一、骨髓间充质干细胞来源类肝细胞的功能和超微结构评估（论文文献综述）
宋晓静[1]（2021）在《hucMSCs来源的外泌体促进大鼠肝切除术后肝再生的机制研究》文中进行了进一步梳理研究目的肝脏具有强的再生能力,但由于受年龄、肝硬化、性别、肝纤维化、病毒性肝炎、肝脏脂肪变性及术中缺血再灌注损伤等一系列因素的影响,肝切除术后围手术期肝脏的再生能力受到极大程度的挑战,严重制约了肝脏外科手术的安全性。随着基础及临床转化研究的进展,干细胞、干细胞来源的外泌体及其传输的各种非编码RNA在再生医学领域表现出惊人的潜力,逐渐受到广大学者的关注。本研究在前期研究的基础上,成功实现了人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs）的分离培养,并提取外泌体;经鉴定成功后,用以干预SD大鼠70%肝切除模型及肝脏缺血再灌注损伤模型,验证hucMSCs来源的外泌体促进大鼠部分肝切除术后的肝再生、减轻肝脏缺血再灌注损伤的能力;之后,利用大鼠BRL-3A细胞系结合模型动物在体内、体外通过细胞分子生物学技术阐释hucMSCs来源的外泌体miR-124促进肝细胞再生的分子机制。本研究拟利用miRNA芯片技术探索相关的功能性miRNA表达谱,进行验证,预测并筛选出下游靶蛋白,分析micro RNA表达调控对肝再生的影响,并进行机制研究,为临床肝切除术后的治疗的防治提供科学依据,并试图找出提示肝再生的关键因子,为临床治疗提供指导意见。研究方法本研究以hucMSCs为研究对象,首先在新鲜脐带组织中利用组织块培养法分离并培养出hucMSCs。采用电镜观察、流式细胞技术鉴定成功后,更换无血清低葡萄糖的LG-DMEM培养基提取细胞培养液,采用超速离心法提取外泌体,通过TEM、NAT系统进行外泌体形态学表征及粒径分析,并利用Western Blot检测外泌体表面CD63、CD9等表面标记蛋白。分别用70%大鼠肝切除模型及大鼠缺血再灌注损伤模型在体内验证hucMSCs来源的外泌体促进部分肝切除术后肝再生、减轻肝脏缺血再灌注损伤的作用。利用Target Scan、DIANA及miRDB等多种在线工具开展生物信息学靶基因的相关预测,预测miR-124的主要潜在靶点,通过大量的反复对比和验证,依靠预测结果来推测实验目标的内在原因,最后结合模型动物及大鼠BRL-3A细胞系,利用q PCR、Western Blot等方法判断预测准确性。揭示hucMSCs来源的外泌体miRNA调控肝再生的作用机制,分析靶miRNA的下游信号通路及潜在的相互作用网络,为临床扩大肝切除及活体肝移植提供科学的借鉴。研究结果1、镜下观察提取、培养得到的hucMSCs细胞呈梭形,纺锤状,细胞形态均匀。流式细胞技术对靶细胞进行定量分析和分选,显示CD73-FITC（99.49%）和CD105-PE（99.88%）呈现阳性表达;HLA-DR-PE和CD45-FITC表达呈现阴性,各自对应于0.26%和0.38%的表达率。2、超速离心所提取的hucMSCs来源的外泌体超微结构分析显示,主要为椭圆或者是圆形的外部特征,且尺寸不一,膜结构较为完整,其中还存在着一定量的低密度物质;纳米粒子跟踪分析系统显示其粒径大小分布在48-150nm之间;通过筛选外泌体相关的标志性蛋白CD9、CD63,证实了获取的hucMSCs来源的外泌体结果稳定、可靠。3、hucMSCs来源的外泌体可显着增加SD大鼠70%肝切除术后第2天、第3天的肝体比,测定数值在实验组（PH+Exo）、对照组（PH）之间差异明显（P<0.05）;hucMSCs来源的外泌体可以显着降低缺血再灌注损伤组第2天、第3天大鼠肝脏组织中SOD、MDA、IL-6等缺血再灌注相关的肝组织损伤指标水平,实验组（HIRI+Exo）与对照组（HIRI）之间差异明显（P<0.05）。4、采用Micro RNA微阵列分析发现经过hucMSCs来源的外泌体干预后实验组（PH+Exo组）较对照组（PH组）肝脏组织中miR-193a、miR-124和miR-93显着上调,而miR-204和miR-10a-5p呈下调趋势。采用q PCR方法分析了miR-193a、miR-204、miR-124、miR-365、miR-93、miR-16、miR-10a-5p、miR-32等在PH+Exo组与PH组中的相对表达情况,进一步发现miR-193a、miR-204、miR-124、miR-93和miR-10a-5p在两组中的表达存在差异,其中miR-124在两组中的表达存在显着差异（P<0.01）。通过q PCR分析miR-193a、miR-204、miR-124、miR-93和miR-10a-5p在hucMSCs来源的外泌体中的相对表达量,发现miR-193a、miR-124和miR-93在外泌体中高表达。5、通过三种生物信息学方面的靶基因预测工具（如Target Scan、DIANA及miRDB等）对miR-124所对应的潜在靶点进行在线预测,发现了6个常见靶点（Chtf8、Pasp、CHSYS、Adam9、Strbp和Foxg1）,通过q PCR、Western Blot、双荧光素酶报告分析系统等进一步证实Foxg1是miR-124的直接靶点。6、通过Western Blot分别检测各实验组（PH、PH+Exo、PH+antigomiR-124、PH+Exo+antigomiR-124、Sham、Sham+Exo、Sham+agomiRNA-124等）大鼠肝脏中Foxg1蛋白的表达,反复验证后发现调控miR-124的表达水平后可负向调节Foxg1的表达促进大鼠肝细胞增殖。结论1、本实验成功分选出hucMSCs及其来源的外泌体,并验证了所提取的外泌体的特性。2、实验获取的外泌体对实验大鼠在实施了肝切除手术之后的肝再生起到了良好的促进作用,且减轻了SOD、MDA、IL-6等缺血再灌注相关的肝组织损伤指标,具有一定肝损伤保护作用。3、采用Micro RNA微阵列技术鉴定出了在hucMSCs来源外泌体中差异表达并与肝脏生相关的miR-124,进一步证明了hucMSCs来源的外泌体miR-124对大鼠部分肝切除术后的肝再生有很大的促进作用,并有助于减轻肝细胞损伤。4、本研究发现转录因子Foxg1是miR-124的直接靶点,miR-124可对Foxg1表达进行靶向抑制,从而使实验大鼠体内的肝细胞实现快速增殖。
