、真核表达研究及生物活性研究利用重叠PCR方法构建含A/Swine/Sichuan/01/2006（H3N2）三个M2e拷贝的基因序列,分别构建原核、真核表达质粒。原核表达融合蛋白大小约为29KD,Western-blotting结果显示该蛋白可以与H3N2和H1N1亚型流感病毒阳性血清发生免疫反应,同时以此融合蛋白免疫小鼠可制备高效价（GMT=14336）的可识别受流感病毒感染的细胞外膜上的抗原成分的抗体,此抗体不具备体外中和病毒特性但是可以在小鼠体内发挥被动免疫保护效果,帮助小鼠抵御致死剂量病毒和异源毒株的攻击；M2e*3真核表达载体在体外可以在细胞内高效表达,为后续研究重组质粒免疫效力奠定基础。4.猪白介素18（IL-18）及伪狂犬VP22作为分子佐剂的初步研究构建猪IL-18真核表达质粒,该质粒可在细胞内表达IL-18（400.6±21.88μg/L）并可更好地活化小鼠脾淋巴细胞增殖的潜力（SI=3.016±0.244）;PCR扩增伪狂犬病毒Fa株VP22基因序列,经测序分析发现该基因与Kaplan和Ea株同源性很高。将VP22插入pEGFP-N3载体中EGFP基因上游,构建真核表达质粒,转染细胞后发现其能够转录及表达,继而将其与HA以融合形式构建真核表达重组质粒免疫小鼠,pVP22-HA免疫组HI抗体水平（230.4+57.24）显着高于pCI-HA免疫组（102.4+35.05）。5.M2e重组质粒免疫效力及IL-18和VP22作分子佐剂对其影响的研究分别构建pCI-M2e*3、pM2e*3-IRES-IL 18和pVP22-M2e*3真核表达重组质粒,并将它们在体外转染Vero细胞,通过RT-PCR和间接免疫荧光法证明它们均可转录表达。三种质粒免疫小鼠后均不同程度激发了小鼠体液免疫和细胞免疫水平,其中pM2e*3-IRES-IL18和pVP22-M2e*3多项指标均显着高于pCI-M2e*3,说明IL-18和VP22均针对M2e发挥了佐剂作用；小鼠遭受致死剂量攻毒后,三组免疫组从体重丢失率和存活保护率来看所诱导的免疫保护效果均不理想,特别是存活保护率也只有pVP22-M2e*3组仅达到了30%,而其它两组均为10%。在遭受中等剂量攻毒后,pVP22-M2e*3组相对于对照组不能减轻肺部病理损害程度；另外pVP22-M2e*3有一定异源保护能力。6.M2e和HA基因融合表达重组质粒免疫效力研究将M2e*3的C端与HA基因融合构建真核表达重组质粒pM2e*3-HA,该质粒可在细胞内转录表达；pM2e*3-HA免疫小鼠后,所激发的M2e特异性抗体水平显着高于pCI-M2e83组,HI抗体水平与pCI-HA组几无差异,而中和抗体稍高于后者但不显着；小鼠经致死剂量病毒攻击后,pM2e*3-HA在体重丢失率表现理想,存活保护率达100%,在遭受中等剂量攻毒后能减轻肺脏病理损害程度；同是对于异源病毒攻击的保护也较理想。M2e与HA的联合应用为新型猪流感疫苗的研究提供了一条新的思路。
牟旭鹏[10]（2010）在《流感病毒M2e蛋白的制备及其抗甲型流感病毒研究》文中研究表明M2 （Matrix protein 2,M2）蛋白是流感病毒主要的膜蛋白之一。研究发现,针对M2蛋白的单克隆抗体在细胞培养中具有抑制流感病毒复制的功能。进一步证明,M2蛋白胞外功能区（Extracellular domain of M2 protein,M2e）诱导机体产生的抗体同样具有保护性。目前,在人群中流行的所有甲型流感病毒,其M2蛋白的胞外区都未发现存在明显差异,认为M2e在流感病毒间是高度保守的。因此,M2e蛋白被认为是可刺激机体对不同流感变异株都产生具有交叉保护效果的保护性抗原。鉴于此,本研究围绕M2e蛋白进行了如下工作。利用基因重组技术构建了毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-HSA/M2e,电转化毕赤酵母X-33,SDS-PAGE筛选出能够稳定高效分泌表达重组HSA/M2e的工程菌。重组蛋白经AKTA explorer多功能纯化系统纯化,Western Blot方法进一步证明表达的重组HSA/M2e分别具有HSA和M2e的活性;蛋白质N-端测序证明表达的重组HSA/M2e与天然HSA N-端氨基酸序列相同。利用80 L发酵罐进行HSA/M2e中试规模发酵,并对其发酵条件进行优化,HSA/M2e表达量可达到1080 mg/L,同时建立了一种分离纯化HSA/M2e的新方法。用纯化的融合蛋白HSA/M2e免疫BALB/c小鼠三次后,用甲型流感病毒H1N1和H3N2对小鼠滴鼻进行攻击,从小鼠的肺部病毒滴度、体重变化及死亡率等几个方面检测M2e蛋白的免疫效果。结果表明,融合蛋白HSA/M2e能显着减少小鼠体重的丢失和降低小鼠的死亡率,保护小鼠抵抗甲型流感病毒H1N1和H3N2的攻击。本研究创新之处:1)首次在毕赤酵母中高效表达了融合蛋白HSA/M2e;2)利用80 L发酵罐进行了HSA/M2e毕赤酵母工程菌的中试规模发酵,对其表达条件进行了优化,建立了一种适用于大规模分离纯化HSA/M2e的方法,证明应用毕赤酵母表达系统表达的重组蛋白HSA/M2e具有HSA和M2e的活性;3)融合蛋白HSA/M2e能显着地减少小鼠体重的丢失和降低小鼠的死亡率,并降低肺部病毒滴度,保护小鼠抵抗甲型流感病毒的攻击。
二、流感病毒A HA(H3N2)基因真核表达载体的构建及序列分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、流感病毒A HA(H3N2)基因真核表达载体的构建及序列分析（论文提纲范文）
（1）PB2蛋白576E对H3N2犬流感病毒哺乳动物适应性的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 H3N2亚型犬流感病毒的概述 |
| 1.2 A型流感病毒的病原学特征 |
| 1.3 流感病毒聚合酶三聚体的功能 |
| 1.4 流感病毒跨宿主传播的限制因素 |
| 1.5 宿主蛋白ANP32A对流感病毒的作用 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 H3N2犬流感病毒PB2基因576氨基酸位点对聚合酶活性有重要影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病毒、细胞与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 生物软件 |
| 2.1.5 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 病毒的纯化与增值 |
| 2.2.2 病毒全基因组测序 |
| 2.2.3 真核表达载体的构建 |
| 2.2.4 双荧光素酶报告基因检测实验 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 目的片段扩增结果 |
| 2.3.2 PB2基因影响聚合酶活性的结果 |
| 2.3.3 关键氨基酸位点的筛选 |
| 2.3.4 不同区域以及氨基酸位点影响聚合酶活性的结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 PB2基因氨基酸位点E576K对小鼠致病性的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 毒株及细胞 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.1.5 生物软件 |
| 3.1.6 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 ZJ01、ZJ01-PB2-E576K、SHD6、SHD6-PB2-K576E反向遗传系统表达质粒的构建 |
| 3.2.2 反向遗传操作系统拯救病毒 |
| 3.2.3 病毒的鸡胚半数感染量(EID_(50)) |
| 3.2.4 小鼠致病性实验 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PCR扩增8基因片段结果 |
| 3.3.2 ZJ01、ZJ01-PB2-E576K、SHD6、SHD6-PB2-K576E病毒拯救结果 |
| 3.3.3 ZJ01、ZJ01-PB2-E576K、SHD6、SHD6-PB2-K576E对小鼠致病性结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 PB2基因576氨基酸位点在不同宿主细胞中对病毒复制的影响 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 毒株、细胞与实验动物 |
| 4.1.2 实验动物 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.1.4 实验仪器 |
| 4.1.5 生物软件 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 鸡胚成纤维细胞CEF的制备 |
| 4.2.2 在MDCK和 CEF细胞中接毒 |
| 4.2.3 不同时间点病毒EID_(50)的滴定 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 病毒在MDCK上的生长曲线 |
| 4.3.2 病毒在CEF上的生长曲线 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 PB2调控聚合酶活性的分子机制 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 细胞与质粒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 实验仪器 |
| 5.1.4 生物软件 |
