一、原生质体介导的外源性GRF基因在家兔体内的表达（论文文献综述）
李静宇[1]（2020）在《小分子RNA在抗枯萎病香蕉新品种抵御尖孢镰刀菌Foc4侵染的作用与机理研究》文中研究指明香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc）引起的土传性真菌流行病害,可造成香蕉枯萎黄化甚至死亡,目前严重威胁香蕉产业的发展,其中4号生理小种（Foc4）是侵染能力和毒性最强的生理小种。本实验采用高通量小RNA测序和降解组测序相结合,以抗枯萎病新品种南天蕉和其亲本易感病巴西蕉及致病菌Foc4为研究对象,从两方面研究香蕉小RNA的调控作用。一方面以染病前后两种香蕉根系（N0,N8,B0和B8）为实验材料,构建了4个小RNA测序文库和一个降解组文库,并使用RT-qPCR实验进行验证,研究香蕉小分子RNA的内源性作用。另一方面以染病处理后的南天蕉和巴西蕉球茎中分离出的Foc4菌丝（NFoc4和BFoc4）及空白对照组实验室培养Foc4菌丝（Foc4）为实验材料,构建了9个小RNA测序文库和3个降解组文库,研究香蕉小RNA跨界传递及其可能的作用。结合生物信息学分析,对获得数据进行处理,得出以下主要结论:通过对香蕉根系B0、B8、N0和N8共4个小RNA测序文库数据分析,共鉴定出分属28个miRNA家族的152个known miRNA和59个novel miRNA。利用降解组测序鉴定香蕉根系miRNA的自身靶基因,共获得了1113个miRNA-m RNA对,分析差异表达的miRNA及其靶基因,结果显示香蕉miRNA通过负调控靶基因参与植物激素信号转导和植物-病原体相互作用通路,从而影响香蕉与Foc4互作,推测miRNA介导的靶基因表达调控是南天蕉具有更高抗性的原因之一。以Foc4侵染的南天蕉和巴西蕉球茎中分离Foc4菌丝及实验室培养Foc4菌丝为实验材料,构建了9个小RNA测序文库,共鉴定出6条跨界传递的香蕉小RNA,包括2条miRNA和4条s RNA。利用降解组测序对香蕉小RNA在真菌Foc4内的靶基因进行分析鉴定,发现mus-novel miR1靶基因编码吡哆胺5’-磷酸氧化酶和过氧化物酶体长链脂肪酸输入蛋白2,Mus-s RNA4的靶基因编码SLG1蛋白参与MAPK信号通路。这些靶基因均可能与Foc4毒力因子的表达有关。此外,发现Mus-s RNA2靶基因编码FBP1-果糖-1,6-双磷酸酶参与能量代谢相关通路,影响真菌生长发育。上述小分子RNA研究结果将会对香蕉-Foc4互作机理研究提供重要参考,为香蕉枯萎病的防治提供新的思路。
林智敏[2]（2019）在《水稻矮化少分蘖基因D26的图位克隆及功能研究》文中研究表明作为重要的粮食作物,水稻从传统的经验育种向现代精准育种转变的过程中,株型是影响水稻产量最为重要因素之一,它取决于植株高度、分蘖数目、分蘖角度、穗形态等因素。对于水稻株型的机制研究,是短期内难以突破的科学问题和技术难题,其中矮化突变体是非常理想的研究对象,但是调控机制知之甚少。本文在前期研究的工作基础上,对水稻矮化、少分蘖D26突变体进行系统研究,揭示它参与水稻油菜素内酯激素调控的信号通路机制。本文从水稻突变体库中组织培养变异获得了2个农艺性状表现矮化、少分蘖的突变材料D26-1和D26-2,通过图位克隆实现精细定位和进一步的功能分析,揭示了D26突变体矮化表型的遗传机理,并从互作蛋白筛选和转录组测序分析角度,进一步挖掘水稻矮化机制。主要结果如下:D26突变体一个隐性单基因控制表型。利用D26突变体做母本和93-11亲本做父本,构建杂交F2群体,通过425个群体和531个群体将其分别定位在3号染色体短臂上63 kb区间,该区间内包含12个候选基因;分析预测和克隆、测序表明D26基因是一个编码GRAS家族蛋白的转录因子,两个突变体在D26基因540 bp和560 bp处各缺失一个碱基C造成基因提前终止;另将野生型D26基因转入D26突变体中获得突变表型恢复。此外,D26突变体直立表型和特异地表现第二节间缩短,推测表明D26基因可能参与了油菜素内酯（BR）的信号通路;进一步的BR激素不敏感性实验表明,D26突变体是一个对外源BR不敏感表型的矮化突变体。水稻原生质体亚细胞定位结果表明,D26表达分布于整个细胞。通路基因相对定量分析表明D26基因不仅参与BR应答机制,而且是一个水稻BR激素信号通路中的正向调控因子。D26突变体中一个重要的产量性状控制表型是调控水稻粒型,为了进一步了解掌握D26基因调控水稻粒型机制,我们分别设计了D26基因的过量表达和基因敲除实验。结果表明,在D26基因过量表达的株系中,谷籽的变化与基因的表达成正比,表达量越高,谷籽越长、越细;在D26基因基因敲除中,谷籽反而变宽、变短。正、反向遗传学研究数据表明,D26基因是通过BR正向响应调节水稻籽粒发育。种子颖壳的电镜扫描观察结果表明,D26基因表达水平直接影响水稻颖壳表皮细胞分裂程度,从而调节了水稻粒型形态。结合生物信息学预测和GST pull-down技术筛选互作蛋白的结果表明,D26蛋白作为GRAS家族的一个转录因子,它的互作蛋白主要是与水稻锌指蛋白家族成员相关,初步推测D26蛋白可能是通过与水稻锌指蛋白一起互作后参与到油菜素内酯BR通路调控。转录组GO富集数据挖掘分析,表明差异基因变化主要集中在分子功能和生物学过程方面表达的基因差异显着,而对细胞组分方面的基因影响不显着。其中,外源BR处理突变体的样本,与野生型相比,差异基因的总数是增加的,但与突变体相比,差异基因显着性变化的基因主要是下调表达,上调表达的差异显着的基因仅有15个。KEGG通路富集的数据表明,D26突变体主要引起3条通路的表达显着变化,一方面影响牛磺酸和低钙氨酸代谢和糖酵解/糖异生代谢通路基因差异表达,另一方面主要影响二萜类生物合成通路,该通路对应的是赤霉素生物合成,其GA生物合成上游基因表达发生调节。突变体与野生型相比,GA生物合成上游中有4个基因发生了上调,促进了GA的生物合成代谢通路;而BR外源激素处理过的突变体与突变体本身相比,GA生物合成上游有5个基因发生了下调,抑制了GA的生物合成代谢通路。综上所述,本项研究以2个矮化、少分蘖D26突变体为材料,阐明了其参与水稻油菜素内酯（BR）信号通路和正向调节水稻粒型的机制,pull down蛋白互作的结果表明D26蛋白在体内不是独立起作用的,很有可能与水稻锌指蛋白一起共同作用。转录组测序KEGG富集通路获得了水稻中外源与内源的油菜素内酯（BR）和赤霉素之间相互作用的关系,表现为外源的BR抑制了GA的生物合成代谢通路。所有这些拓宽了对D26蛋白功能的认识,有效补充了油素内酯激素在水稻中的调控机制,为下一步的应用研究奠定了一定的理论基础。
张震[3]（2019）在《黄瓜果实长度调控基因SF2的克隆及分子机制的研究》文中提出植物器官大小和形状的调控机制是重要的基础生物学问题。在细胞学水平上,细胞增殖和细胞膨大决定了器官的大小和形态,然而其分子调控机制依然存在许多未知。果实的大小和形状影响了收获器官的产量和商品品质,是重要的农艺性状。黄瓜（Cucumis sativus L.）作为我国设施栽培的主要蔬菜作物之一,具有重要的经济价值。同时黄瓜果实属于瓠果,果实生长速度快,形态变异丰富多样,是研究果实形态建成的优良系统。因此,解析黄瓜果实形态建成的遗传机理和分子机制,将具有重要的理论和应用价值。本课题利用一个黄瓜短瓜突变体sf2（short fruit 2）,通过遗传克隆得到一个控制果长的候选基因SF2（Short Fruit 2）。对SF2基因的功能及全基因组靶点进行挖掘分析,揭示了SF2通过直接调控激素合成和信号转导相关的关键基因影响细胞增殖,从而调控黄瓜果实发育的复杂调控网络;并提出了SF2介导的基因激活和抑制的表观调控模型。主要结果如下:1、明确了SF2通过促进细胞增殖调控黄瓜果实发育短瓜突变体sf2的短瓜表型是由一个隐性单基因控制,利用MutMap技术结合传统遗传定位的方法,克隆了果长候选基因SF2;SF2编码一个拟南芥HISTONE DEACETYLASE COMPLEX 1（HDC1）同源蛋白,推测参与组蛋白去乙酰化修饰。在sf2突变体中,SF2蛋白第515位的甘氨酸突变为谷氨酸（G515E）,抑制细胞增殖,果实长度显着变短。转基因遗传互补实验和CRISPR-Cas9转基因敲除实验证实了SF2促进果实发育过程中的细胞增殖。研究揭示了SF2主要在快速细胞分裂的分生组织中表达,其表达可能受到转录后调控;初步证实果实胎座组织是具有细胞分裂干细胞活性的拟分生组织。2、明确了SF2参与形成HDAC复合体并发挥组蛋白去乙酰化的功能SF2与HDA19A、HDA19B、SIN3-LIKE1、SIN3-LIKE3、SAP18以及MSI1等HDAC复合体成员互作。LCI（Luciferase Complementation Imaging Assay）、Co-IP（Co-Immunoprecipitation）和ChIP-seq（Chromatin Immunoprecipitation sequencing）实验表明,在突变体中,SF2G515E与SIN3-LIKE1/3的互作能力减弱,导致SF2-HDAC复合体对下游基因的结合能力显着下降。组蛋白ChIP-seq和免疫印迹实验证明,在突变体中,全基因组水平的H3K9ac、H3K14ac水平显着升高;相应的组蛋白H3不同位点的乙酰化水平显着升高（K9、K14、K18、K23、K27、K56）,证明SF2-HDAC促进了组蛋白的去乙酰化。3、揭示了SF2直接抑制和激活调控的核心靶基因集将野生型黄瓜（406;WT）和突变体sf2果实的差异转录组数据和ChIP-seq数据取交集,挖掘了SF2直接结合、促进组蛋白去乙酰化修饰、并抑制或激活基因表达的核心靶基因集,分别得到包含有321个基因的“核心抑制靶基因集”和包含有237个基因的“核心激活靶基因集”。进一步分析发现,SF2直接靶向抑制多种激素合成和信号响应途径的相关基因,包括负调控生长素（Auxin）、赤霉素（GA）和细胞分裂素（CK）合成或信号响应的相关基因,正调控茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）和多胺（PA）合成或信号响应的相关基因。而SF2直接靶向激活的核心基因主要涉及到细胞周期调控途径。以上结果与SF2正调控细胞增殖的结果相符,表明SF2通过协同调控多种激素途径调节细胞增殖。4、SF2的直接靶标基因与果实的细胞增殖相关对黄瓜早期果实发育过程不同时期的转录组数据进行分析,结果显示,321个核心抑制靶基因中,有236（73.5%）个基因在细胞分裂时期0 DAA到3 DAA呈现降低的转录水平,表达模式与细胞增殖趋势呈现负相关。在237个核心激活靶基因中,有154（65.5%）个基因的转录水平在细胞分裂时期明显升高,与细胞增殖呈现正相关。结果与SF2促进细胞分裂相一致。以上结果显示,SF2直接调控的下游靶基因在黄瓜果实的细胞增殖过程中很可起到重要作用。5、SF2通过调节CK和PA的平衡调控细胞增殖在sf2突变体果实中,细胞分裂素氧化酶/脱氢酶（CKX）的酶活显着升高,相应的内源细胞分裂素异戊烯腺嘌呤（iP）和二氢玉米素（DZ）含量显着降低。外源喷施CKX的抑制剂噻苯隆（TDZ）,sf2的果实长度增加26.1%,表明SF2通过抑制CKX7表达,增加CK的含量,促进果实细胞增殖。内源多胺的测定结果显示,sf2果实中的亚精胺（Spd）含量显着升高。外源喷施S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）的抑制剂甲基乙二醛双脒基腙（MGBG）,sf2的果实长度增加16.3%,表明SF2通过抑制SAMDC1/2的表达抑制PA合成,促进果实细胞增殖。而TDZ和MGBG共同处理的sf2果实长度得到大幅度恢复（80.3%）,细胞数目显着增加,显示CK和PA在调控果实细胞增殖过程中存在协同调控的作用。以上结果表明,SF2通过抑制CK降解和维持多胺水平的平衡,调控果实细胞增殖。
