一、丙型肝炎病毒致病的分子生物学机制（论文文献综述）
董娜[1]（2020）在《云南省一种新型丙型肝炎病毒全基因组和遗传进化分析》文中指出目的:对云南省小型哺乳动物携带丙型肝炎病毒属（Hepacivirus,HEPV）病毒进行调查研究,阐明云南省小型哺乳动物携带HEPV病毒的流行现状和遗传进化。方法:采用HEPV的通用检测引物,用逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）对采集的小型哺乳动物样本进行病毒核酸检测,调查HEPV在小型哺乳动物中的感染现状;参考扩增序列,设计特异性引物,采用定量PCR进行HEPV病毒的组织嗜性研究;通过高通量测序获取HEPV病毒全基因组;应用Cluster W和MAGE7.0生物信息学软件对HEPV病毒进行相似性分析并建立系统进化树。结果:本调查研究2016-2017年在云南省12个县（区、市）共捕获13属22种1597只小型哺乳动物。对这些小型哺乳动物进行了HEPV病毒检测,感染率为0.13%（2/1597）,感染宿主动物为长尾大麝鼩（Crocidura dracula）,长尾大麝鼩中HEPV的感染率为12.5%（2/16）。检测到的2份阳性样品分别命名为Crocidura dracula dracula/NJ12-2017和Crocidura dracula dracula/XY174-2017;扩增Crocidura dracula/NJ12-2017序列,与MF775363.1相似度最高,氨基酸水平同源性为69.25%。定量PCR表明HEPV病毒在肝脏中的拷贝数最高。获得的Crocidura dracula dracula/NJ12-2017 HEPV病毒全基因组序列,进行序列比对和遗传进化分析提示,氨基酸水平与已报道的HEPV病毒的相似度较低,为36.548%-43.59%;在系统发生树上,本研究获得的HEPV病毒独立于其他病毒,独立成为一个分支。结论:在云南省长尾大麝鼩中首次发现一种新型HEPV病毒,病毒的靶器官为肝脏组织。
杜江[2]（2017）在《啮齿目动物沙粒病毒科、黄病毒科等7科病毒组及进化研究》文中指出全球关于新发突发传染病疫情的报道层出不穷。重大传染病疫情的发生不仅严重威胁人类健康,并会引发人群恐慌、区域性限制等,给社会稳定和经济发展带来巨大冲击。因此,有效防控新发突发传染病已成为人类社会亟待解决的的重要问题之一。全球超过60%的新发传染病是动物源性的,而且所占比例还在逐年增加。啮齿目动物是全球地理位置分布最广、种类最多的哺乳动物种群,它们的生活区域与人类社区和饲养动物有广泛的重叠和紧密的联系。病毒组对人和其它哺乳动物的健康有重要的影响,它是感染人和动物致病的病毒的来源。作为自然界众多病毒最主要的自然宿主,啮齿类动物扮演了人类和其它野生动物联系的纽带,将人类暴露给自然生态系统中可致病的病毒。近年来,国内外的研究人员已经在啮齿目动物体内鉴定出三十余种能感染人致病的病毒,如汉坦病毒、沙粒病毒等,所以了解啮齿目动物病毒组对新发传染病的预警溯源体系具有十分重要的意义。目前,全球范围内啮齿目动物携带病毒组的研究仍处于起步阶段,而我国更缺少针对啮齿目动物携带病毒组的大规模系统性研究。基于此,作为啮齿目动物病毒组学研究的一部分,本博士课题通过宏基因组学的方法,对我国境内代表性啮齿目动物所携带的沙粒病毒科、黄病毒科、戊型肝炎病毒科、小RNA病毒科、星状病毒科、圆环病毒科和细小病毒亚科共7科病毒的病毒组学进行了研究,分析其宿主种类、宿主体内病毒峰度和地域分布,并尝试鉴定新的病毒属或种。此外,这几个病毒科中都包含有能够感染人和哺乳动物的病毒,本课题组从病毒基因组遗传进化的角度对这几科病毒以及与啮齿目动物的联系进行了分析,探索是否存在有潜在的可能感染人类或饲养动物的病毒。在中国疾病预防控制中心的协助下,在我国国家医学媒介生物监测网点的20个地域及气候代表性省份,共采集了啮齿目6个科51种动物,鼩形目鼩鼱科和兔形目鼠兔科4种动物,共计6010份咽拭子和肛拭子样品,并通过外表形态和细胞色素b测序鉴定了哺乳动物的种类。