单光颂[2]（2020）在《人脐带间充质干细胞治疗小儿心脏扩大伴心衰类心肌病的单中心、非随机、开放性真实世界研究》文中指出目的探讨人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）治疗小儿心脏扩大伴心衰类心肌病的疗效和安全性的真实世界研究结果,为其进一步临床推广提供依据。方法将在青岛市妇女儿童医院心脏中心就诊并定期门诊随访的心脏扩大伴心衰类心肌病患儿纳入本研究,根据患儿及家属的治疗意愿非随机性分为hUC-MSCs治疗组和常规治疗组,收集两组患儿性别、身高、体重、就诊年龄、就诊前病程、随访时间、心功能分级、辅助检查结果、超声心动图、心电图和基因检测结果,比较两组患儿的中短期疗效及安全性指标。结果1.两组患儿的基线资料:hUC-MSCs治疗组40例,其中DCM 17例,LVNC 17例,EFE 5例,ARVC 1例,男女比例1.1:1,平均身高（98.58±25.28）cm,平均体重（20.04±16.32）kg,平均年龄（62.08±44.06）月,入组前平均病程（36.25±29.02）个月;常规治疗组33例,其中DCM 28例,LVNC 4例,EFE 1例;男女比例0.94:1,平均身高（87.61±34.28）cm,平均体重（13.76±12.20）kg,平均年龄（23.88±28.04）个月,入组前平均病程（19.58±24.04）个月。治疗前NYHA III级及以上的患儿,hUC-MSCs治疗组24例,常规治疗组为26例;hUC-MSCs治疗组外周血NT-proBNP为（4211.68±7234.88）pg/ml,常规治疗组为（17961.59±14713.08）pg/ml。两组患儿治疗前LVPWd Z值及IVSd Z值均在正常范围,且差异并无统计学意义;LVDd Z值、LVM Z值、LVEDV Z值以及LVMI、LVEDVI均高于正常,差异亦无统计学意义。2.随访截止,hUC-MSCs治疗组患儿无死亡病例,平均存活（26.75±17.80）个月;常规治疗组有4例患儿死亡,29例患儿存活,平均存活（19.03±13.98）个月。hUC-MSCs治疗组NYHA分级好转率为77.5%,外周血NT-proBNP差值为（-2950.33±6014.95）pg/ml;常规治疗组患儿NYHA分级的好转率为57.58%,外周血NT-proBNP差值（-11740.10±14572.18）pg/ml。3.hUC-MSCs治疗组LVEF较治疗前提高（22.14±13.70）%,LVFS提高（9.37±7.83）%;LVPWd Z值及IVSd Z值在正常范围;LVDd Z值较治疗前下降（-4.84±3.89）;LVM Z值下降（-6.94±7.54）,LVEDV Z值下降（-11.67±13.13）。常规治疗组LVEF较治疗前提高（10.73±15.38）%,LVFS提高（5.11±8.72）%;LVPWd Z值及IVSd Z值在正常范围;LVDd Z值较治疗前下降（2.07±4.30）,LVM Z值下降（2.92±6.67）,LVEDV Z值下降（4.77±7.56）。4.hUC-MSCs治疗组异常心电图好转率94.12%,常规治疗组为70.59%。两组患儿心肌病患儿治疗前后,血常规、肝脏、肾脏功能均无显着差异;hUC-MSCs治疗组无免疫排斥等异常反应。结论人脐带间充质干细胞治疗心脏扩大伴心衰类心肌病患儿的中短期疗效较好,可改善生活质量,且无明显不良作用。
焦智慧[3]（2020）在《ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究》文中研究表明肝脏是哺乳动物最大的实质器官,具有加工储存营养物质、代谢药物毒物、分泌胆汁、合成蛋白质等重要功能。肝脏缺血再灌注损伤是外科手术中常见的一种临床综合征,20世纪90年代出现了腹腔镜的肝切除术,腹腔镜手术可以最大程度的减少腹壁神经和肌肉的损伤,减少出血、术后疼痛和粘连,加快手术恢复。尽管采用微创外科手术,在肝切除、肝移植、出血性休克等临床手术中仍不可避免的出现肝脏缺血再灌注损伤,严重会导致肝炎以及术后肝功能的衰竭。对于晚期肝功能不全的有效治疗办法是原位肝移植,但也面临着器官短缺,费用昂贵、免疫排斥和移植并发症等问题,因此,寻找能够减轻肝脏缺血再灌注损伤以及提高肝脏再生能力的安全有效的治疗办法是目前肝脏外科亟待解决的问题之一。脂肪间充质干细胞（ADSCs）能够自我更新、具有多向分化能力、来源丰富、取材损伤小,是目前细胞疗法理想的种子细胞。ADSCs主要依靠分化和旁分泌发挥作用,旁分泌指干细胞释放的多种生物因子在微环境里通过细胞基质在局部以及临近组织对靶细胞发挥的生物学作用。随着对旁分泌机制的深入研究,发现ADSCs分泌的多种细胞因子具有促进血管生成,抑制炎症反应,调节免疫应答,修复组织再生等多种生物学功能。ADSCs在体外培养的过程中,会将细胞因子等生物活性物质分泌到培养液中,这种含有细胞分泌物的培养液为脂肪间充质干细胞的条件培养液（ADSC-CM）。尽管ADSCs在临床上对许多疾病有治疗效果,但ADSCs具有免疫原性,对植入ADSCs的不可控分化仍是重要的安全隐患。因此,使用ADSC-CM的无细胞疗法成为绕过细胞疗法局限性的一种再生医学治疗方法。目前有关肝脏缺血再灌注损伤的动物模型以啮齿类动物为主,而从比较医学角度,小型猪与人的同源性好,体积大小以及器官大小与人更为接近,因此也作为研究缺血再灌注损伤理想的实验动物,所获得的研究数据更有价值,易于临床转化。而ADSC-CM在大型实验动物的研究较少,特别是肝脏领域尚未见报道,所以本研究旨在通过建立小型猪肝脏缺血再灌注合并部分切除模型,探究ADSC-CM治疗肝脏缺血再灌注合并部分切除损伤的疗效,为比较医学开展肝病治疗,拓宽ADSC-CM移植领域提供研究依据。本研究使用30头小型猪,其中6头用于脂肪组织的获取。采用胶原酶消化法分离培养ADSCs,使用诱导培养基和特定染色鉴定ADSCs成脂、成骨、成肝分化能力,应用细胞流式鉴定ADSCs表面特异性抗原。ADSCs饥饿培养48 h获得ADSC-CM,经3 kda超滤管离心浓缩ADSC-CM用于后续实验。另外24头小型猪随机分为四组:模型组（IRI）,DMEM对照组（DMEM）,脂肪间充质干细胞组（ADSCs）,脂肪间充质干细胞条件培养基组（CM）,每组6头。四组实验动物均通过腹腔镜手术建立肝脏缺血再灌注合并部分肝切除模型,IRI组通过肝实质注射生理盐水,DMEM组注射基础培养基,ADSCs组注射脂肪间充质干细胞,数量为1×106/kg,CM组按照1×106/kg细胞数提取等量干细胞分泌的条件培养液,注射浓缩的ADSC-CM进行干预。分别在术前、术后1 d、3 d、7 d采集血液样本及肝组织样本用于相关指标的检测。通过HE染色观察病理组织学变化,透射电镜观察超微结构的变化,血常规检测外周血的炎性细胞变化,试剂盒检测抗氧化酶以及细胞凋亡酶活性,TUNEL染色检测凋亡细胞的阳性率,ELISA法检测血清中炎症相关因子、再生相关因子以及ADSC-CM成分,q RT-PCR法检测炎症、凋亡以及再生相关基因水平变化,Western Blot法检测肝组织中凋亡以及再生相关蛋白水平的变化,免疫组化染色检测凋亡相关蛋白以及再生相关蛋白水平的变化。本研究结果如下:（1）病理组织学与超微结构变化:术后各组肝小叶结构被破坏,肝索排列紊乱,肝细胞空泡变性明显,炎性细胞浸润,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预明显减少空泡变性和炎性细胞浸润;术后IRI组和DMEM组肝细胞内质网严重扩张,细胞核膜皱缩,染色质边集化,ADSCs或ADSC-CM干预改善了内质网扩张及肝细胞核膜皱缩的程度。（2）肝脏功能变化:术后各组ALT、AST、LDH、ALP和T-BIL均升高,TP呈降低趋势,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预明显降低了ALT、AST、LDH、ALP和T-BIL的升高程度,缓解了TP的降低程度,促进肝脏功能的恢复。