| 5.1.5 引物 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 ANP32A载体的构建 |
| 5.2.2 过表达不同宿主ANP32A对聚合酶活性的影响 |
| 5.2.3 不同宿主ANP32A与 PB2 蛋白的相互作用 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 ANP32A对聚合酶活性作用的最佳剂量结果 |
| 5.3.2 过表达不同宿主ANP32A对聚合酶ZJ01和SHD6 聚合酶活性的影响 |
| 5.3.3 不同宿主ANP32A与 PB2 蛋白相互作用的结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）MDA5基因在犬流感病毒感染中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词或符号表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 流感概述 |
| 1.1.2 流感病毒结构特征 |
| 1.1.3 流感病毒蛋白功能 |
| 1.1.4 犬流感的流行状况 |
| 1.1.5 转录组学的研究进展 |
| 1.1.6 天然免疫 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 第2章 CIV感染幼犬的转录组学和mi RNA分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 病毒的TCID50结果 |
| 2.3.2 CIV对比格犬的致病性研究 |
| 2.3.3 H5N1 感染后转录组和mi RNA分析 |
| 2.3.4 H3N2和H5N1转录组联合分析 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 H3N2和H5N1 CIV感染诱导的宿主天然免疫反应 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 病毒MOI的选择 |
| 3.3.2 CIV感染犬和MDCK细胞后RLRs的表达情况 |
| 3.3.3 CIV感染犬和MDCK细胞后抗病毒蛋白的表达情况 |
| 3.3.4 CIV感染MDCK细胞后细胞因子的表达情况 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 犬MDA5基因的克隆和组织分布研究及其介导的信号通路研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 犬MDA5基因的克隆和序列分析 |
| 4.3.2 MDA5不同功能域的克隆 |
| 4.3.3 IFA和激光共聚焦鉴定MDA5 各个功能区域在MDCK细胞上的表达 |
| 4.3.4 Western-blot鉴定MDA5 各个功能区域在MDCK细胞上的表达 |
| 4.3.5 过表达MDA5 各个功能区对IFN-β启动子的影响 |
| 4.3.6 MDA5调节的信号传导途径 |
| 4.3.7 过表达MDA5各个功能域诱导的模式识别受体的表达 |
| 4.3.8 过表达MDA5各个功能域对抗病毒蛋白的影响 |
| 4.3.9 过表达MDA5各个功能域对细胞因子的影响 |
| 4.3.10 过表达MDA5 基因和MDA5的CARD区对病毒复制的影响 |
| 4.3.11 过表达不同剂量的p3x FLAG-MDA5 对流感病毒复制影响 |
| 4.3.12 沉默MDA5基因后,炎性因子产生降低,抗病毒活性减弱 |
| 4.3.13 沉默MDA5基因对病毒复制的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 MDA5与H3N2 CIV流感病毒之间的相互作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组质粒p CV-MDA5 的鉴定 |
| 5.3.2 MDA5蛋白与流感病毒蛋白之间的相互作用 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 H3N2 CIV感染细胞后调节MDA5 介导的信号通路研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 重组质粒的构建及验证 |
| 6.3.2 CIV的 NS1 蛋白抑制MDA5 CARD区对通路的调节作用 |
| 6.3.3 重组病毒感染MDCK细胞后诱导的免疫反应比较 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 全文讨论与结论 |
| 7.1 全文讨论 |
| 7.1.1 CIV感染后基因转录水平和mi RNA表达关联性研究 |
| 7.1.2 先天性免疫在CIV感染过程中的作用研究 |
| 7.1.3 CIV与 MDA5 的相互作用研究 |
| 7.2 结论 |
| 7.3 创新之处 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（3）H9N2内部基因盒对H5亚型重配禽流感病毒致病力的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 符号说明 综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 H9N2亚型禽流感病毒在我国的出现和发展 |
| 1.3 H9N2病毒在我国的进化 |
| 1.4 H9N2亚型禽流感病毒在我国生物学特性的演变 |
| 1.5 H9N2亚型禽流感病毒在我国频繁提供内部基因给其它亚型流感病毒 |
| 1.5.1 H9N2亚型禽流感病毒提供内部基因给H5亚型病毒 |
| 1.5.2 H9N2亚型禽流感病毒提供内部基因给H7亚型病毒 |
| 1.5.3 H9N2亚型禽流感病毒提供内部基因给其它亚型病毒 |
| 1.6 H9N2亚型禽流感病毒在我国家禽和人类及其它哺乳动物的适应性 |
| 1.6.1 表面蛋白 |
| 1.6.2 内部蛋白 |
| 1.7 H9N2亚型禽流感病毒在我国感染家禽和人类的概况 |
| 1.8 总结 |
| 参考文献 第一章 S基因型H9N2内部基因盒对H5亚型重配病毒致病力的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 毒株 |
| 2.2.2 细胞、鸡胚和实验动物 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 重配病毒的拯救 |
| 2.3.2 病毒的滴定 |
| 2.3.3 病毒生长曲线的测定 |
| 2.3.4 聚合酶活性的检测 |
| 2.3.5 SPF鸡致病性和传播性实验 |
| 2.3.6 小鼠致病性实验 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 内部基因盒来自S基因型H9N2的H5重配病毒的拯救 |
| 2.4.2 S基因型H9N2病毒内部基因盒降低H5重配病毒在体外细胞中的复制能力 |
| 2.4.3 S基因型H9N2病毒内部基因盒降低H5重配病毒聚合酶活性 |
| 2.4.4 S基因型H9N2病毒内部基因盒降低H5重配病毒对鸡的毒力和复制能力 |
| 2.4.5 传播效力试验 |
| 2.4.6 S基因型H9N2病毒内部基因盒降低H5重配病毒对小鼠的毒力和复制能力 |
| 2.4.7 S基因型H9N2病毒内部基因盒对重配H5病毒刺激宿主细胞因子表达的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 参考文献 第二章 H9N2不同进化谱系PB2和M基因对重配H5病毒在禽类动物模型上致病性的影响及机制探索 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 毒株 |
| 3.2.2 细胞、鸡胚和实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 主要仪器 |
| 3.2.5 分子生物学软件 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 基因序列分析 |
| 3.3.2 重配病毒的拯救 |
| 3.3.3 重配病毒在禽类细胞上复制能力的测定 |
| 3.3.4 Western blot方法检测病毒蛋白的表达 |
| 3.3.5 免疫荧光试验 |
| 3.3.6 不同进化谱系PB2影响H9N2病毒RNP聚合酶活性检测 |
| 3.3.7 电镜试验 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 携带G1-like PB2和G1-like M基因的H9N2病毒在禽源H9N2病毒中占主导地位 |
| 3.4.2 内部基因来自H9N2病毒的重配H5病毒的产生 |
| 3.4.3 G1-like M和G1-like PB2基因增强重配H5病毒对鸡的毒力和复制能力 |
| 3.4.4 G1-like M和G1-like PB2基因增强重配H5病毒在禽类细胞系上的复制能力和蛋白表达水平 |
| 3.4.5 G1-like PB2蛋白提高S基因型H9N2病毒在禽类细胞系上的聚合酶活性 |
| 3.4.6 G1-like PB2基因增强PB2蛋白在禽类细胞上核输入能力 |
| 3.4.7 G1-like M基因增加重配H5病毒在禽类细胞上的球形病毒粒子 |
| 3.4.8 G1-like M基因增强M1蛋白在禽类细胞上协助RNP核输出的能力 |
| 3.5 讨论 |