张博[4]（2019）在《参薯块茎特异microRNA基因的挖掘分析》文中进行了进一步梳理参薯（Dioscorea alata）富含碳水化合物、蛋白质、维生素,是热带以及亚热带地区的重要有机食物来源。参薯产量高的亩产可达上万斤,但是地下块茎形态多变,研究参薯块茎膨大的机制将为培育优良薯型品种奠定理论基础。MicroRNA（miRNA）参与植物体众多的生命活动,包括植物的生长、发育、繁殖和逆境反应,土豆中miR172和miRNA156通过参与光周期途径影响薯类作物的块茎形成,超量表达miR172可以加快块茎在长日照条件下形成,而过量表达miR156会改变土豆形态且块茎产量下降。本实验以测序的参薯基因组、转录谱和小RNA数据为基础,利用生物信息学工具挖掘茎和块茎中差异表达的miRNA,筛选在块茎形成过程中起到关键作用的miRNA,并预测其靶基因,之后通过RT-PCR、RT-qPCR分析miRNA和靶基因的表达特征,并应用荧光双报告系统验证miRNA靶基因,得到了如下的结果:1、通过小RNA序列分析对比,得到参薯中保守miRNA家族的miRNA基因139个,比对分析参薯普通茎和块茎的小RNA数据,获得差异表达两倍以上的miRNA 基因 44 个,其中属于 miR159,miR164,miR167 和 miR168 家族的 miRNA有9个。对miRNA前体序列进行了二级结构的预测,前体序列长度变化较大,在77-212 bp区间内,在预测的成熟miRNA序列中,miR159的不同基因位点只在miRNA长度上有1-2个碱基的差异,成熟miRNA序列5端一致。对靶基因进行预测并对结果进行注释发现4个家族中可能的靶基因一共有1 7个,不同miRNA家族可能对应同一个靶基因,同一个miRNA家族可能对应不同的靶基因。为了进一步分析这4个miRNA家族中的哪些基因有表达,我们依据参薯的转录谱数据找到13个miRNA的前体序列。2、使用RT-PCR检测miR159,miR164,miR167和miR168的在参薯不同组织的表达部位,发现这4个家族中有5个miRNA基因在块茎中都有表达,在叶、茎组织中都有一定的表达量,而其余miRNA均在叶、茎和块茎中表达,没有组织表达的特异性。3、在组培苗的叶、茎、块茎和田间的叶、茎和块茎的4个发育时期共12个组织进行14个差异表达成熟miRNA的表达模式进行RT-qPCR检测,结果发现8个miRNA在块茎中表达量高于其他组织,这些miRNA属于miR164（1个）、miR171（1 个）、miR396（1 个）和 miR168（5 个）家族,而 miR167、miR398、miR156等miRNA在块茎表达量显着低于其他组织,剩余miRNA在田间的茎、叶组织表达差异低,大部分结果符合小RNA的测序。4、使用RT-qPCR检测与miRNA相同的12个参薯组织中,17个靶基因的表达模式,荧光定量PCR检测结果大部分基因在田间块茎不同发育时期的表达量较低,除了DaLSH3-1、DaLSH3-2、DaAlfin的等基因在块茎中表达量显着高于其他组织。DaCO、DaGRAS1、DaTify、DaMYC等基因在叶片表达量显着高于其他组织,而其余基因在茎中的表达量显着高于块茎组织。以上结果表明miR171与靶基因DaGRAS1/DaGRAS2、miR396 与靶基因 miR159 与靶基因 DaMYC 间存在较为明显的消长关系。5、对双荧光报告系统中的连接靶基因序列的载体进行改造,加入35S启动子启动靶序列的表达,并在靶序列插入位点加入多克隆位点序列,为后续实验提供基础,另外将miR156家族的5个基因序列连上双荧光报告系统的psk62载体。
何毅[5]（2015）在《红色红曲菌M7高效基因敲除体系的构建及桔霉素生物合成途径的解析》文中认为红曲菌（Monascus spp.）是我国传统的药食两用微生物,主要用于红曲的生产,能够产生丰富的有益次级代谢产物。红曲在我国及东南亚地区已有上千年的应用历史,广泛用作食品着色剂、防腐剂、发酵剂和中药配伍等。同时,红曲也是我国的传统出口产品。自1995年首次发现某些红曲菌株能够分泌一种肾脏毒素——桔霉素（citrinin,CIT）以来,红曲中的CIT问题已经成为红曲产品出口及新产品开发的限制性因素,因此如何控制红曲菌中的CIT至关重要。研究表明,CIT属于聚酮化合物（polyketide,PK）,由包括聚酮合成酶（polyketide synthase,PKS）等相关基因组成的基因簇控制合成。但是,由于红曲菌的分子生物学研究起步较晚,而且红曲菌基因敲除效率较低,所以目前对CIT基因簇中各基因的功能和CIT的生物合成途径与调控机理知之甚少,从而为有效控制红曲产品中的CIT增加了难度。基因敲除和基因异源表达是目前广泛用于基因功能研究的分子生物学方法。在基因敲除中,如何提高基因的敲除效率至关重要。研究表明,通过敲除非同源性末端连接（non-homologous end-joining,NHEJ）途径中的关键基因（ku70、ku80和/或ligase Ⅳ）能够显着地提高真核生物中的基因敲除效率。基因敲除能够阻断生物合成途径而使突变菌株积累目标基因的前体物,而基因异源表达则能够使转化菌株分泌目标基因的合成产物,因此通过分析基因敲除与异源表达菌株中代谢产物的变化,再结合质谱、核磁等结构鉴定手段即可研究目标基因作用的底物、产物及其基因功能,从而探索微生物次生代谢产物等的生物合成途径。本研究以红色红曲菌（Monascus ruber）M7为研究对象,首先通过敲除其中的ku70、ku80和ligase Ⅳ基因构建了红曲菌的高效基因敲除体系。在此基础上,通过对M.ruber M7 基因组的分析获得了 CIT基因簇,并运用生物信息学的方法预测了该基因簇中各基因的功能。然后以基因敲除的方法对关键基因的功能进行了研究;并结合基因异源表达技术探讨了 CIT的生物合成途径。研究成果如下:1红曲菌高效基因敲除体系的构建从M rubber M7中分别克隆并敲除了ku70、ku80和ligase Ⅳ基因,分析了各敲除菌株（MrAku70、MrAku80和MrAlig4）的菌落与显微形态、产孢能力、生长速度、色素和CIT产量以及基因敲除效率。结果表明,这3个基因的敲除均不影响红曲菌的生长、形态、分化、发育、繁殖以及分泌CIT和红曲色素的能力。但是ku70、ku80和ligase Ⅳ各基因敲除菌株中其他基因（MpigC、fmndS和triA）的敲除效率均有了明显提高,分别为野生菌株的2倍、3倍和4倍,且最高的基因敲除效率达到约85%,从而成功构建了红曲菌高效基因敲除体系,为后续的基因敲除提供了材料。2红曲菌CIT合成基因簇的分析通过对M.M7基因组序列的分析,获得了包括PKS基因（命名为pksCT）在内的44 kb的CIT生物合成基因簇。该基因簇包括16个基因,分别是pksCT基因及其上游7个基因:丝氨酸水解酶（MRL1）、加氧酶（MRL2）、转录调节因子（MRL3）、醛脱氢酶（MRL4）、醛酮变位酶（MRL5）、脱氢酶（MRL6）、氧化还原酶（MRL7）,以及下游8个基因:转运蛋白（MRR1,MRR8）、组氨酸磷酸酶（MRR2）、WD蛋白（MRR4）、碳酸酐酶（MRR5）、烯酰还原酶（MRR7）以及未知蛋白（MRR3,MRR6）。对pksCT结构域的分析表明,其属于非还原型PKS,具有SAT-KS-AT-PT-ACP-CMeT-R的结构域。序列比对分析表明,CIT基因簇中5’端的9个基因（MRL1-MRL7,pksCT和MRR1）在产CIT的不同红曲菌株和扩展青霉（Penicillium expansum）中高度保守,其中MRL3为转录调节基因,MRR1为负责物质转运的基因,MRL5编码的蛋白过短,而pksCT、MRL1、MRL2、MRL4、MRL6和MRL7为结构基因,可能直接参与CIT的生物合成,因此在接下来的基因敲除和异源表达实验中把这6个基因作为研究对象。3 CIT生物合成关键基因敲除菌株的构建及性质分析根据同源重组原理,以已建立的红曲菌高效基因敲除菌株（MrAku80）为出发菌株,分别构建了pksCT、MRL1、MRL2、MRL4、MRL6和MRL7各基因的敲除菌株 MrAku80△pksCT、MrAku80AL1、MrAku80△L2、MrAku80△L4、MrAku80△L6和MrAku80AL7,并分析了各敲除菌株在PDB培养基中CIT及其相关产物的变化。结果表明,与出发菌株MrAku80相比,MrAku80ApksCT菌株不能分泌CIT;MrAku80△L1菌株仍然能够合成CIT,但其产量比出发菌株减少了约95%;而MRL2、MRL4、MRL6和MRL7这4个基因的敲除均阻断了 CIT的合成,而且突变菌株能够产生一种新的代谢产物2,其中MrAku80△L2菌株积累的2的量非常高,达到8.6 mg/L,而 MrAku80△L4、MrAku80△L6 和 MrAku80△L7 菌株只产生微量的 2。经结构鉴定后,产物2（2,4-二羟基-3,5-二甲基-6-（1-甲基-2-氧代丙基）苯甲醛）的分子式为(C13H16O4,结合对pksCT结构域的分析,产物2应该是CIT合成途径中的第一个中间体。