一、荧光分析技术在细胞内Ca~(2+)研究中的应用及钙离子比率荧光测量方法（论文文献综述）
王悦[1]（2021）在《新型功能化荧光探针设计及在汞胁迫下生物活性物种的成像分析研究》文中研究表明荧光成像分析技术凭借其超高的灵敏度、优异的选择性、可实现目标物动态、实时、原位监测的优势已逐渐成为环境分析、生物分析等领域不可或缺的成像分析手段。在本文中,基于荧光成像分析技术,致力于构建新型荧光探针工具,用于汞离子胁迫下细胞及体内生物活性物种（超氧阴离子、多硫化谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶）的成像分析与监测。通过研究汞胁迫下生物活性物种在细胞、组织及活体水平上的分布、浓度变化、转运及其他生物效应,揭示汞污染问题对人类健康造成的影响,为进一步阐明汞中毒机制提供技术支持和科学依据。本文的详细内容如下:1.三通道荧光探针用于汞中毒模型中超氧阴离子和汞离子的联动检测汞离子(Hg2+)作为一种细胞毒性的重金属离子会引起机体氧化应激,并诱导严重的生理功能障碍。为深入探索汞中毒的复杂机制,设计并合成三通道荧光探针HCy-Se H用于汞中毒细胞及小鼠模型中超氧阴离子(O2·-)和Hg2+的联动检测。探针的荧光响应由氢花菁荧光团部分的抽氢反应引发;探针被O2·-氧化后,其共轭体系恢复,转化为可发射荧光信号的中间体七甲川花菁衍生物Cy-Se H,并且中间体Cy-Se H与它的共轭碱Cy=Se共存。响应基团硒醇可以通过硒汞拮抗反应检测Hg2+,从而得到最终产物同时伴随着荧光发射波长的变化。该探针对O2·-和Hg2+展示出好的选择性及高的灵敏度,可用于O2·-和Hg2+的联动检测。将探针应用于汞中毒细胞及小鼠模型的肾脏中,进行O2·-和Hg2+的原位成像分析。实验结果表明,汞中毒引起严重的氧化应激并诱发肾组织损伤。因此,该新型荧光探针HCy-Se H有助于揭示与汞中毒相关的病理机制。2.基于巯基的近红外比率型荧光探针用于对比性研究急性/长期汞中毒在前期研究中,使用三通道荧光探针用于O2·-和Hg2+联动检测的工作引起了研究人员的关注,考虑到汞中毒发病机制的复杂性,希望借助荧光探针这一工具进一步揭示急性汞中毒与长期汞中毒之间的区别,以便更好地针对汞中毒进行诊断与治疗。然而,前期荧光探针的稳定性不能满足长期测试的实验要求。鉴于三通道比率型荧光探针的优势,继续采用花菁染料作荧光团,同时采用巯基作响应基团,构建出更稳定的荧光探针HCy-SH,用于汞中毒模型中O2·-和Hg2+的检测。探针对O2·-和Hg2+展示出良好的光谱特征,并进一步将探针应用于对比性研究急性汞中毒与长期汞中毒。实验结果表明,汞中毒会引起严重的O2·-爆发,并且在急性汞中毒中O2·-的爆发比长期汞中毒中的要严重的多,尤其是在心脏中。与急性汞中毒不同,在长期汞中毒小鼠模型中,O2·-在不同器官、不同时间的爆发不尽相同。但是无论在急性汞中毒还是长期汞中毒中,Hg2+都主要在肾脏中积累。实验结果表明,该探针HCy-SH是准确诊断和评估汞中毒的潜在候选者。3.比率型荧光探针用于汞离子胁迫下多硫化谷胱甘肽的检测还原性活性物种,多硫化谷胱甘肽（GSSH）在信号转导,氧化还原稳态及代谢调节中发挥着关键作用,然而GSSH在这些方面详细的生物学功能却模糊不清。研究GSSH生理功能的主要障碍是缺乏具有高时空分辨率的检测工具。为解决这一问题,设计并合成新型比率荧光探针,基于硒硫交换反应实现汞离子胁迫下活细胞和组织中还原性活性物种GSSH的检测。将荧光探针应用于细胞内GSSH生物合成路径的研究,实验结果表明,GSSH主要来自两种硫转移酶:胱硫醚-β-合成酶和胱硫醚-γ-裂解酶,这与此前的研究报道一致。此外,应用探针探索了GSSH在保护细胞抵抗汞离子诱导的细胞损伤中的生物学作用。实验结果表明,GSSH可以有效缓解汞毒性。该探针是准确评估GSSH生理病理学功能的有力候选者,它可以促进研究人员对GSSH生物学功能的深入探索。4.谷胱甘肽过氧化物酶可激活的比率型荧光探针用于成像分析谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）是一线抗氧化防御系统中非常重要的蛋白酶,它参与氧化还原稳态以及戊糖磷酸途径的调节等生理活动。然而,当前的技术无法实现Gpx的可视化研究,并且Gpx具有较高的反应活性,容易受到外界因素的干扰。在此,构建新型比率荧光探针用于汞中毒和老龄化模型中Gpx的检测,并探索谷胱甘肽过氧化物酶/谷胱甘肽（Gpx/GSH）氧化还原池的催化循环机制及对汞胁迫引起的氧化应激的抗氧化机理。将探针应用于衰老细胞及小鼠模型中Gpx的研究,实验结果表明Gpx的活性在衰老过程中逐渐降低。进一步,利用探针研究Gpx在汞中毒细胞及小鼠模型中的抗氧化机理。结果表明,汞离子降低了Gpx的活性,并通过诱导活性氧物种的爆发导致氧化应激、激活凋亡信号通路,从而加剧汞离子对生物体的损伤。Gpx/GSH氧化还原池可以利用GSH作为底物有效缓解氧化应激。此外,探针还可应用于深层脑组织中Gpx的检测。该新型荧光探针是探索Gpx生理功能和细胞内氧化还原稳态事件强有力的化学工具,同时期望该新型荧光探针可以促进Gpx靶向工具的开发,并在探索Gpx的生理病理学功能方面提供帮助。5.比率型荧光探针用于内源性生物信号分子超氧阴离子的成像分析体内生物活性物种在应对汞污染等各类环境问题时发挥着重要的生理功能,然而这些生物活性物种在其他方面的生理及病理学功能也值得进一步探讨。以O2·-为例,汞中毒会引起严重的O2·-爆发并诱发氧化损伤;而高浓度的O2·-则会激活肿瘤凋亡信号通路,有效杀伤肿瘤细胞。在此,设计并合成荧光探针工具TP-Tfs,用于可视化检测内源性生物信号分子O2·-,深入研究O2·-在其他方面的生理功能。探针对O2·-的选择性较好,并可实现O2·-的快速检测。探针TP-Tfs可用于细胞内源性的O2·-检测,并可应用于汞中毒细胞内O2·-的成像分析。此外,探针TP-Tfs可应用于肿瘤细胞药物化疗期间及荷瘤小鼠模型肿瘤药物治疗期间的O2·-检测。实验结果表明,化疗药物顺铂可诱导细胞内O2·-的浓度增加,并有效杀伤肿瘤细胞。姜黄素联合化疗药物顺铂可诱导更严重的O2·-爆发,并对化疗药物顺铂发挥增敏作用,从而提高肿瘤的治疗效果。因此,O2·-除在汞中毒中发生变化,其在其他方面的生理功能亦值得深入探索,探针TP-Tfs作为强有力的分析工具可发挥其潜在作用。
张雯佳[2]（2021）在《新型分子荧光探针的设计合成及其细胞成像研究》文中研究说明第一章阐述了荧光产生的机理、分子荧光探针的分类、结构及影响因素,并对常见分子荧光探针识别机理和研究进展进行了综述。第二章通过乙烯基桥连2-甲基苯并噻唑和4-（二甲基氨基）肉桂醛,利用一步缩合反应,合成基于ICT机理的比率型荧光探针4-（（1E,3E）-4-（benzo[d]thiazol-2-yl）buta-1,3-dienyl）-N,N-dimethylbenzenamine（BTDB）,在低pH范围（2.3-4.0）下具有高灵敏度和大的Stokes位移（177 nm）,可用于极度酸性测定。此外,BTDB具有低细胞毒性、优良的选择性以及极好的光稳定性。采用激光共聚焦扫描显微技术,成功实现了BTDB与商业用溶酶体染料在He La细胞中共染色成像,说明BTDB可以快速进入细胞并准确靶向定位细胞内溶酶体;同时实现了探针在E.coli细胞内极度酸性环境中的比率测定,是对于细胞内极度酸性环境pH荧光探针的种类的拓展。第三章以萘环为双光子母体结构,吡啶碘盐线粒体靶向基团兼具荧光团,2,4-二硝基苯磺酰基为Cys选择性识别基团,设计合成比率型荧光探针4-（2-（6-（2,4-dinitrophenylsulfonyloxy）-2-naphthalenyl）ethenyl）-1-methylpyridinium iodide（DNEPI）,能对半胱氨酸进行快速、灵敏、高选择性的比率传感。DNEPI的发射比率（F583/F485）与半胱氨酸浓度在2-10μM范围内呈线性关系,伴随着检出限为0.29μM,同时具有较快的反应速度、好的选择性、极好的光稳定性和低细胞毒性。通过质谱和理论计算进一步验证了其与半胱氨酸的反应机理。在He La细胞溶酶体靶向定位实验中,DNEPI与市售的溶酶体特异染料的皮尔森共定位系数为0.94,说明探针可准确定位细胞溶酶体。DNEPI能够可视化监测SMMC7721细胞中半胱氨酸浓度的波动。第四章基于荧光素与罗丹明类荧光染料的结构进行杂化,从而设计合成一系列新型Rhodol类近红外荧光染料,利用螺环的开关实现对荧光的调控,进而对Rhodol荧光染料做出进一步拓展。表征了这一系列染料的光学性质,并从中选择一种荧光性能较优的染料合成了近红外荧光探针WR-Cys和WR-ClO。两个探针的最大发射波长分别位于674nm和680nm处,具有近红外发射特性,可以有效避免细胞自发荧光的干扰。WR-Cys还具有大stokes位移、好的选择性和低细胞毒性。细胞内荧光成像显示WR-Cys和WR-ClO具有优良的细胞膜通透性,能分别可视化监测He La细胞中半胱氨酸和次氯酸浓度的变化。
李铭[3]（2020）在《Orai1对高NEFA介导的犊牛肝细胞氧化应激和内质网应激的调控作用》文中进行了进一步梳理脂肪肝是围产期奶牛高发的一个重要营养代谢性疾病,降低奶牛的生产性能。由于奶牛产后干物质采食量（DMI）降低,而泌乳能量需求增加,致使奶牛机体进入能量负平衡状态,而为了满足妊娠和泌乳的能量需求而动员脂肪导致大量非酯化脂肪酸（NEFAs）进入血液,形成高NEFA血症。大量NEFA进入肝脏后酯化形成甘油三酯（TG）,进而导致脂肪肝的产生。血浆NEFA,脂肪肝和脂质过氧化之间的联系均与代谢应激有关。细胞内Ca2+的稳态是细胞保持正常结构和功能的前提与基础。钙池引发的钙离子进入（SOCE）是非兴奋性细胞调控其细胞内钙离子浓度Ca2+的主要通道。Orai1是SOCE在细胞膜上的孔蛋白。本研究团队前期发现Orai1调控围产期奶牛高NEFA引起的肝脂肪从头合成通路,进而形成脂肪肝。而Orai1是否通过代谢应激引起肝脂沉积尚不明确。因此,本研究旨在明确高NEFA在肝脂沉积过程中是如何调控氧化应激与内质网应激。本研究利用高NEFA刺激原代犊牛肝细胞构建的肝脂沉积模型进行研究。首先原代犊牛肝细胞经1.2 mM NEFA分别刺激0.5、1、3、6、9、12 h。结果发现,NEFA在0.5 h时可显着增加肝细胞中Orai1的表达含量并且1 h时显着增加Ca2+浓度,氧化应激相关指标还原型谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）在1 h极显着降低,丙二醛（MDA）和过氧化氢（H2O2）在1 h极显着升高。内质网应激相关分子PERK、IRE1、GRP78、ATF6、CHOP在6 h显着增加。结果表明,NEFA激活Orai1表达、增加胞内Ca2+浓度,并促进氧化应激与内质网应激。随后在肝细胞中添加氧化应激抑制剂NAC 2 h后,再加入NEFA刺激6 h,结果显示,NAC阻断了由NEFA引起的Orai1以及主要的ER应激蛋白的表达。表明氧化应激可引起内质网应激的产生,降低氧化应激可缓解内质网应激。为了研究Orai1在氧化应激、线粒体功能障碍以及内质网应激中的作用。在肝细胞中加入1.2 mM NEFA处理6 h,结果显示NEFA可上调Orai1表达,以及线粒体损伤相关分子VDAC1,CLPP,CypD丰度。NEFA诱导线粒体通透性过渡孔（mPTP）的瞬时开放并增加了线粒体膜电位。这些变化与线粒体形态的改变高度相关。此外,NEFA诱导氧化应激相关指标GSH和SOD的降低,MDA、H2O2和ROS的升高,增加内质网应激相关分子PERK、IRE1、GRP78、ATF6和CHOP的表达。随后分别对犊牛肝细胞进行沉默或抑制Orai1,SOCE激活剂毒胡萝卜素（Thapsigargin）或钙离子载体离子霉素（Ionomycin）的刺激,以确定ORAI调节。当沉默或抑制Orai1 12 h后,添加NEFA刺激6 h,结果发现,Orai1的沉默或抑制可消除氧化应激,包括增加的GSH和SOD含量,减少MDA和H2O2含量以及减少的ROS产生。ER应激蛋白的丰度被下调,线粒体功能得以恢复。此外,Thapsigargin或Ionomycin诱导的线粒体功能障碍并导致Orai1表达增加。结果表明,Orai1可以调控氧化应激、线粒体功能障碍以及内质网应激,NEFA可激活Orai1的表达,随后诱导线粒体功能障碍、氧化应激以及内质网应激的发生。综上所述,能量负平衡诱导的高浓度NEFA刺激肝细胞,通过Ca2+的信号转导和Orai1激活氧化应激以及线粒体损伤进而导致内质网应激。