| 参考文献 第三章 H9N2不同进化谱系PB2和M基因对重配H5病毒在哺乳类动物模型上致病性的影响及机制探索 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 毒株 |
| 4.2.2 细胞、鸡胚和实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 主要仪器 |
| 4.2.5 分子生物学软件 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 基因序列分析 |
| 4.3.2 重配病毒的拯救 |
| 4.3.3 重配病毒在哺乳类动物细胞复制能力的测定 |
| 4.3.4 病毒蛋白表达水平的检测 |
| 4.3.5 免疫荧光试验 |
| 4.3.6 聚合酶活性测定 |
| 4.3.7 电镜试验 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 携带G1-like PB2和M基因的H9N2病毒在我国H9N2病毒中占主导地位 |
| 4.4.2 重配病毒在哺乳类动物细胞感染性测定 |
| 4.4.3 G1-like M和G1-like PB2基因增强重配H5病毒对小鼠的毒力和复制能力 |
| 4.4.4 G1-like M和G1-like PB2基因增强重配H5病毒在哺乳动物细胞系上的复制能力和蛋白表达水平 |
| 4.4.5 G1-like PB2蛋白提高S基因型H9N2病毒在哺乳动物细胞系上的聚合酶活性 |
| 4.4.6 G1-like PB2基因增强PB2蛋白在哺乳动物细胞系上核输入能力 |
| 4.4.7 G1-like M基因增加重配H5病毒在哺乳动物细胞上的球形病毒粒子 |
| 4.4.8 G1-like M基因增强M1蛋白在哺乳动物细胞上协助RNP核输出的能力 |
| 4.5 讨论 |
| 参考文献 第四章 基于TMT技术研究含S和H基因型H9N2内部基因盒的重配H5病毒感染鸡肺脏的差异表达蛋白 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 毒株 |
| 5.2.2 细胞、鸡胚和实验动物 |
| 5.2.3 主要试剂 |
| 5.2.4 主要仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 SPF鸡感染性实验 |
| 5.3.2 蛋白样品制备 |
| 5.3.3 蛋白浓度测定 |
| 5.3.4 SDS-PAGE电泳样品检测实验 |
| 5.3.5 蛋白还原烷基化及酶解 |
| 5.3.6 蛋白标记及质谱分析 |
| 5.3.7 数据分析 |
| 5.3.8 生物信息学分析 |
| 5.3.9 qRT-PCR验证 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 比较H5/S和H5/H重配病毒对SPF鸡的毒力 |
| 5.4.2 比较H5/S和H5/H重配病毒在SPF鸡肺中的复制能力 |
| 5.4.3 筛选H5/H和H5/S重配病毒感染鸡的肺脏差异蛋白组 |
| 5.4.4 差异蛋白组的生物信息功能分析 |
| 5.4.5 差异蛋白的qRT-PCR验证 |
| 5.5 讨论 |
| 参考文献 全文小结 致谢 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（4）H3N2亚型犬流感病毒保护性单抗的制备及宿主microRNA对病毒复制的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 犬流感病毒的研究进展 |
| 1 犬流感病毒致病性研究 |
| 1.1 病原学特征 |
| 1.2 流感病毒对犬类的适应性 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 犬流感的临床症状 |
| 1.5 犬流感病毒的跨宿主传播 |
| 1.6 犬流感的诊断 |
| 1.7 犬流感的治疗 |
| 1.8 犬流感的预防和控制 |
| 2 犬流感病毒宿主模型的研究 |
| 2.1 动物模型 |
| 2.2 宿主细胞模型 |
| 3 MicroRNA在宿主与病毒互作中的研究 |
| 3.1 MiRNA的作用机制 |
| 3.2 MiRNA在病毒感染过程中的调节作用机制 |
| 3.3 MiRNA作为抗病毒治疗靶标影响病毒复制 |
| 4 研究目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第二章 H3N2亚型犬流感病毒单克隆抗体的制备及其特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、细胞及实验动物 |
| 1.2 培养基及主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 抗原的制备 |
| 1.5 免疫小鼠 |
| 1.6 ELISA检测方法的建立 |
| 1.7 细胞融合 |
| 1.8 杂交瘤细胞的抗体检测 |
| 1.9 阳性杂交瘤细胞的亚克隆筛选 |
| 1.10 细胞的冻存与复苏 |
| 1.11 腹水型单克隆抗体的制备及纯化 |
| 1.12 单克隆抗体的鉴定 |
| 1.13 Western blot鉴定单抗所针对的抗原位点 |
| 2 结果 |
| 2.1 病毒的扩增及纯化 |
| 2.2 小鼠免疫后的抗体效价 |
| 2.3 抗原抗体最佳包被浓度的确定 |
| 2.4 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 |
| 2.5 单克隆抗体的鉴定 |
| 2.6 单克隆抗体的Western blot鉴定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 单克隆抗体对不同H3N2亚型流感病毒株感染的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物、细胞及毒株 |
| 1.2 培养基、试剂盒及主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 1.4 单克隆抗体D7对三株流感病毒毒株的血凝抑制试验及细胞中和试验 |
| 1.5 单抗对3株流感病毒株感染动物的交叉保护试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 单克隆D7针对三株流感病毒株的细胞中和效价和血凝抑制效价结果 |
| 2.2 单抗D7对三株流感病毒株在BALB/c小鼠临床症状和体重变化上的结果 |
| 2.3 小鼠血液、粪便及多种脏器的病毒RNA载量测定结果 |
| 2.4 小鼠肺、心和脑组织病理组织学结果和免疫组化结果 |
| 2.5 小鼠肺脏组织细胞因子检测结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 永生化犬细支气管上皮细胞系的建立及其特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物、质粒及实验器械 |
| 1.2 主要试剂、仪器和设备 |
| 1.3 犬细支气管组织的分离 |
| 1.4 原代犬细支气管上皮细胞的培养 |
| 1.5 真核表达载体pEGFP-hTERT的构建 |
| 1.6 永生化犬细支气管上皮细胞的制备 |
| 1.7 原代细胞的特性鉴定 |
| 1.8 细胞增长曲线的测定 |
| 1.9 细胞周期的分析 |
| 1.10 逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 1.11 Western blot检测 |
| 1.12 端粒酶活性检测 |
| 1.13 细胞核型分析 |
| 1.14 QRT-PCR检测相关基因的表达水平 |
| 1.15 软琼脂试验和裸鼠致瘤性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 犬原代细支气管上皮细胞的培养和特性分析结果 |
| 2.2 真核表达载体pEGFP-hTERT的酶切鉴定 |
| 2.3 永生化细胞hTERT-CBECs的鉴定 |
| 2.4 永生化细胞hTERT-CBECs的增殖能力检测结果 |
| 2.5 不同代次的永生化细胞hTERT-CBECs的特性分析结果 |
| 2.6 永生化细胞hTERT-CBECs和原代细胞CBECs的基因表达水平分析结果 |
| 2.7 永生化细胞hTERT-CBECs没有在体内或在体外表现出致瘤性 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 CIV感染犬原代细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞的microRNA表达谱分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒、细胞和实验动物 |
| 1.2 主要试剂、仪器和设备 |
| 1.3 原代犬细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞的制备 |
| 1.4 感染比和感染时间点的确定 |
| 1.5 流式细胞术定量检测细胞凋亡 |
| 1.6 Small RNA测序和miRNA基因芯片测序 |
| 1.7 差异表达miRNA的实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证 |
| 2 结果 |
| 2.1 原代犬细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞的制备 |
| 2.2 感染比和感染时间的确定 |
| 2.3 原代犬细支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞的凋亡情况 |
