一、金丝雀痘诊断与痘病毒致弱试验（论文文献综述）
潘广林,赵鹏鹏,高更更,雷颖虎,骆琛,王兴龙[1]（2021）在《大熊猫犬瘟热抗体间接ELISA方法的初步建立及应用》文中研究表明为建立大熊猫犬瘟热血清抗体间接ELISA检测方法,用合成的犬瘟热病毒（canine distemper virus, CDV）H和F短肽作为包被抗原,分别以HRP标记的鼠抗大熊猫IgG Fc二抗、HRP标记兔抗犬IgG二抗、HRP标记SPA作为检测二抗,通过矩阵法优化抗原包被浓度、血清稀释度和酶标二抗稀释度,评估3种方法的符合率、敏感性和重复性,建立3种大熊猫犬瘟热血清抗体ELISA检测方法,并用该方法检测大熊猫2次免疫犬瘟热疫苗的血清抗体。结果显示,抗原最佳包被质量浓度为25 mg/L,血清最佳稀释度为1∶100,3种二抗的最佳稀释度分别1∶1 000,1∶1 000,1∶500,3种方法的符合率分别为100%,92%,100%,敏感性分别为1∶400,1∶100,1∶100,3种方法的重复性较好,批内和批间变异系数均小于10%。对大熊猫血清抗体的检测结果表明,所有血清样本的抗体效价均大于1∶100,50%的血清样本抗体水平相较一免有了显着升高。本研究对3种用于大熊猫犬瘟热血清抗体检测二抗进行评估,为大熊猫犬瘟热ELISA试剂盒的开发、流行病学监测以及疫苗免疫效力的评估提供支撑。
李国华[2]（2020）在《西尼罗病毒病重组乙型脑炎病毒载体疫苗的构建及实验免疫研究》文中研究表明西尼罗病毒病（West Nile virus disease,WND）是由西尼罗病毒（WNV）经蚊虫叮咬感染动物和人的、以西尼罗热（WNF）和西尼罗脑炎（WNE）为主要临床症状的人兽共患传染病。自1999年在美国纽约暴发以来,每年均有动物和人感染发病。据美国动植物卫生检验局（APHIS）统计,2002年美国确诊了12 527例马匹感染,为历史最高。针对传染性疾病,疫苗是最有效的防治手段之一。当前已有4株上市的马用西尼罗病毒疫苗。其中3株是灭活疫苗,1株为含有西尼罗病毒结构基因的金丝雀痘病毒活疫苗（该活疫苗在体内不能复制）。虽然4株疫苗经免疫后均具有良好的免疫保护效果,但是马匹均需要在首免后每年加强免疫一次,才能持续获得免疫保护,疫苗成本和人力成本随之增加。因此,急需研制一种免疫1～2次即可获得持久免疫力的西尼罗病毒活疫苗。流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株（JEV SA14-14-2）属于黄病毒科黄病毒属病毒,与WNV同科同属,是建立西尼罗病毒嵌合株活疫苗的优良载体。JEV SA14-14-2安全性高,自1989年JEV SA14-14-2上市以来,经过30余年的免疫接种,该疫苗未见明显的不良反应,有效控制了流行性乙型脑炎在我国的流行。其次,流行性乙型脑炎病毒和西尼罗病毒同科同属,基因组结构相似,西尼罗病毒嵌合株候选疫苗容易构建成功。WNV NY99株导致的西尼罗脑炎（WNE）致死率高,严重威胁动物和人的生命健康。虽然我国在2011年从尖音库蚊体内分离到了西尼罗病毒,但还未有动物感染发病报道,因此选用危害较大的WNV NY99株进行疫苗研究。目的:建立JEV SA14-14-2反向遗传操作系统,以JEV SA14-14-2为载体,构建含有西尼罗病毒pr MΔE基因的嵌合株病毒ChiVax-WN01,并验证其免疫原性,为研制经济高效的马用西尼罗病毒候选疫苗奠定基础。方法:（1）JEV SA14-14-2全基因组序列测定。本研究采用蚀斑纯化法,利用BHK-21细胞经3轮纯化获得JEV SA14-14-2蚀斑单克隆,并利用BHK-21细胞扩繁病毒。提取病毒RNA并反转录成c DNA,通过PCR方法分11段扩增病毒全长c DNA,分别连入p EASY-Blunt克隆载体测序。利用DNAStar和DNAMAN比对并拼接病毒全长基因组序列,获得JEV SA14-14-2全基因组c DNA序列。（2）建立JEV SA14-14-2反向遗传操作系统。利用DNAStar软件分析JEV SA14-14-2序列,选取4个单克隆酶切位点将病毒基因组全长分为5段（F1～F5）。利用分子生物学技术引入T7 promoter序列、HDVr序列、T7 terminator序列和内含子序列,分段连接5个片段,构建含有病毒全长c DNA的感染性克隆质粒p FLJEV。通过Lipofectamine 3000将p FLJEV转染BSR T7/5细胞拯救病毒。通过蚀斑形态、生长曲线和病毒核酸复制能力鉴定并比较拯救毒和母本毒的生物学特性。（3）西尼罗病毒嵌合株候选疫苗ChiVax-WN01构建与鉴定。基于JEV SA14-14-2反向遗传操作系统,将WNV NY99株（DQ211652）的prMΔE基因替换JEV SA14-14-2的pr MΔE基因,构建含有WNV NY99 pr MΔE基因的嵌合株感染性克隆质粒p ChiVax-WN01。利用Lipofectamine 3000将p ChiVax-WN01转染BSR T7/5细胞拯救病毒。鉴定并比较嵌合株病毒ChiVax-WN01的生物学特性。（4）西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01安全性与实验免疫研究。以BALB/c小鼠为动物模型,经腹腔分别注射105～101 PFU嵌合株病毒ChiVax-WN01和JEV SA14-14-2母本毒,连续观察15 d,统计小鼠存活率,分析病毒对小鼠神经侵袭性。分别经颅内注射100 PFU嵌合株病毒ChiVax-WN01和100 PFU JEV SA14-14-2,连续观察15 d,统计小鼠存活率,分析病毒对小鼠的神经毒性。为验证ChiVax-WN01免疫原性,以BALB/c小鼠为动物模型,分别腹腔接种100 PFU JEV SA14-14-2、100 PFU ChiVax-WN01和PBS,接种后1 d、3 d、5 d、7 d和9d分别取各组小鼠的血浆、脑、肝、脾、肺和肾,利用蚀斑法检测病毒在血液的增殖水平和内脏的分布。通过微量中和试验测定小鼠血清的中和抗体效价。通过ELISpot法测定脾淋巴细胞中分泌IFN-γ、IL-2和IL-4细胞的数量。结果:（1）获得JEV SA14-14-2全长序列,Gen Bank序列号为MK585066。（2）成功构建出JEV SA14-14-2感染性克隆质粒pFLJEV,转染拯救出在病毒滴度、生长动力学特征和蚀斑形态方面与母本病毒无明显差别的子代病毒,经电镜超薄切片可观察到完整病毒粒子。（3）成功构建出嵌合株病毒感染性克隆质粒p ChiVax-WN01,成功拯救出子代病毒ChiVax-WN01,电镜观察可见包装完整的病毒粒子。（4）神经侵袭性试验表明ChiVax-WN01组小鼠存活率均为100%,与JEV SA14-14-2组和PBS组无差别。神经毒性试验表明ChiVax-WN01组小鼠存活率为50%,有神经毒性,JEV SA14-14-2组和PBS组小鼠存活率100%。病毒在内脏分布情况表明,ChiVax-WN01接种后各个时间点内脏中均未检测到病毒滴度。嵌合株病毒ChiVax-WN01能诱导机体产生中和抗体,效价为1:90,并可显着提高IFN-γ和IL-2分泌细胞在脾淋巴细胞中的比例。以上结果表明,西尼罗病毒嵌合株候选疫苗ChiVax-WN01腹腔接种具有较高的安全性和良好的免疫原性。结论:成功建立JEV SA14-14-2反向遗传操作系统,并基于该系统构建构建了ChiVax-WN01,且ChiVax-WN01在小鼠上具有较好的安全性和免疫原性。
闫修魁[3]（2020）在《水禽源禽痘病毒的生物学特性及致病性研究》文中研究指明禽痘是由禽痘病毒属（Avipoxvirus,APV）成员引起家禽、野生鸟类和各种禽类的一种急性接触性传染病,流行范围遍及全球。禽痘的临床症状主要表现在无毛或少毛皮肤部位出现痘疹的皮肤型病变或在禽口腔、咽喉或气管黏膜出现纤维素性痂膜的黏膜型病变。APV主要通过昆虫机械性传播,也可通过气溶胶、破溃皮肤和黏膜传播。禽痘给家禽养殖业带来巨大的影响,同时极大威胁野生鸟类尤其是濒危珍禽。禽痘在鸭和鹅等水禽较为罕见,对其研究尚属空白。本研究对分离得到的鹅源禽痘病毒YNE株和麻鸭源禽痘病毒MDUPV01/GX-2015株的培养特性、理化学特性、血凝特性、蛋白组学等生物学特性和致病特性进行探索。将自然感染的病禽皮肤痘疹组织研磨制备的病毒悬液采用人造气室法接种9-12日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜,连续传代并通过PCR扩增、病理学检查和电镜观察考察其培养特性。APV P4b基因PCR检测结果为阳性;病理组织学检查发现绒毛尿囊膜存在特征性的嗜酸性病毒包涵体;电镜观察到典型痘病毒粒子结构;证实YNE和MDUPV01/GX-2015能在鸡胚绒毛尿囊膜上增殖。理化特性鉴定发现,YNE和MDUPV01/GX-2015分别经55℃30 min和60 min处理后完全丧失感染性;用酸（p H=5）、碱（p H=10）和胰蛋白酶0.5%处理后两株水禽源APV对鸡胚的半数感染量均下降100倍以上;终浓度为5%氯仿处理后病毒丧失感染性;表明这两株水禽源APV毒株均对热、酸碱、氯仿和胰蛋白酶敏感。血凝性检验发现YNE和MDUPV01/GX-2015仅对鹅红细胞有较高凝集活性,凝集效价分别为1:16和1:64,而且该血凝活性可被阳性血清抑制。将YNE和MDUPV01/GX-2015毒株分别在鸡胚上连续传代培养,第5代鸡胚传代毒的鸡胚半数感染量为104.14 EID50/0.1 m L和104 EID50/0.1 m L,病毒含量分别104.89 Copies/μL和104.62 Copies/μL。