本课题组创新性地根据物种特征、采集地等信息对样品进行混合并制备测序样品,极大地减少了样品制备的工作量。建立文库时采用“过滤-富集-核酸酶消化-病毒核酸提取”策略,并通过加入锚定序列提高了 cDNA文库质量。利用课题组所建立的适合病原体筛查的Hiseq文库建立技术、测序参数以及一系列创新性的面向病原检测的宏基因组学数据分析和质控方法（AS4PS、QC4PS）,排除重复序列、adapter、低质量及长度<50bp的序列,最终得到了 65.6GB的数据,近7亿条100bp有效读长信息（reads）。通过排除宿主信息、细菌、真菌等序列信息,依次比对病毒库-NR库-病毒库,提取获得12,073,729（占全部数据量的1.7%）条病毒reads,分为70个科的病毒。进一步排除掉非哺乳动物病毒,得到了 7,148,634条23个哺乳动物病毒科的病毒序列信息。按地域、物种和病毒科分别提取,最后得到7科病毒序列共计3,298,152条有效reads。分析结果发现,啮齿目动物沙粒病毒分布在10个省的16个种（小型哺乳动物）,黄病毒分布在8个省的12个种,戊型肝炎病毒分布在16个省的36个种,小RNA病毒分布在20省的23个种,星状病毒分布在17省的51个种,圆环病毒分布在20省的55个种,细小病毒亚科分布在20省的52个种。根据病毒组结果的提示,设计了巢式引物,对每个原始样品中上述7科病毒进行了进一步的实验验证,并根据序列相似性选择代表性序列进行全基因组序列的扩增。鉴于绝大多数新病毒株的高通量测序仅获得部分基因组序列,仍有大量未知区域,我们采用了多种分子生物学技术,如对没有polyA尾的RNA病毒进行加尾,以及染色体步移技术、5’RACE系统扩增病毒5’末端、3’RACE系统扩增病毒3’末端,获取病毒全基因组序列。目前已完成7个病毒科28个病毒属65株病毒全基因组序列、73株病毒基因组序列,其中建议新的病毒属7个、新的病毒种55个。本研究在云南、湖南和浙江的家鼠属中发现新的啮齿目动物沙粒病毒,与在东南亚地区引起人发热的Wenzhou病毒亚型具有87%-97%的氨基酸相似性,可能具有传播给人的风险。我们在国际上首次发现啮齿目动物携带黄病毒科瘟病毒属的病毒,以及跳鼠科的三趾跳鼠携带沙粒病毒;在国内首次发现啮齿目动物携带黄病毒科丙型肝炎病毒属的病毒;在大陆地区首次发现啮齿目动物携带细小病毒亚科博卡病毒属的病毒。该结果扩充了啮齿目和鼩行目动物携带的病毒的宿主种类和地域范围,并发现大量新病毒属和新种,扩展了病毒学的分类。本项目通过宏基因组学、分子生物学研究方法,调查了我国生态环境中啮齿目和鼩行目动物宿主所携带病毒的情况,逐步建立不同物种所携带病毒水平的基线数据库;同时发现和鉴定了新病毒,为我国应对动物源性病毒性传染病提供了本底水平的数据,为啮齿目动物源性传染病的预警和防治提供了有力的科学依据,为应对将来潜在的动物源性新发传染病的病原体检测打下了坚实的基础。
成军[3]（2006）在《慢性肝炎病毒感染致病机制相关新基因克隆化研究策略》文中指出乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染,与慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌（HCC）的发病密切相关,其发病机理涉及到很多基因的共同参与.病毒基因的复制和表达受到肝细胞中蛋白质因子的调节,肝炎病毒基因编码的蛋白与肝细胞中的蛋白能够结合,肝炎病毒蛋白在肝细胞中的表达对于肝细胞的基因表达谱产生影响,也可能是病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌发病机制的重要机制.酵母单杂交技术、酵母双杂交技术、基因芯片技术、抑制性消减杂交技术、噬菌体展示技术、蛋白质分离纯化与基因克隆化的反向遗传学技术等,在肝炎病毒基因调控、肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究、肝炎病毒蛋白反式激活靶基因的研究中都有重要的应用,是促进慢性病毒性肝炎发病机理研究,探索病毒性肝炎新型治疗技术和治疗方法的有效途径.