张伟伟[4]（2020）在《SLO家族在中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）精子发生过程中的表达及功能》文中进行了进一步梳理精子是在睾丸曲细精管内完成,属于非常复杂的细胞分裂分化过程,为了使这一过程有条不紊的完成,需要曲细精管的内外信号、膜蛋白等对这一发生过程进行严格有序的调控。目前认为精子形成可能与生殖细胞电位的改变密切相关。精子为了获得受精能力需要完成以下几个步骤:附睾成熟、精子获能、超活化、趋向性,最后是精子的顶体反应。这些生理过程与细胞内外离子浓度变化有关。离子通道在精子形成过程中可以调节其内外的渗透压平衡,可以通过改变膜电位的变化推进精子的各种生理过程;受精过程中,精子外部环境会有很大的改变,离子通道就起了至关重要的作用,因此离子通道蛋白的表达、以及其功能的改变都会影响有性生殖物种雄性配子的发育以及受精能力。中华绒螯蟹（学名:Eriocheir sinensis）的生活史比较复杂,其受精过程有别于其它物种,其个体的生活环境与其它物种也有很大的不同。中华绒螯蟹有一个非常重要的生理现象,即生殖洄游。淡水的离子浓度与海水的离子浓度有很大的不同,因此中华绒螯蟹在生殖迁移过程中经历了很强的离子浓度的变化。由此可见,离子浓度变化对中华绒螯蟹生殖发育起着不可或缺的作用。钾通道为目前为止种类和亚型最多的离子通道。有报道称钾离子通道对精子的形成过程以及受精过程都有调节作用,SLO家族是钾通道一类非常特殊的通道,这类通道不仅具有电压依赖性,还对其它因素如Ca2+、Na+、Cl-、pH等具有敏感性。本文以中华绒螯蟹生精细胞为实验材料,采用Western blot、免疫组化、免疫荧光、PCR、基因克隆等技术对SLO家族蛋白进行组织及细胞定位和序列分析;用全细胞膜片钳技术分析生精细胞SLO通道的电生理特性和表达情况。结果如下:1、通过Western blot确定了SLO1存在于中华绒螯蟹精巢以及其它组织内,但是储精囊内的精子SLO1表达较少。SLO2在精巢的生精细胞和储精囊内的精子均有表达,但表达出现了差异性。2、对编码SLO1蛋白的基因克隆,并将测序的结果进行分析,发现slo1 cDNA序列与其它物种有相似性较高,说明其保守性较强,且与拟穴青蟹的slo1最相近;克隆slo2.2的cDNA序列与其它物种虽有相似性,但是其保守性不是很高,与小鼠和和人类有很大的差异性,且与北黄道蟹（Cancer borealis）的slo2.2最相近,关系最为密切。（3）采用全细胞膜片钳技术记录SLO1介导的钙激活钾通道和SLO2介导的钠激活钾通道:结果表明中华绒螯蟹生精细胞的钾电流包含钙激活钾电流。随后加入不同的阻断剂IbTX、CdCl2观察该电流,发现这些阻断剂均可以将钾电流进行阻断,根据阻断的结果分析SLO1蛋白主要表达于精原细胞和精母细胞,这与前期的SLO1蛋白的免疫定位结果一致;SLO2介导的钠激活钾通道也存在于中华绒螯蟹的生精细胞内,但是生精细胞对钠离子的依赖性不同,精子对钠离子的依赖性较强,而精原细胞、精母细胞、精细胞对钠离子的依赖性较弱,说明SLO2在生精细胞的表达存在差异性。（4）观察SLO家族通道对精子的顶体反应的影响,发现钾通道不仅与精子的形成有关,而且还间接调节精子的顶体反应,SLO1与顶体反应相关,其不同抑制剂对顶体反应有不同的抑制作用;采用含不同浓度的钠离子作用于中华绒螯蟹的精子观察其顶体反应,发现钠离子和顶体反应没有直接的关系,这也间接说明SLO2的作用可能更多在精子能动性以及获能上面。综上所述,中华绒螯蟹生精细胞内既有SLO1介导的钙激活钾电流,也有SLO2介导的钠激活钾电流。前者随着精子的形成分布越来越少;后者表现出精子对钠离子的敏感性与其它生精细胞不同,需要更高钠离子浓度才能激活,这与中华绒螯蟹生殖洄游环境密切相关。通过顶体反应诱导率实验发现,SLO1不仅与精子的形成有关,而且还间接调节精子的顶体反应,SLO1通道的关闭导致顶体反应的降低。SLO2的作用可能更多在精子能动性以及获能上面,需进一步试验进行验证。
陈华丽[5]（2020）在《Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制》文中研究指明哺乳动物超过99%的卵子在发育过程中都会经历闭锁性退化而不排卵,在促性腺激素的作用下,其中一些可以达到排卵前阶段,为了促进濒危物种以及基因优良畜禽体外培养卵子更好的应用,卵子发生和卵泡发育的机制尚需进一步研究。颗粒细胞分泌的激素和生长因子对卵泡发育起重要作用,同时卵母细胞分泌各种生长因子也可以调节颗粒细胞的增殖和分化。在卵泡液中含有多种不同水平的类固醇激素,比如雌激素、孕酮和雄激素,可以通过作用于颗粒细胞生长以及卵泡液的形成来影响卵巢的卵泡发育。近年来很多的研究表明,Wnt信号可以调节小鼠和人类的性腺发育和性别分化,并且可以调节激素的合成和分泌,对哺乳动物卵泡形成和发育以及卵巢功能的维持具有重要作用,可以参与调控卵泡闭锁等生理过程。Wnt5a和Wnt11属于非经典Wnt蛋白,它们在颗粒细胞中表达并且在整个卵泡发育过程中发挥特异的调控作用。当颗粒细胞Wnt5a失去活性的时候可以导致小鼠卵泡闭锁增加和排卵率降低。然而Wnt非典型通路对猪卵泡发育的作用尚未见系统报道,本文探究Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡发育过程中凋亡和激素分泌的影响。本试验通过抽吸法取得直径为2-5mm的卵泡中的卵泡液,并且收集颗粒细胞和卵母细胞,在体外培养液中添加一定剂量的Wnt/Ca2+通路中蛋白抑制剂或激活剂,包括Wnt蛋白抑制剂IWP-2、磷脂酶C（PLC）蛋白抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS以及PKCβ蛋白抑制剂Enzastaurin。通过显微镜观察卵母细胞成熟率;通过CCK8试验分别观察IWP-2、U73122、m-3M3FBS或Enzastaurin对颗粒细胞活力的影响。由荧光Ca2+指示剂Fluo3-AM监测颗粒细胞内钙离子含量,Ca2+指示剂Fura-2AM测定卵母细胞内钙离子含量。采用实时荧光定量（q RT-PCR）法检测通路相关基因以及激素分泌、细胞凋亡调控相关基因转录水平的表达;Annexin V-FITC法检测PLC抑制剂和激活剂对颗粒细胞的凋亡的影响。酶联免疫法（ELISA法）检测猪颗粒细胞雌二醇和孕酮的水平。Western Blot法检测凋亡调控若干蛋白、PLC四个亚基蛋白及三种钙离子敏感蛋白（PKCβ、CAMKⅡα、Caln A）的相对表达量。得到如下主要研究结果:1. 与对照组相比,0.05μM或5μM的IWP-2对猪颗粒细胞活力没有影响,0.1μM、0.5μM和2.5μM的IWP-2增加了猪颗粒细胞活力（P<0.05）。这表明Wnt配体在一定程度上抑制颗粒细胞活力。PLC抑制剂U73122的浓度不超过0.5μM时颗粒细胞的活力没有变化,浓度增加时细胞活力在4 h、24 h和48 h降低（P<0.05）,而PLC激活剂m-3M3FBS的添加使12 h之前的颗粒细胞活力随着浓度的增加呈现先升高再降低的趋势,m-3M3FBS浓度为0.5μM时活力最高（P<0.05）。这表明,PLC蛋白参与猪颗粒细胞的活力,并且一定程度上促进颗粒细胞活力。与对照组相比,0.25μM和2μM的Enzastaurin可以降低猪颗粒细胞的活力（P<0.05）。2.0.1-5μM的Wnt抑制剂IWP-2可以对卵母细胞成熟的抑制作用具有剂量依赖性,并且0.5μM的IWP-2抑制卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。0.5μM的PLC抑制剂U73122提高了卵母细胞的成熟率（P<0.05）,降低了卵裂率（P<0.001）和囊胚率（P<0.01）;0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS降低了卵母细胞成熟率（P<0.05）,提高了卵裂率（P<0.01）和囊胚率（P<0.01）。这说明Wnt配体在猪卵母细胞的成熟过程中可能具有促进作用,PLC蛋白可以抑制卵母细胞的成熟。3.0.5μM的IWP-2可以下调颗粒细胞（P<0.01）和卵母细胞（P<0.05）中的Ca2+的浓度。0.5μM的IWP-2处理猪颗粒细胞24 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCG1（P<0.01）和PLCZ1（P<0.001）的m RNA丰度;IWP-2处理猪卵母细胞44 h降低了PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.001）和PLCZ1（P<0.001）基因的表达,同时降低了PLCD3（P<0.05）蛋白的表达。抑制剂U73122和激活剂m-3M3FBS对PLCB1 m RNA的最佳作用时间是4 h,最佳处理浓度是0.5μM。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h降低了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,同时降低了PLCB1（p=0.001）和PLCG1（P<0.05）的相对蛋白丰度以及钙离子的浓度（P<0.001）。0.5μM的m-3M3FBS处理颗粒细胞4 h显着增加了PLCB1（P<0.05）、PLCD3（P<0.05）与PLCZ1（P<0.05）的m RNA表达,并升高了钙离子浓度（P<0.01）。与对照组相比,0.5μM的U73122处理猪卵母细胞44h后,PLCB1（P<0.001）、PLCD3（P<0.01）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度下降,钙离子浓度变化不大;用0.5μM m-3M3FBS处理猪卵母细胞44小时后,PLCB1（P<0.01）、PLCD3（P<0.001）、PLCG1（P<0.05）和PLCZ1（P<0.05）的m RNA丰度增加,PLCB1蛋白的丰度明显增加（P<0.05）,钙离子浓度增加（P<0.05）。IWP-2与U73122共同作用降低了颗粒细胞（P<0.001）和卵母细胞（P<0.05）中的钙离子水平,而IWP-2与m-3M3FBS共同作用则对颗粒细胞和卵母细胞的钙离子水平没有影响。结果表明,Wnt配体与PLC蛋白可以协同调节卵泡内钙离子水平的变化,能够增加胞质中Ca2+的增加。4. 在颗粒细胞中,抑制剂U73122降低了钙离子敏感蛋白PKCβ（P<0.05）、CAMKIIα（P<0.05）和Caln A（P<0.01）的表达丰度,激活剂m-3M3FBS升高了CAMKIIα蛋白（P<0.001）的表达量。在卵母细胞中,PLC蛋白对PKCβ和CAMKIIα蛋白具有正调控功能（P<0.05）,但是不影响Caln A的表达。在颗粒细胞中,抑制剂U73122可以下调CDC42（P<0.01）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.01）的m RNA表达水平,同时对CTNNB有少许上调作用（P>0.05）;激活剂m-3M3FBS可以上调CDC42（P<0.05）、NFATc1（P<0.01）和NFκB（P<0.05）的m RNA表达水平,同时降低CTNNB（P<0.05）的表达。在卵母细胞中,PLC对下游基因具有上调作用,但是并不影响CTNNB的m RNA表达水平（P>0.05）。结果表明,PLC蛋白可以激活猪颗粒细胞和卵母细胞的钙离子敏感蛋白和下游基因,并且在颗粒细胞中可以抑制CTNNB的表达。5.0.5μM的IWP-2上调了调控猪颗粒细胞凋亡的BAK（P<0.001）、BAX（P<0.01）、CASP8（P<0.05）和TP53（P<0.05）基因的m RNA水平,同时Bak、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表达增加（P<0.05）。0.5μM的IWP-2处理猪卵母细胞44 h之后,BAX（P<0.01）、CASP3（P<0.05）和TP53（P<0.01）基因的表达显着升高,同时抗凋亡基因BCL6（P<0.05）基因的表达降低;Bax（P<0.01）和Cleaved caspase3（P<0.05）蛋白的表达显着增加,Bcl-6（P<0.01）蛋白的表达降低。PLC活性变化可以抑制颗粒细胞的凋亡调控基因,并且在不同的时间对凋亡率的影响有所不同。0.5μM的PLC抑制剂U73122可以上调BAK（P<0.01）、BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.01）的m RNA表达水平。0.5μM的U73122作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率（P<0.05）和晚期凋亡率（P<0.05）达到最高。PLC激活剂m-3M3FBS可以上调抗凋亡基因BCL2（P<0.01）的m RNA水平,并且下调BAX（P<0.05）和CASP3（P<0.05）的m RNA表达;并降低Bax蛋白的表达,增加Bcl-2蛋白的表达。0.5μM的m-3M3FBS作用颗粒细胞4 h时早期凋亡率最高（P<0.05）,作用8 h时晚期凋亡率达到最高（P<0.05）。用0.5μM U73122培养猪卵母细胞44小时,与对照组相比,、、CASP3（P=0.001）、和的相对m RNA丰度增加,而的相对m RNA水平降低;、Cleaved和蛋白的表达上调。使用0.5μM m-3M3FBS培养猪卵母细胞44 h,与对照组相比,、、CASP3（p）、和TP53（p=0.001）的相对m RNA丰度降低,而BCL6的相对m RNA水平而升高（图4-6 D）;Bcl-6的蛋白表达丰度增加（P<0.05）,且P53的蛋白表达丰度降低。0.5μM的IWP-2与0.5μM的U73122于体外共同处理猪的颗粒细胞,与对照组相比,上调了BAK（P<0.01）、BAX（P<0.001）、CASP3（P<0.01）、CASP8（P<0.001）和TP53（P<0.05）的m RNA表达量,下调了BCL2（P<0.05）的m RNA表达水平。在猪颗粒细胞培养液中同时添加0.5μM的IWP-2和0.5μM的m-3M3FBS,与对照组相比,BAK（P<0.001）和CASP8（P<0.001）的m RNA表达水平降低。与对照组相比,2μM的Enzastaurin增加了BAK（P<0.001）、BAX（P<0.001）和CASP3（P<0.01）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.001）基因的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用增加了BAK（P<0.001）和BAX（P<0.05）基因的表达,同时降低了BCL2（P<0.01）基因的表达。2μM的Enzastaurin增加了Bax蛋白（P<0.05）的表达,降低了Bcl-2蛋白（P<0.01）的表达;0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin共同作用降低了Bcl-2蛋白（P<0.001）的表达。结果表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以协同抑制猪颗粒细胞和卵母细胞的凋亡过程。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同促进猪颗粒细胞的凋亡。6.0.5μM IWP-2可以促进猪颗粒细胞中雌二醇相关基因CYP17A1（P<0.01）、CYP19A1（P<0.01）、ER1（P<0.001）和ER2（P<0.01）的表达上调。0.5μM PLC抑制剂U73122可以上调猪颗粒细胞CYP11A1基因（P<0.05）,0.5μM PLC激活剂m-3M3FBS对激素调控的作用很小。0.5μM U73122处理颗粒细胞2 h、8 h、12 h、24 h、48 h后雌二醇分泌下降（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2h后雌二醇分泌下降（P<0.05）。0.5μM U73122处理猪颗粒细胞4 h增加了孕酮的分泌（P<0.05）,0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h和8 h后孕酮水平增加（P<0.05）。0.5μM的U73122处理猪颗粒细胞后,除了8 h（P>0.05）之外,各时间点雌二醇与孕酮的比例均下降（P<0.05）。使用0.5μM m-3M3FBS处理猪颗粒细胞2 h降低了雌二醇与孕酮的比例（P<0.05）。IWP-2和U73122共同作用提高了参与调节E2和P4的基因的m RNA表达水平,IWP-2与m-3M3FBS共同作用降低了CYP11A1的m RNA表达水平（P<0.01）,提高了CYP17A1（P<0.05）、CYP19A1（P<0.01）和ER1（P<0.05）的表达水平。与对照组相比,2μM Enzastaurin以及0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用均增加了猪颗粒细胞中CYP11A1基因（P<0.01）的表达和降低了CYP19A1（P<0.001）基因的表达。0.5μM U73122和2μM Enzastaurin共同作用比2μM Enzastaurin单独作用更明显地降低了猪颗粒细胞中CYP17A1基因的表达。研究表明,Wnt/Ca2+通路中Wnt配体和PLC蛋白可以共同调控猪颗粒细胞和卵母细胞的雌二醇（E2）和孕酮（P4）的激素水平。0.5μM的U73122和2μM的Enzastaurin可以协同调控三种激素相关基因CYP11A1、CYP17A1和CYP19A1。综上所述,Wnt/Ca2+信号通路中Wnt蛋白和PLC蛋白可发挥协同作用在猪的卵泡发育过程中具有抑制细胞凋亡和调节激素分泌的功能;Wnt/Ca2+信号关键蛋白PLC可以调控钙离子敏感蛋白和下游基因的表达。