（3）氧化应激指标变化:术后各组肝组织抗氧化酶CAT、GSH-Px和SOD活性显着降低,MPO酶活性和MDA含量显着升高,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预显着增强了抗氧化酶的活性,降低MPO酶活性,并能减少氧化产物MDA的水平,从而减少术后的氧化应激反应,且两个干预组的上述氧化应激指标均无显着性差异。（4）炎症指标变化:术后外周血中炎性细胞WBC、NE、LY含量迅速升高,ADSCs或ADSC-CM干预减少了外周血中的炎性细胞的数量;IRI组和DMEM组血清中的炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量呈升高趋势,ADSCs或ADSC-CM干预降低促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平,同时增强抑炎因子IL-10的表达;肝组织中炎症因子基因水平的表达与血清结果一致,ADSCs和ADSC-CM通过抑制促炎因子的过度释放以及增强抑炎因子的表达显着改善了术后的炎症反应,且两个干预组之间没有显着性差异。（5）凋亡指标变化:术后各组P53、Bax、Fas、Fasl基因和蛋白水平均显着升高,Bcl-2表达水平降低,相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预抑制了凋亡相关指标P53、Bax,、Fas、Fasl的表达,提高抗凋亡Bcl-2的表达水平;ADSCs组和CM组显着降低TUNEL阳性细胞率及Caspase酶活性,减少术后肝细胞凋亡,且两组之间没有显着性差异。（6）再生指标变化:相比于IRI组和DMEM组,ADSCs或ADSC-CM干预显着提高血清中血管生成相关因子VEGF、ANG-1、ANG-2的表达,增强组织中肝脏再生相关基因HGF、Cyclin D1的表达,抑制肝再生终止基因TGF-β的表达,提高Ki67的阳性细胞数及细胞增殖PCNA蛋白的表达,且ADSCs组和CM组之间没有显着性差异。（7）ADSC-CM成分检测:通过ELISA法检测到小型猪ADSC-CM中含有促进血管生成的VEGF、ANG-1、ANG-2、b-FGF,调节炎症反应与肝脏再生的TNF-α、IL-1β、IL-6。综上所述,经肝实质移植ADSCs和ADSC-CM均能够改善肝脏缺血再灌注合并部分肝切除的病理组织学损伤及超微结构变化,减轻过度炎症反应及氧化应激反应,减少细胞凋亡,促进肝脏再生。本试验成功应用ADSCs和ADSC-CM干预肝脏缺血再灌注合并部分切除后的肝损伤,证明ADSCs和ADSC-CM抗氧化、抗炎、抗凋亡和促进肝再生的作用,且二者干预效果无显着差异,推测ADSCs发挥作用的机制很可能是通过分泌细胞因子的旁分泌途径。
王璐[4]（2019）在《淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究》文中研究指明干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞,具有十分广阔的应用前景,已被广泛应用至多种疾病的临床研究中,但是临床上移植入体内的干细胞存活率低,限制了其推广应用。因此,亟需新的治疗策略改进干细胞抵御体内恶劣微环境的能力。天然药物独具优势,前期实验发现淫羊藿素（icaritin,ICT）预处理后的人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）治疗急性肝衰竭大鼠,死亡率进一步降低,肝脏病理、肝功能得到进一步改善,但是内在机理尚不清楚。预实验发现ICT可以增加体外培养的hUC-MSCs的细胞活力,调节多种细胞因子的分泌,并减少细胞的凋亡,电镜下可见ICT减少了自噬小体包裹的线粒体数量,因此,本研究将从细胞凋亡与线粒体自噬入手,探索淫羊藿素影响人脐带间充质干细胞的机制,为中药联合干细胞疗法提供理论依据。目的:本研究首先通过文献综述,为实验提供理论支持;随后在体外采用无血清培养部分模拟体内微循环障碍的环境,使用ICT干预hUC-MSCs,探索其是否具有抗凋亡作用,并深入研究是否通过HGF（肝细胞生长因子）/c-Met通路发挥作用;观察ICT能否干预hUC-MSCs的线粒体自噬过程;同时采用蛋白质谱,分析ICT预处理后的hUC-MSCs的差异表达蛋白,并进行GO分析、KEGG分析、蛋白互作分析等生物信息学分析,评估淫羊藿素参与的生物学过程。方法:人脐带间充质干细胞无血清培养72小时作为基本的造模方式,模拟微循环障碍的体内环境。不同浓度的ICT干预造模细胞,用MTS法测定其0D值,筛选最佳处理浓度。BrdU掺入试验检测Control组（正常培养组）、Serum free组（无血清培养组）、ICT组（淫羊藿素组）、HGF组（肝细胞生长因子组）的细胞增殖率。ELISA法检测ICT促进hUC-MSCs的HGF分泌情况。WB与qRT-PCR法检测ICT影响hUC-MSCs的c-Met受体表达情况。转染构建c-Met+MSCs,通过qRT-PCR和WB检验其转染效率。使用CCK8法筛选c-Met受体抑制剂克唑替尼（crizotinib）的最佳作用浓度。采用AnnexinV-FITC/PI凋亡检测,评估各组细胞凋亡率。qRT-PCR与WB检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-3、Bax的表达。MTS法检测不同浓度的自噬抑制剂3MA对造模细胞的影响。使用qRT-PCR、WB以及免疫荧光显微镜检测线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基II（MT-C02）、自噬相关蛋白LC3B的表达情况。透射电镜观察各组细胞的超微结构,重点观察其线粒体自噬水平。采用qRT-PCR筛选ICT干预hUC-MSCs线粒体自噬的相关通路。使用JC-1膜电位检测试剂盒检测膜电位情况。采用蛋白质谱进行各组细胞差异蛋白的生物信息学分析。结果:1.不同浓度的淫羊藿素处理无血清培养hUC-MSCs,各处理浓度均提高了其细胞活力,但是仅50ng/ml（0.1uM）、100ng/ml具有统计学意义（P<0.05）。选择50ng/ml为最佳处理浓度进行后续实验。BrdU检测显示较Control组,Serum free组增殖率下降（P<0.05）,而使用ICT或者HGF均提高了细胞增值率（P<0.05）。2.人脐带间充质干细胞本身可分泌HGF,也表达HGF的受体c-Met,而ICT能够促进其表达更高水平的HGF与c-Met受体（P<0.05）。构建c-Met+MSCs后,WB与qRT-PCR法证实了基因转染成功。根据细胞抑制率,筛选4 u M为克唑替尼（c-Met受体抑制剂）的最佳处理浓度。MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,c-Met+MSCs的细胞凋亡率显着降低（P<0.01）,克唑替尼处理后,细胞凋亡率显着增高（P<0.01）,提示HGF/c-Met通路对于MSCs具有抗凋亡作用。