| 2.4 细胞总RNA的提取及质控检测 |
| 2.5 Small RNA测序和miRNA测序的分析结果 |
| 2.6 差异表达miRNA所对应靶基因的功能分析 |
| 2.7 差异表达miRNA的qRT-PCR验证 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 宿主细胞microRNA对H3N2亚型犬流感病毒复制的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞、载体、病毒和抗体 |
| 1.2 主要仪器和设备 |
| 1.3 慢病毒载体和腺病毒载体的构建 |
| 1.4 慢病毒和腺病毒的包装及扩大培养 |
| 1.5 稳定细胞系的建立 |
| 1.6 病毒滴度的测定 |
| 1.7 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测目的基因 |
| 1.8 Western blot检测目的蛋白 |
| 2 结果 |
| 2.1 慢病毒载体和腺病毒载体的构建 |
| 2.2 慢病毒载体对hTERT-CBECs和DH82细胞的感染效率 |
| 2.3 稳定细胞系的建立 |
| 2.4 病毒滴度的测定结果 |
| 2.5 QRT-PCR的检测结果 |
| 2.6 Western blot的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 博士期间发表的论文 |
| 博士期间申请的国家发明专利 |
| 致谢 |
（5）鸭源禽流感病毒的分离鉴定及其聚合酶活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 前言 第一篇 文献综述 |
| 1 禽流感概述 |
| 2 禽流感病原学 |
| 2.1 理化学特性 |
| 2.2 培养特性 |
| 3 分子生物学特征 |
| 3.1 禽流感病毒基因组结构组特征 |
| 3.2 禽流感病毒编码的蛋白质及其功能 |
| 4 流行病学特征 |
| 4.1 传染源 |
| 4.2 传播途径 |
| 4.3 发病季节 |
| 4.4 生态学 |
| 4.5 水禽在禽流感病毒传播中的意义 |
| 5 临床症状与剖检特征 |
| 5.1 急性型 |
| 5.2 温和型 |
| 5.3 隐性型 |
| 5.4 病理变化 |
| 6 禽流感病毒的感染和分子致病机制 |
| 6.1 禽流感病毒的感染 |
| 6.2 分子致病机制 |
| 7 禽流感病毒的诊断 |
| 7.1 鉴别诊断 |
| 7.2 传统诊断技术 |
| 7.3 分子生物学诊断技术 第二篇 研究内容 |
| 第一章 鸭源H5N5亚型禽流感病毒的分离与鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料及其来源 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离 |
| 2.2 病毒的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的分离培养结果 |
| 3.2 胶体金试纸条检测结果 |
| 3.3 形态学鉴定 |
| 3.4 血清学鉴定 |
| 3.5 PCR扩增结果 |
| 3.6 PCR产物纯化、克隆、PCR鉴定与测序结果 |
| 3.7 HA与NA基因序列分析鉴定 |
| 3.8 血凝素和神经氨酸酶的基因系统进化分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 本研究病毒的分离 |
| 4.2 关于鸭源禽流感病毒的形态学观察 |
| 4.3 关于鸭源禽流感病毒的鉴定 |
| 4.4 鸭流感病毒的HA与NA基因序列分析 |
| 5 小结 |
| 第二章 鸭源H5N5亚型禽流感病毒聚合酶基因序列测定与分析 |
| 1 材料 |
| 1.1.病毒毒株 |
| 1.2 感受肽工程菌与载体 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒培养 |
| 2.2 提取病毒总 RNA |
| 2.3 cDNA 的反转录 |
| 2.4 PCR扩增 |
| 2.5 胶回收 PCR 产物 |
| 2.6 连接与转化 PCR 产物 |
| 2.7 菌落PCR鉴定 |
| 2.8 质粒提取 |
| 2.9 基因的测序与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR结果 |
| 3.2 菌落PCR结果 |
| 3.3 鸭源 H5N5 亚型 AIV 的 PB2 基因生物信息学分析 |
| 3.4 H5N5亚型鸭源禽流感病毒PB1基因生物信息学分析 |
| 3.5 H5N5亚型鸭源禽流感病毒PA基因生物信息学分析 |
| 3.6 H5N5亚型鸭源禽流感病毒NP基因生物信息学分析 |
| 3.7 同源性分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PB2、PB1、PA、NP基因生物信息学分析 |
| 4.2 PB2基因序列分析 |
| 4.3 PB1 基因序列分析 |
| 4.4 PA基因序列分析 |
| 4.5 NP基因序列分析 |
| 5 小结 |
| 第三章 鸭源禽流感病毒聚合酶活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒毒株 |
| 1.2 载体、感受态细胞 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 PCR产物处理 |
| 2.2 载体处理 |
| 2.3 表达载体的构建 |
| 2.4 转化 |
| 2.5 菌落PCR鉴定 |
| 2.6 质粒提取 |
| 2.7 测序连接产物 |
| 2.8 PB2基因点突变 |
| 2.9 聚合酶蛋白活性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 PCR产物双酶切 |
| 3.2 菌落PCR |
| 3.3 连接产物测序 |
| 3.4 PB2基因点突变 |
| 3.5 聚合酶蛋白活性检测 |
| 4 分析与讨论 |
| 4.1 流感病毒的点突变 |
| 4.2 流感病毒突变后的聚合酶活性分析 |
| 5 小结 结论 参考文献 作者简介 致谢 |
（6）大熊猫源H1N1流感病毒的分离鉴定、全基因组序列分析、感染性克隆构建及疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 流感病毒概述 |
| 1.1 流行病学特点 |
| 1.2 公共卫生意义 |
| 1.3 甲型流感病毒病原学及生物学特性 |
| 1.4 流感分子生物学特征 |
| 1.4.1 血凝素基因HA |
| 1.4.2 神经氨酸酶基因NA |
| 1.4.3 核蛋白基因NP |
| 1.4.4 聚合酶基因PA、PB1、PB2 |
| 1.4.5 基质蛋白基因M |
| 1.4.6 非结构蛋白基因NS |
| 1.5 流感病毒的抗原性变异 |
| 1.6 流感病毒免疫学机制 |
| 1.7 流感实验室诊断技术 |
| 1.7.1 病毒分离 |
| 1.7.2 血清学诊断 |
| 1.7.3 分子生物学诊断 |
| 1.8 流感病毒致病机制的研究 |
| 1.9 流感病毒反向遗传技术的研究进展 |
| 1.10 疫苗研究进展 |
| 2 本研究的意义及目的 |
| 第二章 H1N1亚型大熊猫流感病毒的分离鉴定以及遗传进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 病料和实验动物 |
| 1.1.2 鸡胚、细胞及载体 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 病毒的分离及纯化 |
| 1.2.2 病毒分离物的鉴定 |
| 1.2.3 病毒特性研究 |
| 1.2.4 动物回归试验 |
| 1.2.5 流感病毒全基因组序列扩增于遗传进化分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒分离及传代 |
| 2.2 病毒血凝特性、特异性及亚型初步鉴定 |
| 2.3 病毒命名 |
| 2.4 病毒致MDCK细胞病变进程及病毒感染动力学 |
| 2.5 病毒特性研究 |
| 2.5.1 EID50测定结果 |
| 2.5.2 TCID50测定结果 |
| 2.6 动物回归实验结果 |
| 2.7 流感病毒全基因序列测定与遗传进化分析 |
| 2.7.1 流感病毒基因组RT-PCR扩增结果 |
| 2.7.2 遗传进化分析结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 病毒的分离鉴定 |
| 3.2 病毒生物学特性 |
| 3.3 流感病毒的全基因组序列分析 |
| 4 小结 |
| 第三章 大熊猫流感病毒A/Panda/Sichuan/9/2011(H1N1)八质粒反向遗传系统的构建 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 质粒、细胞以及鸡胚等 |
| 1.2 限制性内切酶 |
| 1.3 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 三个聚合酶基因的连接 |
| 2.1.1 连接引物的设计 |
| 2.1.2 六个片段的PCR扩增 |
| 2.1.3 PCR产物的回收与纯化 |
| 2.1.4 扩增基因磷酸化 |
| 2.1.5 纯化PCR产物与pMD1 8-T载体的连接 |
| 2.1.6 感受态细胞的制备 |
| 2.1.7 连接产物转化感受态细胞 |