测定病毒生长曲线,结果表明YNE和MDUPV01/GX-2015分别在接种后第4 d和第5 d增殖达到最高水平,此后病毒生长进入平台期。通过液相色谱串联质谱对纯化的MDUPV01/GX-2015病毒蛋白进行测定,基于生物信息学分析并利用APV蛋白数据库进行筛选,结果共鉴定出108个APV同源蛋白,其中结构蛋白14个、9种与病毒复制或毒力相关的酶,病毒转录因子4个、病毒转录因子4个、蛋白家族成员12个。YNE和MDUPV01/GX-2015毒株对鸡胚的致病性体现于对鸡胚孵化率的影响和造成绒毛尿囊膜的病变。绒毛尿囊膜病理变化表现水肿增厚和痘斑组织的出现。在接毒后第2 d鸡胚绒毛尿囊膜出现增厚现象,接毒后第3d鸡胚绒毛尿囊膜上出现肉眼可见的白色痘斑,此后感染鸡胚绒毛尿囊膜病变表现为持续水肿增重和痘斑增多;检测接毒第9 d后鸡胚的绒毛尿囊膜、尿囊液、喙、喉头、气管、心、肺和脾,结果仅在绒毛尿囊膜中检出病毒。最后,探索了MDUPV01/GX-2015毒株对麻鸭、鸡和鸽的致病性研究。首先筛选最佳接种方式,发现只有刺种方式在接种麻鸭后可观察到典型临床症状,而滴鼻、点眼、滴鼻+点眼、投喂等方式接种后均未观察到临床症状。通过刺种方法接种2×104ELD50/0.1 m L的病毒量于麻鸭、鸡和鸽子。荧光定量PCR检测麻鸭在接种后第3 d、7 d和15 d的各组织脏器病毒分布情况,结果在接毒后第3 d和第7 d的腭、眼周和喙等部位有病毒检出,接毒后第15 d所有皮肤痘疹都有病毒检出且病毒滴度最高,同时喉头、气管、心和肺组织亦可检到病毒,而血清、脑、肝、脾和肾组织均未检出。对接种MDUPV01/GX-2015毒株的鸡和鸽进行连续15 d的观察,分别解剖并采集接毒后第3 d、7 d和15 d的鸡和鸽的组织器官进行病毒检测。结果病毒不能使鸡和鸽出现临床症状,在鸡和鸽各组织脏器中均未检出病毒。本研究结果增加了对水禽源APV生物学特性认识,为禽痘病毒分类学、遗传衍化以及致病机制研究提供基础数据。
高映雪[4]（2020）在《2016～2018年江西部分地区猪瘟抗体水平调查及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪痘病毒的构建》文中研究指明猪瘟（Classical Swine Fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classic Swine Fever virus,CSFV）引起的高度接触性热性传染病,是影响养猪业的主要传染病之一,疫苗接种是该病的主要的防控手段,对猪群猪瘟抗体水平的监测反映猪群的免疫保护水平。本研究对2018～2018年江西省部分地区猪群的猪瘟抗体水平进行了血清学检测,旨在了解不同阶段猪群的猪瘟免疫保护水平。猪瘟病毒E2蛋白是猪瘟病毒的一种结构蛋白,是猪瘟病毒的主要保护性抗原,目前已有商品化猪瘟E2蛋白亚单位疫苗应用于猪瘟的免疫防控。本研究构建了表达猪瘟E2蛋白的重组猪痘病毒,成功表达猪瘟E2蛋白,为猪瘟亚单位疫苗的研发打下基础。1.江西省猪瘟抗体水平的调查利用IDEXX公司猪瘟抗体检测试剂盒对2016～2018年来自江西省部分地区猪场共计16424份猪血清进行了猪瘟抗体水平检测（其中种猪10238份、哺乳仔1107份、保育猪2745份、育肥猪2289份）。结果显示,2016～2018年的猪瘟抗体阳性率分别为82.53%、83.21%、82.88%;春、夏、秋、冬猪瘟抗体阳性率分别为83.19%、81.41%、83.53%和83.27%,不同季节之间抗体阳性率差异不明显;不同阶段猪群的猪瘟抗体阳性率差异较大:种猪阳性率为90.16%、哺乳仔猪阳性率为73.23%、保育猪阳性率为59.20%、育肥猪阳性率为82.96%,其中保育猪的猪瘟抗体水平最低,究其原因可能为哺乳仔猪阶段的母源抗体衰减,免疫程序的不合理或机体还没有足够的时间产生良好的免疫应答;南昌、九江、赣州、宜春、上饶、吉安、抚州、景德镇、萍乡、新余、鹰潭共11个地区的猪瘟抗体阳性率分别为86.23%、82.94%、87.55%、82.35%、79.23%、82.87%、82.49%、87.70%、75.29%、86.21%、79.42%,不同地区的猪瘟抗体阳性率差异不大。2.表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪痘病毒的构建以猪瘟病毒江西分离株CSFV-JXNC01-2015（NCBI登录号:KX064281.1）基因组为模板合成E2基因全长,设计引物扩增E2基因（3’端加标签蛋白6×his）,采用In-fusion Clone方法将E2基因连接到本实验室已构建的p SWE101转移载体上,构建重组质粒p SWE101-P28-E2-His。猪痘病毒江西分离株SWPV-JX20G为亲本病毒,TK基因为外源基因的插入位点,痘苗病毒启动子P28启动外源基因,经转染及5轮重组病毒纯化得到纯的重组猪痘病毒r SWPV-P28-E2-His,重组病毒大量增殖后进行SDS-PAGE电泳验证,结果表明重组病毒成功表达可溶性E2蛋白。
张红云[5]（2018）在《麻鸭源禽痘病毒的分离鉴定、全基因组测序和动物实验研究》文中认为禽痘是一种严重危害禽鸟的病毒性疾病。禽痘病毒自然感染约278种禽鸟,主要侵害鸡、鸽子和火鸡,引起部分濒危珍禽的生存危机。根据典型临床症状,禽痘可以分为皮肤型、黏膜型和混合型,其中黏膜型和混合型致死率高于皮肤型。国际上对水禽痘报道比较罕见,与水禽痘病毒相关的研究几乎空白。近年来广西麻鸭痘有零星报道,本研究结合临床实际开展了麻鸭源禽痘病毒的诊断、分离鉴定、全基因组测序和一系列动物试验。2016年广西邕宁同场混养的麻鸭和阳江鹅的喙、眼睑和脚先后出现痘疹,发病率约为20%,没有死亡病例,采用q PCR方法诊断为禽痘病毒感染。痘疹样本负染电镜观察,可见大小为330 nm×280 nm×200 nm呈卵圆形的病毒粒子,且表面呈不规则管状结构;痘疹样本超薄切片电镜观察可见病毒粒子具有囊膜,囊膜内包含一个双凹核心结构,两侧凹陷中各有一个侧小体,表现为典型的痘病毒粒子形态。组织切片HE染色镜检,在病变的上皮细胞胞浆中可见嗜酸性、呈环状的胞浆包涵体,符合痘病毒感染的病理学特征。将痘疹样本处理后通过绒毛尿囊膜途径接种于9～12日龄SPF鸭胚,培养64 h后观察到绒毛尿囊膜增厚水肿,胚体眼睛出现白色结节。病变的绒毛尿囊膜在研磨处理后接种DEF细胞,培养3天出现50%的细胞病变。用间接免疫荧光方法检测,在细胞中出现特异性绿色荧光。病毒培养三代后用PCR方法鉴定为禽痘病毒阳性,证实分离到一株麻鸭源禽痘病毒,命名为YNY。国际上对禽痘病毒基因分型是根据保守的病毒粒子核心蛋白P4b基因和DNA多聚酶蛋白基因（Popr）的核苷酸序列的一致性来划分的。本研究采用相同的方法分别克隆邕宁麻鸭源禽痘病毒YNY、邕宁阳江鹅源禽痘病毒YNE、中国鸡痘疫苗弱毒株282E4和百色麻鸭源禽痘病毒MDUPV01/GX-2015的相应基因片段,测序后与62株禽痘病毒的相应序列进行核苷酸一致性比较,构建进化树。结果表明YNY、YNE和MDUPV01/GX-2015划入A5亚群（水禽源）;A5亚群可进一步划分为两个分支,其中MDUPV01/GX-2015与2013年～2014年发生在广西百色、崇左的3株麻鸭源禽痘病毒均属于A5.1分支,它们之间的核苷酸一致性为99.9%～100%;而广西邕宁毒株YNY和YNE属于5.2分支,它们之间核苷酸一致性高达99.9%。上述结果表明,当前我国水禽群中至少有两种基因分支的禽痘病毒在同时流行。A5.2分支广西毒株与A5.1分支广西毒株的P4b基因的核苷酸一致性为100%,但它们的Popr基因的核苷酸一致性为87.4%～87.6%,却与A1亚群的Popr基因的核苷酸一致性为99.5%～99.8%,根据时间推测A5.2分支是由A5.1分支和A1亚群经过基因重组形成。对2015年广西百色麻鸭源禽痘病毒MDUPV01/GX-2015的痘疹样品采用蔗糖密度梯度离心方法进行病毒纯化。提取病毒DNA后利用高通量Illumina测序技术对进行全基因组测序,获得了长为230805 bp的麻鸭源禽痘病毒的基因组序列,其G+C含量为31.02%。将MDUPV01/GX-2015基因组序列与病毒数据分析资源库（Vi PR）中收录的六种禽痘病毒的全基因组进行比较,结果发现其与火烈鸟基因组相似性最高,并确定了201个开放阅读框（ORF）,并将其与鸡痘病毒代表株FPVUS全基因组进行比较分析和功能预测。MDUPV01/GX-2015含有脊椎动物痘病毒亚科（Ch PV）保守的90个基因,核酸总数占基因组长度的38.3%,主要位于基因组的中心区域,与病毒转录和m RNA生成、核苷酸代谢、DNA复制和修复、蛋白质修饰以及病毒的结构蛋白功能相关;鉴定了56个禽痘病毒基因家族成员,核酸总数占基因组长度的31.7%,主要位于中央编码区两端,推测其涉及病毒对宿主的免疫逃避、病毒对细胞的趋向性、免疫调节以及其他一些细胞功能。在MDUPV01/GX-2015基因组序列中未发现禽网状内皮增生症病毒（REV）的序列。本研究通过动物同居感染试验发现邕宁麻鸭源禽痘病毒YNY在自然条件下可感染麻鸭、樱桃谷鸭和阳江鹅,但不能感染番鸭和三黄鸡。通过临床观察和病毒接种实验,了解麻鸭源禽痘病毒的发病过程,潜伏期为5～7天;在接毒后10天进入明显期;接毒后19天进入转归期,整个病程持续1个月左右。在试验条件下,麻鸭源禽痘病毒感染麻鸭,主要出现皮肤型临床症状,表现为鼻周、喙、眼睑、翅膀、脚蹼出现痘疹;部分麻鸭表现混合型临床症状,除上述皮肤型症状外,在口腔黏膜、舌尖和咽喉出现痘疹;麻鸭的发病率可高达84.0%,死亡率8.0%。采用q PCR方法对发病麻鸭的597份组织样品进行检测,发现在多个组织中均可以检测到病毒DNA,其中以痘疹中病毒含量最高,其次为食管、喉头、气管。通过攻毒保护试验证实鸡痘疫苗对麻鸭源禽痘病毒有一定保护力,保护率为64.7%。本研究填补了国内外对麻鸭源禽痘病毒形态学和基因组认识的空白,阐述了麻鸭痘的发病经过和流行病学,为麻鸭源禽痘病毒的分类、遗传衍化以及致病机制研究提供坚实的基础。