WB显示,对比MSCs组,c-Met+MSCs组Bcl-2的表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调（P<0.05）,克唑替尼则使Bcl-2蛋白水平降低,Cleaved caspase-3和Bax蛋白表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示HGF/c-Met通路通过调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。3.MSCs在无血清培养72h时凋亡率较高,ICT或HGF处理后,MSCs凋亡率显着降低（P<0.05）。当使用c-Met受体抑制剂克唑替尼时,拮抗了 ICT的抗凋亡作用,差异有统计学意义（P<0.01）。这表明克唑替尼可以抑制ICT对MSCs的保护作用,ICT对MSCs的抗凋亡作用与HGF/c-Met通路相关。WB显示,ICT或HGF处理后的MSCs的Bcl-2表达上调且Cleaved caspase-3、Bax表达下调（P<0.05）,对比ICT组,加用克唑替尼后可使Bcl-2蛋白水平降低,使Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表达增加,qRT-PCR验证了上述结论。提示ICT通过HGF/c-Met通路调控凋亡蛋白的表达发挥抗凋亡作用。4.低浓度的自噬抑制剂3-MA对造模细胞的活性具有促进作用（P<0.05）,而高浓度的自噬抑制剂3-MA抑制了细胞活性（P<0.01）。提示无血清培养条件下,适度的抑制细胞自噬有利于细胞的存活,而过度的抑制细胞自噬则会降低细胞活力,不利于细胞存活。5.与Control组比较,Serum free组MSCs的线粒体外膜蛋白tomm20、线粒体内膜蛋白timm23、线粒体基质蛋白细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ（MT-C02）均会减少,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率提高,线粒体膜电位降低,提示线粒体自噬水平被上调,电镜可见细胞内“线粒体自噬体”（被自噬小体包裹的线粒体）显着增多,损伤线粒体增加,细胞形态不佳,证实了无血清培养增加了线粒体自噬;而ICT或者HGF干预后上述线粒体蛋白表达增加,自噬蛋白LC3Ⅰ和LC3Ⅱ表达均减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率降低,线粒体膜电位升高,提示线粒体自噬水平被下调。电镜可见胞内“线粒体自噬体”减少,损伤线粒体减少,细胞形态得到一定的改善,证实了ICT和HGF均减少了线粒体自噬。6.采用qRT-PCR进行Pink1/Parkin通路,FUNDC1通路以及Bnip3/Nix通路的筛选,结果如下:Pink1、Bnip3的mRNA与前述线粒体自噬趋势相符,Nix、FUNDC1的mRNA呈现出相矛盾的趋势。7.蛋白质谱分析:通过GO分析,发现Control组与Serum free组的差异蛋白,以及ICT组与Serum-free组之间,HGF组与Serum free组之间的差异蛋白,均参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程（P<0.05）。对ICT组与Serum free组的差异蛋白进行分析,AKT1位于蛋白互作中心节点位置,KEGG分析PI3K-AKT通路具有统计学意义,可作为研究的重点通路。对于HGF组与Serum free组之间的差异蛋白进行分析,筛选出NF-κ B通路作为研究重点通路。结论:1.淫羊藿素能够通过HGF/c-Met通路降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的凋亡率,与调节Cleaved Caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表达水平有关。2.淫羊藿素或肝细胞生长因子均可降低无血清培养的人脐带间充质干细胞的线粒体自噬水平,减少损伤线粒体数目,改善细胞形态,增加线粒体蛋白tomm20、timm23、MTC02的表达,提高线粒体膜电位。3.蛋白质谱分析发现淫羊藿素或肝细胞生长因子介导的差异蛋白参与细胞凋亡、自噬、线粒体自噬相关的生物过程,对于ICT,PI3K-AKT通路可作为研究重点通路,对于HGF,NF-κ B通路可作为研究重点。
袁伦志[5]（2019）在《人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究》文中研究指明乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染在全球范围内造成了严重的疾病负担。HBV感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,其感染人肝细胞后能够持续复制,诱发宿主免疫耐受状态、逐步形成慢性化、直接或间接诱导一系列病理生理学变化并造成重症肝炎、肝衰竭、肝纤维化、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病。目前,虽然预防性疫苗的普及已经在很大程度上控制HBV新发感染率,但是已批准上市的临床药物仍然无法彻底清除病毒,实现功能性治愈。由于HBV的天然宿主人类和猩猩等大型灵长类动物用于研究收到严格的伦理限制,因此发展能够最大限度模拟HBV感染和发病的动物模型成为进一步认识HBV感染发病机制,以及研发和评价新一代抗HBV药物所面临的一项挑战。数十年来,研究人员建立了转基因小鼠、尾静脉高压注射小鼠、旱獭、北京鸭和树鼩等替代模型,然而它们都不能完全模拟HBV在人类中感染发病的自然史,因此,建立人源化小鼠动物模型,特别是人肝和人免疫系统双嵌合的人源化小鼠动物模型,用于支持HBV感染发病相关研究具有相当的重要性。然而,目前已有的人源化小鼠动物模型一直存在原代人细胞来源匮乏和体外难以扩增、个体差异大、多种细胞移植不匹配、伦理问题、造模周期长、实验窗口期短和难以模拟HBV感染相关的终末期肝脏疾病等限制。因此,建立一种方便易用的、能够支持HBV感染发病研究的新型人源化小鼠动物模型对于进一步推进HBV相关基础研究和治疗策略的发展十分必要。本论文中,我们利用临床分离的健康人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）在免疫缺陷小鼠体内同时重建了同源的人源肝脏和免疫系统,并将此种双嵌合人源化小鼠用于乙肝病毒感染及相关病理生理学研究。我们对乙肝病毒的生物学特征、流行病学、感染自然史、相关肝脏疾病、天然宿主动物、感染细胞和动物模型等方面进行综述研究,基于前期研究和对最新研究成果的考察,我们发现hBMSCs具有重建人类肝脏和免疫系统的巨大的潜力,并选择其作为我们构建新型双嵌合人源化小鼠模型的细胞材料。我们使用hBMSCs移植暴发性肝衰竭免疫缺陷FRGS小鼠,发现其能够在小鼠体内迅速转分化为具有活性的人肝细胞和多种人免疫细胞,同时证明暴发性肝衰竭的肝脏微环境是驱动hBMSCs在免疫缺陷FRGS小鼠体内大量快速转分化为人源肝细胞和免疫细胞的重要驱动因素。