| 2.1.8 重组质粒的筛选 |
| 2.1.9 质粒鉴定 |
| 2.1.10 各重组载体的酶切 |
| 2.1.11 酶切产物片段回收 |
| 2.1.12 目标片段和重组质粒的再连接 |
| 2.1.13 连接重组载体的转化 |
| 2.1.14 完整基因重组质粒双酶切鉴定 |
| 2.1.15 测序及其序列分析 |
| 2.2 含BSPQI酶切位点的全基因T载体克隆 |
| 2.2.1 技术路线 |
| 2.2.2 全基因扩增 |
| 2.2.3 全基因克隆 |
| 2.2.4 全基因转化质粒的鉴定 |
| 2.3 八质粒共转染系统的构建 |
| 2.3.1 八个pMD18-T重组载体和PBD载体的酶切 |
| 2.3.2 酶切产物的回收与纯化 |
| 2.3.3 纯化酶切产物与PBD载体的连接 |
| 2.3.4 感受态细胞的制备 |
| 2.3.5 连接产物转化感受态细胞 |
| 2.3.6 重组质粒的筛选 |
| 2.3.7 全基因转化质粒的PCR鉴定 |
| 2.3.8 酶切鉴定 |
| 2.4 重组质粒的测序 |
| 2.5 PB2基因点突变 |
| 2.6 测序结果的生物信息学分析 |
| 2.7 病毒的拯救 |
| 2.7.1 质粒准备 |
| 2.7.2 转染细胞准备 |
| 2.7.3 八质粒共转染 |
| 2.7.4 转染细胞上清液感染MDCK细胞 |
| 2.7.5 接种鸡胚 |
| 2.7.6 病毒鉴定 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1. 三个聚合酶基因的连接 |
| 3.1.1 六个待连接片段的PCR扩增 |
| 3.1.2 重组后的质粒酶切鉴定 |
| 3.1.3 再重组质粒的鉴定 |
| 3.2 含BspQ酶切位点的全基因T载体克隆 |
| 3.2.1 全基因组序列的扩增 |
| 3.2.2 重组质粒的酶切的酶切鉴定 |
| 3.3 八质粒共转染载体的构建 |
| 3.3.1 双向表达载体的电泳鉴定 |
| 3.3.2 双向表达载体pBD的酶切结果 |
| 3.3.3 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.3.4 全基因序列分析 |
| 3.4 病毒拯救 |
| 3.4.1 病毒在293T细胞上的病变 |
| 3.4.2 病毒在MDCK细胞上的病变 |
| 3.4.3 血凝及血凝抑制实验 |
| 3.4.4 电镜实验 |
| 3.4.5 PCR检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于流感病毒反向遗传技术的应用 |
| 4.2 关于共转染质粒的准备 |
| 4.3 关于细胞的准备和八质粒共转染实验 |
| 4.4 关于反向遗传操作技术所涉及的生物安全问题 |
| 5 小结 |
| 第四章 M2e和HA基因融合表达重组质粒免疫效力研究 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株、菌株及载体 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 真核表达载体的构建 |
| 1.2.3 重组真核表达载体在Vero细胞中的转录表达研究 |
| 1.2.4 重组质粒免疫效力研究 |
| 1.2.7 攻毒保护实验 |
| 1.2.8 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 pM2HA的构建 |
| 2.2 pM2HA的转录及表达研究 |
| 2.4 重组质粒免疫效力研究 |
| 2.4.1 体液免疫 |
| 2.4.2 细胞免疫 |
| 2.5 重组质粒免疫保护研究 |
| 2.5.1 攻毒后存活率及体重变化 |
| 2.5.2 免疫保护对中等剂量攻毒后组织病变程度影响 |
| 2.5.3 对异源病毒攻击的保护 |
| 3 讨论 |
| 3.1 HA基因的选择 |
| 3.2 HA和M2e基因的联用 |
| 3.3 重组质粒的表达及免疫效果 |
| 4 小结 |
| 全文总结论 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（7）H9N2亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒的生物学特性研究及疫苗的初步研制（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 插图 附表清单 引言 |
| 1 A型流感病毒 |
| 1.1 A型流感概述 |
| 1.2 流感病毒抵抗力 |
| 1.3 流感病毒结构、形态及化学组成 |
| 1.4 流感病毒复制、变异及重组 |
| 1.5 流感病毒历史上的爆发与流行 |
| 1.6 流感病毒的抗原变异蛋白的结构与功能 |
| 1.7 流感病毒抗原变异的分子基础 |
| 1.8 流感病毒各蛋白与致病性的关系 |
| 2 H9N2型禽流感病毒 |
| 2.1 H9N2亚型禽流感病毒的历史 |
| 2.2 H9N2亚型禽流感病毒的分子演化 |
| 2.3 H9N2亚型流感病毒在哺乳动物的分离及其“基因池”作用 |
| 2.4 H9N2亚型禽流感病毒的增殖 |
| 3 流感病毒的疫苗研制 |
| 3.1 抗原基因的选择 |
| 3.2 流感疫苗的类型 |
| 4 反向遗传操作技术 |
| 4.1 定义 |
| 4.2 流感反向遗传技术 |
| 4.3 流感病毒反向遗传技术应用 |
| 5 鸭坦布苏病毒 |
| 5.1 鸭坦布苏病毒概述 |
| 5.2 鸭坦布苏病毒的理化特性 |
| 5.3 鸭坦布苏病毒基因组编码蛋白产物及E蛋白的生物学功能与特性 |
| 5.4 鸭坦布苏病毒流行状况及致病特征 |
| 6 DNA疫苗研究进展 |
| 7 本实验研究的目的和意义 第一部分 H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及抗原性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用H9N2亚型禽流感病毒 |
| 1.2 SPF鸡胚、SPF鸡及其它 |
| 1.3 H9N2亚型禽流感病毒的鉴定方法 |
| 1.4 实验用H9N2亚型禽流感病毒的有限稀释法纯化及EID_(50)测定 |
| 1.5 实验用H9N2亚型禽流感病毒阳性血清的制备 |
| 1.6 H9N2亚型禽流感病毒的血凝抑制实验 |
| 1.7 代表抗原性差别“r”值的计算 |
| 1.8 H9N2亚型禽流感病毒的中和实验 |
| 1.9 代表血清抑制性差别“R”值的计算 |
| 1.10 H9N2亚型禽流感病毒接毒SPF鸡后病毒在感染鸡脏器的分布实验 |
| 1.11 候选疫苗株Ck441(Ck/Shanghai/441/09)对SPF鸡的保护性实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 27株H9N2亚型禽流感病毒EIDso测定结果 |
| 2.2 H9N2亚型禽流感病毒血凝抑制及“r”值计算结果 |
| 2.3 H9N2亚型禽流感病毒中和实验结果 |
| 2.4 SPF鸡接毒H9N2亚型禽流感病毒后脏器病毒的分离结果 |
| 2.5 候选疫苗株Ck441灭活后对SPF鸡的保护性实验结果 |
| 3 讨论与小结 第二部分 H9N2亚型禽流感病毒对BALB/c小鼠的致病性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验用毒株 |
| 1.2 实验动物及器械 |
| 1.3 BALB/c小鼠实验操作过程 |
| 1.4 BALB/c小鼠脏器的采集 |
| 1.5 脏器病毒含量的测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 27株H9N2亚型禽流感病毒在BALB/c小鼠脏器的分离结果 |
| 2.2 27株H9N2亚型禽流感病毒对BALB/c小鼠的致病性结果 |
| 3 讨论与小结 第三部分 H9N2亚型禽流感病毒分子进化分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 PCR及测序用引物 |
| 1.4 病毒RNA的提取 |
| 1.5 反转录 |
| 1.6 目的片段的获得 |
| 1.7 核苷酸序列的测定 |
| 1.8 27株H9N2亚型禽流感病毒基因序列的拼接与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 参考毒株及基因序列测定结果 |
| 2.2 PB2基因比较分析结果 |
| 2.3 PB1基因比较分析结果 |
| 2.4 PA基因比较分析结果 |
| 2.5 HA基因比较分析结果 |
| 2.6 NP基因比较分析结果 |
| 2.7 NA基因比较分析结果 |
| 2.8 M基因比较分析结果 |
| 2.9 NS基因比较分析结果 |
| 2.10 27株H9N2亚型禽流感病毒8基因片段的归类结果 |
| 3 讨论与小结 第四部分 H9N2亚型重组流感病毒的拯救及其生物学特性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒及试剂 |
| 1.2 SPF鸡胚和SPF鸡 |
| 1.3 载体及构建质粒 |
| 1.4 用于扩增HA和NA基因用引物 |
| 1.5 HA和NA片段的扩增 |
| 1.6 PCR产物的凝胶电泳纯化 |
| 1.7 pBD载体和目的片段的酶切处理 |
| 1.8 质粒pBD-441HA和pBD-441NA的构建 |
| 1.9 H9N2亚型重组流感病毒的拯救过程 |
| 1.10 拯救重组流感病毒的鉴定 |
| 1.11 4株H9N2亚型重组流感病毒的拯救 |
| 1.12 拯救重组流感病毒的增殖实验 |