4基因异源表达菌株的构建、性质分析及CIT生物合成途径的推测以克隆的pksCT、MRL1、MRL2、MRL4、MRL6和MRL7基因构建了 10种不同的米曲霉异源表达菌株（A.oryzae-pksCT、A.oryzae-pksCT-L1、A.oryzae-pksCT-L1-L2、A.oryzae-pksCT-L1-L2-L4、A.oryzae-pksCT-L1-L2-L6、A.oryzae-pksCT-L1-L2-L4-L6、A.oryzae-pksCT-L1-L2-L7、A.oryzae-pksCT-Ll-L2-L4-L7、A.oryzae-pksCT-L1-L2-L6-L7和A.oryzae-pksCT-L1-L2-L4-L6-L7）,并用 HPLC-MS分析了各菌株在MPM（麦芽糖-蛋白胨培养基）培养基中代谢产物的差异,对产物1-9进行分离、纯化和结构鉴定,根据不同基因表达下合成的代谢产物在结构上的差异推测出CIT的生物合成途径以及各基因的功能,即1分子的乙酰CoA和4分子的丙二酰CoA在pksCT基因编码的PKS的催化下合成末端醛基的产物2,然后MRL2基因编码的加氧酶催化产物2的C-12位的甲基氧化为醇羟基而得到产物4,随后C-12位的醇羟基被MRL7编码的氧化还原酶继续氧化为醛基（产物14）,并最终被MRL4基因编码的醛脱氢酶氧化为羧基而得到产物15,合成途径中最后一步为MRL6编码的脱氢酶催化产物15的C-3位的羰基还原为羟基并环化、脱水而生成最终的产物CIT。5 pksCT基因的前体mmRNA选择性剪接的初步探讨通过对M ruber M7pksCT基因转录的mRNA的测序分析表明,该基因转录的前体mRNA存在选择性剪接的情况,即能够转录成两种不同的mRNA,其中丰度较低的mRNA序列中仅含一个位于第640-695位碱基的56 bp的内含子,而另一种丰度较高的mRNA序列中除含此内含子外,在第6549-6610位碱基处还有另外一个62 bp的内含子,这两种mRNA翻译成的PKS的结构域分别为:SAT-KS-AT-PT-ACP-CMeT-R 和 SAT-KS-AT-PT-ACP-CMeT。通过构建去除不同内含子的pksCT基因的异源表达载体,并导入米曲霉中进行表达,结果表明,只有当PKS具有完整的SAT-KS-AT-PT-ACP-CMeT-R结构域时才能合成CIT合成途径中的中间产物2,而缺失R结构域的PKS则不能合成2,也不能合成其他代谢产物。
张瑷[6]（2015）在《胡杨大片段基因在拟南芥中的表达及转基因株系的耐盐性分析》文中研究说明本实验以根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）为介导,利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为受体植物进行胡杨基因大片段的大规模转化。主要实验结果如下：1、本实验目前共将1884个根癌农杆菌进行了活化实验,其中有1570个农杆菌活化成功,OD600介于0.8-1之间,活化成功率为83.33%。2、将活化后的1570个胡杨（PopuLus euphratica Oliv.） BIB AC克隆进行了拟南芥转化,抗生素平板筛选转基因T1代,得到了抗性转基因拟南芥株系590个。3、对转基因T2代590个株系播种,采集幼苗利用Tissue Lyser结合CTAB法提取DNA,并采用微量紫外分光光度计检测其纯度,统计得到A260/280（排除酚类物质、RNA、碳水化合物、多肽等的污染对DNA纯度的影响）比值介于1.8-2.0之间的株系共521个。4、将以上521个T2代拟南芥进行PCR检测,采用NPTII基因为引物进行目标条带的扩增,目标条带540 bp,共得到403株阳性植株。5、实验用卡那霉素平板播种观察法,对所得到的部分转化子共119个进行纯合子筛选实验,分离得到T2纯合系49个,纯合子的比例为41.18%。6、对分离得到的49个纯和系进行耐盐初筛实验（NaC1浓度150mM）,共得到11个有耐盐表现的株系；进一步验证试验证实（NaC1浓度150 mM和175 mM）,有2个株系具有稳定的耐盐表现。7、对11个有耐盐性的株系播种后进行NaCl水溶液处理,在对相对含水量的测定时发现有3个株系在50、100、150 mM NaC1处理时RWC （Relative Water Content）均接近90%；培养基培养发现此耐盐株系的最大耐盐浓度为150mM,而土壤播种研究中也发现,在盐梯度处理转基因幼苗时,200mM盐处理1次就会导致生长停滞,说明此耐盐株系的最大耐盐浓度为150mM。8、在盐梯度处理时还得到了2个表型发生变化的突变体。本研究主要采集额济纳地区胡杨并对其基因资源进行耐盐能力分析,通过对其生长环境、生活习性的深入了解,结合BIBCA文库技术将胡杨基因随机大片段利用花序浸泡转化法转入拟南芥中表达,利用拟南芥自身的优势来筛选、鉴定转入的胡杨基因功能,这对于解析胡杨的耐盐机理及挖掘胡杨耐盐基因资源具有重要意义。这不仅丰富胡杨耐盐方面的研究内容,同时,对其他植物耐盐性的研究提供了可以借鉴的依据。
齐剑英,刘松财,戴建威,丁景华,杨丽华,江青艳,张永亮[7]（2010）在《活体电穿孔方法提高外源GRF基因在小鼠肌肉组织中的表达》文中提出向小鼠后肢小腿肌注pGRF表达质粒并加以电穿孔条件,注射剂量分别为5,10,50μg,于注射前及注射后10,20,30d测体质量,并采血分离血清测血清GRF水平。结果显示,5μgpGRF质粒电穿孔组注射后10dGRF分别比对照组、5μgpGRF质粒组升高44.73%（P<0.05）,12.86%（P>0.05）;血清中GRF水平升高。30d累积增重,5μgpGRF质粒电穿孔组分别比对照组、5μgpGRF质粒组高11.46%,6.75%（P>0.05）;10μgpGRF质粒组分别比对照组和10μgpGRF质粒电穿孔组高19.52%（P>0.05）,19.42%（P>0.05）。50μgpGRF质粒组45d累积增重分别比对照组、pGRF质粒电穿孔组高14.00%,12.00%（P>0.05）。结果表明,电穿孔处理可提高GRF基因在小鼠肌肉中的表达。
戴建威[8]（2008）在《生长激素双向调节病毒载体系统在小鼠肌肉组织的表达及对生长的影响》文中进行了进一步梳理本研究采用腺相关病毒（AAV）与慢病毒（LV）介导基因转移技术,同时构建CMV与肌肉特异启动子（SP）双启动子真核表达载体,以期提高目的基因在肌肉组织的表达效率。首先构建了CMV-SP双启动子表达载体,检验其在非肌源细胞及肌源细胞中对外源基因的表达效率,结果证明双启动子载体在非肌源细胞中与CMV启动子效率相近,而在肌源细胞中明显提高,比单启动子载体均提高2倍以上。其次,生产双启动子启动的GHRH和HBsAg/SST单基因以及GHRH-HBsAg/SST双基因AAV病毒颗粒,并注射小鼠肌肉组织,结果显示AAV介导的双基因表达对小鼠的生长具有明显的促进作用,证实了GHRH与HBsAg/SST双基因共表达对动物的促生长具有协同作用。对动物血液中相关激素水平测定发现,GHRH与SST出现了拮抗作用。最后选用LV作为基因转移载体介导GHRH,观察对动物生长影响,并与AAV载体相比较,结果表明LV载体对动物生长持续性更优于AAV。本研究为寻求高效的基因表达系统,实现对GH的双向调节,开发新一代提高动物生产性能的长效促生长制剂打下了基础。
王杨[9]（2007）在《导入外源GHRH基因质粒对犊牛生长性能和健康的影响》文中研究表明通过导入GHRH基因质粒，本论文主要研究了GHRH基因质粒对犊牛血液生化指标、生长激素水平、免疫功能及生长性能的影响。试验选用20头平均体重为54kg的荷斯坦牛犊，随机分为四组，这四组分别导入5ml含0mg、3mg、6mg和9mgGHRH基因质粒的生理盐水。研究发现，注射不同剂量的GHRH基因质粒，各处理组的生长激素水平与对照组相比均有不同程度的升高，其中6mg处理组的升高幅度最大（P＜0.05）。在整个饲养试验期中各处理组的平均日增重也均好于对照组，3mg组的平均日增重同对照组相比有增加的趋势，但未达到显着的影响水平（P＞0.05），而6mg处理组和9mg处理组的平均日增重效果则更加明显（P＜0.05）；3mg组、6mg组和9mg组的胸围值分别比对照组高5.17％、6.06％和14.08％，其中9mg处理组胸围值升高明显（P＜0.05）；各处理组的髻甲高与体斜长等体尺指标也都有不同程度的提高（P＞0.05）。可见注射GHRH基因质粒可以提高犊牛生长性能。试验结果表明，导入不同剂量的GHRH基因质粒，各处理组的IgG含量同对照组相比均有增加的趋势，而IgA、IgM含量则没有显着变化（P＞0.05）。各处理组的血清溶菌酶浓度都高于对照组，其中6mg处理组升高的幅度最大，差异显着（P＜0.05）；3mg处理组和6mg处理组的SOD浓度变化幅度较小，而9mg处理组的SOD浓度升高明显（P＜0.05）；各处理组的MDA含量同对照组相比都有降低的趋势，但未达到显着的影响水平（P＜0.05）；而导入GHRH基因质粒各处理组的一氧化氮含量没有显着性的变化。所以我们可以看出，GHRH基因质粒可以在一定程度上提高犊牛的免疫机能。在整个饲养试验期，导入GHRH基因质粒各处理组的白蛋白含量没有显着性变化，而各处理组的总蛋白和球蛋白含量同对照组相比均有升高的趋势，其中9mg组的总蛋白和球蛋白含量升高的幅度最大（P＜0.05）。3mg组、6mg组和9mg组的碱性磷酸酶含量均比对照组有不同程度的提高，其中9mg处理组的碱性磷酸酶含量升高明显（P＜0.05）；导入不同剂量的GHRH基因质粒各处理组的谷草转氨酶浓度同对照组相比均有降低的趋势，但差异并不显着（P＞0.05）；GHRH基因质粒也有降低谷丙转氨酶的趋势，同样未达到显着影响水平。而各处理组的血清乳酸脱氢酶含量同对照组相比都没有明显变化（P＞0.05）。整个试验表明，导入GHRH基因质粒不仅没有对犊牛健康产生不良影响，而且可以提高其生长性能和免疫机能。