我们在hBMSCs移植的免疫缺陷FRGS小鼠（hBMSC-FRGS）体内建立了HBV慢性感染,实现A,B,C,D四种常见HBV基因型病毒感染超过50周。我们连续监测了 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内病毒DNA及蛋白水平,证明被HBV感染的小鼠血清内含有具备感染活力的HBV病毒颗粒。我们初步研究了HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内的免疫病理生理学变化,在感染进行和持续和过程中同步分析了小鼠肝内人源免疫细胞、人源细胞因子、肝脏炎症进展和HBV特异性人源抗体水平等指标,证明HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠出现持续的肝脏炎症和免疫耐受状态。我们在HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内观察到一系列的指示肝硬化发生发展的典型性指标,包括:肝硬化血清学指标持续增高、小鼠肝脏组织中肝硬化相关人源基因表达持续上调、小鼠肝脏组织中胶原纤维堆积持续增加、纤维结节生成、肝小叶结构被破环、肝板塌陷、肝脏外表粗糙体积固缩等。综上所述,我们建立了肝脏和免疫系统双重人源化的hBMSC-FRGS小鼠模型,将其用于HBV感染和相关免疫病理生理学研究,并通过长期观察发现HBV感染后小鼠产生肝脏炎症并且逐步发展为典型的肝硬化。
杨荣[6]（2019）在《双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记BMSCs移植治疗大鼠肝脏缺血再灌注损伤的MR活体示踪》文中指出研究背景:现阶段,临床上对于终末期肝脏疾病最有效且常用的治疗手段,是肝脏切除和肝移植手术,而肝脏缺血再灌注损伤是在肝脏切除和肝移植手术过程中常见的且不可避免的并发症。干细胞因其具有强大的自我复制能力和体外多向分化潜能,干细胞移植在缺血再灌注损伤的实验研究中应用甚广。以往研究已证实,哺乳动物骨髓来源的干细胞在生理或病理情况下都具有很强的迁移与分化能力,在体外经过特定的条件培养可分化为多个胚层来源的细胞,如类肝样细胞、成神经细胞、成脂细胞、成骨细胞等,且干细胞移植治疗有利于组织损伤修复及功能的恢复,是组织修复工程较为理想的种子细胞,是一种临床上很有发展前景的治疗策略。但如何可以对移植入缺血再灌注损伤肝脏内的干细胞进行活体监测?那么就需要分子成像技术的支持。影像技术的进步和成像试剂的创新,使分子成像技术得到了快速发展。在分子成像领域,通过分子生物学和影像技术的结合,使在分子或细胞水平上进行研究和诊断的能力得到了飞速提升。医学分子成像技术有许多成像设备,如US、CT、MRI、OI、PET、SPECT等,这些分子影像设备在成像灵敏度、空间和时间分辨率等性能方面都有各自的优缺点,它们可以为临床工作人员及基础研究人员提供人或动物细胞甚至分子水平的信息,也能够提供从形态结构到功能代谢等方面的详细信息。这些成像技术的联合使用,可以弥补单独使用某一种成像方法的不足。比如,在动物实验研究中,多种分子影像设备（如MRI）在无需处死实验动物的情况下即可实现对动物的长期非侵入性的观察,但是,其空间分辨率以及信噪比（Signal-to-noise ratio,SNR）存在一定的不足。因此,常常需要通过使用对比剂或分子影像探针,或结合其他影像学检查方法进行双/多模态成像来改进空间分辨率和SNR。理论上,双模态和多模态医学检查仅需要使用一种探针,而且,通过这种多模式成像可以获得更准确和完整的信息,帮助临床医生早期发现疾病,改善诊断和进行疗效评估。目前,双模态和多模态医学影像方法越来越多的应用于小动物的分子成像研究,双模态和多模态对比剂也广泛应用于标记移植细胞的动物体内示踪。本课题以荧光及MR双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记大鼠骨髓来源的间充质干细胞,由于MR检查序列中的T2WI序列可对顺磁性物质标记的细胞进行体内示踪,显示为低信号区,因此可以对Molday IONTM EverGreen标记的大鼠骨髓来源的间充质干细胞进行体内外检测示踪,同时研究其对同种异体移植大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的抗损伤、抗凋亡、促修复的作用。目前,随着医学影像技术后处理应用研究技术的发展,磁共振（Magnetic resonance imaging,MRI）成像技术不仅可以利用MR非侵袭性的方法观测到活体组织中细胞的迁移和增殖状况,而且可以通过定量或半定量后处理分析软件对细胞移植后的器官功能、血流动力学变化进行评价,对于评估干细胞移植的效果有重要意义,本研究采用动态增强（Dynamic contrast-enhanced,DCE）MRI扫描方法结合定量后处理软件分析大鼠肝脏缺血再灌注损伤区域肝组织微血管的血流动力学参数,为干细胞体内移植治疗肝脏缺血再灌注损伤提供了帮助。研究共分为以下两个部分。第一部分 双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记大鼠骨髓间充质干细胞及体外MR成像研究目的:骨髓间充质干细胞在体外一定条件诱导下具有多向分化的能力,因此,在组织工程研究中成为使用越来越广泛的种子细胞。若想借助医学影像设备深入研究BMSCs在体内的分布、增殖情况及其对器官功能的影响,首先必须要解决如何能安全、高效地使用影像显影剂标记BMSCs的问题。本文采用荧光和磁性双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记大鼠骨髓来源间充质干细胞（Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）,探讨 Molday IONTM EverGreen 标记BMSCs的适宜标记浓度及其标记BMSCs 6周以内不同时间点的细胞活力和标记率;初探Molday IONTM EverGreen标记BMSCs进行体外MR成像的可行性,为进一步研究BMSCs移植后的活体示踪提供实验依据。方法:分离、培养、传代大鼠BMSCs后,使用三种浓度的（铁浓度为10、20、50 μg/ml）Molday IONTM EverGreen对第三代BMSCs进行荧光及磁性双标记,通过普鲁士蓝染色观察细胞铁标记率、荧光镜观察细胞的荧光标记率,比较三种浓度Molday IONTM EverGreen 标记 BMSCs 的阳性标记率;观察 20 μg/ml Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后1天及1周、2周、4周、6周细胞的荧光标记率。台盼蓝拒染法检测20 μg/ml Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后1天及1周、2周、3周、4周、5周、6周的细胞活力。