许信刚[4]（2005）在《逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究》文中研究表明丙型肝炎病毒（HCV）是输血后非甲非乙型肝炎以及社区获得性肝炎的主要病原因子,目前全世界约有2 亿HCV感染者。HCV感染后缺乏有效的保护性免疫。目前对HCV感染尚未找到有效的治疗手段,因此需要提高治疗手段和发展有效的疫苗以控制HCV感染。HCV 为单股正链RNA 病毒,属于黄病毒科的成员。其基因组全长9.4kb,编码约3 000 氨基酸的多聚蛋白前体,在宿主及病毒蛋白酶的作用下,将其切割成3 个结构蛋白和7 个非结构蛋白,其中有2 个糖蛋白E1 和E2 为HCV的包膜蛋白。由于其位于病毒颗粒的最外侧,是宿主免疫系统攻击的主要目标,也是HCV 疫苗研究的首选抗原。近年来各国学者运用基因重组技术对HCV包膜糖蛋白的结构和功能进行了深入研究,以期进一步理解HCV感染后慢性化机制及病毒与宿主相互作用的关系,并寻找有效的保护性疫苗及治疗药物。Chiron公司的研究人员在1994 年首先报道了用哺乳动物细胞表达的E1 和E2 蛋白共免疫大猩猩,可诱生出中和抗体能抵抗同源病毒攻击的。他们认为在大猩猩免疫试验中,E2 区尤其是E2 的高变区之一HVR1（386～411 位氨基酸）对于诱导中和抗体的保护性免疫具有更为重要的作用。但是由于E2 区的高度变异性,针对某种型或株的抗体往往对其他型或株的HCV 无中和作用。而且有的学者认为抗E2 抗体对病毒感染的预防作用仍难以肯定。由于尚未建立HCV 体外复制系统,病人血清中的HCV 病毒粒子又极难纯化,迄今为止的HCV被膜蛋白研究几乎完全以各种系统中表达的重组蛋白为对象。有证据表明,只有哺乳动物细胞中表达的E1、E2 糖蛋白才能较好地反映天然HCV病毒粒子上被膜蛋白的构象和性质。但就目前而言,E1 及E2 糖蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达,以及表达蛋白的纯化,仍然是世界范围内都未攻克的难题,严重影响了被膜蛋白相关研究及其临床应用的进展,说明HCV 中和抗体的研究还面临许多困难。本研究由三部分构成,第一部分是用逆转录病毒载体将HCV囊膜蛋白基因整合到SP2/0 细胞基因组中,在SP2/0 细胞的细胞膜上成功表达了HCV 囊膜蛋
成军[5]（2005）在《肝炎病毒相关新基因的克隆化研究》文中研究表明乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染引起的急性和慢性病毒性肝炎,以及由此引起的肝硬化、肝细胞癌等慢性肝病,是严重影响我国人民健康的重要传染病。尽管干扰素、核苷类似物的抗病毒治疗在一部分患者中取得了一定的疗效,中西医结合的综合治疗在终末期肝病的治疗中也取得了明显的效果,但总的来讲疗效不满意。因此,必须探索肝炎病毒感染相关的慢性肝脏疾病新的治疗技术和方法。要探索新的治疗技术和方法,就要以肝炎病毒致病的机制作为基础。近
邵清,成军,白雪帆,王琳,张健,卢成哲,梁耀东,刘敏,李强[6]（2004）在《酵母双杂交筛选白细胞中新基因NS3TP6结合蛋白基因》文中研究说明目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）反式调节靶基因编码产物NS3TP6 蛋白结合蛋白的基因. 方法:用多聚酶链反应（PCR）法扩增HCV NS3TP6蛋白基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析. 结果:成功克隆出HCV NS3TP6蛋白基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺（SD/-Trp-Leu-Ade-His）培养基和铺有X-α-半乳糖（X-α-gal）的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共7个,其中3个人类白细胞CD14抗原,1个人类免疫球蛋白入轻链,3个人类推定蛋白基因（AC124014,AC097504,AC023785）. 结论:成功克隆出NS3TP6蛋白的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
邵清[7]（2004）在《丙型肝炎病毒NS3结合蛋白和NS3反式激活新靶基因NS3TP6的研究》文中提出丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化（LC），甚至肝细胞癌（HCC）。HCV非结构蛋白3（NS3）蛋白由631个氨基酸组成，相对分子质量为70KDa，在HCV感染的慢性化、致纤维化、致癌作用中非常重要。 为研究HCV NS3蛋白的结合蛋白，我们用酵母双杂交技术筛选表达型cNDA白细胞文库中与丙型肝炎病毒NS3蛋白结合蛋白的基因。首先用多聚酶链反应（PCR）法扩增NS3基因，连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落，增菌后提出质粒，转化入大肠杆菌（DH5α），提出质粒并测序，进行生物信息学分析。结果成功克隆出NS3基因并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺（SD／-Trp-Leu-Ade-His）培养基又能在铺有X-α-半乳糖（X-α-gal）的四缺培养基上生长并变成蓝色的真阳性菌落18个，其中4个真核细胞翻译延伸因子2；2个免疫球蛋白λ轻链；1个肌动蛋白β；1个铁蛋白轻多肽；1个（丝裂原）活化蛋白激酶3；2个肌球蛋白因子1；1个白细胞介素2受体β；1第四军医大学硕士学位论文个富含精氨酸/丝氨酸剪切因子6:1个组织蛋白酶S;1个2’一5’-寡腺甘酸合成酶类似物:1个缺失精子缺乏相关蛋白2;1个CNNZ;1个新基因。上述结果表明已成功克隆出HCV NS3的结合蛋白，为进一步研究HCV的作用提供了新线索。 为了探索HCV NS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因，我们应用微矩阵（microarray）技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepGZ进行分析。首先根据HCv一H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长Hcv一H株。