任晓慧[10]（2007）在《RNA复制子对基因表达的促进作用及动物促生长方法的探讨》文中研究指明本研究采用塞姆利基森林病毒（SFV）RNA复制子和微球（MP）介导基因转移技术,以期提高目的基因的表达水平。首先构建了GHRH和HBsAg-SS单基因以及GHRH-HBsAg-SS双基因RNA复制子真核表达载体,在细胞和小鼠肌肉中成功地表达了目的蛋白,且表达的HBsAg-SS具有反应原性。制备的MP-DNA复合物提高了目的基因的表达以及基因免疫水平;也证实了复制子载体对基因表达具有明显的促进作用,表达水平比普通载体高3倍,诱发抗体水平的升高也显着优于普通载体。微球介导的GHRH和HBsAg-SS基因直接转移,对小鼠和育肥猪均表现出明显的促生长作用。初步探讨了非遗传性获得的促生长机制,证实利用这项技术在大型哺乳动物产生两代间的,非遗传性生物效应的可能性。给妊娠母鼠和母猪进行GHRH和HBsAg-SS基因直接转移,后代表现出明显的促生长作用。同时也证实了GHRH与HBsAg-SS双基因共表达对动物的促生长具有协同作用。本研究为寻求高效的基因表达系统,实现对GH的双向调节,开发新一代提高动物生产性能的长效促生长制剂打下了基础。
二、原生质体介导的外源性GRF基因在家兔体内的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、原生质体介导的外源性GRF基因在家兔体内的表达（论文提纲范文）
（1）小分子RNA在抗枯萎病香蕉新品种抵御尖孢镰刀菌Foc4侵染的作用与机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 香蕉简介 |
| 1.3 香蕉枯萎病 |
| 1.3.1 香蕉枯萎病尖孢镰刀菌 |
| 1.3.2 香蕉枯萎病菌的致病过程 |
| 1.3.3 香蕉枯萎病发病症状 |
| 1.3.4 香蕉枯萎病的发展及防治措施 |
| 1.4 小分子RNA研究进展 |
| 1.4.1 小分子RNA |
| 1.4.2 植物miRNA |
| 1.4.3 植物miRNA响应生物胁迫 |
| 1.4.4 植物-微生物相互作用中的跨界RNAi机制 |
| 1.5 MiRNA的研究方法 |
| 1.5.1 小分子RNA测序 |
| 1.5.2 降解组测序 |
| 1.6 本论文的研究目的意义和内容 |
| 1.6.1 研究目的和意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 第二章 香蕉根系响应Foc4 侵染的miRNA分析及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法步骤 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 试剂、仪器与设备 |
| 2.2.3 Foc4菌液配制和香蕉幼苗培养 |
| 2.2.4 RNA的提取 |
| 2.2.5 小RNA文库的构建 |
| 2.2.6 miRNA测序数据预处理 |
| 2.2.6.1 原始数据测序质量评估 |
| 2.2.6.2 质控数据统计 |
| 2.2.7 序列比对分析 |
| 2.2.8 MiRNA鉴定 |
| 2.2.8.1 Known miRNAs鉴定 |
| 2.2.8.2 Novel miRNAs鉴定 |
| 2.2.9 MiRNA表达量差异分析 |
| 2.2.10 RT-qPCR验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 抗病南天蕉和易感巴西蕉响应Foc4侵染 |
| 2.3.2 测序样品的准备及质量评估 |
| 2.3.3 小RNA测序数据统计 |
| 2.4 MiRNA鉴定及差异表达分析 |
| 2.4.1 Known miRNA鉴定及差异表达分析 |
| 2.4.2 Novel miRNA鉴定及差异表达分析 |
| 2.5 RT-qPCR验证miRNA表达 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 降解组测序鉴定miRNA靶基因 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法步骤 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 降解组文库的构建 |
| 3.2.3 降解组测序数据分析 |
| 3.2.4 RT-qPCR |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 降解组测序数据统计 |
| 3.3.2 靶基因RT-qPCR验证 |
| 3.3.3 靶基因的富集分析 |
| 3.3.4 靶基因注释 |
| 3.3.5 差异表达miRNA靶基因功能分析 |
| 3.3.5.1 植物激素信号转导和植物-病原体相互作用通路 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 香蕉miRNA调控植物激素信号转导响应Foc4 侵染 |
| 3.4.2 香蕉miRNA调控植物-病原体相互关系响应Foc4 侵染 |
| 3.4.3 植物防御相关酶 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 香蕉小RNA的跨界传递 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 香蕉染病处理 |
| 4.2.3 香蕉球茎内菌丝分离 |
| 4.2.4 小RNA文库的构建 |
| 4.2.5 小RNA测序数据处理 |
| 4.2.6 MiRNA鉴定 |
| 4.2.7 降解组文库构建及测序 |
| 4.2.8 降解组测序数据处理及分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 香蕉染病症状及球茎内Foc4菌丝分离 |
| 4.3.2 测序样品RNA提取及质量评估 |
| 4.3.3 测序质量及样本间重复性 |
| 4.3.4 小RNA测序数据与参考基因组比对统计 |
| 4.3.5 跨界传递香蕉小RNA的预测 |
| 4.3.6 降解组测序预测靶基因 |
| 4.3.7 靶基因功能分析 |
| 4.4 小结 |
| 结论、创新点及展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）水稻矮化少分蘖基因D26的图位克隆及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 油菜素内酯的结构与表型分析 |
| 1.1.1 BR的发现及其结构 |
| 1.1.2 BR突变体的表型分析 |
| 1.2 油菜素内酯的生物合成及作用机制研究进展 |
| 1.2.1 拟南芥中BR相关基因合成 |
| 1.2.2 水稻中BR相关基因合成 |
| 1.2.3 其他作物BR相关基因合成 |
| 1.2.4 BR合成途径的研究 |
| 1.2.5 水稻中BR信号转导研究 |
| 1.2.6 BR功能机制的研究 |
| 1.3 水稻粒型调控基因及其分子机制 |
| 1.3.1 克隆的主要水稻粒型基因 |
| 1.3.2 水稻粒型调控的主要分子机制 |
| 1.3.3 G蛋白信号传导 |
| 1.3.4 植物激素信号 |
| 1.3.5 转录调控因子 |
| 1.4 CRISP/Cas9 基因编辑技术的进展 |
| 1.5 本研究目的与意义 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株 |
| 2.1.3 表达载体 |
| 2.1.4 仪器与设备 |
| 2.1.5 主要试剂与耗材 |
| 2.1.6 主要培养基 |
| 2.2 技术方法 |
| 2.2.1 水稻种植 |
| 2.2.2 图位克隆方法 |
| 2.2.3 田间农艺性状差异调查 |
| 2.2.4 水稻成熟胚农杆菌转化方法 |
| 2.2.5 水稻DNA基因组CTAB提取方法 |
| 2.2.6 感受态细胞制备 |
| 2.2.7 克隆载体构建 |
| 2.2.8 植物叶片总RNA提取-TRIzol法 |
| 2.2.9 PCR反应 |
| 2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.2.11 质粒提取(小量碱裂解法) |
| 2.2.12 GUS组织染色分析 |
| 2.2.13 水稻原生质体分离及转化 |
| 2.2.14 BR激素敏感性实验 |
| 2.2.15 CRISPS/Cas9 基因编辑载体构建 |
| 2.2.16 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.2.17 转录组学分析 |
| 2.2.18 GST pull-down技术筛选互作蛋白 |
| 2.2.19 LC-MS/MS质谱蛋白鉴定 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 D26 突变体表型分析、精细定位及其候选基因功能分析 |
| 3.1.1 D26 突变体的表型分析 |
| 3.1.2 D26 突变体基因的图位克隆及候选基因的确立 |
| 3.1.3 D26 基因及其编码蛋白的生物信息学分析 |
| 3.2 D26 突变体互补验证及功能分析 |
| 3.2.1 互补实验分析 |
| 3.2.2 D26 基因的水稻原生质体亚细胞定位分析 |
| 3.2.3 D26 基因的表达模式分析 |
| 3.2.4 D26 突变体的BR激素的不敏感性实验分析 |
| 3.2.5 D26 突变体中BR激素相关的应答基因的表达调控分析 |
| 3.2.6 D26 基因通过内源或外源BR激素起正向调节功能 |
| 3.3 D26 基因过量表达及粒型调控功能分析 |
| 3.3.1 D26 基因过量表达载体构建及GUS染色表达鉴定 |
| 3.3.2 D26 基因在水稻中过量表达的表型分析 |
| 3.3.3 粒型基因在过量表达株系中表达分析 |
| 3.4 CRISP/Cas9 编辑水稻D26 基因 |
| 3.5 D26 蛋白的互作蛋白筛选 |
| 3.5.1 生物信息学预测互作分析 |
| 3.5.2 GST pull-down联合LC-MS/MS筛选互作蛋白 |
| 3.6 D26 突变体转录组分析 |
| 3.6.1 RNA-seq差异表达基因聚类分析 |
| 3.6.2 突变体与野生型差异基因统计分析 |
| 3.6.3 GO富集分析和KEGG路径富集分析 |
| 第4章 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 D26 蛋白编码一个GRAS家族蛋白新的等位基因 |
| 4.2.2 D26 蛋白缺失功能参与水稻粒型的调节机制 |
| 4.2.3 D26 蛋白可能协同其它转录因子共同完全基因的调控作用 |