| 1.13 H9N2亚型拯救重组流感病毒的SPF鸡免疫及保护性实验 |
| 1.13.1 疫苗候选病毒及其属性 |
| 1.13.2 疫苗免疫与攻毒保护实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 pBD-441HA和pBD-441NA重组质粒构建 |
| 2.2 4株H9N2亚型重组流感病毒的拯救结果 |
| 2.3 拯救H9N2亚型重组流感病毒的鸡胚增殖实验结果 |
| 2.3.1 病毒37℃鸡胚增殖结果 |
| 2.3.2 病毒33℃鸡胚增殖结果 |
| 2.4 拯救H9N2亚型重组病毒的细胞增殖实验结果 |
| 2.4.1 无TPCK-trypsin的HA-2细胞增殖结果 |
| 2.4.2 有TPCK-trypsin的HA-2细胞增殖结果 |
| 2.5 SPF鸡免疫及保护性实验结果 |
| 2.5.1 灭活疫苗免疫SPF鸡后不同时间激发抗体产生的含量结果 |
| 2.5.2 喉头和泄殖腔病毒分离结果 |
| 2.5.3 攻毒4d后实验鸡脏器的病毒分离结果 |
| 3 讨论与小结 第五部分 鸭坦布苏病毒对BALB/c小鼠及SPF鸡的致病性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 鸭坦布苏病毒对BALB/c小鼠的致病性实验 |
| 1.3.1 鸭坦布苏病毒不同接种途径感染BALB/c小鼠实验 |
| 1.3.2 鸭坦布苏病毒脑内接种感染BALB/c小鼠实验 |
| 1.3.3 鸭坦布苏病毒不同稀释度脑内接种感染BALB/c小鼠实验 |
| 1.3.4 鸭坦布苏病毒脑内接种感染BALB/c小鼠后不同时间脏器病毒含量实验 |
| 1.4 鸭坦布苏病毒对SPF鸡的致病性实验 |
| 1.4.1 鸭坦布苏病毒对2周龄SPF鸡的致病性实验 |
| 1.4.2 鸭坦布苏病毒对产蛋SPF鸡的致病性实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 BALB/c小鼠不同途径接种鸭坦布苏病毒的实验结果 |
| 2.1.1 脏器病毒含量的测定结果 |
| 2.1.2 小鼠体重变化 |
| 2.2 BALB/c小鼠脑内接种鸭坦布苏病毒的结果 |
| 2.2.1 脏器病毒含量的测定结果 |
| 2.2.2 小鼠体重变化 |
| 2.3 BALB/c小鼠脑内接种不同稀释度鸭坦布苏病毒后的体重变化 |
| 2.4 BALB/c小鼠脑内接种鸭坦布苏病毒后不同时间脏器病毒含量结果 |
| 2.5 鸭坦布苏病毒对2周龄SPF鸡致病性实验结果 |
| 2.5.1 脏器病毒含量的测定结果 |
| 2.5.2 2周龄SPF鸡的体重增长趋势 |
| 2.6 鸭坦布苏病毒对产蛋SPF鸡致病性实验结果 |
| 2.6.1 病毒含量的测定结果 |
| 2.6.2 产蛋鸡产蛋量的变化 |
| 3 讨论与小结 第六部分 鸭坦布苏病毒DNA疫苗的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病毒 |
| 1.2 质粒、细胞及抗体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验动物 |
| 1.5 扩增E基因用引物的设计及合成 |
| 1.6 E基因的密码子优化及合成 |
| 1.7 野生型(Wild-type)和优化型(Opti-type)真核表达载体的构建 |
| 1.7.1 野生型真核表达载体的构建 |
| 1.7.2 优化型真核表达载体的构建 |
| 1.8 间接免疫荧光(IFA)检测蛋白的表达 |
| 1.9 Western blot检测蛋白的表达 |
| 1.10 疫苗质粒对BALB/c小鼠的免疫 |
| 1.11 间接ELISA检测BALB/c小鼠血清抗体 |
| 2 结果 |
| 2.1 E基因的优化及合成结果 |
| 2.2 重组DNA疫苗质粒的构建结果 |
| 2.2.1 成功构建野生型DNA疫苗质粒pCAGGS-E |
| 2.2.2 成功构建优化型DNA疫苗质粒pCAGGS-OptiE |
| 2.3 间接免疫荧光(IFA)检测结果 |
| 2.4 Western blot检测结果 |
| 2.5 免疫BALB/c小鼠后不同时间分离血清中抗体的检测结果 |
| 3 讨论与小结 第七部分 全文结论 致谢 参考文献 附录 作者简介 |
（8）甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立及通用型猪流感疫苗基础研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 1 引言 |
| 1.1 流感与流感病毒 |
| 1.1.1 流感 |
| 1.1.2 流感病毒 |
| 1.2 中国大陆猪流感病毒流行特征及未来值得关注的几个问题 |
| 1.2.1 中国大陆SIV流行特征 |
| 1.2.2 未来值得关注的几个问题 |
| 1.3 猪流感疫苗研究进展 |
| 1.3.1 灭活疫苗 |
| 1.3.2 弱毒疫苗 |
| 1.3.3 病毒活载体亚单位疫苗 |
| 1.3.4 基因工程DNA疫苗 |
| 1.3.5 已应用于人或其他动物流感但尚未在SIV上应用的疫苗研发系统 |
| 1.4 本研究的目的和意义 2 材料与方法 |
| 2.1 甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立 |
| 2.1.1 质粒、菌株、病毒及细胞 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.1.3 重组A/Brisbane/59/2007(H1N1)[BR07]毒株HA蛋白的PR8病毒的构建 |
| 2.1.4 r07、r09的纯化及全病毒多抗的制备 |
| 2.1.5 BR07HA与CA09HA基因在杆状病毒中的表达 |
| 2.1.6 特异性识别大流行流感病毒的单克隆抗体的制备 |
| 2.1.7 单抗的抗原表位鉴定 |
| 2.1.8 甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立 |
| 2.2 整合大流行性H1N1流感病毒血凝素蛋白的伪型病毒的构建 |
| 2.2.1 载体、血清及主要试剂 |
| 2.2.2 表达HA基因的真核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.2.3 伪型病毒的包装 |
| 2.2.4 报告基因LacZ表达检测 |
| 2.2.5 伪型病毒感染的中和试验 |
| 2.2.6 统计学分析 |
| 2.3 通用型猪流感疫苗基础研究 |
| 2.3.1 质粒、毒株、细胞、血清 |
| 2.3.2 主要试剂及仪器 |
| 2.3.3 DNA疫苗的设计 |
| 2.3.4 重组质粒的构建及验证 |
| 2.3.5 重组质粒的体外表达 |
| 2.3.6 基因枪子弹的制备 |
| 2.3.7 小鼠的免疫及攻毒 |
| 2.3.8 血清学试验 |
| 2.3.9 IFN-γ ELISPOT |
| 2.3.10 攻毒后小鼠肺脏的病毒滴定 |
| 2.3.11 组织病理学观察 |
| 2.3.12 统计学分析 3 结果 |
| 3.1 甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立 |
| 3.1.1 PBD-07HA重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.1.2 拯救病毒r07核酸序列验证 |
| 3.1.3 拯救病毒r07的HA滴度测定 |
| 3.1.4 重组杆粒的PCR鉴定 |
| 3.1.5 重组杆状病毒的获得 |
| 3.1.6 HA蛋白在细胞表面的表达 |
| 3.1.7 特异性识别r09单抗的筛选 |
| 3.1.8 血凝抑制试验及中和试验 |
| 3.1.9 抗原表位的鉴定及5B12对r07、r09差异性识别的分子基础 |
| 3.1.10 该表位不能被全病毒阳性血清识别 |
| 3.1.11 抗原表位的保守性分析 |
| 3.1.12 抗原捕获ELISA方法的建立 |
| 3.2 整合大流行性H1N1流感病毒血凝素蛋白的伪型病毒的构建 |
| 3.2.1 HA基因表达载体的构建及在293T细胞中的表达 |
| 3.2.2 HA蛋白整合的伪型病毒粒子具有感染性 |
| 3.2.3 伪型病毒对细胞的感染可被阳性血清所中和 |
| 3.3 通用型猪流感疫苗基础研究 |
| 3.3.1 M2e、NP147-155及共有HA基因的扩增 |
| 3.3.2 DNA疫苗的构建及鉴定 |
| 3.3.3 DNA疫苗携带的外源基因在293T细胞中的表达 |
| 3.3.4 两种DNA疫苗能有效刺激机体产生HA及M2e特异性抗体 |
| 3.3.5 DNA疫苗诱导机体产生的HI抗体效价水平 |
| 3.3.6 MNHa能够诱导NP147-155特异性的T细胞免疫应答 |
| 3.3.7 MNHa比MHa显示出更强的异源保护效力 |
| 3.3.8 MNHa能够比MHa更显着地抑制异源毒株攻击后小鼠肺脏发生的病变 4 讨论 |
| 4.1 甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立 |
| 4.2 整合大流行性H1N1流感病毒血凝素蛋白的伪型病毒的构建 |
| 4.3 通用型猪流感疫苗基础研究 5 结论 致谢 参考文献 附录 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（9）H1N1亚型猪流感病毒分离鉴定、鉴别诊断及M2e重组质粒免疫效力研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 目录 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪流感病毒概述 |