DNA的pBRTM一30n质粒DNA作为模板，进行多聚酶链反应（PCR）扩增，获得的HCV NS3编码基因片段克隆到TA载体中进行核昔酸序列的测定，构建真核表达载体pcDNA3一NS3。然后以pcDNA3一NS3转染肝母细胞瘤细胞系HepGZ，提取总RNA，逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。最后应用分子生物学技术，结合生物信息学技术 （bioinformaties），克隆HCV Ns3反式激活作用的新的靶基因。结果显示构建的真核表达载体pcDNA3一NS3经过限制性内切酶作图分析和核昔酸序列分析证实正确无误。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆获得NS3反式激活的新型靶基因，命名为NS3TP6。新基因的编码基因序列全长为414个核昔酸（nt），编码产物由138个氨基酸残基（aa）组成，是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。研究还表明，微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效的高通量技术。发现的HCV NS3反式激活作用的新的靶基因，并成功克隆了其中的NS3TP6，为阐明HCVNs3蛋白的反式激活作用及其机制，开辟了新的研究方向。 为研究NS 3TP6的结合蛋白，用酵母双杂交技术筛选白细胞中与Ns3TP6蛋白结合蛋白的基因。首先用多聚酶链反应（P CR）法扩增HCV NS3TP6蛋白基因，连接入酵母表达载体pGBKT一7中构建诱饵质粒，转化酵母细胞AH109并在其内表达，然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合，在营养缺陷型培养基第四军医大学硕士学位论文上进行双重筛选阳性菌落，增菌后提取质粒，转化入大肠杆菌，提取质粒并测序，进行生物信息学分析。结果成功克隆出Hcv NS3TP6蛋白基因并在酵母细胞中表达，配合后选出在四缺 （SD产Trp一Leu一Ade一HIS）培养基和铺有X一a一半乳糖（X一a一gal）的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共7个，其中3个人类白细胞CD14抗原，1个人类免疫球蛋白入轻链，3个人类推定蛋白基因（AC 1 24014，AC097504，AC023785）。以上实验成功克隆出NS3TP6蛋白的结合蛋白，为进一步研究HCV的作用提供了新线索。 为了进一步研究NS3TP6可能的分子生物学功能，我们应用基因芯片技术，检测丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白3（NS3）反式激活基因NS3TP6的表达对肝母细胞瘤细胞HepGZ基因表达谱的影响。以分子生物学技术构建NS3TP6的真核表达载体peDNA3.1。)一NS3TP6，以表达质粒peDNA3.1卜)一NS3TP6转染HepGZ细胞，以空载体poDNA3.1。)为平行对照，制备转染后的细胞裂解液，提取瓜RNA。应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析。结果显示，HepGZ细胞经转染NS3TP6后，有7条基因表达增强，38条基因表达降低。应用基因表达谱芯片成功筛选了NS3TP6的反式调节基因，为进一步阐明NS3TP6的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据。
成军[8]（2004）在《加强病毒性肝炎发病的分子生物学机制研究》文中认为
成军[9]（2003）在《坚持相对稳定的科研方向是关键》文中进行了进一步梳理发现、形成、坚持一个适合自己发展的相对固定的科研方向,是一个科学工作者必须面对的、至关重要的、影响全局的重要课题.选择适合自己发展的科研方向,首先要对所从事的学科专业的发展历史和现状有—个非常清楚的了解,还要选择对于学科发展具有重要意义的方向,也要适合自己科学研究的客观条件.对于国内外相对成功的科学家的课题选择特点进行分析,科研选题的风格有许多,典型的包括“守株待兔”型、“隧道挖掘”型.形成适合自己的科研方向还要排除一切形式的不必要的外部干扰.科研方向初步形成之后,要坚持相对固定的研究方向,要坚持、坚持、再坚持.科学工作需要有相应的科学思想、科学传统、科学氛围和科学文化的支持与衬托.提出并思考关于科学的科学,从更高的层次上认识思考,对于我国的科学事业将是一个重要的推动.
邵清,成军,白雪帆,王琳,张健,梁耀东,刘敏,李强[10]（2003）在《酵母双杂交技术筛选白细胞中HCVNS3蛋白结合蛋白基因》文中研究表明目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒（HCV）NS3蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应（PCR）法扩增 NS3基因,连接入酵母表达载体 pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞 Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌（DH5α）,提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出 NS3基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺（SD/-Trp-Leu-Ade-His）培养基和在铺有 X-α-半乳糖（x-α-gal）的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落18个,其中4个真核细胞翻译延伸因子2;2个免疫球蛋白λ轻链;1个肌动蛋白β;1个铁蛋白轻多肽;1个（丝裂原）活化蛋白激酶3;2个肌球蛋白因子1;1个白介素2受体β;1个富含精氨酸/丝氨酸剪切因子6;1个组织蛋白酶 S;1个2’-5’寡腺甘酸合成酶类似物;1个缺失精子缺乏相关蛋白2;1个 CNN2;1个新基因.结论:成功克隆出 HCV NS3的结合蛋白,为进一步研究HCV 的作用提供了新线索.