| 4.2.4 油菜素内酯(BR)对赤霉素(GA)生物合成具有重要调控作用 |
| 4.2.5 油菜素内酯(BR)对细胞分裂和伸长具有重要调控作用 |
| 4.3 本研究的创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 A 实验所用引物 |
| 附录 B BRvsOTF中94 个差异基因表 |
| 附录 C OTFvsESvsBR中130 个差异基因 |
| 附录 D GO富集OTFvsES分子功能上、下调基因 |
| 附录 E GO富集BRvsES下上、下调基因 |
| 附录 F GO富集BRvsOTF下上、下调基因 |
| 附录 G OTFvsES下 KEGG通路富集的上、下调基因 |
| 附录 H BRvsES下 KEGG通路富集的上、下调基因 |
| 附录 I BRvsOTF下 KEGG通路富集的上、下调基因 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（3）黄瓜果实长度调控基因SF2的克隆及分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物器官大小的研究进展 |
| 1.1.1 植物器官大小的特征和意义 |
| 1.1.2 植物器官的发育过程 |
| 1.1.3 植物器官大小调控因子的研究进展 |
| 1.2 植物果实发育的研究进展 |
| 1.2.1 植物果实的形态特征 |
| 1.2.2 植物果实发育的细胞学基础 |
| 1.2.3 植物果实发育过程中的激素调控 |
| 1.2.4 黄瓜果实发育相关进展 |
| 1.3 组蛋白去乙酰化酶复合体在植物中的功能研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 黄瓜果实长度基因SF2的克隆及其功能初步分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.3 引物 |
| 2.2.4 试验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 sf2 短瓜突变体表型分析与鉴定 |
| 2.3.2 SF2 基因定位与克隆 |
| 2.3.3 SF2 是一个保守的核定位蛋白 |
| 2.3.4 转基因互补sf2 短瓜表型 |
| 2.3.5 利用CRISPR/Cas9 系统转基因敲除SF2 |
| 2.3.6 多克隆抗体的特异性鉴定 |
| 2.3.7 黄瓜不同组织SF2的mRNA和蛋白表达分析 |
| 2.3.8 黄瓜果实不同发育时期SF2的mRNA和蛋白表达分析 |
| 2.3.9 SF2 在果实中的免疫荧光定位 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 SF2 参与HDAC复合体的形成及作用机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2.3 引物 |
| 3.2.4 试验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 SF2 互作蛋白的挖掘与验证 |
| 3.3.2 SF2G515E对 SF2 的全基因组结合能力的影响 |
| 3.3.3 G515E突变促进了全基因组的乙酰化水平 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SF2全基因组靶点的挖掘与分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2.3 引物 |
| 4.2.4 试验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 野生型WT与突变体sf2 果实的RNA-seq分析 |
| 4.3.2 SF2 主要结合在靶基因的启动子和基因body区域 |
| 4.3.3 SF2 的结合元件的分析 |
| 4.3.4 SF2 的全基因组结合水平与乙酰化水平的关联性分析 |
| 4.3.5 SF2 的全基因组结合水平与基因表达水平的关联性分析 |
| 4.3.6 WT和 sf2 果实中H3K9ac和 H3K14ac结合peaks分析 |
| 4.3.7 核心抑制靶基因集的挖掘 |
| 4.3.8 核心激活靶基因集的挖掘 |
| 4.3.9 SF2 激活基因集具有更高的SF2 结合水平、H3K9ac水平以及H3K14ac水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 SF2 通过组蛋白去乙酰化修饰抑制激素合成和信号相关基因的表达 |
| 4.4.2 SF2 通过组蛋白去乙酰化修饰激活细胞周期途径相关基因的表达 |
| 4.4.3 SF2 抑制和促进基因表达的表观调控机制 |
| 第五章 SF2下游调控网络在果实发育过程中的功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 主要试剂和仪器 |
| 5.2.3 引物 |
| 5.2.4 试验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 核心抑制靶基因集在早期果实发育过程中的表达模式 |
| 5.3.2 核心激活靶基因集在早期果实发育过程中的表达模式 |
| 5.3.3 SF2 通过调控细胞分裂素合成代谢途径影响果实细胞增殖 |
| 5.3.4 SF2 通过调控多胺合成途径影响果实细胞增殖 |
| 5.3.5 细胞分裂素和多胺在果实细胞增殖过程中的协同调控 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）参薯块茎特异microRNA基因的挖掘分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 参薯是重要的热带薯类作物且块茎营养丰富 |
| 1.2 MicroRNA参与调控植物生长发育 |
| 1.2.1 植物MicroRNA的生物合成 |
| 1.2.2 成熟MiRNA参与植物生长发育 |
| 1.3 microRNA参与薯块发育 |
| 1.4 重要miRNA家族的研究进展 |
| 1.4.1 miR159家族研究进展 |
| 1.4.2 miR164家族研究进展 |
| 1.4.3 miR167家族研究进展 |
| 1.4.4 miR168家族研究进展 |
| 1.4.5 miR156家族研究进展 |
| 1.5 利用双荧光报告系统验证参薯miRNA靶基因 |
| 1.5.1 RLM-5'RACE验证剪切类 |
| 1.5.2 双荧光素酶报告系统 |
| 1.6 研究的目的和意义 |
| 1.7 技术路线图 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 试剂及培养基的配置 |
| 2.4 序列信息 |
| 2.5 总RNA提取,反转录cDNA和miRNA cDNA |
| 2.5.1 RNA的提取和质量检测 |
| 2.5.2 RNA反转录cCDNA |
| 2.5.3 Stem-loop法反转录miRNA cDNA |
| 2.6 植物基因组DNA的提取 |
| 2.7 荧光定量的引物设计及程序设定 |
| 2.7.1 荧光定量的引物设计需遵循以下原理: |
| 2.7.2 扩增miRNA基因荧光定量 |
| 2.7.3 扩增靶基因荧光定量 |
| 2.8 改造双荧光素酶报告系统 |
| 2.8.1 pGreen Ⅱ 62-sk和pGreen Ⅱ 0800-LUC的活化及菌种保存 |
| 2.8.2 pGreen Ⅱ 62-sk和pGreen Ⅱ 0800-LUC质粒提取 |
| 2.8.3 利用pGreen Ⅱ 62-sk扩增35S启动子 |
| 2.8.4 PCR产物回收 |
| 2.8.5 PCR产物、质粒双酶切 |
| 2.8.6 双酶切产物回收 |
| 2.8.7 回收产物连接 |
| 2.8.8 连接产物进行转化 |
| 2.8.9 阳性菌株的筛选 |
| 2.8.10 连接接头 |
| 2.8.11 扩增6个MI156基因 |
| 2.9 荧光定量的数据处理 |
| 2.10 原生质体的制备 |
| 2.10.1 参薯原生质体提取液的配置 |
| 2.10.2 大薯原生质体提取 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 参薯miRNA基因的挖掘和特征分析 |
| 3.1.1 miRNA基因家族数目和分布 |
| 3.1.2 miRNA靶基因特点 |
| 3.2 普通茎和块茎间差异表达miRNA基因筛选 |
| 3.3 差异表达miRNA的表达分析 |
| 3.3.1 miRNA基因表达部位分析 |
| 3.3.2 miRNA成熟miRNA表达分析 |
| 3.4 miRNA靶基因的表达分析 |
| 3.5 利用双荧光报告系统验证参薯miRNA靶基因 |
| 3.5.1 双荧光报告系统改造 |
| 3.5.2 接头连接 |
| 3.5.3 miR156和靶基因SPL的双荧光报告系统验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 miRNA分布结果分析 |
| 4.2 miRNA基因定量的结果分析 |
| 4.3 荧光双报告系统载体构造 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 本人硕士研究期间所做科研成果 |
| 致谢 |
（5）红色红曲菌M7高效基因敲除体系的构建及桔霉素生物合成途径的解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 红曲与红曲菌 |
| 1.1 红曲菌及其代谢产物 |
| 1.2 红曲的安全性问题 |
| 1.2.1 桔霉素 |
| 1.2.2 红曲菌产CIT的发现 |
| 1.2.3 红曲中CIT的限量标准 |
| 1.3 红曲菌功能基因组的研究进展 |
| 1.4 红曲菌SMs生物合成途径的研究进展 |
| 1.4.1 CIT生物合成途径及其相关基因 |
| 1.4.2 红曲色素生物合成途径及其相关基因 |
| 1.4.3 monacolin K生物合成途径及其相关基因 |
| 2 聚酮化合物与PKS |