冯娜[6]（2017）在《大熊猫犬瘟热流行病学调查与实验免疫研究》文中研究表明犬瘟热（Canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）感染引起的犬和其他肉食动物的一种急性、高度接触性传染病。近年来CDV的宿主范围不断扩大,已由传统的犬科、浣熊科和鼬科扩展到猫科、灵猫科等所有陆地食肉目动物及非人灵长类动物。近年来大熊猫种群的增加和栖息地的不断扩大使得大熊猫感染疾病的风险大大增加,犬瘟热已成为威胁大熊猫种群数量和生命安全的第一大传染病。2014年12月-2015年4月,陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心暴发圈养大熊猫犬瘟热疫情,共造成5只大熊猫死亡。本研究通过病原分离和抗体检测,首次证明CDV已经具备对大熊猫的跨种感染能力。疫苗免疫是预防CDV感染唯一的有效措施,但因现有弱毒疫苗对大熊猫具有致病性,目前尚无安全性高、稳定而有效的大熊猫用犬瘟热疫苗。本研究结合已有数据,针对大熊猫宿主的珍稀性和敏感性,开展了全病毒灭活疫苗和病毒样颗粒亚单位疫苗的制备与免疫原性评估。鉴于雪貂用CDV重组金丝雀痘病毒活载体疫苗的安全性和有效性已经在2只大熊猫上通过免疫试验得到证实,本研究对商品化犬用金丝雀痘病毒重组犬瘟热活载体疫苗在大熊猫上进行了免疫效果评价。第一章:大熊猫犬瘟热病毒分离鉴定及遗传进化分析。通过对2014年12月-2015年4月陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心送检大熊猫样品的RT-PCR检测,发现22只大熊猫中共有6只CDV核酸检测阳性,其中5只后期表现全身抽搐的严重神经症状,抢救无效相继死亡。处于同一（龙龙、凤凤）或相邻圈舍（大宝、欣欣）的4只大熊猫相继发病死亡,表明直接接触或飞沫可能是其在大熊猫间相互传播的原因。将死亡大熊猫组织接种Vero/DogSLAM细胞系进行病毒分离培养,经电镜观察、细胞病变及CDV特异性抗体染色以及基因组序列测定等一系列分析确定所分离病毒为CDV,命名为giant panda/SX/2014。H基因遗传进化和氨基酸差异分析结果显示,giant panda/SX/2014仍属于流行的Asia-1型,但H蛋白出现了5个氨基酸突变:V26M、T213A、K281R、S300N和P340Q。此外,还发现决定与宿主SLAM受体结合的关键氨基酸位点549位aa突变为His（H）,而非犬源分离株Tyr（Y）。推测giant panda/SX/2014 H蛋白Y549H替换可能导致CDV获得了跨种传播能力,且毒力增强,从而引发了此次大熊猫CDV的致死性感染。大熊猫“珠珠”CDV核酸检测阳性,但因体内存在CDV中和抗体（效价为1:128）,未表现临床症状,至今仍存活,表明中和抗体可以使大熊猫免受CDV强毒的致死性攻击。提示可通过疫苗免疫接种预防大熊猫犬瘟热。第二章:犬瘟热灭活疫苗制备与免疫原性评估研究。由于CDV弱毒疫苗株可能会引起一些易感野生动物感染与发病,大熊猫也曾有因接种CDV弱毒疫苗发病死亡的报道。为此,本研究进行了犬瘟热灭活疫苗的制备。为保证疫苗免疫原剂量,本研究以荷兰Applikon细胞培养罐和GE公司Cytodexl球型微载体生产CDV,最高滴度可达107.8TCID50/mL。共选择β-丙内酯、甲醛2种灭活剂和3种不同的免疫剂量组合评估了犬瘟热灭活疫苗小鼠的免疫效果,结果显示甲醛灭活疫苗组免疫效果优于β-丙内酯灭活疫苗组,且免疫效果与剂量呈正相关,原液免疫组血清的中和抗体效价明显高于5×稀释组和10×稀释组,10×稀释组也可以诱导小鼠产生持久的中和抗体。为了进一步评价灭活疫苗的免疫原性,分别将其免疫水貂和狐狸,结果显示CDV甲醛灭活疫苗均可以诱导水貂和狐狸产生特异性中和抗体,显示出良好的免疫原性。在整个免疫试验中,未见任何免疫动物表现出犬瘟热的临床症状,结果表明:制备的犬瘟热灭活疫苗安全且具有良好的免疫原性。但其是否可以应用于大熊猫CDV预防,成为安全、有效的疫苗候选者还需进一步证实。第三章:犬瘟热病毒病毒样颗粒构建与实验免疫研究。VLPs是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的空心蛋白颗粒,可以诱导体液和细胞免疫,作为疫苗具有独特的优势。M蛋白是副黏病毒VLPs形成和出芽的主要驱动力,H蛋白是机体的主要保护性抗原,为此,本研究克隆giant panda/SX/2014 M和H基因,通过flashBAC杆状病毒表达系统分别拯救表达CDV M和H蛋白的重组杆状病毒,共感染昆虫细胞Sf9,即可自主装配成CDV VLPs并分泌到培养上清。电镜观察CDV VLPs大小约100nm左右,表面有纤突结构,呈典型的副黏病毒特征。Western Blot结果证实所构建CDV VLPs确由M与H蛋白组成。为初步评价CDV VLPs免疫原性,将包含CDV VLPs培养上清与佐剂混合后分别免疫水貂和狐狸,结果显示:CDV VLPs经两次免疫仍不能诱发水貂和狐狸产生可检测VNAs反应,可能需多次免疫或将VLPs纯化才能获得理想的免疫效果。第四章:犬用金丝雀痘病毒重组犬瘟热疫苗大熊猫实验免疫研究。金丝雀痘病毒重组活载体是一种非复制型载体,接种哺乳动物后外源基因可进行转录表达而不能形成感染性子代病毒,是一种安全有效的病毒载体。目前,梅里亚公司已成功研发多种表达CDV弱毒疫苗株F和H基因的重组金丝雀痘病毒活载体疫苗。本研究选择商品化犬用金丝雀痘病毒重组犬瘟热活载体疫苗“Recombitek?CDV”,分别按两种不同的免疫策略对来自某研究中心的23只大熊猫和某研究基地的37只大熊猫进行实验免疫,通过检测免疫动物的血清抗体效价评估该疫苗的免疫效果。结果显示:犬用重组犬瘟热疫苗可以诱导大熊猫产生中和抗体。经过两次疫苗免疫后,某研究中心的23只大熊猫无论有无预存抗体均全部能检测到CDV VNAs,平均值分别为65.1、33.1,范围为8-256;某研究基地的37只大熊猫中有9只可以检测到CDV VNAs,效价范围为8-32。进一步依据抗体阳性率和中和抗体水平高低确定最佳免疫策略为:初次免疫对有初始抗体的大熊猫接种1头份/只,无初始抗体的大熊猫接种2头份/只,3周后加强免疫一次,剂量为1头份/只。
刘存霞[7]（2013）在《鸡痘病毒282E4株基因组和蛋白质组解析、载体构建与HIV重组疫苗研究》文中研究指明鸡痘病毒（Fowlpox virus, FPV）是脊椎动物痘病毒科、禽痘病毒属的代表成员,该病毒仅感染禽类,可引起禽类动物的疾病。因禽痘病毒通常不感染人与其他哺乳动物,且能有效表达大量的外源DNA,并可在感染细胞的胞浆中复制等特点而成为活病毒载体研究的热点。然而,目前对FPV的基因组、结构、毒力、致病机制、宿主范围及其免疫逃逸等方面尚无系统深入的研究。为设计出更加安全、有效的FPV表达载体系统,本研究以FPV282E4株为研究对象,开展其基因组背景分析、蛋白质组成、新型表达载体构建及重组鸡痘病毒载体疫苗筛选和实验免疫研究。本研究首先采用高通量Illumina测序技术对中国弱毒疫苗株FPV282E4株进行全基因组测序,通过对测序数据组装后利用基因预测软件进行基因de novo预测及功能注释。结果测定FPV282E4全基因组为308829bp,GC含量约为28%,预测出313个编码序列（Coding sequence, CDS）,并与FPVUS株、CNPV ATCC株进行核酸平等共线性分析,通过功能注释表明FPV282E4的基因具有核营酸代谢、运输、转录、复制、重组、修复及翻译后修饰、伴侣蛋白和信号转导功能。在此基础上,采用LC-ESI-MS/MS对鸡痘病毒282E4株进行蛋白质全谱分析,鉴定出76个蛋白,对其进行功能注释,结果与基因组序列相互印证,从而为重组鸡痘病毒载体构建及感染与致病机制研究奠定理论基础。基于FPV282E4全基因组序列测定数据,针对本实验室前期在鸡痘病毒载体构建中遇到的重组效率较低、筛选周期长等问题,本研究优化FPV282E4株5个非必需CDS区作为候选同源重组臂,通过插入含有PE/L早／晚期启动子和终止信号的三基因表达盒,进行重组鸡痘病毒载体的构建,分别以红、绿、蓝三种荧光蛋白基因作为报告基因,进行病毒重组及外源基因表达活性的验证。荧光蛋白表达检测结果表明,三个表达盒均可独立表达外源基因；通过对rFPV进行形态学、生物特性检测,结果成功构建出3个rFPV,且基因缺失未影响重组鸡痘病毒的形态及其复制,3株重组鸡痘病毒无差异。在成功获得表达载体的基础上,以本实验室前期构建的包含HIV-1复合多表位（MEGNp24）、CpG基序和CTB基因（CCMp24）的免疫原为基础,构建表达HIV-1复合多表位的rFPV-CCMP24,通过荧光噬斑筛选纯化rFPV-CCMP24。采用PCR、RT-PCR、Western Blot方法进行重组病毒及外源基因表达的鉴定。成功获得rFPV-CCMp24,重组病毒复制效率及病毒滴度与野生株FPV一致,重组病毒能够在体外表达外源基因且具有反应原性。然后开展了rFPV-CCMp24的小鼠免疫试验,分析其免疫原性,同时结合前期构建的重组痘苗病毒rddVTT-CCMp24进行联合免疫研究,通过检测特异性HIV-1抗体、淋巴细胞刺激指数、淋巴细胞分泌IFNy以及流式细胞术检测CD3+CD4+、CD3+CD8+等指标,综合分析免疫效果,探寻有效的病毒载体为基础的免疫策略。结果显示,rFPV-CCMp24单独免疫及与rddVTT-CCMp24联合免疫,均能诱导细胞免疫及体液免疫。本研究为研制有效鸡痘病毒活载体疫苗及多载体疫苗联合免疫的临床前实验研究奠定了基础。