马忱[6]（2020）在《氯离子和溴离子荧光探针及纳米载体的合成与应用》文中认为阴离子具有重要的环境和生理作用,得到了越来越多研究者的广泛关注。关于阴离子研究的一个热点领域是阴离子跨膜转运。阴离子跨膜转运主要有两种方式,一种是合成小分子载体,另一种是人工合成离子通道。最新的研究表明,利用纳米载体运输离子是一种新型的离子运输策略,能解决小分子载体和离子通道合成路线复杂和难以应用的缺陷。阴离子运载的关键是成功将阴离子运载至细胞,因此,细胞内阴离子浓度的变化还需要一种有力的工具对其进行即时检测。荧光探针由于其独特的成像优势近年来发展迅速,设计出能够监测阴离子浓度变化的荧光探针不仅对研究细胞内阴离子的生理作用具有重大意义,还会为阴离子跨膜转运的研究提供有效工具。本论文主要研究了氯离子和溴离子荧光探针及纳米载体的合成与应用。主要工作如下:（1）氯离子（Cl-）作为人生理环境中含量最多的阴离子,在维持正常的生理活动中起着至关重要的作用。Cl-含量异常会引起多种疾病,所以检测生物样品中的Cl-有着至关重要的意义。在该工作中,我们首先合成了一种水溶性荧光探针M2用于Cl-的高选择性灵敏检测,M2具有较高的相对荧光量子产率（Φ=45%）,能在生理条件下定量检测Cl-。之后,为了降低探针浓度、仪器参数和光漂白的干扰,设计了一种比率荧光探针MY用来检测Cl-,该探针具有优异的选择性和抗干扰性能,能检测实际水样与生物样品中的Cl-。并且,M2和MY均具有优良的光学性质,能成功应用于细胞中Cl-的成像,为研究Cl-纳米载体提供了有效工具。（2）溴离子（Br-）作为人体构成所需的一种必要微量元素,其在一些过氧化物酶例如髓过氧化物酶（MPO）或嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）的催化下可以被活性氧（ROS）氧化为次溴酸（HOBr）,HOBr会影响IV型胶原蛋白的活性,而IV型胶原蛋白是基底膜的重要组成部分,所以检测细胞内Br-或HOBr有着重要的意义。在该工作中,我们以萘酰亚胺为荧光基团利用Suzuki偶联反应合成了溶酶体靶向的HOBr荧光探针NA-lyso。NA-lyso具有响应速度快,特异性好,相对荧光量子产率（Φ=59.17%）高和优良的生物相容性等特性。NA-lyso不仅能成功用于HOBr的体外和体内成像,而且还证明了细胞中的Br-可以被ROS氧化为HOBr,有望成为探索生物体中HOBr或Br-相关生理功能的一种工具。（3）研究表明协同运输Na+和Cl-的小分子载体具有诱导细胞凋亡的性质,但小分子载体合成复杂使其应用受限。在该工作中,我们利用生物相容性好的聚合物聚乳酸-羟基乙酸（Poly（D,L-lactic-co-glycolic acid）,PLGA）合成了一种可以运载Cl-和Na+的纳米载体（SNP）,并在该纳米载体表面修饰了聚多巴胺（Polydopamine,PDA）制备出SNP@PDA,从而提高了材料的稳定性。此外,在SNP@PDA中上载了NaHCO3,酸性条件下HCO3-与H+作用产生CO2气体,导致纳米载体胀破,使Cl-和Na+从纳米载体中快速释放。细胞实验表明,该纳米载体可以促进细胞凋亡并导致ROS浓度增加。通过研究线粒体和细胞质中细胞色素c含量的变化以及细胞凋亡过程中关键酶半胱天冬酶-9（caspase-9）和半胱天冬酶-3（caspase-3）的活性,证明了凋亡途径是半胱天冬酶（Caspase）依赖型。使用纳米材料来运输离子的新颖策略使离子运输的研究不再局限于合成小分子载体和离子通道,这为研究离子稳态,离子转运和癌症治疗提供了新颖有效的方向。（4）为了提高离子的上载量和实现靶向作用,在该工作中,我们使用一种新型表面活性剂Vitamin E-O（EG2-Glu）（VEOEG）通过共沉淀法合成了一种高上载量的Cl-纳米载体SN,在SN表面修饰上PDA得到SNP,PDA的修饰使其具有了光热性质。接着通过静电作用在SNP表面修饰上了两性壳聚糖（Zwitterionic chitosan,ZWC）,得到最终的纳米载体SNPZ。ZWC的修饰使载体可以区分肿瘤组织和正常组织,实现了靶向性。将NH4HCO3上载至该纳米载体,温度升高时,NH4HCO3分解为NH3和CO2,从而使SNPZ快速释放Cl-和Na+。为了实现近红外（NIR）成像,将一种具有光热性质的NIR染料IR-780装载至SNPZ中,IR-780不仅能降低背景荧光进行NIR成像,还可以提高材料的光热效率。通过细胞实验证明了Cl-和Na+在细胞内快速释放可以诱导细胞发生Caspase依赖性凋亡。活体实验表明,在接种了Hela瘤的裸鼠模型中,SNPZ能聚集在肿瘤部位并抑制肿瘤的生长,且辅助NIR激光照射能够实现更好的治疗效果,这种无药物引入就可实现抑制肿瘤生长的策略将在癌症治疗中有着广阔的应用前景,也为治疗离子通道病提供借鉴意义。此外,采用SNPZ的合成路径合成了Br-的纳米载体SNPZ-Br,并用NA-lyso进一步验证了细胞内的Br-可以被ROS氧化为HOBr。
王昕[7]（2020）在《抑郁症相关活性分子的细胞及活体内荧光成像分析》文中研究表明抑郁症的核心症状是情绪低落、快感缺乏、易怒、难以集中注意力、食欲和睡眠异常等,具有极高的发病率和致死致残率,为家庭和社会带来了极大的精神和经济负担。为了对抑郁症进行有效的预防和治疗,必须对抑郁症的发生和发展过程进行彻底的了解。然而,目前抑郁症因其致病因素复杂、病因不清、发病机制不详,一直是神经科学领域的一大难题。现有研究结果表明,生物活性分子包括神经递质、相应的合成或水解酶、活性氧自由基（ROS）、活性氮自由基（RNS）、金属离子等,在抑郁症的发生发展过程中发挥至关重要作用。因此,探讨神经细胞信号通路对小鼠抑郁行为的影响,尤其是分析神经递质等生物活性分子的种类和浓度变化对神经元功能以及小鼠抑郁行为的调控作用,对揭示抑郁症的发生发展机制以及诊疗研究显得尤为重要。目前,荧光成像技术具有分辨率高、损伤小、操作简便等明显优势,广泛用于活细胞及活体内生物活性分子的实时原位准确检测。尤其是双光子荧光成像的方法,由于采用长波长激发,具有背景荧光干扰小、组织穿透深、光损伤小等显着优势,更加适用于活体原位可视化分析。然而迄今为止,能够高选择性识别脑神经元内抑郁症相关活性分子的荧光探针还很少,尤其是双光子荧光探针少见报导。小分子荧光探针具有稳定的性能、易于透过血脑屏障、操作相对简便、生物相容性好等优势,是用于活体双光子脑部成像抑郁症相关活性分子的理想工具。因此,为了利用双光子荧光成像技术精准检测活体脑内神经元中抑郁症相关生物活性分子,探究相关信号通路,亟需发展理想的有机小分子双光子荧光探针。基于以上原因,本论文针对目前检测活体脑内神经元中抑郁症相关生物活性分子所面临的瓶颈问题,发展了一系列性质稳定、生物相容性良好、应答快速的有机小分子荧光探针,实现了对活体脑内神经元细胞中ROS（羟基自由基、超氧阴离子自由基）、神经递质水解酶（乙酰胆碱酯酶）、金属离子（锌离子）的高灵敏度、特异性双光子荧光成像分析,系统研究了小鼠活体脑部抑郁症相关生物活性分子的变化,并初步探讨了活性分子参与的相关信号通路,为揭示抑郁症发生发展的相关分子机制研究提供重要信息和理想的成像探针。本论文主要内容如下:1、设计合成了一个用于活体脑部成像乙酰胆碱酯酶的双光子荧光探针MCYN。该探针能够快速、高选择性地监测乙酰胆碱酯酶的活性变化。利用双光子成像技术,首次在活体水平用荧光成像方法观察到了抑郁小鼠模型大脑中的乙酰胆碱酯酶活性的升高。此外,借助一个O2·-的双光子荧光探针,首次在活体小鼠脑内揭示了乙酰胆碱酯酶与O2·-水平的协同变化。研究结果指出可能是氧化应激导致了乙酰胆碱酯活性的增加从而导致了小鼠抑郁行为的加重,为深入揭示氧化应激在抑郁症发生发展过程中的病理学作用提供了新策略和新思路。2、设计合成了一个高选择性、高灵敏度成像小鼠大脑中·OH的双光子荧光探针MD-B。基于特异性的单电子氧化反应,该探针可以瞬时、高灵敏、高选择性地识别·OH。利用双光子成像技术,MD-B可以应用于成像高浓度谷氨酸刺激下神经胶质细胞中·OH的爆发。探针中引入的三氟甲基基团大大增加了探针的脂溶性,有助于通过血脑屏障,从而实现活体大脑中·OH的荧光成像。成像结果表明抑郁小鼠脑部·OH浓度升高。利用蛋白质组学分析,进一步证明过量产生的·OH可以导致SIRT1的失活从而导致抑郁行为的加重。这一工作为探究抑郁症相关的分子机制和抗抑郁治疗提供了新工具。3、设计合成了一个同时检测Zn2+和O2·-的双光子荧光探针,在单光子400 nm或双光子800 nm激发下,探针与Zn2+反应后,560 nm处荧光明显增强,而与O2·-反应后,480 nm处荧光明显增强。基于同一激发,两处发射光谱可区分,有利于进行双色成像。该探针对Zn2+和O2·-的识别具有高选择性,且荧光信号互不干扰。细胞成像结果表明,在高浓度的谷氨酸诱导的氧化应激状态下细胞内Zn2+和O2·-同时升高。重要的是,利用检测SIRT1活性的探针,观察到了Zn2+和O2·-同时升高伴随着SIRT1活性的降低。该工作进一步揭示了在抑郁症的发生发展过程中活性氧对SIRT1的调控作用。4、设计合成了靶向线粒体定量检测·OH的双光子荧光探针,通过引入带有正电荷的脂溶性三苯基膦结构,该探针可以精确检测线粒体中·OH的变化。在单光子400 nm或双光子800 nm激发下,探针的荧光发射在450 nm,与·OH反应后,探针结构的ICT效应增强,450 nm处荧光降低,560 nm处荧光明显增强,从而实现了对·OH的比率检测。细胞共定位实验表明,探针具有优异的线粒体定位能力。更重要的是,该探针能够对活体小鼠大脑中线粒体内的·OH进行定量可视化分析。此外,结合SIRT3 Elisa试剂盒分析结果,进一步揭示了氧化应激过程中线粒体内产生的过量·OH可能通过抑制SIRT3的活性,最终导致抑郁行为的加重。该工作进一步揭示了抑郁症的发生发展过程中ROS参与的分子机制。
熊梦仪[8]（2019）在《基于功能核酸的荧光探针用于细胞的金属离子及RNA成像研究》文中研究指明随着生命科学技术的持续革新,人类对生命活动的本质及其规律的认识日益深刻。于此同时,人类也正面临着来自外界以及人类自身的挑战,诸如生存环境恶化、疾病困扰等。因此,快速、准确的检测与生命活动相关的目标物对监测环境状况,以及疾病早期诊断具有重要意义,这也是现代生物分析研究的核心课题。在众多的生物分析手段中,荧光探针具有易于构建、响应速度快、灵敏度高、能实现原位成像等特点,而被广泛地应用。传统荧光探针通常采用抗体、酶等具有识别或催化功能的蛋白质,或者能与目标物结合或反应的有机小分子作为识别单元。由于制备和应用的局限性,传统的荧光探针已经无法满足现代分析技术的需求。功能核酸的出现极大地拓展了荧光探针的应用范围,为荧光探针的设计开辟了全新的途径。目前已被发现并广泛应用的功能核酸主要分为两大类:第一类功能核酸被称为核酸适配体（Aptamers）,核酸适配体能够行使与抗体相似的识别功能,能特异性识别金属离子、小分子、蛋白质、细胞、组织甚至是器官,因此常作为识别单元用于功能核酸探针的构建。另一类功能核酸被称为脱氧核酶（DNAzymes）,脱氧核酶可与辅酶因子结合（通常为金属离子）,行使与蛋白酶类似的催化功能。功能核酸探针由于序列简单、易于设计与合成、响应速度快、选择性好等优点,而受到广泛的关注。通过对功能核酸序列进行合理的设计,并结合核酸探针可编程的特点,研究人员已开发出诸多高效的功能核酸荧光探针用于复杂样品中目标物的检测。实时监测细胞生物分子的浓度变化与分布情况对于研究其生理、病理功能以及疾病的早期诊断具有重要意义。尽管功能核酸探针已被广泛地用于体外检测,其在细胞成像检测中的研究仍处于初级阶段。为了进一步发掘功能核酸探针在细胞研究中的潜力,本研究中论文构建了多种高效的新型功能核酸荧光探针,用于金属离子和RNA的细胞成像检测,并探究其用于疾病监测及治疗的可能性。具体内容展示如下:第2章构建了一种细胞膜锚定的核酸探针,用于细胞膜外微环境中K+的动态监测。该探针采用凝血酶核酸适配体序列（TBA）和荧光共振能量转移（FRET）荧光团作为K+的识别和信号报告单元,并在序列末端连接二酰基脂质作为细胞膜锚定基团。此外,这里通过对传统的TBA荧光探针序列进行优化,使探针获得了更好的信背比。基于该探针优良的灵敏度和选择性,以及快速的响应时间和可逆性的响应方式,我们实现了细胞膜外微环境中K+的动态监测。近年来,基因编码探针在细胞内金属离子成像的研究中取得重大进展,但是能与荧光蛋白融合的金属结合蛋白或多肽的种类较少,并且将金属离子的结合转化为荧光信号较为困难,目前这类传感器能检测的金属离子种类十分有限。