| 3.1 聚酮化合物 |
| 3.2 PKS及作用机理 |
| 3 高效基因敲除 |
| 3.1 DNA双链断裂及其修复机制 |
| 3.2 基因敲除 |
| 3.3 真菌中高效基因敲除体系的研究进展 |
| 4 真菌SMs生物合成途径的异源表达 |
| 4.1 异源表达载体的构建 |
| 4.2 异源表达宿主的选择 |
| 4.2.1 真菌PKS在细菌中的表达 |
| 4.2.2 真菌PKS在酵母中的表达 |
| 4.2.3 真菌PKS在丝状真菌中的表达 |
| 5 选择性剪接 |
| 5.1 前体mRNA的选择性剪接 |
| 5.2 真菌中AS的研究进展 |
| 6 目的及意义 |
| 第二章 红曲菌高效基因敲除体系的构建 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 酶与主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 ku70、ku80和ligase Ⅳ因的克隆分析 |
| 2.1.1 M. ruber M7全基因组测序 |
| 2.1.2 ku70基因的克隆分析 |
| 2.1.3 ku80基因的克隆分析 |
| 2.1.4 ligase Ⅳ基因的克隆分析 |
| 2.2 敲除载体的构建 |
| 2.2.1 敲除盒的构建 |
| 2.2.2 敲除载体的构建 |
| 2.3 农杆菌介导的红曲菌转化 |
| 2.4 转化子鉴定 |
| 2.4.1 转化子的PCR检测 |
| 2.4.2 转化子的Southern杂交验证 |
| 2.5 突变子性质分析 |
| 2.5.1 红曲菌孢子计数 |
| 2.5.2 形态观察和显微观察 |
| 2.5.3 生物量测定 |
| 2.5.4 红曲色素和CIT产量测定 |
| 2.5.5 GRF的统计 |
| 2.5.6 对MMS的敏感性分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ku70、ku80和ligase Ⅳ基因的克隆 |
| 3.1.1 M. ruber M7全基因组测序 |
| 3.1.2 ku70基因的克隆分析 |
| 3.1.3 ku80基因的克隆分析 |
| 3.1.4 ligase Ⅳ基因的克隆分析 |
| 3.2 敲除载体的构建 |
| 3.2.1 ku70敲除载体的构建 |
| 3.2.2 ku80敲除载体的构建 |
| 3.2.3 ligase Ⅳ敲除载体的构建 |
| 3.3 转化子的鉴定 |
| 3.3.1 Mr△ku70的鉴定 |
| 3.3.2 Mr△ku80的鉴定 |
| 3.3.3 Mr△lig4的鉴定 |
| 3.4 突变子性质分析 |
| 3.4.1 菌落形态和显微形态观察 |
| 3.4.2 红曲菌孢子产量 |
| 3.4.3 生物量比较 |
| 3.4.4 红曲色素产量比较 |
| 3.4.5 CIT产量比较 |
| 3.4.6 GRF的比较 |
| 3.4.7 对MMS的敏感性比较 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.1.1 从M. ruber M7基因组中克隆了ku70、ku80和ligase Ⅳ基因 |
| 4.1.2 构建了基因敲除菌株Mr△ku70、Mr△ku80和Mr△lig4 |
| 4.1.3 分析了基因敲除菌株孢子产量、营养生长和有性/无性繁殖的差异 |
| 4.1.4 分析了基因敲除菌株产红曲色素和CIT能力的差异 |
| 4.1.5 分析了基因敲除菌株中其他基因敲除效率的差异 |
| 4.1.6 分析了基因敲除菌株对MMS的敏感性的差异 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 关于ku70、ku80和ligase Ⅳ基因的敲除对M. ruber M7菌株表型及SMs影响的讨论 |
| 4.2.2 关于Mr△ku70、Mr△ku80和Mr△lig4菌株中GRF的讨论 |
| 4.2.3 关于不同的基因敲除菌株对MMS的敏感性的讨论 |
| 第三章 红曲菌产CIT基因簇的分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株 |
| 1.2 软件和数据库 |
| 2 方法 |
| 2.1 CIT基因簇的生物信息学分析 |
| 2.2 不同真菌中CIT基因簇的序列比对分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CIT基因簇的生物信息学分析 |
| 3.1.1 pksCT的基因结构分析 |
| 3.1.2 MRL1的基因结构分析 |
| 3.1.3 MRL2的基因结构分析 |
| 3.1.4 MRL3的基因结构分析 |
| 3.1.5 MRL4的基因结构分析 |
| 3.1.6 MRL5的基因结构分析 |
| 3.1.7 MRL6的基因结构分析 |
| 3.1.8 MRL7的基因结构分析 |
| 3.1.9 MRR1的基因结构分析 |
| 3.1.10 MRR2的基因结构分析 |
| 3.1.11 MRR3的基因结构分析 |
| 3.1.12 MRR4的基因结构分析 |
| 3.1.13 MRR5的基因结构分析 |
| 3.1.14 MRR6的基因结构分析 |
| 3.1.15 MRR7的基因结构分析 |
| 3.1.16 MRR8的基因结构分析 |
| 3.2 不同真菌中CIT基因簇的序列比对分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.1.1 从M. ruber M7全基因组序列中找到并分析了负责CIT生物合成的基因簇 |
| 4.1.2 确定了基因簇中负责CIT生物合成的关键基因 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 关于全基因组测序及生物信息学分析在功能基因组学研究中应用的讨论 |
| 4.2.2 关于如何确定基因簇中负责SMs生物合成的关键基因的讨论 |
| 第四章 红曲菌CIT基因簇中相关基因的功能验证 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 酶与主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 敲除载体的构建 |
| 2.1.1 敲除盒的构建 |
| 2.1.2 敲除载体的构建 |
| 2.2 农杆菌介导的红曲菌转化 |
| 2.3 转化子的PCR鉴定 |
| 2.4 各基因敲除菌株产CIT能力分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 敲除载体的构建 |
| 3.1.1 pksCT敲除载体的构建 |
| 3.1.2 L1敲除载体的构建 |
| 3.1.3 L2敲除载体的构建 |
| 3.1.4 L4敲除载体的构建 |
| 3.1.5 L6敲除载体的构建 |
| 3.1.6 L7敲除载体的构建 |
| 3.2 转化子的鉴定 |
| 3.3 各基因敲除菌株产CIT能力分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.1.1 分别构建了pksCT、L1、L2、L4、L6和L7的基因敲除菌株 |
| 4.1.2 分析了不同基因敲除菌株中与CIT相关的代谢产物的变化 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 关于运用构建的红曲菌高效基因敲除体系进行CIT基因簇中多基因敲除的讨论 |
| 4.2.2 关于基因敲除菌株中与CIT相关的代谢产物的变化的讨论 |
| 第五章 CIT基因簇在米曲霉中的异源表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 酶与主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 异源表达载体的构建 |
| 2.1.1 pksCT表达载体的构建 |
| 2.1.2 pksCT+L1表达载体的构建 |
| 2.1.3 L2表达载体的构建 |
| 2.1.4 L2+L4表达载体的构建 |
| 2.1.5 L2+L6表达载体的构建 |
| 2.1.6 L2+L4+L6表达载体的构建 |
| 2.1.7 L2+L7表达载体的构建 |
| 2.1.8 L2+L4+L7表达载体的构建 |
| 2.1.9 L2+L6+L7表达载体的构建 |
| 2.1.10 L2+L4+L6+L7表达载体的构建 |
| 2.2 PEG介导的米曲霉转化 |
| 2.3 转化子鉴定 |
| 2.4 转化子代谢产物分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 异源表达载体的构建 |
| 3.1.1 pksCT表达载体的构建 |
| 3.1.2 pksCT+L1表达载体的构建 |
| 3.1.3 L2表达载体的构建 |
| 3.1.4 L2+L4表达载体的构建 |
| 3.1.5 L2+L6表达载体的构建 |
| 3.1.6 L2+L4+L6表达载体的构建 |
| 3.1.7 L2+L7表达载体的构建 |
| 3.1.8 L2+L4+L7表达载体的构建 |
| 3.1.9 L2+L6+L7表达载体的构建 |
| 3.1.10 L2+L4+L6+L7表达载体的构建 |
| 3.2 转化子鉴定 |
| 3.3 转化子代谢产物分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.1.1 分别构建了含有pksCT、L1、L2、L4、L6和L7基因的不同组合的米曲霉异源表达菌株 |
| 4.1.2 分析了不同的米曲霉异源表达菌株中代谢产物的差异 |
| 4.1.3 阐述了CIT的生物合成途径 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 异源表达技术研究CIT生物合成途径的讨论 |
| 4.2.2 关于文献报道的CIT生物合成途径的讨论 |
| 4.2.3 关于CIT生物合成最小基因簇的讨论 |