朱战波[8]（2012）在《表达NDV、IBDV及FMDV基因的重组FPV载体活疫苗构建和实验免疫研究》文中研究表明新城疫（ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一种禽类动物的烈性传染病之一，给养禽业带来了巨大的经济损失。疫苗接种是特异性预防和控制ND的可靠和有效的手段。鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）又称甘波罗病，是由呼肠弧病毒引起的一种急性、高度传染性疾病。由于该病发病突然、病程短、死亡率高，且可引起鸡体免疫抑制，是危害当前养禽业的重要传染病。近年来，各地出现超强毒株（vvIBDV）及变异株，并能突破母源抗体的保护，给IBD的防制带来了巨大的困难。这两种病毒病常规灭活苗免疫原性低，弱毒疫苗存在易散毒、毒力返强等缺陷，因此，研究新型疫苗已经成为当前的热点。口蹄疫（Foot-and-Mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-Mouthdisease virus，FMDV）引起偶蹄动物感染的烈性传染病之一。目前FMD呈世界范围流行趋势，其血清型有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia1型共7种。O型、Asia1型等FMD在我国周边国家或东南亚地区时有发生，对我国养殖业构成了严重的威胁。使用重组鸡痘病毒诱导鸡和哺乳动物细胞免疫应答抵抗外来抗原已经取得明显进步，鸡痘病毒的主要优势在于它允许插入较大量的外源基因。需要我们明确的是对于任何一种病毒表达哪些基因用作多价抗原。使用天然的鸡痘病毒启动子可能优化外源抗原的表达。也要对重组鸡痘病毒表达抗原（外源抗原或鸡痘病毒抗原）之间的竞争进行更多的认识，从而帮助构建有效预防多种病原体的多价重组体鸡痘病毒。联合免疫的深入研究有助于帮助我们认识进而选择不同疫苗形式（包括DNA、蛋白和传统的疫苗）的最佳组合。本实验以合成的痘病毒早晚期启动子PE/L及P7.5作为串联启动子的具有自主产权的鸡痘病毒转移载体为基础，选择NDV的F、HN基因，IBDV的VP0（VP243）、VP2基因，分别置于双向启动子下游，构建了双向表达的鸡痘病毒转移载体pMTB18-F-F、pMTB18-F-HN、pMTB18-F-VP0、pMTB18-VP0-VP2、pUTAL-F-VP2。应用脂质体转染法，将该重组鸡痘病毒中间转移载体与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），经BrdU连续三次加压筛选，挑斑纯化后传代，对鸡痘病毒重组体在体外分别以PCR、RT-PCR和IFA对外源基因的重组、转录和蛋白表达及其生物学活性进行了鉴定。PCR检测结果表明转移载体构建均正确，同时在转录水平上进一步证实了重组病毒可以稳定携带外源基因并正确转录。将重组鸡痘病毒rFPV-F-VP0、rFPV-F-F、rFPV-F-HN、rFPV-F-VP2以抗NDV血清作为一抗，rFPV-F-VP0、rFPV-VP0-VP2、rFPV-F-VP2以抗IBDV血清作为一抗分别进行间接免疫荧光和免疫酶检测，分别检测到了特异性荧光和褐色的痘斑。研究证明获得了5株重组鸡痘病毒rFPV，能够有效的表达外源蛋白，表达产物具有相应的生物学活性。以SPF鸡作为动物模型，对之前构建的5株重组鸡痘疫苗进行了免疫研究，通过体液与细胞免疫指标检测，对疫苗的免疫原性进行了评估。结果显示，所构建的重组鸡痘病毒rFPV均能刺激SPF鸡产生抗NDV或IBDV的特异性ELISA抗体，疫苗接种后第2周抗体水平开始逐渐提高，在第5-6周达到高峰，其抗体水平均高于对照组。对脾T淋巴细胞的增殖能力和血清中Th1类细胞因子（IFN-γ和IL-2）、Th2类细胞因子（IL-4和IL-10）进行了检测。研究表明，重组鸡痘疫苗使SPF鸡产生了特异性体液和细胞免疫应答。攻毒试验结果显示，用重组鸡痘病毒rFPV-F-HN能在一定程度上抵抗新城疫强毒的攻击；重组鸡痘病毒rFPV-F-VP2、rFPV-VP0-VP2免疫的SPF鸡能够明显降低分离株IBDV-JL01/2007对法氏囊组织的损伤程度。本实验室先后成功构建并筛选出FMDV vUTAL3CP1（O型）、vUTAL-P1-2A-3C-IL18（Asia1型）、 vUTA2-P1-2A-3C （Asia1型）、vUTA2-P1-2A-IL18（O型）重组鸡痘病毒疫苗， FMDVGS115/pPIC9K-VP1-2A-CTE（O型）、GS115/pPIC9K-VP1-2A-CTE（Asia1型）酵母重组表达蛋白，pVIRIL18P1（O型）和pVAXI-P1-2A-3C（Asia1型）核酸疫苗。上述疫苗经小鼠单独免疫试验，表明均具有良好的免疫原性，可以激发针对FMDV的特异性体液和细胞免疫应答。据此，本研究利用上述疫苗，采用prime-boost策略免疫FMDV敏感动物豚鼠，并对其诱导的特异性体液和细胞免疫水平进行了检测，以此确定最佳疫苗和免疫策略。结果显示，O型疫苗中，核酸苗pVIRIL18P1首免，重组鸡痘病毒疫苗加强免疫的体液和细胞效果最好，Asia1型以重组鸡痘苗vUTA2-P1-2A-3C-IL18细胞免疫效果突出。研究表明，在针对目标抗原的初次免疫反应中DNA免疫是最有效的，重组痘病毒可加强免疫。同时能依靠能痘病毒自身佐剂的活性增强免疫反应。以猪为动物模型，应用prime-boost策略，评价了O型苗pVIRIL18P1/vUTAL3CP1、 vUTAL3CP1/vUTAL3CP1， Asia1型苗pVAXI-P12A3C/vUTA2-P12A3CIL18、vUTA2-P12A3CIL18/vUTA2-P12A3CIL18几种联合免疫方案的特异性体液和细胞免疫应答水平。核酸苗（500μg/头）采用壳聚糖包裹，鸡痘苗（107PFU）加入佐剂QS-21后与冻干保护剂混合。对35日龄仔猪间隔28d进行两次免疫，应用O型和Asia1型口蹄疫间接ELISA、LPB-ELISA、VP1结构蛋白抗体ELISA（O型）、ELISPOT、T淋巴细胞增殖试验、细胞因子检测等试验方法，证实了候选DNA和鸡痘重组疫苗均能诱导特异性的免疫应答。核酸苗首免，重组鸡痘病毒疫苗加强免疫的体液和细胞效果最优。总之，本研究以新的载体构建和联合免疫研究思路，探讨了重组鸡痘病毒在鸡新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、口蹄疫病毒新型疫苗的设计和免疫策略，对基于双向启动子的重组核酸疫苗构建与实验免疫进行了深入研究，为有效禽类和哺乳动物重组疫苗的研制与临床前实验研究奠定了基础。
戚亭[9]（2011）在《中国部分地区马流感病毒的分子流行病学调查和重组禽痘病毒载体疫苗的初步研究》文中认为马流感（equine influenza,EI）是由正黏病毒科A型流感病毒属引起的马属动物的一种常见的病毒性呼吸系统疾病。众所周知,A型流感病毒可以根据病毒粒子表面糖蛋白的差异划分成不同的亚型（H1-H16,N1-N9）,而感染马属动物的流感病毒通常是H7N7亚型或H3N8亚型。虽然H7N7亚型的马流感病毒在马群内已经消失很久,但是疫苗接种并没有有效地预防H3N8亚型马流感病毒在世界范围内的蔓延。我国是一个养马大国,历史上曾经发生过多次马流感疫情,给我过的养马业造成严重的经济损失;同时,我国的赛马业也正在逐步兴起。因此,本论文的主要研究内容是研究我国目前马流感病毒的遗传演化规律,选择适合在我国作为疫苗株应用的马流感病毒分离株,制备能够有效预防马流感疫情在我国蔓延的候选疫苗。2007年,我国新疆和田地区发生马流感疫情,发病动物除了马外,大量地方品种的驴也被感染,发病率较高,死亡率较低。我们采集发病驴的鼻拭子样品,进行病毒的分离鉴定。结果表明,有一份鼻拭子分离物能够在9-10日龄的鸡胚上进行增殖,收集尿囊液能够具有血凝效价,传代稳定后效价能够达到128价,病毒EID50为107.5/ml。通过对浓缩的鸡胚尿囊液以及病毒在细胞上传代之后的切片进行电镜检查,能够看到病毒粒子呈多形性,具有流感病毒的典型特征。小鼠致病性试验表明,该病毒株对小鼠致病性较低,病毒感染后不能引起小鼠出现临床症状和典型的病理变化。通过对该病毒株的全基因组各个节段的扩增和聚类分析表明,该流感病毒的8个节段都与马的流感病毒处于同一簇,为典型的马流感病毒。因此,本试验研究表明该病毒分离株为一株驴源的马流感病毒。为了有效地预防马流感疫情在我国的蔓延,我们除了加强对马的流感疫情监测,还应该加强对其他马属动物,如驴等,的马流感疫情的监测。最近几年来,我国一直发生马流感疫情。我国的周边国家如印度、蒙古、日本也发生马流感疫情。北美地区和欧洲及英国地区的马流感病例也时有发生。为了研究我国马流感病毒的遗传变异情况,我们从全国主要的养马地区,采集疑似马流感症状的鼻拭子样本,然后进行病毒分离和RT-PCR验证。通过对马流感病毒全基因组各个节段的序列比对和遗传进化分析表明,我国近年来分离的马流感病毒为佛罗里达II型的H3N8马流感病毒,与蒙古分离株A/Mongolia/1/2008和印度分离株A/equine/Jammu-Katra/6/2008同源性较近,这些病毒都起源于欧洲近年来流行的佛罗里达II型马流感病毒,但与日本分离株在遗传进化树上处于不同的进化分支,同时与我国上世纪90年代分离的马流感病毒（欧洲型）也处于明显不同的进化分支。