为了拓展基因编码荧光蛋白传感器在金属离子检测中的应用,并且加强脱氧核酶在细胞生物学领域中的影响力,在第3章的研究中,我们利用Mg2+响应的脱氧核酶（10-23 DNAzyme）特异性地切割mRNA,从而调节荧光蛋白表达,以此构建了新型的金属离子荧光传感器。结果证明,通过10-23 DNAzyme剪切Clover2（绿色荧光蛋白的突变体）的mRNA可以抑制Clover2的表达,而红色荧光蛋白的突变体Ruby2的表达不受影响。通过体外筛选可以获得多种具有金属离子特异性的脱氧核酶,而且不同的脱氧核酶通常具有类似的二级结构和反应机理,如Mg2+、Na+、Cu2+、Zn2+,Pb2+,Hg2+,Ag+和UO22+的脱氧核酶。因此,本工作中描述的方法可应用具有一定的通用性,可用于多种金属离子的成像,从而显着扩展基因编码荧光蛋白的应用范围,使得这类传感器更好地用于探究金属离子在生物学中的意义。一直以来,杂交链式反应（HCR）信号放大策略被广泛地用于目标物的超灵敏检测,其在癌细胞成像和治疗方面的潜力尚待开发。在第4章中,我们报道了基于杂交链式反应（HCR）的荧光纳米探针,用于高选择性和灵敏度的癌细胞识别和放大光动力学治疗。该荧光纳米探针利用DNA杂交识别癌细胞内特有的mRNA,并以此激活HCR信号放大策略,实现高灵敏度的癌细胞成像检测。同时DNA序列上携带的光敏剂随着HCR的进行而被激活,从而实现放大的光动力学治疗。本课题充分利用HCR的优势,探究了核酸探针在癌症识别和治疗中的可行性。第5章构建了基于金属有机框架（MOFs）的核酸酶运载及可控释放体系,用于细胞内miRNA的放大检测。这里选择细胞外核酸探针放大检测常用的核酸外切酶III（Exo III）作为目标运输蛋白,并将其通过一步合成法包裹在金属有机框架（ZIF-8）内部,同时将DNA探针吸附在金属有机框架材料表面,从而实现Exo III和DNA探针的同步细胞运输。该纳米探针可在细胞微酸性环境中降解,释放出Exo III和DNA探针,通过DNA探针与细胞内miRNA-21（miR-21）杂交,再由Exo III将杂交后的DNA探针序列水解,从而实现信号放大。该研究课题有望为酶催化的DNA信号放大策略用于活细胞成像开辟新的思路。
刘智超[9]（2019）在《氧化应激下神经元的荧光成像与实时传感》文中研究指明氧化应激作为生命体内重要的生理过程,其水平与很多疾病密切相关。例如癌症、神经退行性疾病以及心脑血管疾病等。因此,实现对氧化应激相关过程监控的研究具有重要意义,实现氧化应激相关过程监控的重要途径是对与氧化应激密切相关物质的分析与检测。目前已报道多种方法用于氧化应激相关物质的检测与分析,其中荧光法因能实现原位、动态监控活体或细胞内物质变化而得到广泛应用。然而,实现这些相关物质的实时、动态、高选择、高灵敏的荧光分析仍然具有挑战。目前的挑战主要在三个方面:（1）在活体、细胞中,成分复杂、共存物质多,实现活体或细胞层次中氧化应激相关物质的荧光检测与分析对探针的选择性要求很高;（2）与氧化应激密切相关的物质浓度处于动态变化中,实时、动态的监测这些物质的变化能够更准确的理解氧化应激相关过程。这对探针的时间分辨率提出更高的要求,因而需要制备具有快速响应动力学的探针;（3）不同物质之间存在关联,实现多物质同时检测与分析能够更好理解氧化应激相关过程。然而,混合探针进入活体或细胞的动力学不同、分布不均匀,而不同荧光探针的共修饰容易导致荧光共振能量转移和交叉干扰,因此,需要发展高效探针实现多物质的同时检测与分析。为解决以上关键科学问题,本人博士论文主要开展了以下三个方面工作:（1）通过合成对Fe2+或Ca2+特异性识别的有机配体分子来提高探针的选择性,并在此基础上合成金属纳米簇构建无机-有机复合纳米探针,实现探针快速的响应动力学,从而提高探针的时间分辨率。此外,进一步修饰参比分子构建比率型荧光探针,实现了神经元内Fe2+和Ca2+高选择性、高准确度的实时成像与分析。研究发现神经元内Fe2+分布不均匀,并且缺血会导致神经元内Fe2+浓度明显升高。另一方面,发现组胺诱导的神经元内Ca2+浓度增加在不同部位是不一样的。（2）系统总结并研究了影响碳量子点发光的因素。通过调研和研究发现,影响碳量子点发光的因素主要包含两方面,即内部因素和外部因素。内部因素主要包括尺寸效应和掺杂效应,其中碳量子点的荧光发射峰会随着其尺寸的增加而逐渐红移。此外,碳量子点的荧光量子产率可以通过掺杂而得到有一定的提高。外部因素主要是指影响碳量子点表面态的因素,通过研究发现给电子基团对于碳量子点的荧光影响最大,碳量子点表面修饰分子给电子能力越强,碳量子点荧光越强。该工作为碳量子点荧光机制解析以及功能化碳量子点的设计与制备提供支持。（3）在解析碳量子点荧光增强机制后,进一步构建基于碳量子点的新型Ca2+高选择性荧光探针,并引入边长为12 nm的DNA四面体纳米结构,进而与pH响应分子、参比荧光分子以及线粒体靶向分子同时修饰到DNA四面体的顶点,构建DNA复合纳米探针,避免不同响应探针之间可能发生的荧光共振能量转移和交叉干扰,实现了神经元线粒体内pH和Ca2+的同时成像与定量分析。研究发现线粒体pH和Ca2+具有密切联系,超氧阴离子和Aβ蛋白诱导的神经元死亡与酸诱导的线粒体Ca2+过载密切相关。这些研究结果表明Fe2+、Ca2+以及pH与氧化应激密切相关,为从细胞层次解析氧化应激在相关脑神经疾病中的作用及分子机制提供新方法。
谢委翰[10]（2019）在《新型生物活性玻璃微球及其复合材料的皮肤创面修复机制研究》文中提出皮肤组织一旦受到严重损伤,会给患者的生活和生命健康带来极大的影响。因此,开发具有良好的生物应答效应的新型生物医用材料,从而实现创面尤其是难愈创面的快速修复,不仅是生物材料界的一大挑战,也具有重大的临床意义和市场价值。生物活性玻璃由于其本身具有的高生物活性,在皮肤修复领域具有极大的潜力。本文在溶胶-凝胶法的基础上,通过引入模板法制备了形貌规则的生物活性玻璃微球,并将生物活性玻璃微球与参与创面修复的细胞（如成纤维细胞和巨噬细胞）接触培养,探究生物活性玻璃微球对细胞行为的调控作用及其机制;将其与凡士林结合,制备生物活性玻璃微球复合膏剂,并通过体内实验探究其对难愈创面愈合的促进作用及其机理。在此基础上,将生物活性玻璃微球与生物医用高分子材料复合制备具生物活性的新型多孔纤维膜并探究其对创面修复的调控作用及修复机理。本文的主要研究内容和结论如下:（1）结合溶胶-凝胶法与模板法,制备出成分均匀、粒度整齐单一且分散性良好的新型生物活性玻璃微球,并对其表面形貌、粒径分布等性质进行表征。在此基础上,制备了分散均匀、浓度可控的生物活性玻璃/凡士林复合膏剂;（2）将生物活性玻璃微球与成纤维细胞接触培养,探究生物活性玻璃对成纤维细胞的增殖、迁移、细胞外基质分泌和分化等细胞行为的影响,并揭示其相关调控机制。结果表明:生物活性玻璃不仅可以促进成纤维细胞迁移,还可以抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,并限制成纤维细胞I型胶原和III型胶原的过度分泌。而这种抑制作用可能是通过抑制TGF-β1-Smad2信号通路中TGF-β受体I的表达来实现的;（3）将生物活性玻璃微球与巨噬细胞接触培养,研究其对巨噬细胞的增殖、趋向性迁移、吞噬和表型极化等细胞行为的影响,并揭示不同浓度生物活性玻璃对其调控的机制。结果表明:生物活性玻璃对巨噬细胞行为的调控具有一定的浓度依赖性。低浓度（20μg/mL）时,被摄入的生物活性玻璃能够被巨噬细胞较快降解,并促进巨噬细胞的增殖,加快M1型向M2型的极化过程,NF-κB信号通路可能参与介导生物活性玻璃对巨噬细胞极化的调控;相反,在高浓度（100μg/mL）时,被摄入的生物活性玻璃降解较慢,破坏巨噬细胞细胞器结构的完整性,导致明显的细胞毒性并延长其炎症反应。此外,生物活性玻璃也能够诱导巨噬细胞趋向性迁移,但是与其浓度似乎不存在正相关性;（4）将生物活性玻璃微球/凡士林复合膏剂应用于糖尿病大鼠难愈创面的治疗,通过考察创面的愈合速率、创面新生组织的组成和结构、组织中巨噬细胞的表型极化和相关生长因子的表达情况,探究不同用量的生物活性玻璃对难愈创面修复的调控作用及其机制。实验结果表明:在难愈创面的微环境下,虽然生物活性玻璃的使用会带来一定的炎症反应,但是低浓度的生物活性玻璃可以加快糖尿病创面处巨噬细胞从M1型向M2型极化的进程,而高浓度的生物活性玻璃会导致创面处炎症反应的长期存在,不利于创面的修复;（5）通过对纺丝溶液中聚己内酯、造孔剂和生物活性玻璃微球的含量进行调节,结合静电纺丝技术和相分离技术,制备新型生物活性玻璃微球/聚己内酯多孔纤维膜,并对其表面形貌、亲疏水性和离子释放等性质进行表征。结果表明:提高聚己内酯浓度可以去除纤维中的串珠结构;使用合适浓度的造孔剂可以在纤维表面制备出密集的多孔结构;生物活性玻璃加入量过多会导致纤维形态的改变和表面孔洞结构的消失。最终制备的多孔复合纤维膜的纤维尺寸均一,生物活性玻璃分布均匀,表面多孔结构能更好地吸附蛋白并促进生物活性玻璃的离子释放;（6）通过在生物活性玻璃微球/聚己内酯多孔纤维膜上分别接种巨噬细胞和内皮细胞,探究其对这两种细胞行为的调控作用,并将其应用于糖尿病大鼠难愈创面的治疗,考察多孔纤维膜对难愈创面修复的调控作用及其机制。结果表明:生物活性玻璃微球/聚己内酯多孔纤维膜能促进巨噬细胞的向M2表型极化和HUVECs的增殖及成血管性能;并通过在创面初期为细胞迁移、粘附提供结构上的支持,促进创面再表皮化进程;还可以缩短创面的炎症阶段,并加快修复相关生长因子的分泌和糖尿病大鼠创面处血管的形成,从而加速糖尿病创面的愈合。综上所述,生物活性玻璃微球能够抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,并调控巨噬细胞的极化过程,通过对创面的炎症反应的调控促进难愈创面的愈合。在此基础上将其与生物医用高分子材料结合制备了具生物响应性的新型复合多孔纤维膜,并证明其能够促进糖尿病创面炎症反应的消退和血管的快速生成。本文不仅阐明了生物活性玻璃对创面修复的调控作用,也为皮肤组织再生修复材料的设计提供了新思路和理论依据。
二、荧光分析技术在细胞内Ca~(2+)研究中的应用及钙离子比率荧光测量方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、荧光分析技术在细胞内Ca~(2+)研究中的应用及钙离子比率荧光测量方法（论文提纲范文）
（1）新型功能化荧光探针设计及在汞胁迫下生物活性物种的成像分析研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 汞污染与人类健康 |
| 1.2 环境成像分析技术 |
| 1.3 荧光探针的设计及其应用 |
| 1.3.1 荧光探针简介 |
| 1.3.2 荧光探针的设计机理 |
| 1.3.3 荧光探针的应用 |
| 1.4 本文的研究思路和研究内容 |
| 第2章 三通道荧光探针用于汞中毒模型中超氧阴离子和汞离子的联动检测 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂与材料 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.2.3 探针HCy-Se H的合成 |
| 2.2.4 光谱实验分析 |
| 2.2.5 细胞培养 |
| 2.2.6 激光共聚焦显微镜成像分析 |
| 2.2.7 流式细胞术分析 |
| 2.2.8 透射电镜分析 |
| 2.2.9 蛋白免疫印迹分析 |
| 2.2.10 电感耦合等离子体质谱分析 |
| 2.2.11 活体实验 |
| 2.2.12 病理学实验 |
| 2.2.13 细胞模型的建立 |
| 2.2.14 小鼠模型的建立 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 探针HCy-Se H的设计策略 |
| 2.3.2 探针HCy-Se H对 O_2~(·-)和Hg~(2+)的光谱分析 |
| 2.3.3 探针HCy-Se H对 O_2~(·-)和Hg~(2+)的选择性分析 |
| 2.3.4 探针的光稳定性分析 |
| 2.3.5 探针的细胞兼容性分析 |
| 2.3.6 探针HCy-Se H用于细胞中O_2~(·-)和Hg~(2+)的成像分析 |
| 2.3.7 探针用于小鼠模型中O_2~(·-)和Hg~(2+)的可视化检测 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 基于巯基的近红外比率型荧光探针用于对比性研究急性/长期汞中毒 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂与材料 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.2.3 探针HCy-SH的化学合成 |
| 3.2.4 探针HCy-SH的光谱测试 |
| 3.2.5 细胞培养与成像分析 |
| 3.2.6 流式细胞仪实验 |
| 3.2.7 汞离子含量的测定 |
| 3.2.8 透射电子显微镜分析 |
| 3.2.9 组织学实验 |
| 3.2.10 Western Blot分析 |
| 3.2.11 汞中毒小鼠模型的构建 |
| 3.2.12 活体荧光成像分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 探针HCy-SH的设计与合成 |
| 3.3.2 探针HCy-SH的光谱测试 |
| 3.3.3 探针HCy-SH的选择性测试 |
| 3.3.4 pH对探针的影响 |
| 3.3.5 探针的稳定性分析 |
| 3.3.6 探针HCy-SH的细胞毒性测试 |
| 3.3.7 探针HCy-SH的细胞成像分析 |
| 3.3.8 探针HCy-SH用于急性汞中毒小鼠模型中的成像分析 |
| 3.3.9 探针HCy-SH用于长期汞中毒小鼠模型中的成像分析 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 比率型荧光探针用于汞离子胁迫下多硫化谷胱甘肽的检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂和材料 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.2.3 探针的合成 |