二、丙型肝炎病毒致病的分子生物学机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丙型肝炎病毒致病的分子生物学机制（论文提纲范文）
（1）云南省一种新型丙型肝炎病毒全基因组和遗传进化分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 常见缩写词说明 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 丙型肝炎病毒概述 |
| 1.1.1 丙型肝炎病毒的分类、基因组结构及蛋白功能 |
| 1.1.2 丙型肝炎病毒的致病性 |
| 1.1.3 预防与控制 |
| 1.2 课题研究的目的及意义 |
| 第二章 云南省小型哺乳动物携带丙型肝炎病毒的检测 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验试剂与材料 |
| 2.1.2 样品采集 |
| 2.1.3 样品处理 |
| 2.1.4 病毒核酸提取RNA |
| 2.1.5 引物合成 |
| 2.1.6 病毒的检测及阳性样本的物种分子鉴定 |
| 2.1.7 PCR产物序列比对和统计学分析 |
| 2.1.8 小型哺乳动物分子鉴定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 丙型肝炎病毒检测结果 |
| 2.2.2 检测出丙型肝炎病毒序列BLAST结果 |
| 2.2.3 阳性样品宿主动物分子鉴定结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 云南省新型丙型肝炎病毒的全基因组扩增及遗传进化分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.2 全基因序列扩增 |
| 3.1.3 全基因组以及扩增区NS3区域的氨基酸水平分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 云南省新型丙型肝炎病毒组织嗜性研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验试剂与材料 |
| 4.1.2 实时定量PCR核酸扩增检测方法对阳性样本进行扩增 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 云南省丙型肝炎病毒核酸检测结果 |
| 5.2 云南省新型丙型肝炎病毒全基因组及遗传进化结果 |
| 5.3 云南省新型丙型肝炎病毒组织定量分析 |
| 参考文献 |
| 附录1 云南省不明原因发热病人中温州病毒血清流行病学调查 |
| 1.1 沙粒病毒结构 |
| 1.2 实验试剂与材料方法 |
| 1.3 样本采集 |
| 1.4 温州病毒N蛋白(pEVL-7.3WENV-NP)真核细胞表达及蛋白纯化和浓缩 |
| 1.4.1 2015-YM16N蛋白小量验证质粒提取 |
| 1.4.2 pEVL-7.3-WENV-NP的真核表达(小量验证) |
| 1.4.3 Western Blot(WB)验证蛋白表达 |
| 1.4.4 pEVL-7.3-WENV-NP的大量表达及纯化浓缩 |
| 1.4.5 pEVL-7.3-WENV-NP的大量表达 |
| 1.4.6 pEVL-7.3-WENV-NP的纯化 |
| 1.4.7 纯化的蛋白超滤浓缩 |
| 1.4.8 p EVL-7.3-WENV-NP的验证 |
| 1.5 ELISA检测云南省不明原因发热病人血清 |
| 1.6 蛋白质免疫印迹法检测云南省不明原因发热病人血清IgG抗体 |
| 1.7 结果 |
| 1.7.1 云南省温州病毒p EVL-7.3-WENV-NP N蛋白真核表达及纯化浓缩 |
| 1.7.2 用ELISA检测云南省不明原因发热病人血清中温州病毒Ig G抗体检测结果 |
| 1.7.3 用WB方法验证云南省不明原因发热病人血清中温州病毒 |
| 1.8 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 丙型肝炎病毒分类和宿主动物的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）啮齿目动物沙粒病毒科、黄病毒科等7科病毒组及进化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 英文缩略词表 第一章 前言 |
| 一、啮齿动物源性病毒与传染病 |
| 二、沙粒病毒科、戊型肝炎病毒科等7科病毒 |
| 2.1. 沙粒病毒科 |
| 2.2. 小RNA病毒科 |
| 2.3. 黄病毒科 |
| 2.4. 戊型肝炎病毒科 |
| 2.5. 星状病毒科 |
| 2.6. 细小病毒亚科 |
| 2.7. 圆环病毒科 |
| 三、病毒组 |
| 四、新一代测序技术与动物源性病毒 |
| 五、本研究的立题依据 |
| 六、实验设计 |
| 6.1. 采样 |
| 6.2. 技术路线 第二章 材料和方法 |
| 一、实验材料仪器 |
| 1.1. 实验所需载体 |
| 1.2. 主要试剂耗材 |
| 1.3. 主要实验仪器 |
| 1.4. 溶液配置 |
| 二、实验方法 |
| 2.1. 样品及建立核酸文库 |
| 2.2. Hiseq文库构建及Hiseq测序准备实验 |
| 2.3. 生物信息学分析 |
| 2.4. 病毒鉴定及保守区域扩增 |
| 2.5. 病毒全基因组扩增 |
| 2.6. 系统进化分析 第三章 实验结果 |
| 一、啮齿目和鼩形目宏基因组分析 |
| 1.1. 样品采集 |
| 1.2. 样品合并富集及cDNA文库建立 |
| 1.3. 宏基因组测序结果 |
| 1.4. 生物信息分析结果 |
| 1.5. 啮齿动物携带沙粒病毒科、黄病毒科等病毒组分析 |