与其它分支的马流感病毒相比,我国流行的马流感病毒HA蛋白一些抗原位点上的关键氨基酸发生改变,有意思的是A/equine/Liaoning/9/2008由于165位氨基酸位点的改变使得该病毒在位置发生一处糖基化位点的缺失。以上结果表明,我国的马流感疫情发生了新的遗传演化情况,这需要我们进一步加强我国的马流感疫情监测。近几年来,我国一直受到马流感疫情的威胁。许多养马地区并未接种马流感疫苗,并且我国也没有自己的马流感疫苗可用,马流感疫苗还主要依赖进口。鉴于此,本研究拟用禽痘病毒载体表达系统来进行马流感疫苗的研制,以希望能够制备出适合在我国应用的马流感疫苗。首先我们构建了分别表达欧洲系马流感病毒A/equine/Qinghai/1/1994和美洲系马流感病毒A/equine/Xinjiang/3/2007的保护性抗原基因HA基因的重组禽痘病毒载体,通过western-blot和IFA鉴定,我们所构建的重组病毒能够和马流感病毒特异性的阳性血清发生反应,说明我们构建的重组病毒能够正确地表达外源基因。这为进一步研究该重组疫苗对实验动物的保护效果奠定了基础。为了进一步验证该重组禽痘病毒载体疫苗的保护效果。本试验进一步研究了重组禽痘病毒疫苗的动物实验情况。首先,我们将重组病毒分组免疫小鼠,疫苗免疫后进行攻毒保护试验,试验结果表明,本研究所构建的两个重组病毒均能够诱导小鼠产生针对病毒的抗体;攻毒后,重组病毒免疫组能够保护小鼠抵抗流感病毒的攻击,而对照组小鼠均感染马流感病毒。进一步马体试验表明,本研究所构建的重组病毒能够诱导马产生针对马流感病毒的抗体,疫苗免疫组在攻毒后偶尔能够分离到病毒,而对照组在攻毒后持续能够分离到病毒。通过本研究证实,我们所构建的表达H3N8亚型马流感病毒的重组禽痘病毒载体疫苗能够保护小鼠和马抵抗流感病毒的感染,该重组疫苗具有良好的应用前景。
李浩波[10]（2010）在《表达蓝舌病病毒VP2，VP5蛋白的重组山羊痘病毒的构建及免疫原性研究》文中进行了进一步梳理蓝舌病是由蓝舌病病毒引起的反刍动物的出血性疾病,它是OIE规定的多种动物共患病。长久以来有弱毒苗和灭活苗获得了商业化应用。这两种苗存在两个共同问题：无法区别自然感染和免疫过的动物；疫苗保护力具有血清型特异性。为解决上述问题,本研究利用我国自行培育并得到广泛应用的CPV弱毒株,构建出表达蓝舌病病毒VP2,VP5蛋白的重组山羊痘病毒,并利用PCR鉴定法对重组病毒进行了鉴定,最后使用重组病毒进行了动物试验,检测了其免疫原性,为蓝舌病重组山羊痘疫苗的产业化奠定了基础。该重组疫苗克服了现有疫苗缺陷,为蓝舌病的防控做了充足技术储备,具有极大的实践生产价值。试验一重组质粒的构建根据已发表BTV-12的VP5,VP2基因序列,设计并合成两对引物。利用RT-PCR方法扩增BTV-12型毒株的VP5,VP2基因片段。将扩增片段克隆至pBluescript载体中,随后进行序列测定。经核酸序列测定,获得的基因片段正确。在已有载体ptk-gpt-ires-egfp的基础上,将BTV的保护性抗原VP5、VP2基因片段依次分别克隆至载体的Sall, HindⅢ; Xbal, PstI位点,获得重组质粒pTK-BTV-VP5-VP2。试验二重组病毒rCPV-BTV-VP5-VP2的拯救及鉴定分别用限制性内切酶ApaⅠ及BglⅠ对山羊痘病毒基因组和重组质粒进行酶切消化,随后进行回收。以我国自行培养并得到广泛应用的山羊痘病毒（CPV）疫苗株为亲本病毒,以山羊痘病毒CPV的复制非必需区TK基因为靶点,通过重组质粒与CPV的同源重组,进行脂质体转染,获得目的重组病毒rCPV-BTV-VP5-VP2。试验三表达蓝舌病病毒蛋白的重组山羊痘病毒的初步免疫原性研究以106PFU病毒量的rCPV-BTV-VP5-VP2腹腔接种5只4周龄的BALB/C小鼠,免疫后21天采血分离血清进行病毒中和试验。结果表明,用本研究构建的蓝舌病重组山羊痘病毒rCPV-BTV-VP5-VP2一次免疫BALB/C小鼠,3周后所有免疫小鼠CPV中和抗体全部转阳（40-80）；BTV中和抗体转阳率为100%（5/5）,滴度分别为80,160,80,40,40。参照OIE BTV弱毒疫苗效力检验合格要求和国外相关文献的报道,本研究获得的重组病毒应该具有对山羊痘病毒和蓝舌病病毒强毒攻击的完全免疫保护作用,为蓝舌病重组山羊痘疫苗的产业化提供参考。
二、金丝雀痘诊断与痘病毒致弱试验（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、金丝雀痘诊断与痘病毒致弱试验（论文提纲范文）
（1）大熊猫犬瘟热抗体间接ELISA方法的初步建立及应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 多肽和血清 |
| 1.2 主要试剂和材料 |
| 1.3 最适包被质量浓度的确定 |
| 1.4 酶标二抗最佳稀释倍数的确定 |
| 1.5 符合率试验 |
| 1.6 敏感性试验 |
| 1.7 重复性试验 |
| 1.8 血清抗体检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 最适包被质量浓度的确定 |
| 2.2 酶标二抗最佳稀释倍数的确定 |
| 2.3 符合率试验 |
| 2.4 敏感性试验 |
| 2.5重复性试验 |
| 2.6 血清抗体检测结果 |
| 3 讨论 |
（2）西尼罗病毒病重组乙型脑炎病毒载体疫苗的构建及实验免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstracts |
| 主要缩略词 |
| 第一篇 绪论 |
| 1 研究目的和意义 |
| 2 西尼罗病毒病概述 |
| 2.1 病原学 |
| 2.2 流行病学 |
| 2.3 临床症状 |
| 2.4 病理变化 |
| 2.5 致病机制 |
| 2.6 诊断 |
| 2.7 防治措施 |
| 3 西尼罗病毒病疫苗研究进展 |
| 4 黄病毒科病毒反向遗传学技术 |
| 4.1 黄病毒科病毒反向遗传系统的发展概述 |
| 4.2 黄病毒科病毒反向遗传系统的构建策略 |
| 4.3 黄病毒科病毒反向遗传操作系统构建的难点 |
| 4.4 黄病毒科病毒反向遗传操作系统的应用 |
| 5 主要研究内容 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 流行性乙型脑炎病毒全长序列测定与比对 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒与细菌 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 JEVSA14-14-2单克隆制备 |
| 2.2 JEV SA14-14-2 cDNA制备 |
| 2.3 JEVSA14-14-2测序引物设计 |
| 2.4 目的基因扩增 |
| 2.5 重组质粒构建与鉴定 |
| 2.6 测序与比对序列 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病毒蚀斑筛选结果 |
| 3.2 目的基因扩增结果 |
| 3.3 重组质粒鉴定结果 |
| 3.4 全基因组序列比对结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 流行性乙型脑炎病毒反向遗传操作系统的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒、细菌与质粒 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 JEVSA14-14-2反向遗传操作系统构建策略 |
| 2.2 pACYC177载体改造 |
| 2.3 JEVSA14-14-2引物设计 |
| 2.4 JEV cDNA各片段扩增 |
| 2.5 JEVSA14-14-2感染性克隆构建 |
| 2.6 病毒拯救 |
| 2.7 拯救病毒的生物学特性鉴定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 载体改造及各片段扩增结果 |
| 3.2 JEVSA14-14-2感染性克隆鉴定结果 |
| 3.3 拯救病毒生物学特性鉴定结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 感染性克隆构建过程中存在的问题 |
| 4.2 感染性克隆各元件作用 |
| 4.3 体外转录体系和体内转录体系比较 |
| 5 小结 |
| 第三章 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01的构建及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞、病毒、细菌与感染性克隆 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 pChiVax-WN01感染性克隆构建 |
| 2.2 ChiVax-WN01病毒拯救 |
| 2.3 ChiVax-WN01生物学特性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 KLM片段扩增与鉴定 |
| 3.2 pACYC177-KLM和pChiVax-WN01构建与鉴定 |
| 3.3 ChiVax-WN01病毒拯救与生物学特性鉴定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 黄病毒多聚蛋白切割位点 |