使用荧光染料HOECHST33342/PI双染Molday IONTM EverGreen-BMSCs细胞核后,在激光扫描共聚焦显微镜下观察三种浓度 Molday IONTM EverGreen（铁浓度为 10、20、50 μg/ml）标记 BMSCs 的存活率。应用3.0T MR扫描仪对不同浓度Molday IONTM EverGreen标记的BMSCs行T1、T2序列扫描,确定Molday IONTM EverGreen标记BMSCs的最佳标记浓度。结果:BMSCs原代早期细胞呈圆形、三角形、多角形,少数呈梭形,原代晚期呈梭形居多,体外传至第二代培养1周即可达到80%左右的细胞融合,形态上呈比原代细胞更为均匀的长梭形;体外传至第三代,BMSCs基本纯化,经细胞鉴定（免疫荧光检测鉴定法）细胞表面标记物CD29（+）、CD34（-）、CD44（+）、CD45（-）。三种浓度 Molday IONTM EverGreen（铁浓度为 10、20、50 μg/ml）标记BMSCs后经普鲁士蓝染色和荧光镜观察标记率均接近100%,而对照组（无Molday IONTM EverGreen标记）标记率为零。普鲁士蓝染色显示Molday IONTM EverGreen-BMSCs胞质内蓝染的铁颗粒,且随Molday IONTM EverGreen标记浓度增加,蓝染物质增多、颜色加深。三种浓度Molday IONTM EverGreen的细胞荧光标记率均接近100%,但10 μg/ml Molday IONTM EverGreen标记的BMSCs细胞质的荧光强度欠佳,而50 μg/ml Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后培养16 h观察贴壁细胞数量减少;20 μg/ml Molday IONTM EverGreen较长期（6周）标记细胞后,荧光显微镜观察到荧光强度降低,但有绿色荧光显影的细胞比例仍可达93%。细胞活力检测（台盼蓝染色法）20 μg/ml Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后1天、1周、2周、3周、4周、5周、6周的细胞台盼蓝拒染率,并与未标记细胞进行统计学比较,证明20 μg/ml Molday IONTM EverGreen标记后对BMSCs活力的影响不具有统计学意义（p>0.05）。荧光染料HOECHST33342/PI双染细胞核观察 10 μg/ml、20 μg/ml、50 μg/ml 的 Molday IONTM EverGreen 标记BMSCs与未标记干细胞组细胞死亡率均值分别为5%、5%、8%和4%。体外MR扫描显示不同浓度Molday IONTM EverGreen标记的第三代BMSCs（细胞数1×106/ml）T1信号强度无明显差异,T2WI上各标记浓度组均引起信号的减低,Molday IONTM EverGreen浓度越高引起的信号减低越明显,T2信号强度随Molday IONTM EverGreen浓度的增加而降低。结论:应用本实验方法,能够在离体情况下方便快速地分离、培养出大鼠BMSCs,且可以稳定传代,可用于进一步的动物体内研究。使用适宜浓度（20 μg/ml）的双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记BMSCs标记效率高,标记较长时间（6周）的标记率仍能保持在93%,而且对BMSCs的活力以及存活率无影响。体外MR扫描T2WI序列可敏感地发现不同浓度Molday IONTM EverGreen标记BMSCs后信号强度变化。为活体移植BMSCs后进行MR示踪奠定了实验基础。第二部分 同种异体肝门静脉移植Molday IONTM EverGreen标记的BMSCs治疗大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的MR活体示踪研究目的:制作大鼠肝脏右外叶和三角叶缺血再灌注损伤模型,研究双模态对比剂Molday ION?EverGreen标记骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenehymal stem cells,BMSCs）后,同种异体移植Molday IONTM EverGreen-BMSCs至大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的体内MR示踪,和移植后对大鼠肝功能、病理改变以及肝细胞凋亡的影响。用动态对比增强（Dynamic contrast enhanced,DCE）磁共振成像（Magnetic resonance imaging,MRI）技术,研究大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型微血管渗透性参数动态变化规律及B M S Cs移植对其产生的影响。方法:取同龄同质量健康雄性SD大鼠,体外分离、培养骨髓间充质干细胞并传代,使用第三代骨髓间充质干细胞进行活体移植,移植前对骨髓间充质干细胞行双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记。结扎大鼠肝脏右外叶和三角叶的供血血管肝动脉右支和门静脉右支45 min后再灌注,建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型。将大鼠随机分成三组:假手术组（Sham组）（仅开腹1 h后关腹）、Molday IONTM EverGreen标记的BMSCs移植组即Molday IONTM EverGreen-BMSCs组（BMSCs经门静脉右支注入,植入时暂时夹闭左侧肝蒂,以保证足够多的细胞移植入受损肝脏血管内）和缺血再灌注组即I/R组（经门静脉右支注射等量生理盐水,注入时暂时夹闭左侧肝蒂）,各组分别于再灌注术后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天行DCE-MRI检查,所得图像经全定量分析后处理软件包Omnikinetics软件处理后测量术区肝脏微血管通透性参数:Ktrans值、Ve值及Kep值,观察各组微血管通透性变化;MRI扫描后抽取下腔静脉血液用来检测肝功能指标:血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）以及丙氨酸氨基转移酶（ALT）的水平;对肝脏组织行HE染色观察其病理学改变;并通过术区肝组织冰冻切片激光共聚焦显微镜、组织切片普鲁士蓝染色观察Molday IONTM EverGreen标记的细胞移植后在术区肝组织内的分布情况;TUNEL法检测受损肝组织细胞的凋亡指数（AI）。结果:成功建立大鼠肝脏右外叶和三角叶缺血再灌注损伤的稳定模型,术后7天,缺血肝叶形态及颜色恢复正常;大鼠缺血再灌注损伤后24 h行DCE-MR扫描显示I/R组和Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组大鼠术区肝组织与sham组大鼠比较,T1WI序列呈不均匀信号,T2WI序列呈高信号,DWI呈明显高信号,动态增强扫描术区肝组织强化程度增高,延迟扫描（注射对比剂后5分40秒扫描）呈不均匀高信号,证实缺血再灌注损伤模型成功,且Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组大鼠术后24 h T2WI长信号范围及程度较I/R组稍小稍轻;其余各序列扫描（T1WI、DWI、DCE-MRI及延迟期扫描）两组大鼠肝脏信号及强化差异不大。