| 第六章 pksCT基因中AS的初步研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株与质粒 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 酶与主要试剂及配制 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 pksCT基因中内含子分析 |
| 2.1.1 利用生物信息学软件预测内含子位置 |
| 2.1.2 经mRNA测序分析内含子位置 |
| 2.2 移除不同内含子的pksCT在米曲霉中的异源表达 |
| 2.2.1 移除内含子1和62 bp内含子2的pksCT表达载体的构建 |
| 2.2.2 移除内含子1和60 bp内含子2的pksCT表达载体的构建 |
| 2.3 PEG介导的米曲霉转化 |
| 2.4 转化子鉴定 |
| 2.5 转化子代谢产物分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 pksCT基因中内含子分析 |
| 3.2 移除不同内含子的pksCT基因在米曲霉中的异源表达 |
| 3.2.1 移除内含子1和62 bp内含子2的pksCT表达载体的构建 |
| 3.2.2 移除内含子1和60 bp内含子2的pksCT表达载体的构建 |
| 3.3 转化子鉴定 |
| 3.4 转化子代谢产物分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.1.1 发现了M. ruber M7的pksCT基因存在AS |
| 4.1.2 构建了移除不同内含子的pksCT基因异源表达载体 |
| 4.1.3 分析了不同pksCT基因的米曲霉转化子的代谢产物 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 关于pksCT基因的AS的讨论 |
| 4.2.2 pksCT中R结构域的作用的讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 3 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录1 大肠杆菌感受态细胞的转化 |
| 附录2 质粒DNA的抽提 |
| 附录3 LiOAc/SS-DNA/PEG介导的酿酒酵母中外源DNA的转化 |
| 附录4 根癌农杆菌感受态细胞的制备和转化 |
| 附录5 根癌农杆菌介导的红曲菌转化 |
| 附录6 PEG介导的A.oryzae NSAR1菌株的转化 |
| 附录7 PEG介导的A.oryzae M-2-3菌株的转化 |
| 附录8 Southern杂交 |
| 附录9 UV、MS和NMR |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（6）胡杨大片段基因在拟南芥中的表达及转基因株系的耐盐性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 胡杨的概况 |
| 1.2 胡杨耐盐性研究现状 |
| 1.3 拟南芥简介 |
| 1.4 拟南芥突变体的研究 |
| 1.5 植物遗传转化法概况 |
| 1.5.1 农杆菌介导的植物遗传转化 |
| 1.5.2 基因枪介导的遗传转化 |
| 1.5.3 原生质体介导的遗传转化 |
| 1.6 BIBAC文库的研究及进展 |
| 1.7 本研究的主要目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 仪器与设备 |
| 2.1.3 实验药品与试剂 |
| 2.1.4 培养基质 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 营养土种植 |
| 2.2.2 培养基培养 |
| 2.3 实验时间及周期 |
| 2.4 测量方法 |
| 2.4.1 根癌农杆菌的活化培养 |
| 2.4.2 花序浸泡法转化拟南芥 |
| 2.4.3 阳性转化子的筛选 |
| 2.4.4 转化拟南芥的T1代统计 |
| 2.4.5 转基因T2代的DNA提取 |
| 2.4.6 PCR鉴定转基因植株 |
| 2.4.7 T2代转基因苗的纯合筛选 |
| 2.4.8 NaCl处理实验 |
| 2.4.9 突变体的观察 |
| 2.5 统计标准 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 根癌农杆菌的活化培养 |
| 3.2 农杆菌活化率的统计 |
| 3.3 阳性转化子的筛选 |
| 3.4 转基因拟南芥的表型变化统计 |
| 3.5 转基因拟南芥的引物筛选 |
| 3.6 转基因T2代的DNA提取及纯度分析 |
| 3.7 PCR鉴定转基因植株 |
| 3.8 T2代转基因苗的纯合子筛选 |
| 3.9 转基因纯合植株的统计 |
| 3.10 纯化苗的耐盐初筛 |
| 3.11 拟南芥耐盐株系的筛选 |
| 3.12 T3代转化子的耐盐梯度实验 |
| 3.13 11个株系实生苗的耐盐分析 |
| 3.13.1 叶片的鲜重统计 |
| 3.13.2 叶片的干重统计 |
| 3.13.3 叶片吸水后的重量统计 |
| 3.1.3.4 叶片相对含水量的分析 |
| 3.13.5 盐胁迫对于种子萌发率的影响 |
| 3.13.6 不同盐浓度对叶片数量影响 |
| 3.13.7 不同盐浓度对叶片大小的影响 |
| 3.13.8 地上部分与地下部分的比较 |
| 3.14 具有耐盐表现的转化子的表型分析 |
| 3.15 突变体的表型变化分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介 |
（7）活体电穿孔方法提高外源GRF基因在小鼠肌肉组织中的表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 GRF的提取、定量、鉴定 |
| 1.4 注射不同剂量pIRES-GRF质粒小鼠分组及处理 |
| 1.4.1 注射剂量50μg |
| 1.4.2 注射剂量10μg |
| 1.5 注射不同剂量pcDNA3-GRF (1-32) 质粒小鼠分组及处理 |
| 1.6 样品的采集及分析 |
| 1.7 增重试验 |
| 1.8 数据处理与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 pGRF质粒鉴定与定量 |
| 2.2 电穿孔对GRF在小鼠肌肉中表达的影响 |
| 2.2.1 注射pIRES-GRF |
| 2.2.2 注射pcDNA3-GRF (1-32) |
| 2.3 累积增重结果 |
| 2.3.1 不同剂量pIRES-GRF组小鼠增重 |
| 2.3.2 不同剂量pcDNA3-GRF (1-32) 组小鼠增重 |
| 3 讨论 |
（8）生长激素双向调节病毒载体系统在小鼠肌肉组织的表达及对生长的影响（论文提纲范文）
| 提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 病毒载体的应用及安全性评估 |
| 1 病毒载体的应用 |
| 2 危害与阻碍 |
| 3 展望及今后研究方向 |
| 第二章 神经内分泌生长轴对动物生长调控的研究 |
| 1 GHRH， GHRHR 及其基因 |
| 2 SST， SSTR 及其基因 |
| 3 GH，GHR 和GHBP |
| 4 IGFs 家族 |
| 5 展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 CMV、SP 双启动子肌肉组织特异表达系统的建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 AAV 介导生长激素双向基因调节系统的建立.. |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 AAV 介导生长激素双向调节系统在小鼠肌肉组织表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 AAV 介导 GHRH 及 HBSAG/SST 基因对小鼠生长影响及血液激素水平影响 |
| 1 材料与实验动物 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 慢病毒载体介导GHRH基因在小鼠肌肉组织表达及对生长影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的学术论文及其它成果 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（9）导入外源GHRH基因质粒对犊牛生长性能和健康的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 与动物生长调控相关的几种激素 |
| 1.2 牛生长激素的应用现状 |
| 1.2.1 牛生长激素在美国的应用研究现状 |
| 1.2.2 牛生长激素在欧洲的应用研究现状 |
| 1.2.3 牛生长激素在我国的应用研究现状 |
| 1.3 GHRH基因质粒的应用研究现状 |
| 1.3.1 基因治疗的研究现状 |
| 1.3.2 GHRH基因质粒的作用机制 |
| 1.3.3 GHRH基因质粒的构建状况 |
| 1.3.4 GHRH基因质粒的导入方式 |
| 1.3.5 GHRH基因质粒的应用效果及存在问题 |
| 1.4 GH、IGF-I与神经-内分泌-免疫网络 |
| 1.5 试验目的 |
| 2 GHRH基因质粒的制备与鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.2 结果和讨论 |
| 2.2.1 质粒的转化 |
| 2.2.2 质粒的PCR检测结果 |
| 2.2.3 质粒的大量制备与纯化 |
| 2.3 小结 |
| 3 导入外源GHRH基因质粒对犊牛生长性能的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 试验设计 |
| 3.1.2 试验动物及分组 |
| 3.1.3 饲养管理 |
| 3.1.4 试验器材 |
| 3.1.5 指标测定方法 |
| 3.1.6 数据处理 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 导入GHRH基因质粒对犊牛日增重的影响 |