| 4.2.4 光谱分析 |
| 4.2.5 细胞培养 |
| 4.2.6 荧光成像分析 |
| 4.2.7 细胞兼容性测试 |
| 4.2.8 细胞损伤分析 |
| 4.2.9 H&E染色分析 |
| 4.2.10 小鼠模型的构建 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 探针TP-Dise的设计与合成 |
| 4.3.2 探针TP-Dise的吸收光谱分析 |
| 4.3.3 探针TP-Dise的荧光光谱分析 |
| 4.3.4 探针TP-Dise对 GSSH的选择性分析 |
| 4.3.5 探针TP-Dise的反应动力学分析 |
| 4.3.6 探针TP-Dise的细胞毒性分析 |
| 4.3.7 探针TP-Dise用于细胞内GSSH的分析 |
| 4.3.8 探针TP-Dise用于评估GSSH的生物保护作用 |
| 4.3.9 双光子显微镜用于细胞内GSSH的成像分析 |
| 4.3.10 探针TP-Dise用于深层脑组织中的GSSH检测 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 比率型荧光探针用于谷胱甘肽过氧化物酶的成像分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂和材料 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.2.3 探针TP-SS的合成 |
| 5.2.4 探针TP-SS的光谱测试 |
| 5.2.5 细胞培养 |
| 5.2.6 共聚焦荧光成像分析 |
| 5.2.7 流式细胞术分析 |
| 5.2.8 探针TP-SS的细胞毒性分析 |
| 5.2.9 病理学分析 |
| 5.2.10 细胞损伤分析 |
| 5.2.11 Western Blot分析 |
| 5.2.12 衰老小鼠模型的构建 |
| 5.2.13 汞中毒小鼠模型的建立 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 探针TP-SS的设计策略 |
| 5.3.2 探针TP-SS对 Gpx的光谱测试 |
| 5.3.3 探针TP-SS对 Gpx的反应动力学测试 |
| 5.3.4 探针TP-SS对 Gpx的选择性分析 |
| 5.3.5 探针TP-SS的细胞兼容性分析 |
| 5.3.6 体外研究Gpx/GSH氧化还原系统的催化循环机制 |
| 5.3.7 Gpx的抑制实验 |
| 5.3.8 探针TP-SS用于老龄化模型中Gpx/GSH氧化还原循环的研究 |
| 5.3.9 探针TP-SS用于汞中毒模型中Gpx的研究 |
| 5.3.10 双光子显微镜用于Gpx的检测 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 比率型荧光探针用于内源性生物信号分子超氧阴离子的成像分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 实验试剂和材料 |
| 6.2.2 仪器 |
| 6.2.3 探针的合成 |
| 6.2.4 细胞模型的建立 |
| 6.2.5 流式细胞术分析 |
| 6.2.6 小鼠实验 |
| 6.2.7 统计分析 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 探针TP-Tfs的设计与合成 |
| 6.3.2 探针TP-Tfs对 O_2~(·-)的光谱分析 |
| 6.3.3 探针TP-Tfs的反应动力学测试 |
| 6.3.4 探针TP-Tfs对 O_2~(·-)的选择性分析 |
| 6.3.5 探针的细胞毒性分析 |
| 6.3.6 探针TP-Tfs用于细胞内O_2~(·-)的成像分析 |
| 6.3.7 探针TP-Tfs用于汞中毒细胞模型中O_2~(·-)的检测 |
| 6.3.8 探针TP-Tfs用于化疗细胞模型中O_2~(·-)的成像分析 |
| 6.3.9 探针TP-Tfs用于荷瘤鼠模型中O_2~(·-)的检测 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 全文总结与展望 |
| 7.1 全文总结 |
| 7.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）新型分子荧光探针的设计合成及其细胞成像研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 荧光概述 |
| 1.2.1 荧光的产生与发展 |
| 1.2.2 荧光的原理 |
| 1.2.3 分子荧光探针的分类 |
| 1.2.4 分子荧光探针的组成 |
| 1.2.5 分子结构对分子荧光探针的影响 |
| 1.3 荧光探针识别机理 |
| 1.3.1 光诱导电子转移(PET) |
| 1.3.2 分子内电荷转移(ICT) |
| 1.3.3 荧光共振能量转移(FRET) |
| 1.3.4 激发态分子内质子转移(ESIPT) |
| 1.3.5 螺环开-关环(Sproring-Opening and- Closing) |
| 1.4 立题背景和研究内容 |
| 1.4.1 立题背景 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 溶酶体靶向的荧光探针用于E.coli细胞间隔极度酸性的传感和成像研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂和仪器 |
| 2.2.2 荧光探针的合成与表征 |
| 2.2.3 紫外-可见吸收和荧光光谱的测定方法 |
| 2.2.4 细胞毒性试验 |
| 2.2.5 共定位实验方法 |
| 2.2.6 HeLa细胞的培养与荧光成像 |
| 2.2.7 E.coli细胞的培养与荧光成像 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 BTDB的吸收和发射光谱 |
| 2.3.2 BTDB的响应机理 |
| 2.3.3 选择性 |
| 2.3.4 光稳定性和可逆性 |
| 2.3.5 细胞毒性实验 |
| 2.3.6 HeLa细胞和E.coli细胞成像 |
| 2.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 比率型双光子荧光探针对线粒体内半胱氨酸的检测及其生物成像研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 合成路线 |
| 3.2.3 合成步骤 |
| 3.2.4 紫外-可见吸收和荧光光谱的测定方法 |
| 3.2.5 荧光量子产率的计算 |
| 3.2.6 细胞毒性测试方法 |
| 3.2.7 细胞培养及双光子荧光成像 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 探针对半胱氨酸响应的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱 |
| 3.3.2 .探针对其他硫醇的响应 |
| 3.3.3 .pH的影响以及探针的光稳定性 |
| 3.3.4 探针的选择性 |
| 3.3.5 探针的响应机理 |
| 3.3.6 探针的细胞毒性评价 |
| 3.3.7 细胞内半胱氨酸的双光子比率荧光成像 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 两种基于 Rhodol基的近红外荧光探针用于 Cys和次氯酸的测定和传感 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 探针的合成路线 |
| 4.2.3 合成步骤 |
| 4.2.4 紫外-可见吸收和荧光发射光谱的测定方法 |
| 4.2.5 荧光量子产率的计算方法 |
| 4.2.6 细胞毒性测试方法 |
| 4.2.7 细胞培养及细胞成像方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 WR11-14在ROS/RNS存在时的光谱性质 |
| 4.3.2 WR-Cys对 Cys响应的紫外-可见吸收和荧光发射光谱 |
| 4.3.3 WR-Cys的 Cys响应特性、选择性和光稳定性 |
| 4.3.4 WR-Cys的细胞毒性评估和细胞成像 |
| 4.3.5 WR-ClO对次氯酸响应的紫外吸收和荧光发射光谱 |
| 4.3.6 WR-ClO的次氯酸响应特性、光稳定性和选择性 |
| 4.3.7 WR-ClO的细胞毒性评估和细胞成像 |
| 4.4 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（3）Orai1对高NEFA介导的犊牛肝细胞氧化应激和内质网应激的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 奶牛脂肪肝病的研究进展 |
| 1.1.1 奶牛脂肪肝病因学 |
| 1.1.2 奶牛脂肪肝的分类及流行病学 |
| 1.1.3 奶牛脂肪肝病的检测 |
| 1.2 围产期奶牛氧化应激与内质网应激的概述 |
| 1.2.1 围产期奶牛氧化应激概述 |
| 1.2.2 能量负平衡与内质网应激 |
| 1.2.3 氧化应激与内质网应激的关联 |
| 1.3 钙池引发的钙离子进入调控机体氧化应激与内质网应激的研究进展 |
| 1.3.1 内质网中钙离子的作用 |
| 1.3.2 钙离子与线粒体的关系 |
| 1.3.3 钙池引发钙离子的内流 |
| 1.4 试验的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂材料 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 原代犊牛肝细胞的分离与培养 |
| 2.3.1 原代犊牛肝细胞的分离 |
| 2.3.2 原代犊牛肝细胞的培养 |
| 2.3 siRNA的合成 |
| 2.4 NEFA的准备和细胞处理 |
| 2.4.1 NEFA的制备 |
| 2.4.2 肝细胞的分组与处理 |
| 2.5 Western Blotting检测 |
| 2.5.1 总蛋白的提取 |
| 2.5.2 蛋白浓度测定 |
| 2.5.3 蛋白表达的测定 |
| 2.6 Quantitative Real-Time PCR(qRT-PCR)检测 |
| 2.6.1 引物的设计与合成 |
| 2.6.2 总RNA的提取 |
| 2.6.3 反转录 |
| 2.6.4 实时荧光定量PCR |
| 2.7 肝细胞氧化和抗氧化指标检测 |
| 2.8 细胞ROS测定 |
| 2.9 细胞中Ca~(2+)浓度测定 |
| 2.10 免疫荧光分析 |
| 2.11 线粒体钙离子释放检测(mPTP) |
| 2.12 线粒体膜电位检测(JC-1) |
| 2.13 透射电子显微镜观察线粒体形态 |
| 2.14 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 犊牛原代肝细胞中高NEFA介导氧化应激和内质网应激 |
| 3.1.1 犊牛原代肝细胞中高NEFA刺激对氧化应激的影响 |
| 3.1.2 犊牛原代肝细胞中NEFA刺激对内质网应激的影响 |
| 3.1.3 抑制氧化应激可缓解NEFA诱导肝细胞内质网应激 |
| 3.2 犊牛原代肝细胞中高NEFA对胞内Ca~(2+)浓度及Orai1 表达的作用 |
| 3.3 犊牛肝细胞Orai1 调控高NEFA介导的氧化应激和内质网应激 |
| 3.3.1 肝细胞中Orai1对NEFA诱导氧化应激的影响 |
| 3.3.2 肝细胞中Orai1对NEFA诱导线粒体损伤的影响 |
| 3.3.3 肝细胞中Orai1对NEFA诱导内质网应激的影响 |
| 3.3.4 钙离子对线粒体损伤的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 Orai1对NEFA诱导的犊牛肝细胞氧化应激与线粒体损伤的影响 |
| 4.2 Orai1对NEFA诱导的犊牛肝细胞内质网应激的影响 |
| 4.3 Orai1对NEFA诱导犊牛肝细胞氧化应激与内质网应激关系的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）SLO家族在中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）精子发生过程中的表达及功能（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 精子的形成及受精过程 |
| 1.1.1 精子形成过程 |
| 1.1.2 精子的获能 |
| 1.1.3 精子的顶体反应 |
| 1.1.4 中华绒螯蟹精子的成熟过程 |
| 1.2 离子通道的研究进展 |
| 1.2.1 离子通道的功能及分类 |
| 1.2.2 钾离子通道的分类与特性 |
| 1.2.3 SLO家族钾离子通道 |
| 1.3 离子通道在生殖方面的研究进展 |
| 1.3.1 精子成熟和受精过程中离子通道的研究进展 |
| 1.3.2 离子通道与精子激活 |
| 1.3.3 离子通道与精子的趋化性 |
| 1.3.4 精子离子通道与顶体反应 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 SLO蛋白在中华绒螯蟹生殖系统的定位 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 仪器与试剂 |
| 2.3.1 仪器 |
| 2.3.2 试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 免疫印迹 |
| 2.4.2 免疫组组织化学技术 |
| 2.4.3 免疫荧光技术 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 SLO1 蛋白在生精细胞内的定位 |