术后各时间点（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植的受损肝脏区域T2信号强度较无Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植的肝脏均有下降,其中第3-5天信号改变差异最为明显。不同恢复时间受损肝脏微血管渗透性参数的变化:缺血再灌注术后1天,I/R组和Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组的Ktrans、Ve值升高,Kep值降低;缺血再灌注损伤2天,I/R组和Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组的Ktrans,Ve值达到最高值,Kep值达到最低值,且两组之间三项指标的差异无统计学意义;缺血再灌注损伤3天开始至第4、5、6天,细胞移植组Ktrans,Ve值低于I/R组,且差异有统计学意义（p<0.05）;术后3-5 d,细胞移植组的Kep值高于I/R组,差异有统计学意义（p<0.05）,术后6d,细胞移植组的Kep值高于I/R组,但差异无统计学意义;缺血再灌注损伤7天,两组Ktrans、Ve、Kep值基本恢复正常,差异无统计学意义。缺血再灌注术后1天,I/R组和Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组的ALT、AST差异无统计学意义,均高于假手术组,且达到最高值;术后2天、3天,I/R组和Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组的ALT、AST值逐渐减低,Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组的ALT、AST均低于I/R组,两组差异有统计学意义（p<0.05）;术后4天、5天、6天,I/R组和Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组的ALT、AST逐渐减低,第5-6天基本恢复正常,两组差异无统计学意义;术后7天,I/R组和Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组的ALT、AST值差异无统计学意义,接近假手术组。Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植入大鼠门静脉右支后,于再灌注后24 h、2d、3d、4 d、5 d、6 d、7 d制作受损肝组织冰冻切片,激光共聚焦显微镜下观察冰冻切片中Molday IONTM EverGreen-BMSCs的分布情况,可见绿色荧光染色细胞早期分布较稀疏,但荧光较强,随着术后恢复时间的延长,荧光强度逐渐减弱,范围逐渐扩大。术区肝组织的普鲁士蓝染色:Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组在细胞移植后1 d,术区肝组织见少许蓝色深染铁颗粒位于肝血窦和少许肝细胞内,之后随时间延长,肝组织损伤区出现了经普鲁士蓝染色后细胞质呈蓝色的细胞,部分蓝染物质位于肝血窦,汇管区及血窦周围,肝组织损伤区含蓝染铁物质的区域逐渐扩大,含蓝染物质的肝细胞增多,但染色逐渐变淡。术区肝组织切片的HE染色显示:Sham组肝组织细胞结构正常;术后I/R组和Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组的肝小叶结构紊乱、肝细胞肿胀伴有空泡状变性、炎细胞浸润,肝窦狭窄且部分肝窦内可见红细胞;参照Suzuki的肝脏损伤组织病理学评分标准比较I/R组和Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组的病理学评分,结果显示,术后1天,I/R组和Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组损伤评分均达到最高但两组差异无统计学意义;术后2d开始至第5 d,Molday IONTMEverGreen-BMSCs移植组损伤程度（评分）轻于I/R组,且两组损伤评分差异有统计学意义（p<0.05）;术后6 d,两组肝脏损伤评分差异无统计学意义,但高于假手术组;术后7d,两组标本评分与假手术组评分相近,且两组损伤评分差异无统计学意义。肝细胞凋亡TUNEL法染色结果显示,Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组和I/R组的细胞凋亡均在术后24 h最为严重,术后第2、3、4天凋亡细胞逐渐减少,约术后第5天恢复正常;凋亡细胞在中央静脉周围较为显着;缺血再灌注术后1-4 d各个时间点I/R组的凋亡指数（AI）均高于Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植组,差异有统计学意义（p<0.05）;术后5-7 d两组凋亡指数相仿且基本正常,与Sham组的均值相近,且两组凋亡指数差异无统计学意义。结论:Molday IONTM EverGreen标记的BMSCs经门静脉右支注射可成功移植至大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型内,且可经T2WI进行活体示踪,在移植后3-5天信号改变最明显;Molday IONTM EverGreen-BMSCs移植可减轻肝脏缺血再灌注对肝脏功能、肝细胞病理改变和受损肝脏微血管通透性的影响,抑制大鼠肝脏缺血再灌注损伤后的肝细胞凋亡,来保护大鼠肝脏缺血再灌注损伤。
韦佼君[7]（2018）在《聚合物短纤维作为可注射药物载体和细胞球培养支架的研究》文中认为药物筛选和组织修复是生物医学领域中的重要研究课题。在药物筛选方面,体外检测药物的药效和毒性是药物进入临床研究前的一个重要环节。细胞二维（2D）培养是目前常用的体外药物筛选模型,但通过该模型得到的检测结果与动物实验结果,甚至是临床实际效果相差甚远。在组织修复领域,通常采用器官移植的方式来实现组织或器官修复,而大部分替代的组织器官主要来源于器官捐献、自身组织或动物组织等。然而采用器官移植的方法修复组织,常常受限于器官供体的数量有限,移植后与宿主发生免疫排斥反应以及使用自身组织修复容易造成机体的二次伤害等。因此构建具有与组织器官相似功能结构的类组织,则能够为药物筛选提供理想的体外模型以及替代器官移植实现组织修复。因此本论文旨在一方面以短纤维作为支架培养肝细胞球体、肿瘤细胞球体以及间充质干细胞球体,用于药物筛选、类肿瘤组织模拟、软骨修复和治疗关节炎,另一方面以可注射短纤维作为药物控释载体通过瘤内注射的方式治疗肿瘤,并且实现药物的局部缓释。