| 1.1 流行病学特点 |
| 1.2 公共卫生意义 |
| 1.3 猪流感病毒病原学及生物学特性 |
| 1.4 猪流感分子生物学特征 |
| 1.4.1 血凝素基因HA |
| 1.4.2 神经氨酸酶基因NA |
| 1.4.3 核蛋白基因NP |
| 1.4.4 聚合酶基因PA、PB1、PB2 |
| 1.4.5 基质蛋白基因M |
| 1.4.6 非结构蛋白基因NS |
| 1.5 猪流感病毒的抗原性变异 |
| 1.6 猪流感病毒免疫学机制 |
| 1.7 猪流感实验室诊断技术 |
| 1.7.1 病毒分离 |
| 1.7.2 血清学诊断 |
| 1.7.3 分子生物学诊断 |
| 1.8 猪流感新型疫苗的研究进展 |
| 2 M2疫苗研究进展 |
| 2.1 M2e蛋白类疫苗 |
| 2.2 M2e核酸疫苗 |
| 2.3 M2e疫苗目前仍存在的机制争论及有待解决的问题 |
| 2.3.1 广谱性的大小 |
| 2.3.2 免疫反应类型的问题 |
| 3 核酸疫苗佐剂研究进展 |
| 3.1 细胞因子佐剂 |
| 3.2 蛋白转导类佐剂VP22 |
| 4 本研究的意义及目的 |
| 第二章 H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 病料及参考毒株 |
| 1.1.2 鸡胚、细胞及载体 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器及设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 病毒的分离及纯化 |
| 1.2.2 病毒分离物的鉴定 |
| 1.2.3 病毒特性研究 |
| 1.2.4 动物回归试验 |
| 1.2.5 流感病毒RT-PCR检测方法 |
| 1.2.6 HA和NA基因序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 病毒分离及传代 |
| 2.2 外源病毒检测 |
| 2.3 病毒血凝特性、特异性及亚型初步鉴定 |
| 2.4 病毒命名 |
| 2.5 病毒致MDCK细胞病变进程及病毒感染动力学 |
| 2.6 病毒特性研究 |
| 2.6.1 EID_(50)测定结果 |
| 2.6.2 TCID_(50)测定结果 |
| 2.7 病毒理化特性研究 |
| 2.7.1 病毒感染力热稳定性试验结果 |
| 2.7.2 乙醚敏感性试验结果 |
| 2.7.3 氯仿敏感试验结果 |
| 2.7.4 病毒核酸类型实验 |
| 2.8 动物回归实验结果 |
| 2.9 流感病毒RT-PCR检测方法的建立 |
| 2.9.1 RT-PCR检测反应体系的建立及优化 |
| 2.9.2 RT-PCR检测反应特异性研究 |
| 2.9.3 RT-PCR检测反应敏感性研究 |
| 2.9.4 临床样品的检测及与其它流感检测方法的比较 |
| 2.10 HA和NA的RT-PCR扩增测序及序列分析 |
| 2.10.1 HA和NA扩增测序 |
| 2.10.2 HA和NA序列分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 病毒的分离鉴定 |
| 3.2 病毒生物学特性 |
| 3.3 病毒遗传进化及分子特征 |
| 4 小结 |
| 第三章 猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 病毒及血清 |
| 1.1.2 菌株及质粒 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 主要试剂的配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 目的片段扩增及克隆 |
| 1.2.2 NS1基因的生物信息学分析 |
| 1.2.3 重组质粒的诱导表达及表达产物的检测 |
| 1.2.4 表达产物的纯化及复性 |
| 1.2.5 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2 结果 |
| 2.1 NS1的扩增与克隆、表达载体的构建 |
| 2.2 NS1生物信息学分析 |
| 2.3 诱导表达产物的SDS-PAGE和Western-blotting分析鉴定 |
| 2.4 间接ELISA方法的建立 |
| 2.4.1 抗原最适包被浓度与血清最佳稀释度 |
| 2.4.2 临界值的确定 |
| 2.4.3 交叉反应 |
| 2.4.4 竞争性抑制试验 |
| 2.4.5 敏感性试验 |
| 2.4.6 重复性试验 |
| 3 讨论 |
| 3.1 NS1蛋白的血清学诊断 |
| 3.2 原核表达及ELISA |
| 4 小结 |
| 第四章 M2e原、真核表达及生物活性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株、细胞、菌株及载体 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 猪流感病毒M2基因的扩增及TA克隆 |
| 1.2.2 含3个MZe拷贝的MZe*3基因的获得 |
| 1.2.3 M2e*3的原核表达 |
| 1.2.4 原核表达M2e*3融合蛋白免疫原性研究 |
| 1.2.5 M2e*3融合蛋白高免血清生物活性研究 |
| 1.2.6 M2e*3的真核表达研究 |
| 1.2.7 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 M2基因的克隆 |
| 2.1.1 M2基因的RT-PCR扩增 |
| 2.1.2 pMD19-T simple+M2的酶切鉴定 |
| 2.1.3 M2基因测序鉴定 |
| 2.2 M2e*3基因的获得 |
| 2.2.1 M2e*2片段的扩增 |
| 2.2.2 M2e*3片段的扩增 |
| 2.2.3 pMD19-T simple+M2e*3 TA克隆的酶切及测序鉴定 |
| 2.3 M2e*3基因的原核表达研究 |
| 2.3.1 pET32-M2e*3质粒的鉴定 |
| 2.3.2 M2e*3原核表达产物分析 |
| 2.3.3 表达产物的纯化及Western-blotting分析 |
| 2.4 M2e*3融合蛋白免疫原性研究 |
| 2.4.1 Dot-ELISA测定M2e*3融合蛋白高免血清效价 |
| 2.4.2 M2e*3融合蛋白高免血清识别M2天然蛋白的研究 |
| 2.5 M2e*3融合蛋白高免血清生物活性研究 |
| 2.5.1 M2e*3融合蛋白高免血清体外抑制病毒增殖生物活性检测 |
| 2.5.2 M2e*3融合蛋白高免血清体内生物活性研究 |
| 2.6 M2e*3真核表达研究 |
| 2.6.1 M2e*3真核表达质粒pCI-M2e*3的构建 |
| 2.6.2 M2e*3基因转录的RT-PCR检测 |
| 2.6.3 M2e*3真核表达蛋白间接免疫荧光检测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 M2基因的扩增及M2e*3的构建 |
| 3.2 三个M2e拷贝的选择 |
| 3.3 原核表达M2e*3蛋白的免疫原性 |
| 4 小结 |
| 第五章 猪白介素18(IL-18)及伪狂犬VP22基因作为分子佐剂的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 载体、菌株、细胞及实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 pCI-IL18真核表达载体的构建 |
| 1.2.3 pCI-IL18的真核转录表达研究 |
| 1.2.4 pCI-IL18小鼠体内生物活性研究 |
| 1.2.5 VP22的PCR扩增、克隆及序列分析 |
| 1.2.6 pEGFP-N3+VP22E真核表达载体的构建及表达研究 |
| 1.2.7 VP22作为分子佐剂的初步研究 |
| 1.2.8 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 pCI-IL18真核表达载体的构建 |
| 2.2 pCI-IL18真核转录及表达研究 |
| 2.3 pCI-IL18小鼠体内生物活性 |
| 2.4 VP22的扩增、克隆及序列分析 |
| 2.5 pEGFP-N3+VP22E真核表达载体的构建及表达研究 |
| 2.5.1 pEGFP-N3+VP22E的构建 |
| 2.5.2 pEGFP-N3+VP22E的转录及表达 |
| 2.6 VP22对HA重组质粒免疫效力的影响 |
| 2.6.1 pCI-HA、pVP22-HA的构建 |
| 2.6.2 pCI-HA、pVP22-HA的转录及表达研究 |
| 2.6.3 pCI-HA、pVP22-HA诱导小鼠免疫反应 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 M2e重组质粒免疫效力及工L-18和VP22作分子佐剂对其影响的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株、菌株及载体 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 真核表达载体的构建 |
| 1.2.3 重组真核表达载体在Vero细胞中的瞬时表达研究 |
| 1.2.4 H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Sichuan/01/2006)适应Balb/c小鼠的培育 |