| 2.5.2 SLO2 蛋白在生精细胞的定位 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 中华绒螯蟹SLO基因的生物信息学分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 仪器和试剂 |
| 3.3.1 仪器 |
| 3.3.2 试剂 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 RNA提取 |
| 3.4.2 RT-PCR |
| 3.4.3 引物设计 |
| 3.4.4 PCR扩增 |
| 3.4.5 目的片段的连接、转化及测序 |
| 3.4.6 slo基因的生物信息学分析 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 中华绒螯蟹slo1 扩增结果 |
| 3.5.2 中华绒螯蟹slo1 基因测序结果 |
| 3.5.3 中华绒螯蟹slo2.2 基因测序 |
| 3.6 讨论 |
| 第四章 中华绒螯蟹生精细胞SLO家族钾电流的检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 仪器和试剂 |
| 4.3.1 仪器 |
| 4.3.2 试剂 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 生精细胞的提取 |
| 4.4.2 全细胞外向钾电流的记录 |
| 4.4.3 数据统计分析 |
| 4.5 结果与分析 |
| 4.5.1 不同物种生精细胞全细胞钾电流鉴定 |
| 4.5.2 SLO1 介导的外向钾电流的鉴定与特性分析 |
| 4.5.3 生精细胞BK电流的分布 |
| 4.5.4 SLO2.2 介导的外向钾电流的鉴定与特性分析 |
| 4.6 讨论 |
| 第五章 SLO家族钾通道对中华绒螯蟹精子顶体反应的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 仪器和试剂 |
| 5.3.1 仪器 |
| 5.3.2 试剂 |
| 5.4 实验方法 |
| 5.4.1 中华绒螯蟹精子获取 |
| 5.4.2 精子密度测定 |
| 5.4.3 精子成活率测定 |
| 5.4.4 顶体诱导率的分组设计 |
| 5.4.5 精子在不同试剂下的顶体反应 |
| 5.5 结果与分析 |
| 5.5.1 精子成活率的统计 |
| 5.5.2 不同实验组的顶体诱导率 |
| 5.5.3 各时期占总顶体诱导率的百分比 |
| 5.6 讨论 |
| 5.6.1 SLO家族通道对精子顶体反应的影响 |
| 第六章 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间取得的研究成果 |
（5）Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 颗粒细胞和卵母细胞在哺乳动物卵泡闭锁和激素分泌中的作用 |
| 1.1.1 哺乳动物卵巢的基本结构和功能 |
| 1.1.2 卵泡发育的基本过程 |
| 1.1.3 卵泡发育的调控途径 |
| 1.1.4 颗粒细胞在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.5 卵母细胞的发育以及在卵泡发育中的作用 |
| 1.1.6 颗粒细胞与卵母细胞的互作 |
| 1.2 Wnt-Ca~(2+)信号通路对卵泡发育的影响 |
| 1.2.1 Wnt通路概述以及Wnt-Ca~(2+)通路的组成 |
| 1.2.2 Wnt-Ca~(2+)通路在哺乳动物生理病理活动中的调节作用 |
| 1.2.3 Wnt-Ca~(2+)与Wnt典型通路的互作 |
| 1.2.4 Wnt-Ca~(2+)与其它信号通路的关系 |
| 1.3 研究目的和意义 |
| 第二章 Wnt/PLC/Ca~(2+)信号变化对猪颗粒细胞活力和卵母细胞成熟的调控 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要试验仪器 |
| 2.2.3 试验动物来源 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 猪卵巢的采集 |
| 2.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 2.3.3 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.3.4 CCK8法测定颗粒细胞活力 |
| 2.3.5 卵母细胞成熟的判定 |
| 2.3.6 孤雌激活和早期胚胎培养 |
| 2.3.7 早期胚胎发育的评定 |
| 2.3.8 统计学数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 猪颗粒细胞的鉴定 |
| 2.4.2 不同浓度IWP-2对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.3 不同浓度抑制剂U73122对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.4 不同浓度激活剂m-3M3FBS对颗粒细胞活力的影响 |
| 2.4.5 不同浓度IWP-2对猪卵母细胞第一极体排出率的影响 |
| 2.4.6 不同浓度抑制剂U73122 或激活剂m-3M3FBS对卵母细胞成熟的影响. |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 IWP-2对Wnt/PLC/Ca~(2+)通路的抑制、对凋亡的促进及其对颗粒细胞激素的调控 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要试验仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 猪卵巢的采集以及猪颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 3.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度的测定 |
| 3.3.3 猪颗粒细胞RNA提取和反转录 |
| 3.3.4 实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因和激素调控基因的表达水平 |
| 3.3.5 Western Blot法检测凋亡相关蛋白和PLC四种亚基蛋白表达水平 |
| 3.3.6 统计学数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞中Ca~(2+)浓度的影响 |
| 3.4.2 IWP-2对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的影响 |
| 3.4.3 IWP-2对颗粒细胞雌二醇和孕酮调控基因的影响 |
| 3.4.4 IWP-2 对猪颗粒细胞和卵母细胞PLC四种亚基基因和蛋白表达的影响. |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 PLC蛋白对猪卵泡发育过程中细胞凋亡、激素分泌和Wnt/Ca~(2+)信号通路的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要试验仪器 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 4.3.2 颗粒细胞和卵母细胞的总RNA提取和反转录 |
| 4.3.3 实时荧光定量PCR检测凋亡、激素和Wnt/Ca~(2+)通路若干基因的表达 |
| 4.3.4 Western Blot法检测凋亡和Wnt/Ca~(2+)通路相关蛋白的表达 |
| 4.3.5 Annexin V-FITC法检测猪颗粒细胞凋亡 |
| 4.3.6 酶联免疫法(ELISA法)测定猪雌二醇和孕酮的含量 |
| 4.3.7 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度测定 |
| 4.3.8 统计学数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞凋亡的调控 |
| 4.4.2 PLC蛋白对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌的调控 |
| 4.4.3 PLC蛋白对猪颗粒细胞和卵母细胞Wnt/Ca~(2+)信号中PLC四个亚基、Ca~(2+)浓度、三个钙离子敏感蛋白和若干下游基因的调控 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 IWP-2与U73122或m-3M3FBS互作对猪卵泡Ca~(2+)的调节以及对颗粒细胞凋亡和激素的调节作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要试验仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞和卵母细胞的培养 |
| 5.3.2 猪颗粒细胞和卵母细胞钙离子浓度检测 |
| 5.3.3 颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 5.3.4 实时荧光定量PCR检测颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 5.3.5 统计学数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对猪颗粒细胞和卵母细胞Ca~(2+)浓度的影响 |
| 5.4.2 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞凋亡调控基因的影响 |
| 5.4.3 IWP-2与U73122或m-3M3FBS相互作用对颗粒细胞激素调控基因的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 Enzastaurin或 Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞激素和凋亡的调节作用 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要试验仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 猪卵巢的采集以及颗粒细胞的培养 |
| 6.3.2 猪颗粒细胞总RNA提取和反转录 |
| 6.3.3 实时荧光定量PCR检测猪颗粒细胞凋亡和激素调控基因相对表达 |
| 6.3.4 Western Blot法检测猪颗粒细胞PKC蛋白表达的影响 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 Enzastaurin对猪颗粒细胞活力的影响 |
| 6.4.2 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞凋亡相关基因和蛋白表达的影响 |
| 6.4.3 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对猪颗粒细胞雌二醇和孕酮激素相关基因表达的影响 |
| 6.4.4 Enzastaurin以及Enzastaurin与 U73122 互作对PKCβ蛋白表达的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与创新点 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 下一步研究工作 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）氯离子和溴离子荧光探针及纳米载体的合成与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 阴离子荧光探针研究进展 |
| 1.2.1 氯离子荧光探针 |
| 1.2.2 溴离子/次溴酸荧光探针 |
| 1.2.3 氯离子和溴离子荧光探针发展展望 |
| 1.3 阴离子跨膜转运研究现状 |
| 1.3.1 小分子阴离子载体研究进展 |
| 1.3.2 离子通道研究进展 |
| 1.3.3 阴离子跨膜运输发展展望 |
| 1.4 纳米载体运载离子的研究进展 |
| 1.5 论文设计思路 |
| 参考文献 |
| 第二章 氯离子荧光探针的合成与应用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 相关化合物的合成 |
| 2.2.3 相对荧光量子产率(Φ)和双光子截面(TPACS)的测定 |
| 2.2.4 检测样品的制备 |
| 2.2.5 实际样品中氯离子浓度的测定 |
| 2.2.6 国标测定方法(GB11896-89)测定Cl~-含量 |
| 2.2.7 细胞毒性实验及细胞成像实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 化合物的合成表征 |
| 2.3.2 对合成探针的光谱性质进行考察 |
| 2.3.3 响应机理的考察 |
| 2.3.4 优化测试体系 |
| 2.3.5 选择性和抗干扰性的考察 |
| 2.3.6 荧光定量能力考查 |
| 2.3.7 M2和MY的细胞成像 |
| 2.3.8 实际水样和生物样品中Cl~-浓度的测定 |
| 2.4 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三章 溶酶体靶向的双光子荧光探针检测体内外的次溴酸 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 合成荧光探针NA-lyso |
| 3.2.3 合成HOBr和-OBr |