| 二、新型啮齿目和鼩形目动物病毒筛查鉴定 |
| 2.1. 病毒鉴定及全基因组扩增 |
| 2.2. 主要的RNA病毒 |
| 2.3. 主要的DNA病毒 第四章 讨论 |
| 一、啮齿目动物病毒组 |
| 二、啮齿目动物病毒 |
| 2.1. 沙粒病毒 |
| 2.2. 黄病毒 |
| 2.3. 小RNA病毒 |
| 2.4. 戊型肝炎病毒、星状病毒、圆环病毒、细小病毒 |
| 三、结论 创新点 致谢 博士期间发表论文 参考文献 附录 |
（3）慢性肝炎病毒感染致病机制相关新基因克隆化研究策略（论文提纲范文）
| 1 肝炎病毒相关基因的克隆化研究 |
| 1.1 肝炎病毒DNA/RNA结合蛋白基因的克隆化 |
| 1.2 肝炎病毒蛋白结合蛋白基因的克隆化 |
| 1.3 肝炎病毒蛋白反式激活基因的克隆化 |
| 2 新基因研究具有很大的挑战性 |
| 3 重视新基因的研究与临床医学的相关性研究 |
（4）逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述 |
| 第一章 丙型肝炎病毒的分子生物学研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 丙型肝炎的流行现状、致病性与危害 |
| 1.3 病毒的颗粒特征 |
| 1.4 丙型肝炎病毒各区段基因组的结构和功能 |
| 1.4.1 5’非编码区(5’UTR) |
| 1.4.2 核心蛋白区 |
| 1.4.3 包膜蛋白区 |
| 1.4.4 p7 蛋白 |
| 1.4.5 非结构蛋白 |
| 1.4.6 3'非编码区(3'UTR) |
| 1.5 丙型肝炎病毒囊膜蛋白的研究进展 |
| 1.5.1 包膜蛋白的结构 |
| 1.5.2 E2 蛋白在HCV入胞过程中的作用 |
| 1.5.3 E2 与机体免疫反应 |
| 1.6 丙型肝炎病毒基因的变异及分型 |
| 1.6.1 HCV 的变异机制 |
| 1.6.2 HCV 各基因的变异情况 |
| 1.6.3 HCV 基因分型研究 |
| 1.6.4 HCV 基因型的地理分布特点 |
| 1.6.5 HCV 基因分型的方法 |
| 1.7 HCV 的体外复制模型及感染动物模型研究 |
| 1.7.1 HCV 体外复制模型 |
| 1.7.2 黑猩猩 |
| 1.7.3 猴 |
| 1.7.4 树鼩 |
| 1.7.5 转基因和免疫耐受人鼠嵌合肝模型 |
| 1.8 丙型肝炎病毒感染的免疫反应 |
| 1.8.1 体液免疫应答 |
| 1.8.2 细胞免疫应答 |
| 1.9 丙型肝炎预防和治疗 |
| 1.9.1 干扰素(IFN) |
| 1.9.2 病毒唑 |
| 1.9.3 LAK 细胞治疗 |
| 1.9.4 熊去氧胆酸治疗 |
| 1.9.5 免疫调节剂 |
| 1.9.6 联合用药 |
| 1.9.7 中医中药 |
| 1.9.8 丙型肝炎预防 |
| 1.10 丙型肝炎疫苗研究 |
| 1.10.1 重组HCV 蛋白质疫苗 |
| 1.10.2 HCV 基因疫苗 |
| 1.10.3 HCV 融合基因疫苗 |
| 1.10.4 丙肝肝炎口服活菌苗 |
| 1.10.5 丙肝疫苗研制面临的问题 |
| 1.11 丙型肝炎病毒单克隆抗体(HCV-McAb)的研究 |
| 1.11.1 鼠源HCV 单克隆抗体 |
| 1.11.2 人源HCV 单克隆抗体 |
| 1.11.3 HCV单克隆抗体的意义及其发展前景 |
| 1.12 丙型肝炎病毒的实验室诊断研究进展 |
| 1.12.1 血清抗-HCV 抗体检测 |
| 1.12.2 HCV RNA检测用于HCV 感染的诊断 |
| 1.12.3 HCV 抗原的检测 |
| 1.13 丙型肝炎的研究展望 |
| 1.13.1 规范分型 |
| 1.13.2 细胞与动物模型 |
| 1.13.3 大容量噬菌体抗体库与肽库的构建 |
| 1.13.4 基因的表达调控 |
| 1.13.5 发病机制 |
| 1.13.6 HCV 受体 |
| 1.13.7 治疗 |
| 1.13.8 疫苗 |
| 试验研究 |
| 第二章 HCV 囊膜蛋白基因E1E2 的亚克隆及序列分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 含有HCV 囊膜蛋白基因组的质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 载体和菌种 |
| 2.1.4 PCR 引物 |
| 2.1.5 培养基 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收 |
| 2.2.3 纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接 |
| 2.2.4 新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法) |
| 2.2.5 连接产物的转化 |
| 2.2.6 重组质粒的提取 |
| 2.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 2.2.8 序列的计算机分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 PCR 产物的电泳结果 |
| 2.3.2 重组质粒的PCR 鉴定结果 |
| 2.3.3 组质粒的酶切鉴定结果 |
| 2.3.4 测序结果 |
| 2.3.5 氨基酸序列分析结果 |
| 2.3.6 HCV E1E2 基因编码蛋白质的理化性质分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因E1E2在真核细胞中的表达及动物免疫试验 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 细胞系 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.1.4 质粒 |