| 4.2 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01生物学特性 |
| 4.3 内含子对病毒拯救的影响 |
| 4.4 体外转录系统和体内转录系统比较 |
| 5 小结 |
| 第四章 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01的实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 试验动物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 器具 |
| 2 方法 |
| 2.1 神经侵袭性试验 |
| 2.2 神经毒性试验 |
| 2.3 体重及体温变化试验 |
| 2.4 病毒在小鼠体内分布试验 |
| 2.5 微量中和试验 |
| 2.6 ELISpot IFN-γ、IL-2和IL-4试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 神经侵袭性试验 |
| 3.2 神经毒性试验 |
| 3.3 体重和体温 |
| 3.4 病毒内脏分布 |
| 3.5 微量中和试验 |
| 3.6 IFN-γ、IL-2和IL-4酶联免疫斑点试验结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01的安全性 |
| 4.2 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01的免疫原性 |
| 4.3 西尼罗病毒嵌合株ChiVax-WN01神经毒性 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 石河子大学博士研究生学位论文导师评阅表 |
（3）水禽源禽痘病毒的生物学特性及致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩写对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽痘病毒概述 |
| 1.2 禽痘病毒的分类 |
| 1.3 禽痘病毒的形态结构 |
| 1.4 禽痘病毒的基因结构 |
| 1.5 禽痘的流行病学 |
| 1.6 禽痘的诊断 |
| 1.7 禽痘疫苗研究 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 水禽源禽痘病毒的生物学特性 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料组织和鸡胚 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 试剂的配制 |
| 2.2.2 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.3 病毒的形态结构 |
| 2.2.4 病毒的理化特性 |
| 2.2.5 病毒的血凝性 |
| 2.2.6 病毒生长特性 |
| 2.2.7 统计方法 |
| 2.2.8 MDUPV01/GX-2015 株的蛋白鉴定 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒分离鉴定 |
| 2.3.2 病毒感染的组织病理变化 |
| 2.3.3 病毒的电镜鉴定和形态观察 |
| 2.3.4 病毒的理化特性 |
| 2.3.5 病毒的血凝性 |
| 2.3.6 病毒的生长特性 |
| 2.3.7 MDUPV01/GX-2015 株蛋白质谱分析结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 水禽源禽痘病毒的致病性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 毒株 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 病毒悬液的制备 |
| 3.2.2 病毒毒价的测定 |
| 3.2.3 病毒对鸡胚的致病性 |
| 3.2.4 病毒对麻鸭的致病性 |
| 3.2.5 病毒对鸡和鸽子的致病性 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MDUPV01/GX-2015 P1 毒价的测定 |
| 3.3.2 病毒致鸡胚的病理变化观察 |
| 3.3.3 病毒对鸡胚孵化的影响情况 |
| 3.3.4 病毒在鸡胚上的组织嗜性 |
| 3.3.5 MDUPV01/GX-2015 F5和P1 接毒对比试验 |
| 3.3.6 MDUPV01/GX-2015 接种途径试验 |
| 3.3.7 MDUPV01/GX-2015 接种麻鸭的临床观察 |
| 3.3.8 组织病理学观察 |
| 3.3.9 MDUPV01/GX-2015 在麻鸭上的组织嗜性 |
| 3.3.10 患病麻鸭的排毒情况 |
| 3.3.11 MDUPV01/GX-2015 对鸡和鸽子的致病性 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间论文发表情况 |
（4）2016～2018年江西部分地区猪瘟抗体水平调查及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪痘病毒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪瘟的防控 |
| 1.1.1 猪瘟的流行 |
| 1.1.2 猪瘟的实验室诊断 |
| 1.1.2.1 兔体交互试验 |
| 1.1.2.2 动物回归试验 |
| 1.1.2.3 抗体检测 |
| 1.1.2.4 分子诊断 |
| 1.2 CSFV的研究进展 |
| 1.2.1 CSFV的基因组 |
| 1.2.2 CSFV的主要蛋白 |
| 1.2.2.1 Erns蛋白 |
| 1.2.2.2 E2蛋白 |
| 1.3 CSFV疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 传统疫苗 |
| 1.3.2 基因工程疫苗 |
| 1.3.2.1 亚单位疫苗 |
| 1.3.2.2 合成肽疫苗 |
| 1.3.2.3 核酸疫苗 |
| 1.3.2.4 活载体疫苗 |
| 1.3.2.5 基因标记疫苗 |
| 1.4 SWPV载体研究进展 |
| 第二章 江西省猪瘟抗体水平调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试剂盒及主要仪器 |
| 2.1.2 猪血清样品的采集 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 猪瘟抗体检测方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 猪瘟抗体检测结果 |
| 2.3.2 不同年份猪瘟抗体结果分析 |
| 2.3.3 不同季节猪瘟抗体结果分析 |
| 2.3.4 不同阶段猪瘟抗体结果分析 |
| 2.3.5 不同地区猪瘟抗体结果分析 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 2.4.1 讨论 |
| 2.4.2 小结 |
| 第三章 CSFVE2蛋白的表达与纯化 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 质粒、毒株和细胞 |
| 3.1.2 主要仪器和设备 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 P28启动子序列 |
| 3.2.2 引物设计与合成 |
| 3.2.3 P28-E2-His基因的PCR扩增 |
| 3.2.4 PCR产物胶回收 |
| 3.2.5 转移载体p SWE101-P28-E2-His的构建 |
| 3.2.5.1 pSWE101质粒的提取 |
| 3.2.5.2 pSWE101质粒的单酶切 |
| 3.2.5.3 p SWE101与P28-E2-his的连接及转化 |
| 3.2.5.4 阳性克隆筛选及双酶切验证 |
| 3.2.5.5 质粒的构建流程及测序 |
| 3.2.5.6 重组质粒的提取及浓度测定 |
| 3.2.6 转染 |
| 3.2.6.1 细胞准备 |
| 3.2.6.2 细胞接毒 |
| 3.2.6.3 转染 |
| 3.2.7 重组病毒的纯化与增殖 |
| 3.2.7.1 重组病毒感染及蚀斑挑取 |
| 3.2.7.2 病毒增殖 |
| 3.2.8 重组病毒r SWPV-P28-E2-His的 PCR鉴定 |
| 3.2.9 重组病毒的SDS-PAGE电泳分析 |
| 3.2.9.1 样品处理 |
| 3.2.9.2 制胶及电泳 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 P28-E2-His基因的PCR扩增结果 |
| 3.3.2 重组菌菌落PCR结果 |
| 3.3.3 重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.3.4 转染结果 |
| 3.3.5 重组病毒的纯化与增殖 |
| 3.3.6 重组病毒的PCR鉴定 |
| 3.3.7 P28-E2-His蛋白的表达方式鉴定 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 3.4.1 讨论 |