| 3.2.2 导入GHRH基因质粒对犊牛体尺变化的影响 |
| 3.2.3 导入GHRH基因质粒对生长激素水平的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 不同剂量GHRH基因质粒对犊牛生长性能的影响 |
| 3.3.2 GHRH基因质粒对生长激素水平的影响 |
| 3.4 小结 |
| 4 导入外源GHRH基因质粒对犊牛血液生化指标的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 试验设计 |
| 4.1.2 试验动物及分组 |
| 4.1.3 饲养管理 |
| 4.1.4 试验器材 |
| 4.1.5 犊牛的临床观察 |
| 4.1.6 血液采样 |
| 4.1.7 指标测定方法 |
| 4.1.8 数据处理 |
| 4.2 结果和分析 |
| 4.2.1 犊牛临床表现 |
| 4.2.2 不同剂量GHRH基因质粒对犊牛血浆总蛋白、白蛋白、球蛋白的影响 |
| 4.2.3 不同剂量GHRH基因质粒对犊牛血清碱性磷酸酶的影响 |
| 4.2.4 不同剂量GHRH基因质粒对犊牛血清乳酸脱氢酶的影响 |
| 4.2.5 不同剂量GHRH基因质粒对犊牛谷草、谷丙转氨酶的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 导入外源GHRH基因质粒对犊牛免疫相关指标的影响 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 试验设计 |
| 5.1.2 试验动物及分组 |
| 5.1.3 饲养管理 |
| 5.1.4 试验器材 |
| 5.1.5 指标测定方法 |
| 5.1.6 血样采集 |
| 5.1.7 数据处理 |
| 5.2 结果和分析 |
| 5.2.1 不同剂量GHRH基因质粒对犊牛血浆IgA、IgG、IgM的影响 |
| 5.2.2 不同剂量GHRH基因质粒对犊牛溶菌酶的影响 |
| 5.2.3 不同剂量GHRH基因质粒对犊牛超氧化物歧化酶的影响 |
| 5.2.4 不同剂量GHRH基因质粒对犊牛丙二醛的影响 |
| 5.2.5 不同剂量GHRH基因质粒对犊牛一氧化氮的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 附发表文章 |
（10）RNA复制子对基因表达的促进作用及动物促生长方法的探讨（论文提纲范文）
| 提要 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 甲病毒载体系统的研究进展 |
| 1 甲病毒简介 |
| 2 甲病毒复制子载体发展历程 |
| 3 甲病毒复制子结构以及递送方式 |
| 4 甲病毒复制子载体种类 |
| 5 甲病毒复制子载体应用 |
| 6 甲病毒复制子载体的生物安全性问题 |
| 第二章 生长激素释放因子和生长激素释放抑制因子 |
| 1 GHRH、SS 与GH/IGF-I 生长轴的关系 |
| 2 GHRH 概述 |
| 3 SS 概述 |
| 4 GHRH 和SS 共同协调控制GH 的分泌模式 |
| 5 GHRH 在动物生产中的应用研究 |
| 6 SS 在动物生产中的应用研究 |
| 7 GHRH 和SS 基因转移的新方法：PLGA-MP |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 GHRH、SS 及GHRH-SS RNA 复制子真核表达载体的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 GHRH 基因RNA 复制子真核表达载体的构建 |
| 2.2 HBSAG-SS 基因RNA 复制子真核表达载体的构建 |
| 2.3 GHRH-HBSAG-SS 双基因RNA 复制子真核表达载体的构建 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 GHRH、SS 及GHRH-SS RNA 复制子表达载体在真核细胞中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 总RNA 的提取 |
| 2.2 转染细胞的RT-PCR |
| 2.3 TRICINE-SDS-PAGE 和SDS-PAGE 结果 |
| 2.4 表达产物的DOT-ELISA（检测表达的SS 和GHRH） |
| 2.5 WESTERN BLOT 检测结果（检测表达的HBSAG、SS、 |
| 2.6 细胞原位免疫荧光结果 |
| 2.7 双抗体夹心ELISA 法检测细胞表达的HBSAG |
| 2.8 放免法检测转染细胞表达的GHRH 和SS |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 RNA 复制子载体与普通载体表达水平比较的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PIRES-LACZ 载体的构建 |
| 2.2 LACZ 基因在293 和BHK-21 细胞中表达 |
| 2.3 LACZ 基因小鼠肌肉中的表达水平 |
| 2.4 GHRH 基因在293 和BHK-21 细胞中的表达 |
| 2.5 GHRH 基因在小鼠肌肉中的表达 |
| 2.6 HBSAG-SS 基因在293 和BHK-21 细胞的表达 |
| 2.7 HBSAG-SS 基因在小鼠肌肉中的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 RNA 复制子载体与普通载体基因表达水平的比较 |
| 3.2 甲病毒RNA 复制子载体的生物安全性问题 |
| 4 小结 |
| 第四章 微球介导GHRH、SS 和GHRH-SS RNA 复制子表达载体在小鼠体内的表达及对生长的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 PLGA-MP 的制备以及性质考察 |
| 2.2 微球介导GHRH、HBSAG 和SS 基因在小鼠肌肉内的表达 |
| 2.3 微球介导GHRH 和SS 及双基因的RNA 复制子表达质粒在肌肉组织的表达对小鼠生长的影响 |
| 2.4 微球介导 HBsAg 和 SS RNA 复制子表达质粒基因免疫小鼠试验 |
| 2.5 微球介导GHRH 和SS 及双基因的RNA 复制子表达质粒在妊娠母鼠肌肉组织的表达对子代小鼠生长的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PLGA-MP-DNA 的制备方法和性质 |
| 3.2 影响PLGA-MP 质量的因素 |
| 3.3 PLGA-MP 的安全性 |
| 3.4 PLGA-MP-DNA 对基因表达和免疫效果的影响 |
| 3.5 RNA 复制子对SS 融合基因的免疫效果和促生长作用的影响.. |
| 3.6 微球介导GHRH 和SS 基因的RNA 复制子表达质粒在肌肉组织的表达对小鼠生长的影响 |
| 3.7 GHRH 和SS 基因RNA 复制子表达质粒在妊娠母鼠肌肉组织的表达对子代小鼠生长的影响 |
| 3.8 GHRH 和HBSAG-SS 双基因共表达对小鼠促生长的协同作用 |
| 4 小结 |
| 第五章 微球介导GHRH、SS 和GHRH-SS RNA 复制子表达载体在猪体内的表达及对生长和免疫机能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 微球介导HBSAG-SS基因RNA复制子表达质粒在肌肉组织的表达对育肥猪生长及免疫机能的影响 |
| 2.2 微球介导GHRH 和HBSAG-SS 基因以及双基因RNA 复制子表达质粒在妊娠母猪肌肉组织的表达对后代仔猪生长及免疫机能的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 SS 基因主动免疫的效果及其对育肥猪生长的影响 |
| 3.2 微球介导GHRH 和HBSAG-SS 基因RNA 复制子表达质粒在妊娠母猪肌肉组织的表达对后代仔猪生长的影响 |
| 3.3 微球介导GHRH 和HBSAG-SS 基因RNA 复制子表达质粒在肌肉组织的表达对猪免疫机能的影响 |
| 3.4 微球介导GHRH-HBSAG-SS双基因RNA复制子表达质粒在肌肉组织的共表达对猪生长和免疫的协同作用 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士期间发表的学术论文及其它成果 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
| 导师及作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
四、原生质体介导的外源性GRF基因在家兔体内的表达（论文参考文献）
- [1]小分子RNA在抗枯萎病香蕉新品种抵御尖孢镰刀菌Foc4侵染的作用与机理研究[D]. 李静宇. 华南理工大学, 2020(02)
- [2]水稻矮化少分蘖基因D26的图位克隆及功能研究[D]. 林智敏. 华侨大学, 2019(04)
- [3]黄瓜果实长度调控基因SF2的克隆及分子机制的研究[D]. 张震. 西北农林科技大学, 2019
- [4]参薯块茎特异microRNA基因的挖掘分析[D]. 张博. 海南大学, 2019(06)
- [5]红色红曲菌M7高效基因敲除体系的构建及桔霉素生物合成途径的解析[D]. 何毅. 华中农业大学, 2015(04)
- [6]胡杨大片段基因在拟南芥中的表达及转基因株系的耐盐性分析[D]. 张瑷. 内蒙古农业大学, 2015(12)
- [7]活体电穿孔方法提高外源GRF基因在小鼠肌肉组织中的表达[J]. 齐剑英,刘松财,戴建威,丁景华,杨丽华,江青艳,张永亮. 中国兽医学报, 2010(07)
- [8]生长激素双向调节病毒载体系统在小鼠肌肉组织的表达及对生长的影响[D]. 戴建威. 吉林大学, 2008(11)
- [9]导入外源GHRH基因质粒对犊牛生长性能和健康的影响[D]. 王杨. 河北农业大学, 2007(06)
- [10]RNA复制子对基因表达的促进作用及动物促生长方法的探讨[D]. 任晓慧. 吉林大学, 2007(03)