| 3.1.5 载体核菌株 |
| 3.1.6 培养基 |
| 3.1.7 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 逆转录病毒表达质粒的构建 |
| 3.2.2 逆转录病毒假病毒制备 |
| 3.2.3 逆转录病毒假病毒侵染SP 2/0 细胞及抗性筛选表达细胞 |
| 3.2.4 FACS 分析筛选膜表面表达E1E2 蛋白的SP 2/0 细胞 |
| 3.2.5 表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞免疫Balb/c 小鼠 |
| 3.2.6 小鼠采血及血清分离 |
| 3.2.7 血清抗体的检测 |
| 3.2.8 血清中和抗体检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 重组质粒的PCR 鉴定结果 |
| 3.3.2 组质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.3.3 HCV E1E2 基因的核苷酸和相应的氨基酸序列 |
| 3.3.4 FACS 分析检测表达E1E2 囊膜蛋白的 SP2/0 细胞 |
| 3.3.5 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测 |
| 3.3.6 中和抗体检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 HCV 囊膜蛋白单克隆抗体的制备 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 细胞系 |
| 4.1.3 试验动物 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 免疫原的制备 |
| 4.2.2 动物免疫 |
| 4.2.3 骨髓瘤细胞的准备 |
| 4.2.4 脾淋巴细胞的准备 |
| 4.2.5 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 |
| 4.2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选 |
| 4.2.7 阳性杂交瘤细胞的克隆 |
| 4.2.8 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 4.2.9 小鼠腹水的制备 |
| 4.2.10 单抗中和活性的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 分泌特异单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立 |
| 4.3.2 中和抗体检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小节 |
| 第五章 丙型肝炎病毒核酸疫苗的构建及动物免疫试验 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 细胞系 |
| 5.1.3 试验动物 |
| 5.1.4 基因组质粒 |
| 5.1.5 载体和菌株 |
| 5.1.6 培养基 |
| 5.1.7 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 引物的设计 |
| 5.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取 |
| 5.2.3 重组质粒的鉴定 |
| 5.2.4 真核表达质粒的构建 |
| 5.2.5 重组真核表达质粒转染293T 细胞 |
| 5.2.6 FACS 分析表达E1E2 蛋白的293T 细胞 |
| 5.2.7 重组真核表达质粒的大量提 |
| 5.2.8 重组真核表达质粒免疫Balb/c 小鼠取 |
| 5.2.9 免疫小鼠采血及血清分离 |
| 5.2.10 免疫小鼠血清抗体的检测 |
| 5.2.11 小鼠血清中和抗体的检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 PCR 产物的电泳结果 |
| 5.3.2 重组pGEM-T Easy载体质粒的酶切鉴定结果 |
| 5.3.3 重组质粒的酶切鉴定结果 |
| 5.3.4 重组质粒的测序结果 |
| 5.3.5 FACS 分析重组真核表达质粒转染293T 细胞瞬时表达 |
| 5.3.6 免疫小鼠血清抗体的FACS 检测 |
| 5.3.7 中和抗体检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小节 |
| 第六章 HCV 囊膜蛋白基因E1 和E2 原核表达载体的构建及表达 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌株和质粒 |
| 6.1.2 酶和试剂 |
| 6.1.3 阳性血清及酶标抗体 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 引物的设计与合成 |
| 6.2.2 目的基因的扩增、纯化和回收、纯化产物与PGEM-T easy Vector 连接、新鲜感受态细胞的制备(CaCl_2 法)、连接产物的转化、重组质粒的提取、重组质粒的鉴定 |
| 6.2.3 原核重组表达载体的构建与鉴定 |
| 6.2.4 E2 基因在大肠杆菌中的表达 |