| 3.2.4 相对荧光量子产率(Φ)和双光子截面(TPACS)的测定 |
| 3.2.5 测定光谱样品的制备 |
| 3.2.6 细胞毒性和细胞成像试验 |
| 3.2.7 活体成像试验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 探针NA-lyso的合成表征 |
| 3.3.2 NA-lyso的光谱性质 |
| 3.3.3 响应机理的考察 |
| 3.3.4 优化测试条件 |
| 3.3.5 选择性和抗干扰性实验 |
| 3.3.6 HOBr的定量检测 |
| 3.3.7 细胞成像实验 |
| 3.3.8 HOBr的活体成像 |
| 3.4 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第四章 基于poly(D,L-lactic-co-glycolic acid)的纳米载体运输Cl~-和Na~+ |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 SPN@PDA和相关纳米材料的合成 |
| 4.2.3 材料的表征实验 |
| 4.2.4 上载量和释放速率的测定 |
| 4.2.5 MTT实验 |
| 4.2.6 确定离子的细胞内释放实验 |
| 4.2.7 细胞凋亡实验 |
| 4.2.8 验证凋亡机理相关实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 材料的表征 |
| 4.3.2 材料的体外释放 |
| 4.3.3 SPN@PDA的细胞内释放 |
| 4.3.4 SPN@ PDA对细胞存活率的影响 |
| 4.3.5 SPN@PDA对细胞凋亡的研究 |
| 4.3.6 验证凋亡机理 |
| 4.4 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第五章 pH靶向的氯离子纳米载体与光热疗法联用在细胞凋亡和癌症治疗中的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂和仪器 |
| 5.2.2 合成Vitamin E-O(EG2-Glu) (VEOEG) |
| 5.2.3 材料的体外表征 |
| 5.2.4 SNPZ 的细胞实验 |
| 5.2.5 活体实验 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 材料的表征 |
| 5.3.2 材料的体外性能考察 |
| 5.3.3 细胞摄取、毒性及释放实验 |
| 5.3.4 SNPZ诱导细胞凋亡 |
| 5.3.5 凋亡机理的考察 |
| 5.3.6 活体实验 |
| 5.4 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）抑郁症相关活性分子的细胞及活体内荧光成像分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 检测酶的小分子荧光探针的研究进展 |
| 1.3 检测活性氧(ROS)的小分子荧光探针的研究进展 |
| 1.3.1 检测·OH的小分子荧光探针 |
| 1.3.2 检测O_2~(·-)的小分子荧光探针 |
| 1.3.3 检测其他ROS的小分子荧光探针 |
| 1.4 检测金属离子的小分子荧光探针研究进展 |
| 1.4.1 检测Zn~(2+)的小分子荧光探针 |
| 1.4.2 检测Ca~(2+)的小分子荧光探针 |
| 1.4.3 检测Cu~+的小分子荧光探针 |
| 1.5 论文选题的目的和意义 |
| 第二章 双光子荧光成像分析抑郁模型小鼠脑内乙酰胆碱酯酶的活性变化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 仪器和试剂 |
| 2.2.2 探针的设计 |
| 2.2.3 探针的合成与表征 |
| 2.2.4 细胞培养 |
| 2.2.5 蛋白质印迹 |
| 2.2.6 流式细胞分析 |
| 2.2.7 抑郁小鼠模型的构建和培养 |
| 2.2.8 小鼠抑郁行为测试 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 探针MCYN的理论计算 |
| 2.3.2 探针MCYN在化学体系中的荧光分析 |
| 2.3.3 活细胞中乙酰胆碱酯酶的荧光成像分析 |
| 2.3.4 小鼠大脑中乙酰胆碱酯酶的荧光成像 |
| 2.4 结论 |
| 第三章 双光子荧光成像分析抑郁模型小鼠脑内·OH的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 仪器和试剂 |
| 3.2.2 探针的设计 |
| 3.2.3 探针的合成与表征 |
| 3.2.4 细胞培养 |
| 3.2.5 抑郁小鼠模型的构建和培养 |
| 3.2.6 小鼠抑郁行为测试 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 探针MD-B的理论计算 |
| 3.3.2 探针MD-B在化学体系中的荧光分析 |
| 3.3.3 活细胞中·OH的荧光成像 |
| 3.3.4 小鼠大脑中·OH的原位荧光成像 |
| 3.3.5 讨论 |
| 3.4 结论 |
| 第四章 双光子荧光同时成像分析抑郁小鼠脑内O_2~(·-)和Zn~(2+)变化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 仪器和试剂 |
| 4.2.2 探针的设计 |
| 4.2.3 探针的合成与表征 |
| 4.2.4 细胞培养 |
| 4.2.5 抑郁小鼠模型的构建和培养 |
| 4.2.6 小鼠抑郁行为测试 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 探针TCN在化学体系中的荧光分析 |
| 4.3.2 探针TCN在活细胞中荧光成像 |
| 4.3.3 探针TCN在小鼠大脑中荧光成像 |
| 4.3.4 O_2·-调控Zn~(2+)释放的初步探究 |
| 4.3.5 下一步工作计划 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 双光子荧光成像分析抑郁模型小鼠脑内线粒体中·OH的浓度变化 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 仪器和试剂 |
| 5.2.2 探针的设计 |
| 5.2.3 探针的合成与表征 |
| 5.2.4 细胞培养 |
| 5.2.5 抑郁小鼠模型的构建和培养 |
| 5.2.6 小鼠抑郁行为测试 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 探针Mito-P在化学体系中的荧光分析 |
| 5.3.2 探针Mito-P在活细胞中荧光成像 |
| 5.3.3 探针Mito-P在小鼠大脑中荧光成像 |
| 5.3.4 下一步工作计划 |
| 5.4 结论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 相关化合物的表征谱图 |
| 附录二 博士期间所获科研成果及参与课题 |
| 致谢 |
（8）基于功能核酸的荧光探针用于细胞的金属离子及RNA成像研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 荧光分析技术在生物分析中的应用 |
| 1.1.1 荧光光谱分析技术 |
| 1.1.2 激光共聚焦扫描显微成像技术 |
| 1.1.3 流式细胞术 |
| 1.2 功能核酸及其应用 |
| 1.2.1 核酸适配体 |
| 1.2.2 脱氧核酶 |
| 1.2.3 分子信标 |
| 1.3 功能核酸在细胞成像中的应用 |
| 1.3.1 金属离子成像 |
| 1.3.2 RNA分子成像 |
| 1.4 本研究论文的构想 |
| 第2章 基于功能核酸的细胞膜表面荧光探针用于细胞微环境中钾离子的监测 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂与仪器 |
| 2.2.2 荧光分析 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 流式细胞术和CLSM成像分析 |
| 2.2.5 探针的合成 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 探针的构建及工作原理 |
| 2.3.2 探针的表征与优化 |
| 2.3.3 细胞微环境监测 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 基于脱氧核酶的基因编码传感器用于活细胞金属离子的比率型成像 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 凝胶电泳实验 |
| 3.2.3 剪切位点预测 |
| 3.2.4 细胞培养及转染 |
| 3.2.5 细胞内Mg~(2+)成像 |
| 3.2.6 定位细胞内的脱氧核酶 |
| 3.2.7 流式细胞仪检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 探针的设计原理 |
| 3.3.2 探针的性能考察 |
| 3.3.3 细胞内离子成像 |
| 3.3.4 流式细胞术分析 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 基于HCR信号放大的荧光探针用于癌细胞mRNA识别及光动力学治疗 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与仪器 |
| 4.2.2 纳米探针的制备 |
| 4.2.3 凝胶电泳实验 |
| 4.2.4 荧光检测 |
| 4.2.5 原子力显微镜成像 |
| 4.2.6 细胞培养 |
| 4.2.7 激光共聚焦扫描显微成像分析 |
| 4.2.8 流式细胞术 |
| 4.2.9 光毒性研究 |
| 4.2.10 光敏剂与DNA的偶联 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 探针的设计原理 |
| 4.3.2 纳米探针的表征 |
| 4.3.3 纳米探针的性能及优化 |
| 4.3.4 纳米探针用于癌细胞识别 |
| 4.3.5 纳米探针用于癌细胞治疗 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 基于生物矿化的核酸酶可控释放用于细胞内MicroRNA检测 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂与仪器 |
| 5.2.2 纳米探针的制备 |
| 5.2.3 凝胶电泳实验 |
| 5.2.4 荧光检测 |
| 5.2.5 Exo III活性优化 |
| 5.2.6 探针响应测试 |
| 5.2.7 纳米探针的酸响应性质 |
| 5.2.8 纳米材料对Exo III及 DNA的装载效率 |
| 5.2.9 纳米材料对DNA的保护作用 |
| 5.2.10 细胞培养 |
| 5.2.11 激光共聚焦扫描显微成像分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 探针的设计原理 |
| 5.3.2 纳米探针的表征 |
| 5.3.3 纳米探针的性能 |
| 5.3.4 DNA探针的优化 |
| 5.3.5 DNA探针的响应性能 |
| 5.3.6 荧光共聚焦扫描成像 |
| 5.3.7 EMOF-DNA的细胞毒性 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
（9）氧化应激下神经元的荧光成像与实时传感（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 氧化应激 |
| 1.1.1 氧化应激简介 |
| 1.1.2 氧化应激与脑的关系 |
| 1.2 氧化应激相关小分子及分析方法 |
| 1.2.1 Fe~(2+)检测意义及分析方法 |
| 1.2.2 Ca~(2+)检测意义及分析方法 |
| 1.2.3 pH检测意义及分析方法 |
| 1.3 纳米材料在荧光成像与生物传感方面的应用 |
| 1.3.1 金属纳米簇在荧光成像和生物传感方面的应用 |
| 1.3.2 碳量子点在生物传感和生物成像方面的应用 |
| 1.3.3 框架核酸在生物传感方面的应用 |
| 1.4 本文的研究目的、内容及创新点 |
| 1.4.1 研究目的 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 研究创新点 |
| 第二章 基于功能化金纳米簇的神经元内Fe~(2+)荧光成像与生物传感 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与材料 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 Fe~(2+)配体分子(FeL)合成 |
| 2.2.4 金纳米簇(AuNCs)的合成与纯化 |
| 2.2.5 AuNC@FeL@Cy7 比率荧光探针构建 |
| 2.2.6 Mg_2Si纳米颗粒合成 |
| 2.2.7 原代神经元培养及HepG2 细胞培养 |
| 2.2.8 细胞毒性及细胞凋亡分析 |
| 2.2.9 细胞成像实验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 Fe~(2+)配体分子(FeL)的合成与表征 |
| 2.3.2 AuNC@FeL@Cy7 荧光探针的合成与表征 |
| 2.3.3 AuNC@FeL@Cy7 荧光探针对Fe~(2+)响应性能评估 |
| 2.3.4 AuNC@FeL@Cy7 荧光探针对Fe~(2+)响应机理研究 |
| 2.3.5 AuNC@FeL@Cy7 荧光探针用于细胞外源性Fe~(2+)成像研究 |
| 2.3.6 缺血下神经元内Fe~(2+)荧光成像荧光与生物传感 |