| 1.2.5 H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Sichuan/01/2006)适应Balb/c小鼠株TCID_(50)及LD_(50)的测定 |
| 1.2.6 重组质粒免疫效力及IL-18、VP22佐剂效应研究 |
| 1.2.7 攻毒保护实验 |
| 1.2.8 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 pM2e*3-IRES-IL18、pVP22-M2e*3的构建 |
| 2.2 pM2e*3-IRES-IL18、pVP22-M2e*3的转录及表达研究 |
| 2.3 H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Sichuan/01/2006)适应Balb/c小鼠的培育 |
| 2.4 H3N2亚型猪流感病毒小鼠适应株TCID_(50)和LD_(50)的测定 |
| 2.5 重组质粒免疫效力研究 |
| 2.5.1 体液免疫 |
| 2.5.2 细胞免疫 |
| 2.6 重组质粒免疫保护研究 |
| 2.6.1 攻毒后存活率及体重变化 |
| 2.6.2 免疫保护对中等剂量攻毒后组织病变程度影响 |
| 2.6.3 对异源病毒攻击的保护 |
| 3 讨论 |
| 3.1 双基因共表达载体的选用 |
| 3.2 构建M2e*3序列的基础 |
| 3.3 疫苗效果的评估标准 |
| 3.4 pCI-M2e*3免疫效果的评估 |
| 3.5 佐剂对免疫效果的影响 |
| 4 小结 |
| 第七章 M2e和HA基因融合表达重组质粒免疫效力研究 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 毒株、菌株及载体 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 |
| 1.2.2 真核表达载体的构建 |
| 1.2.3 重组真核表达载体在Vero细胞中的转录表达研究 |
| 1.2.4 重组质粒免疫效力研究 |
| 1.2.7 攻毒保护实验 |
| 1.2.8 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 pM2e*3-HA的构建 |
| 2.2 pM2e*3-HA的转录及表达研究 |
| 2.4 重组质粒免疫效力研究 |
| 2.4.1 体液免疫 |
| 2.4.2 细胞免疫 |
| 2.5 重组质粒免疫保护研究 |
| 2.5.1 攻毒后存活率及体重变化 |
| 2.5.2 免疫保护对中等剂量攻毒后组织病变程度影响 |
| 2.5.3 对异源病毒攻击的保护 |
| 3 讨论 |
| 3.1 HA基因的选择 |
| 3.2 HA和M2e基因的联用 |
| 3.3 重组质粒的表达及免疫效果 |
| 4 小结 |
| 全文总结论 |
| 本研究的创新点 |
| 本研究的展望与建议 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）流感病毒M2e蛋白的制备及其抗甲型流感病毒研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 流感疫苗的研究 |
| 1.1.1 流感病毒的生物学特征 |
| 1.1.2 流感病毒的致病性及免疫性 |
| 1.1.3 流感的历史与现状 |
| 1.1.4 流感疫苗的研究进展 |
| 1.1.5 通用型疫苗靶位的选择 |
| 1.2 流感病毒M2 蛋白疫苗研究进展 |
| 1.2.1 M2 蛋白的结构及功能 |
| 1.2.2 M2 蛋白与盐酸金刚烷胺耐药性的研究 |
| 1.2.3 M2 蛋白疫苗研究进展 |
| 1.2.4 M2e 疫苗诱导保护的机制 |
| 1.2.5 M2e 疫苗的临床开发 |
| 1.2.6 展望 |
| 1.3 人血清白蛋白研究进展 |
| 1.3.1 人血清白蛋白的结构 |
| 1.3.2 人血清白蛋白的生物学功能 |
| 1.3.3 人血清白蛋白基因工程研究进展 |
| 1.3.4 人血清白蛋白融合技术 |
| 第2章 HSA/M2E 毕赤酵母高效分泌表达体系的建立和鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 器材及设备 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 Trizol 法从人胚胎肝组织中提取总RNA |
| 2.1.5 RT-PCR 扩增HSA cDNA 序列 |
| 2.1.6 HSA cDNA 克隆载体的构建 |
| 2.1.7 pPICZαC-HSA 载体的构建 |
| 2.1.8 pPICZαC-HSA/M2e 表达载体的构建 |
| 2.1.9 毕赤酵母的转化 |
| 2.1.10 阳性菌株的筛选 |
| 2.1.11 表达产物HSA/M2e 分析 |
| 2.1.12 AKTA explorer 多功能纯化系统小量纯化HSA/M2e |
| 2.1.13 HSA/M2e 氨基酸序列分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 人胚胎肝组织总RNA 的提取 |
| 2.2.2 RT-PCR 扩增cDNA |
| 2.2.3 重组载体pMD18-T-HSA 的酶切鉴定 |
| 2.2.4 重组质粒pPICZαC-HSA 及pPICZαC-HSA/M2e 的酶切鉴定 |
| 2.2.5 HSA/M2e 毕赤酵母工程菌的筛选 |
| 2.2.6 HSA/M2e 小量纯化 |
| 2.2.7 HSA/M2e 的N-端氨基酸序列分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 HSA/M2E 中试规模发酵及纯化工艺研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 器材及设备 |
| 3.1.2 溶液配制 |
| 3.1.3 毕赤酵母表达HSA/M2e 的pH 值优化 |
| 3.1.4 利用80L 发酵罐大规模发酵表达HSA/M2e |
| 3.1.5 HSA/M2e 大规模纯化系统的建立 |
| 3.1.6 Bradford 法定量HSA/M2e |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 毕赤酵母表达HSA/M2e pH 值的优化 |
| 3.2.2 HSA/M2e 大规模发酵结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 融合蛋白HSA/M2E 小鼠体内免疫及其抗流感病毒研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 器材及设备 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 实验动物、病毒和细胞 |
| 4.1.5 动物免疫实验 |
| 4.1.6 动物保护性实验 |
| 4.1.7 结果处理及统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫血清的ELISA 实验结果 |
| 4.2.2 细胞免疫结果 |
| 4.2.3 H1N1 和H3N2 流感病毒的毒力测定结果 |
| 4.2.4 流感病毒攻击后对小鼠一般状况及体重的影响 |
| 4.2.5 肺指数和肺指数抑制率的测定 |
| 4.2.6 小鼠肺部病毒滴度的测定 |
| 4.2.7 肺组织病理观察 |
| 4.2.8 重组蛋白对小鼠的保护效果分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 动物免疫实验 |
| 4.3.2 动物保护性实验 |
| 研究总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 PPICZΑC-HSA/M2E 序列分析结果 |
| 附录二 PPICZΑC-HSA/M2E 载体构建 |
| 附录三 HSA/M2E N-端9 个氨基酸残基序列色谱图 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
四、流感病毒A HA(H3N2)基因真核表达载体的构建及序列分析（论文参考文献）
- [1]PB2蛋白576E对H3N2犬流感病毒哺乳动物适应性的作用及其机制研究[D]. 石晓娜. 中国农业科学院, 2020(01)
- [2]MDA5基因在犬流感病毒感染中的作用和机制研究[D]. 付橙. 华南农业大学, 2019
- [3]H9N2内部基因盒对H5亚型重配禽流感病毒致病力的影响及其机制研究[D]. 郝小利. 扬州大学, 2018(12)
- [4]H3N2亚型犬流感病毒保护性单抗的制备及宿主microRNA对病毒复制的影响[D]. 谢星. 南京农业大学, 2016(12)
- [5]鸭源禽流感病毒的分离鉴定及其聚合酶活性研究[D]. 王军政. 吉林农业大学, 2015(02)
- [6]大熊猫源H1N1流感病毒的分离鉴定、全基因组序列分析、感染性克隆构建及疫苗研究[D]. 李德生. 四川农业大学, 2012(04)
- [7]H9N2亚型禽流感病毒与鸭坦布苏病毒的生物学特性研究及疫苗的初步研制[D]. 徐大伟. 内蒙古农业大学, 2012(08)
- [8]甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立及通用型猪流感疫苗基础研究[D]. 王斌. 东北农业大学, 2012(02)
- [9]H1N1亚型猪流感病毒分离鉴定、鉴别诊断及M2e重组质粒免疫效力研究[D]. 张博. 四川农业大学, 2011(02)
- [10]流感病毒M2e蛋白的制备及其抗甲型流感病毒研究[D]. 牟旭鹏. 吉林大学, 2010(08)