| 6.2.5 表达蛋白的鉴定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的PCR鉴定 |
| 6.3.2 重组原核表达载体E1-pET32a 和E2-pET32a 的酶切鉴定 |
| 6.3.3 重组原核表达载体序列测定 |
| 6.3.4 表达蛋白的SDS-PAGE 检测 |
| 6.3.5 表达蛋白的Western blot 检测 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词英汉对照表 |
| 致 谢 |
| 作者简介 |
（6）酵母双杂交筛选白细胞中新基因NS3TP6结合蛋白基因（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（7）丙型肝炎病毒NS3结合蛋白和NS3反式激活新靶基因NS3TP6的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 丙型肝炎病毒NS3结合蛋白的研究 |
| 1 引言 |
| 2 HCV NS3的克隆化及酵母表达载体构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 3 酵母双杂交法筛选白细胞中HCV NS3蛋白的结合蛋白基因 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 诱饵与白细胞文库酵母配合实验 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第二部分 丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因6(NS3TP6)的研究 |
| 1 NS3TP6克隆化研究 |
| 1.1 NS3TP6基因的克隆化 |
| 1.2 NS3TP6的PCR扩增 |
| 2 酵母双杂交法筛选白细胞中NS3TP6蛋白的结合蛋白基因 |
| 2.1 NS3TP6酵母表达载体构建 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 酵母双杂交法筛选白细胞中NS3TP6蛋白的结合蛋白基因 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.2 实验仪器 |
| 2.3.3 方法 |
| 2.3.4 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 应用基因表达谱芯片技术筛选NS3TP6转染细胞差异表达基因 |
| 3.1 目的 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）加强病毒性肝炎发病的分子生物学机制研究（论文提纲范文）
| 一、病毒性肝炎发病的分子生物学机制的研究内容 |
| 二、病毒性肝炎发病的分子生物学机制的研究技术 |
| 三、病毒性肝炎发病的分子生物学机制的研究意义 |
（9）坚持相对稳定的科研方向是关键（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 发现适合自己的科研方向 |
| 1.1 清楚了解所从事的学科专业的发展历史和现状 |
| 1.2选择对于学科发展具有重要意义的方向 |
| 1.3 适合自己的客观条件 |
| 2 形成适合自己的科研方向 |
| 2.1“守株待兔”型 |
| 2.2“隧道挖掘”型 |
| 3 坚持适合自己的科研方向 |
| 3.1 打水井的故事 |
| 3.2 坚持、坚持、再坚持 |
（10）酵母双杂交技术筛选白细胞中HCVNS3蛋白结合蛋白基因（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 诱饵质粒的构建及表达 |
| 1.2.2 酵母白细胞文库的构建 |
| 1.2.3 诱饵与白细胞文库的酵母配合 |
| 1.2.4 阳性质粒的克隆和分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 cDNA测序与同源性分析初步结果 |
| 3 讨论 |
四、丙型肝炎病毒致病的分子生物学机制（论文参考文献）
- [1]云南省一种新型丙型肝炎病毒全基因组和遗传进化分析[D]. 董娜. 大理大学, 2020(05)
- [2]啮齿目动物沙粒病毒科、黄病毒科等7科病毒组及进化研究[D]. 杜江. 北京协和医学院, 2017(11)
- [3]慢性肝炎病毒感染致病机制相关新基因克隆化研究策略[J]. 成军. 大连大学学报, 2006(04)
- [4]逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒（HCV）囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究[D]. 许信刚. 西北农林科技大学, 2005(02)
- [5]肝炎病毒相关新基因的克隆化研究[A]. 成军. 第三届国际暨全国肝衰竭与人工肝学术会议论文集, 2005
- [6]酵母双杂交筛选白细胞中新基因NS3TP6结合蛋白基因[J]. 邵清,成军,白雪帆,王琳,张健,卢成哲,梁耀东,刘敏,李强. 世界华人消化杂志, 2004(07)
- [7]丙型肝炎病毒NS3结合蛋白和NS3反式激活新靶基因NS3TP6的研究[D]. 邵清. 第四军医大学, 2004(04)
- [8]加强病毒性肝炎发病的分子生物学机制研究[J]. 成军. 胃肠病学和肝病学杂志, 2004(01)
- [9]坚持相对稳定的科研方向是关键[J]. 成军. 世界华人消化杂志, 2003(12)
- [10]酵母双杂交技术筛选白细胞中HCVNS3蛋白结合蛋白基因[J]. 邵清,成军,白雪帆,王琳,张健,梁耀东,刘敏,李强. 世界华人消化杂志, 2003(12)