| 2.3.7 缺氧诱导的HepG2 细胞内Fe~(2+)浓度变化成像研究 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于铜纳米簇探针的神经元Ca~(2+)实时成像与生物传感 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与材料 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.2.3 铜纳米簇模板分子(PEI-CaL)合成 |
| 3.2.4 铜纳米簇(CuNCs)合成与纯化 |
| 3.2.5 CuNC@AF660 比率荧光探针构建 |
| 3.2.6 CuNCs和 CuNC@AF660 比率荧光探针浓度计算 |
| 3.2.7 原代神经元细胞培养 |
| 3.2.8 细胞毒性及细胞凋亡分析 |
| 3.2.9 细胞成像实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 铜纳米簇模板分子(PEI-CaL)合成与表征 |
| 3.3.2 铜纳米簇(CuNCs)表征 |
| 3.3.3 CuNC@AF660 荧光探针表征 |
| 3.3.4 CuNC@AF660 荧光探针对Ca~(2+)响应性能评估 |
| 3.3.5 CuNC@AF660 荧光探针对Ca~(2+)响应机理研究 |
| 3.3.6 CuNC@AF660 荧光探针用于神经元Ca~(2+)成像研究 |
| 3.3.7 组胺刺激神经元Ca~(2+)实时成像与生物传感 |
| 3.3.8 超氧阴离子(O_2~-)刺激神经元Ca~(2+)实时成像与生物传感 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 功能化碳量子点的制备及其发光机制研究 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 试剂与材料 |
| 4.2.2 仪器与设备 |
| 4.2.3 碳量子点及功能化碳量子点合成与纯化 |
| 4.2.4 碳量子点及功能碳量子点浓度计算 |
| 4.2.5 光谱测量和荧光寿命测量 |
| 4.2.6 动态光散射实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 碳量子点及功能化碳量子点的合成与表征 |
| 4.3.2 给(吸)电子效应对碳量子点荧光性能影响 |
| 4.3.3 共轭效应对碳量子点荧光性能影响 |
| 4.3.4 亲(疏)水效应对碳量子点荧光性能影响 |
| 4.3.5 功能化碳量子点发光机制探讨 |
| 4.3.6 碳量子点表面功能化的潜在应用研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 框架核酸纳米探针用于神经元线粒体内pH和Ca~(2+)实时成像及定量研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 基于碳量子点的钙离子探针(CD@CaL)合成 |
| 5.2.4 DNA复合纳米探针的构建 |
| 5.2.5 原代神经元培养及He La细胞培养 |
| 5.2.6 细胞毒性及细胞凋亡分析 |
| 5.2.7 线粒体和细胞质组分的分离与纯化 |
| 5.2.8 荧光免疫印迹分析 |
| 5.2.9 细胞成像实验 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 钙离子探针(CD@CaL)的表征 |
| 5.3.2 DNA复合纳米探针的表征 |
| 5.3.3 DNA复合纳米探针的性能评估 |
| 5.3.4 DNA复合纳米探针对pH和 Ca~(2+)响应机理研究 |
| 5.3.5 DNA复合纳米探针稳定性研究 |
| 5.3.6 DNA复合纳米探针线粒体和细胞质靶向研究 |
| 5.3.7 DNA复合纳米探针用于神经元细胞外源性Ca~(2+)成像研究 |
| 5.3.8 DNA复合纳米探针用于神经元细胞外源性pH成像研究 |
| 5.3.9 O_2~-刺激下神经元细胞内pH和 Ca~(2+)实时成像研究 |
| 5.3.10 Aβ蛋白聚集体刺激下神经元细胞内pH和 Ca~(2+)成像研究 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（10）新型生物活性玻璃微球及其复合材料的皮肤创面修复机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 皮肤的主要结构和功能 |
| 1.3 皮肤组织损伤与修复 |
| 1.3.1 创面修复的生理过程 |
| 1.3.2 皮肤创面修复面对的挑战 |
| 1.3.3 成纤维细胞在创面修复中的作用 |
| 1.3.4 巨噬细胞在创面修复中的作用 |
| 1.3.5 内皮细胞在创面修复中的作用 |
| 1.4 生物活性玻璃在皮肤创面修复中的研究 |
| 1.4.1 熔融法生物活性玻璃 |
| 1.4.2 溶胶-凝胶生物活性玻璃 |
| 1.4.3 形貌规则的溶胶-凝胶生物活性玻璃微球 |
| 1.4.4 生物活性玻璃在皮肤创面修复方面的研究进展 |
| 1.5 创面敷料 |
| 1.5.1 创面敷料的要求及特点 |
| 1.5.2 人造敷料 |
| 1.5.3 静电纺丝技术及其在皮肤敷料制备中的应用 |
| 1.6 本课题的设计与创新 |
| 1.6.1 研究的目的与意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 本课题的主要技术路线 |
| 1.6.4 本课题的主要创新之处 |
| 第二章 生物活性玻璃微球对成纤维细胞行为的调控 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验与方法 |
| 2.2.1 主要试剂、耗材及仪器设备 |
| 2.2.2 生物活性玻璃微球的制备和表征 |
| 2.2.3 成纤维细胞的培养及接种 |
| 2.2.4 生物活性玻璃微球对成纤维细胞骨架的影响 |
| 2.2.5 生物活性玻璃微球对成纤维细胞活性的影响 |
| 2.2.6 生物活性玻璃微球对成纤维细胞迁移能力的影响 |
| 2.2.7 免疫荧光分析肌成纤维细胞分化程度 |
| 2.2.8 流式细胞术分析 |
| 2.2.9 实时定量PCR(q RT-PCR)技术检测成纤维细胞相关基因的表达 |
| 2.2.10 蛋白印迹法(Western blot)检测相关信号通路蛋白的表达 |
| 2.2.11 数据分析 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 生物活性玻璃微球的表征 |
| 2.3.2 生物活性玻璃微球对成纤维细胞骨架的影响 |
| 2.3.3 生物活性玻璃微球对成纤维细胞增殖的影响 |
| 2.3.4 生物活性玻璃微球促进成纤维细胞迁移 |
| 2.3.5 生物活性玻璃微球对成纤维细胞ECM相关基因表达的影响 |
| 2.3.6 生物活性玻璃微球抑制成纤维细胞向肌纤维细胞分化 |
| 2.3.7 生物活性玻璃微球调控TGF-β信号通路 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 生物活性玻璃微球对巨噬细胞行为的调控 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验与方法 |
| 3.2.1 主要试剂、耗材及仪器设备 |
| 3.2.2 生物活性玻璃微球的制备和表征 |
| 3.2.3 巨噬细胞的培养及接种 |
| 3.2.4 细胞增殖和细胞活性检测 |
| 3.2.5 细胞趋向性迁移实验(Transwell) |
| 3.2.6 生物活性玻璃胞内定位(免疫荧光染色) |
| 3.2.7 生物活性玻璃胞内定位(TEM) |
| 3.2.8 生物活性玻璃胞内降解情况 |
| 3.2.9 实时定量PCR(qRT-PCR)技术检测巨噬细胞极化相关基因的表达 |
| 3.2.10 流式细胞术分析巨噬细胞极化情况 |
| 3.2.11 免疫荧光分析巨噬细胞极化机理 |
| 3.2.12 数据分析 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 生物活性玻璃微球的表征 |
| 3.3.2 生物活性玻璃微球对巨噬细胞增殖活性的影响 |
| 3.3.3 生物活性玻璃微球对巨噬细胞形态的影响 |
| 3.3.4 生物活性玻璃微球促进巨噬细胞的迁移 |
| 3.3.5 生物活性玻璃微球在巨噬细胞内的定位和降解 |
| 3.3.6 生物活性玻璃微球对巨噬细胞极化的调控作用 |
| 3.3.7 生物活性玻璃微球对极化相关关键性蛋白NF-κB的调控作用 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 生物活性玻璃微球复合膏剂对糖尿病大鼠难愈创面的修复性能研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验与方法 |
| 4.2.1 主要试剂、耗材及仪器设备 |
| 4.2.2 生物活性玻璃微球/凡士林复合膏剂的制备 |
| 4.2.3 I型糖尿病大鼠模型的诱导 |
| 4.2.4 创面的制作处理和动物实验分组 |
| 4.2.5 创面愈合情况评价 |
| 4.2.6 糖尿病创面的组织病理学分析 |
| 4.2.7 糖尿病创面的免疫组化分析 |
| 4.2.8 数据分析 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 糖尿病大鼠创面修复过程的大体观察 |
| 4.3.2 糖尿病大鼠创面的修复速率 |
| 4.3.3 创面组织病理学分析 |
| 4.3.4 创面组织免疫组化分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 生物活性玻璃微球/聚己内酯多孔纤维膜的制备及研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要试剂、耗材及仪器设备 |
| 5.2.2 静电纺丝溶液的配制 |
| 5.2.3 静电纺丝纤维膜的制备 |
| 5.2.4 静电纺丝纤维膜表面纤连蛋白的涂覆 |
| 5.2.5 静电纺丝纤维膜表面形貌的表征 |
| 5.2.6 静电纺丝纤维膜表面润湿性能的表征 |
| 5.2.7 多孔纤维膜离子溶出情况的表征 |
| 5.2.8 多孔纤维膜EDS表征 |
| 5.2.9 数据分析 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 聚己内酯(PCL)浓度对纤维形貌的影响 |
| 5.3.2 造孔剂(DMSO)的浓度对纤维形貌的影响 |
| 5.3.3 生物活性玻璃含量对纤维形貌的影响 |
| 5.3.4 纤维膜的形貌与尺寸 |
| 5.3.5 纤维膜表面的润湿性 |
| 5.3.6 纤维膜表面的离子释放情况 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 生物活性玻璃微球/聚己内酯多孔纤维膜在糖尿病创面修复中的研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要试剂、耗材及仪器设备 |
| 6.2.2 纤维膜的分组制备和灭菌 |
| 6.2.3 细胞的培养及接种 |
| 6.2.4 细胞增殖活性检测 |
| 6.2.5 实时定量PCR(qRT-PCR)技术检测巨噬细胞极化相关基因和成血管相关基因的表达 |
| 6.2.6 流式细胞术分析巨噬细胞极化情况 |
| 6.2.7 免疫荧光分析多孔纤维膜对HUVECs成血管情况的影响 |
| 6.2.8 Ⅰ型糖尿病大鼠模型的诱导 |
| 6.2.9 创面的制作处理和动物实验分组 |
| 6.2.10 创面愈合情况评价 |
| 6.2.11 糖尿病创面的组织病理学分析 |
| 6.2.12 糖尿病创面的免疫组化分析 |
| 6.2.13 数据分析 |
| 6.3 实验结果与讨论 |
| 6.3.1 纤维膜对巨噬细胞行为的调控 |
| 6.3.2 纤维膜对HUVECs细胞行为的影响 |
| 6.3.3 纤维膜对糖尿病创面愈合速率的影响 |
| 6.3.4 糖尿病创面组织学观察 |
| 6.3.5 糖尿病创面免疫组化分析 |
| 6.3.6 糖尿病创面血管再生情况 |
| 6.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
四、荧光分析技术在细胞内Ca~(2+)研究中的应用及钙离子比率荧光测量方法（论文参考文献）
- [1]新型功能化荧光探针设计及在汞胁迫下生物活性物种的成像分析研究[D]. 王悦. 中国科学院大学(中国科学院烟台海岸带研究所), 2021(01)
- [2]新型分子荧光探针的设计合成及其细胞成像研究[D]. 张雯佳. 山西大学, 2021
- [3]Orai1对高NEFA介导的犊牛肝细胞氧化应激和内质网应激的调控作用[D]. 李铭. 黑龙江八一农垦大学, 2020(09)
- [4]SLO家族在中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）精子发生过程中的表达及功能[D]. 张伟伟. 河北大学, 2020(08)
- [5]Wnt/PLC/Ca2+通路对猪卵泡颗粒细胞和卵母细胞凋亡及颗粒细胞激素分泌的影响机制[D]. 陈华丽. 西北农林科技大学, 2020
- [6]氯离子和溴离子荧光探针及纳米载体的合成与应用[D]. 马忱. 兰州大学, 2020(01)
- [7]抑郁症相关活性分子的细胞及活体内荧光成像分析[D]. 王昕. 山东师范大学, 2020(08)
- [8]基于功能核酸的荧光探针用于细胞的金属离子及RNA成像研究[D]. 熊梦仪. 湖南大学, 2019(07)
- [9]氧化应激下神经元的荧光成像与实时传感[D]. 刘智超. 华东师范大学, 2019(09)
- [10]新型生物活性玻璃微球及其复合材料的皮肤创面修复机制研究[D]. 谢委翰. 华南理工大学, 2019(01)
标签：汞中毒论文; 荧光探针论文; 荧光共振能量转移论文; 荧光蛋白论文; 基因合成论文;