| 3.4.2 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）麻鸭源禽痘病毒的分离鉴定、全基因组测序和动物实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词或符号表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 禽痘病毒简介 |
| 1.1.1 禽痘病毒分类 |
| 1.1.2 禽痘病毒分子生物学特性 |
| 1.1.3 禽痘病毒遗传进化 |
| 1.2 禽痘病毒流行病学 |
| 1.2.1 水禽感染禽痘病毒情况 |
| 1.2.2 临床症状 |
| 1.2.3 危害 |
| 1.3 禽痘病毒的分离培养和鉴定方法 |
| 1.3.1 病毒的分离培养 |
| 1.3.2 电镜观察 |
| 1.3.3 组织病理学观察 |
| 1.3.4 诊断 |
| 1.4 禽痘病毒的疫苗及保护情况 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第2章 麻鸭源禽痘病毒的分离鉴定与序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验样本和SPF鸭胚来源 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.2.4 引物序列 |
| 2.2.5 参考序列 |
| 2.2.6 试剂配制 |
| 2.2.7 Taq Man qPCR诊断 |
| 2.2.8 病理组织切片的制作和染色 |
| 2.2.9 病毒粒子电镜检查 |
| 2.2.10 鸭胚绒毛尿囊膜接种 |
| 2.2.11 鸭胚成纤维细胞接种 |
| 2.2.12 间接免疫荧光 |
| 2.2.13 基因克隆 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 临床症状和流行病学调查 |
| 2.3.2 病料诊断 |
| 2.3.3 电镜观察 |
| 2.3.4 包涵体检查 |
| 2.3.5 鸭胚绒毛尿囊膜接种 |
| 2.3.6 鸭胚成纤维细胞接毒 |
| 2.3.7 间接免疫荧光检测 |
| 2.3.8 克隆基因的测序拼接 |
| 2.3.9 进化树分析 |
| 2.3.10 一致性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 麻鸭源禽痘病毒全基因组的测序分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 样本来源 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 试剂配制 |
| 3.2.5 病料的诊断 |
| 3.2.6 病毒纯化 |
| 3.2.7 纯化病毒的检测 |
| 3.2.8 纯化病毒的核酸纯度和浓度检测 |
| 3.2.9 电镜观察 |
| 3.2.10 全基因组测序 |
| 3.2.11 基因补缺 |
| 3.2.12 基因预测与分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 病料TaqMan qPCR诊断 |
| 3.3.2 纯化病毒的核酸浓度和纯度检测 |
| 3.3.3 电镜观察 |
| 3.3.4 基因组测序 |
| 3.3.5 基因补缺并拼接到基因组 |
| 3.3.6 基因注释 |
| 3.3.7 基因分析 |
| 3.3.8 基因功能预测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 麻鸭源禽痘病毒的动物试验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验动物 |
| 4.2.3 同居感染试验 |
| 4.2.4 接毒试验 |
| 4.2.5 组织嗜性试验 |
| 4.2.6 保护力试验 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 同居感染试验 |
| 4.3.2 接毒试验 |
| 4.3.3 麻鸭源禽痘病毒的组织嗜性研究 |
| 4.3.4 鸡痘疫苗对麻鸭源禽痘病毒的保护试验 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 麻鸭源禽痘病毒的接毒试验结果 |
| 4.4.2 麻鸭源禽痘病毒可能是一种新的禽痘病毒 |
| 4.4.3 麻鸭源禽痘病毒防控措施的探讨 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 全文总结 |
| 5.1 全文讨论 |
| 5.1.1 病毒分离和流行病学调查分析讨论 |
| 5.1.2 全基因组测序分析讨论 |
| 5.1.3 动物试验研究分析讨论 |
| 5.2 全文创新点 |
| 5.3 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 在学期间取得的科研成果 |
（6）大熊猫犬瘟热流行病学调查与实验免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 犬瘟热病原特征及流行病学概况 |
| 1.1 犬瘟热病原特征 |
| 1.2 犬瘟热流行病学概况 |
| 第二章 犬瘟热疫苗研究现状 |
| 2.1 灭活疫苗 |
| 2.2 弱毒活疫苗 |
| 2.3 DNA疫苗 |
| 2.4 基因工程亚单位疫苗 |
| 2.5 重组活载体疫苗 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 病毒样颗粒研究进展 |
| 3.1 病毒样颗粒的分类 |
| 3.2 病毒样颗粒的表达系统 |
| 3.3 副黏病毒科病毒样颗粒研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 大熊猫犬瘟热病毒分离鉴定及遗传进化分析 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 犬瘟热灭活疫苗制备与免疫原性评估研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 犬瘟热病毒病毒样颗粒构建与实验免疫研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 犬用金丝雀痘病毒重组犬瘟热疫苗大熊猫实验免疫研究 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）鸡痘病毒282E4株基因组和蛋白质组解析、载体构建与HIV重组疫苗研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 基因组学和蛋白质组学研究进展 |
| 1 基因组学研究进展 |
| 2 蛋白质组学研究进展 |
| 第2章 禽痘病毒及其载体系统研究进展 |
| 1 禽痘病毒生物学特性 |
| 2 禽痘病毒载体及其应用 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 鸡痘病毒282E4株全基因组测序及序列分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第2章 鸡痘病毒282E4株全谱蛋白质组鉴定与分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第3章 新型鸡痘病毒穿梭载体的构建及功能验证 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 表达HIV-1复合表位重组鸡痘病毒的构建与筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第5章 HIV-1复合表位多载体疫苗联合免疫实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（8）表达NDV、IBDV及FMDV基因的重组FPV载体活疫苗构建和实验免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 鸡痘病毒载体的研究进展 |
| 1 痘病毒家族 |
| 2 痘病毒的分类 |
| 3 鸡痘病毒的趋向性和免疫逃避策略 |
| 4 禽痘病毒抑制细胞凋亡 |
| 5 FPV 编码的受体对宿主蛋白的特异性 |
| 6 痘病毒作为理想疫苗设计的候选载体 |
| 7 强化先天性免疫调节疫苗反应 |
| 第2章 家禽重组禽痘病毒疫苗的研究进展 |
| 1 禽痘病毒重组体的构建 |
| 2 重组 FPV 疫苗 |
| 3 FPV 重组体疫苗对母源抗体的影响 |
| 4 非禽类疫苗 |
| 第3章 哺乳动物禽痘病毒载体疫苗研究进展 |
| 1 FWPV 毒株 |
| 2 哺乳动物 FWPV 疫苗接种的历史：狂犬病和麻疹 |
| 3 重组体鸡痘病毒用作哺乳动物疫苗的发展 |
| 4 宿主免疫调节因子的共表达 |
| 5 涉及鸡痘病毒的联合免疫方案 |
| 6 现存鸡痘病毒免疫效率的提高 |
| 7 临床试验 |
| 8 结语 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 表达 NDV、IBDV 基因重组鸡痘病毒载体活疫苗的构建和筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第2章 表达 NDV、IBDV 基因的重组鸡痘病毒载体活疫苗对 SPF鸡的实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第3章 口蹄疫重组鸡痘载体活疫苗在豚鼠体中的免疫原性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 口蹄疫核酸苗和重组鸡痘病毒活疫苗的猪体实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师及作者简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 致谢 |
（9）中国部分地区马流感病毒的分子流行病学调查和重组禽痘病毒载体疫苗的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 病原体 |
| 1.2 EI 流行病学史 |
| 1.3 国际马匹运输情况 |
| 1.4 近年来EI 流行病学 |
| 1.5 跨种传播 |
| 1.6 马流感疫苗株选择 |
| 1.7 保护性免疫应答 |
| 1.7.1 体液免疫 |
| 1.7.2 细胞免疫 |
| 1.8 马流感病毒疫苗 |
| 1.8.1“死”疫苗 |
| 1.8.2 灭活流感全病毒疫苗 |
| 1.8.3 亚单位疫苗 |
| 1.8.4 DNA 疫苗 |
| 1.8.5 病毒或载体疫苗 |
| 1.8.6 活减毒流感病毒疫苗 |
| 1.8.7 病毒载体疫苗 |
| 1.8.8 用反向遗传学设计的活弱毒流感病毒 |
| 1.9 母源抗体和年龄对马流感疫苗的影响 |
| 1.10 本研究的目的与意义 |
| 第二章 一株驴源马流感病毒的分离鉴定及其生物学特性研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试剂 |
| 2.1.2 鸡血红细胞制备 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 病毒分离 |
| 2.1.7 病毒鉴定 |
| 2.1.8 电镜观察 |
| 2.1.9 病毒滴度测定 |
| 2.1.10 小鼠致病试验 |
| 2.1.11 EIV 基因组克隆 |
| 2.1.12 EIV 基因组序列分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 病毒分离 |
| 2.2.2 病毒滴度测定 |
| 2.2.3 形态学观察 |
| 2.2.4 小鼠致病试验 |
| 2.2.5 EIV 全基因组各节段的克隆、鉴定及序列测定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 我国部分地区马流感病毒分子流行病学调查研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 毒株 |
| 3.1.3 毒株的地理分布情况 |
| 3.1.4 序列分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 HA 基因遗传演化分析 |
| 3.2.2 HA 基因氨基酸序列分析 |
| 3.2.3 NA 基因的遗传演化分析 |
| 3.2.4 内部结构基因的遗传演化分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 表达 H3N8 亚型马流感病毒 HA 基因的禽痘病毒载体的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株和抗体 |
| 4.1.2 载体 |
| 4.1.3 工具酶与试剂 |
| 4.1.4 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 4.1.5 FPV-017 种毒的扩大培养以及病毒含量的滴定 |
| 4.1.6 表达H3N8 亚型马流感病毒HA 基因的重组禽痘病毒载体的构建 |
| 4.1.7 重组载体的鉴定 |
| 4.1.8 转染用质粒的准备 |
| 4.1.9 转染 |
| 4.1.10 重组禽痘病毒的筛选和纯化 |
| 4.1.11 重组禽痘病毒的鉴定 |
| 4.1.12 重组禽痘病毒载体表达EIV HA 蛋白的间接免疫荧光检测 |
| 4.1.13 重组病毒的western blot 检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 pSY538-HA 重组质粒的构建 |
| 4.2.2 pSY681-LP2EP2-HA 重组质粒的构建 |
| 4.2.3 pSY681-LP2EP2-HA-Lac Z 重组质粒的构建 |
| 4.2.4 重组禽痘病毒的获得 |
| 4.2.5 重组病毒的PCR 鉴定 |
| 4.2.6 Western blot 鉴定 |
| 4.2.7 IFA 检测 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 重组禽痘病毒载体疫苗免疫保护效果的初步研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 疫苗成分 |
| 5.1.3 攻毒用毒株 |
| 5.1.4 血凝/血凝抑制试验 |
| 5.1.5 重组病毒的在小鼠模型上的免疫保护试验 |
| 5.1.6 重组病毒的马体保护试验研究 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 重组病毒增殖 |
| 5.2.2 小鼠免疫攻毒试验效果 |
| 5.2.3 马体免疫攻毒试验 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）表达蓝舌病病毒VP2，VP5蛋白的重组山羊痘病毒的构建及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 蓝舌病病毒及山羊痘病毒研究进展 |
| 1 蓝舌病的研究进展 |
| 1.1 蓝舌病概述 |
| 1.2 BTV的生物学特性 |
| 1.3 BTV分子生物学研究情况 |
| 1.4 BTV的诊断方法研究 |
| 1.5 防治 |
| 1.6 BTV疫苗的研究进展 |
| 2 山羊痘病毒的概述 |
| 2.1 CPV分类地位和种群 |
| 2.2 山羊痘病毒载体的优越性 |
| 3 问题和展望 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第二章 重组质粒PTK-BTV-VP5-VP2的构建及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1. BTV-VP2基因,BTV-VP5基因片段的扩增 |
| 2.2 PB-BTV-VP2,PB-BTV-VP5克隆及测序 |
| 2.3 质粒PTK-BTV-VP5的构建 |
| 2.4 重组质粒PTK-BTV-VP5-VP2的构建 |
| 3 讨论 |
| 第三章 重组病毒RCPV-BTV-VP5-VP2的构建及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组病毒的构建 |
| 2.3 重组病毒rCPV-BTV-VP5-VP2外源VP2、VP5基因的整合鉴定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 表达蓝舌病病毒蛋白的重组山羊痘病毒的初步免疫原性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组病毒rCPV-BTV-VP5-VP2的扩增及滴定 |
| 2.2 免疫试验 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、金丝雀痘诊断与痘病毒致弱试验（论文参考文献）
- [1]大熊猫犬瘟热抗体间接ELISA方法的初步建立及应用[J]. 潘广林,赵鹏鹏,高更更,雷颖虎,骆琛,王兴龙. 中国兽医学报, 2021(08)
- [2]西尼罗病毒病重组乙型脑炎病毒载体疫苗的构建及实验免疫研究[D]. 李国华. 石河子大学, 2020(04)
- [3]水禽源禽痘病毒的生物学特性及致病性研究[D]. 闫修魁. 广西大学, 2020(07)
- [4]2016～2018年江西部分地区猪瘟抗体水平调查及表达猪瘟病毒E2蛋白的重组猪痘病毒的构建[D]. 高映雪. 江西农业大学, 2020(07)
- [5]麻鸭源禽痘病毒的分离鉴定、全基因组测序和动物实验研究[D]. 张红云. 华南农业大学, 2018
- [6]大熊猫犬瘟热流行病学调查与实验免疫研究[D]. 冯娜. 吉林农业大学, 2017(01)
- [7]鸡痘病毒282E4株基因组和蛋白质组解析、载体构建与HIV重组疫苗研究[D]. 刘存霞. 吉林大学, 2013(11)
- [8]表达NDV、IBDV及FMDV基因的重组FPV载体活疫苗构建和实验免疫研究[D]. 朱战波. 吉林大学, 2012(12)
- [9]中国部分地区马流感病毒的分子流行病学调查和重组禽痘病毒载体疫苗的初步研究[D]. 戚亭. 中国农业科学院, 2011(11)
- [10]表达蓝舌病病毒VP2，VP5蛋白的重组山羊痘病毒的构建及免疫原性研究[D]. 李浩波. 南京农业大学, 2010(08)