建立一种可靠的,肝细胞球状体大小可控的以及可适用于高通量筛选的体外肝模型用于药物筛选仍存在巨大的挑战挑战性。本论文设计将短纤维作为支架,用于制备尺寸可控的,且具有肝特异性功能和表型的肝细胞球体。短纤维的长度、半乳糖和RGD的接枝密度能够调控细胞球体的大小及功能,长度为50 μm、PSMA混纺比例为95%、半乳糖和RGD接枝密度分别为135.7±4.5 nmol/mg和14.8±0.5 pmol/mg的短纤维培养得到的肝细胞球体具有最佳的肝特异性功能表达。短纤维分布在整个细胞球体中,与肝细胞紧密地相互作用从而形成较为致密的细胞球体。与不含支架的肝细胞球体相比,在对五种药物（甲苯磺丁脲、S-华法林、咪达唑仑、睾酮和对乙酰氨基酚）代谢清除率的考察过程中,含短纤维的细胞球体作为药物模型具有更高的代谢清除率,能够更好地预测体内药物清除率,其体内体外相关值（R2）为0.886。此外,这些肝细胞球体的药物代谢能力还表现在对药物代谢酶的诱导剂和抑制剂具有高度敏感,并且在20天的培养过程中一直保持对药物的响应性,为确定药物-药物的相互作用提供了一种有效的体外模型。因此,通过与短纤维共培养得到的肝细胞球体是一种能够在体外长时间维持肝细胞功能的简便操作方法,可推广至传统的多孔板和微芯片设备中培养,后用于高通量药物筛选。肝脏能够调节葡萄糖代谢和脂代谢。利用半乳糖修饰的PSMA/PS短纤维（gSF）作为支架分别与小鼠原代肝细胞（rPH）和肝癌细胞系（HepG2）共培养获得肝细胞球体模拟肝组织用于糖脂代谢的研究。与HepG2细胞球体相比,rPH细胞球体在葡萄糖消耗、糖原合成、糖异生、对胰岛素和胰高血糖素等葡萄糖调节激素的敏感性方面,表现出较强的葡萄糖代谢能力。HepG2细胞球体则显示出比rPH细胞球体更强的胆固醇和甘油三酯合成水平。通过对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）和腺苷5’-单磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）的活性表征,验证了上述实验结果。采用该模型研究药物的敏感性,含半乳糖修饰的短纤维肝细胞球体对升血糖药物（地塞米松）、降血糖药物（二甲双胍）、胰岛素增敏剂（吡格列酮）以及降脂药物（二甲双胍和洛伐他汀）均表现出较好的响应性。因此rPH和HepG2细胞球体可分别用作体外葡萄糖和脂质代谢研究模型,并且可用于筛选代谢紊乱疾病（如糖尿病和肥胖症等）的治疗药物。在全身性给药后,只有一小部分药物进入肿瘤,有许多障碍因素阻止药物向肿瘤内渗透。为克服这些障碍,通过在瘤内注射含抗癌药物的载药短纤维,使药物在靶点部位积累,从而达到治疗效果。制备了 5（FF-5）、20（FF-20）和50 μm（FF-50）的载HCPT短纤维,分散到2%海藻酸钠溶液中,注射性好。FF-5、FF-20和FF-50的药物释放曲线趋势相似,但纤维长度越长药物释放速度越慢。体外细胞毒性实验表明,FF-5和FF-20比FF-50会引起更高的细胞毒性和细胞凋亡率。短纤维瘤内注射小鼠H22皮下肿瘤后,长度越长的短纤维在瘤内的滞留效果更好。然而,载HCPT的纤维膜虽然在瘤内的滞留效果最好,但其抗肿瘤活性较低。与FF-5和FF-50相比,FF-20在瘤内释放HCPT在肿瘤内具有最佳的空间分布效果,这对动物存活、肿瘤生长抑制和肿瘤细胞凋亡诱导等具有显着的影响。上述结果表明肿瘤内注射载药短纤维是一种有效的治疗实体肿瘤的策略,通过调控载药短纤维在肿瘤内的滞留效果以及释放药物在肿瘤组织内的空间分布,来降低药物的全身毒性并提升治疗效果。为构建类肿瘤模型,以聚乳酸-聚乙二醇共聚物/聚环氧乙烷（PELA/PEO）混纺短纤维作为支架,携载促乳腺癌细胞系（MCF-7）增殖的17β-雌二醇（E2）药物,与细胞共培养构建MCF-7球体。PEO的含量和E2载药量会影响药物的释放速度、细胞的活力、增殖及粘附。结果表明PEO添加比例为3%、E2载药量0.01%的短纤维与MCF-7共培养6天后,即可得到直径为250 μm的成熟类恶性肿瘤细胞球体。该细胞球体在结构和因子表达上与恶性肿瘤类似,即中心细胞生长密集、内部缺氧,与恶性肿瘤的相似性较高;通过表征E-钙粘蛋白表达、恶性因子分泌、上皮-间充质转化相关基因表达等,证明该细胞球体具有恶性侵袭转移的倾向;癌症干细胞（CSC）表型基因表达和体内肿瘤构建表明该细胞球体具有较强的致瘤性。所有结果表明MCF-7球体与恶性实体瘤类似,因此可以作为体外类肿瘤模型用于新药的研发和肿瘤疾病的研究。采用组织工程的方法修复软骨缺损,将载有软骨诱导药物kartogenin（KGN）的PELA短纤维作为支架与骨髓间充质干细胞（BMSC）共培养得到有软骨分化潜能的细胞球体,为避免细胞流失,以可注射水凝胶包裹BMSC球体填充软骨缺损部位。结果表明KGN的载药浓度、水凝胶的机械性能和注射过程会影响BMSC球体的活力和分化能力,其中通过调节凝胶的浓度、反应比例以及在凝胶中添加短纤维可有效调控凝胶的机械强度。最终凝胶浓度为3%,巯基/丙烯双键（HS/Acr）反应比例为1/1.2,短纤维掺杂浓度为1%,以及KGN短纤维载药量为0.1%的复合支架在体外诱导BMSC分化成软骨细胞的效果最理想;体内缺损软骨修复结果表明,该复合凝胶携载BMSC球体治疗6周后缺损部位被大量的成熟新生软骨填充,12周后缺损部位得到了完全的修复。随后将该组织工程软骨与抗关节炎药物塞来昔布（CLX）结合并治疗骨关节炎,将CLX载入增强凝胶力学强度的短纤维上,调节药物浓度对BMSC无毒副作用;结果表明二者的协同作用能够较大程度地抑制关节炎的发展,12周后关节炎症状缓解并且病变引起的软骨缺损得到了修复。综上所述,本论文以短纤维作为可注射的药物控释载体用于瘤内注射治疗皮下肿瘤;作为体外三维培养细胞球体的支架,分别构建了肝脏、肿瘤以及软骨相关的细胞球体,可有效用于药物代谢模型、降糖降脂药物的筛选、类肿瘤的构建、软骨组织的修复和关节炎治疗;研究结果为体外药物筛选模型、器官修复和疾病治疗等提供了新思路和手段。
袁淑芳[8]（2013）在《骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究》文中研究表明目的：（1）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行体外培养、鉴定。（2）对D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的急性肝衰竭（ALF）大鼠给予尾静脉、门静脉二种途径注射同种异体移植大鼠BMSCs,探讨BMSCs移植治疗ALF的可能性、对比两种移植途径的疗效。（3）通过测定各组血清及肝组织中细胞因子的表达,探讨BMSCs移植治疗ALF的机制、了解BMSCs在肝内归巢的影响因素、探讨BMSCs移植对ALF血清和肝组织中细胞因子表达及肝细胞凋亡的影响及机制,为临床开展BMSCs移植治疗ALF、为临床提供可靠的ALF预后评估系统、实时准确地评价ALF的免疫状态、病情及预后并指导临床治疗提供依据。方法：（1）采用全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs,进行体外培养。采用DAPI标记BMSCs、细胞免疫荧光、流式细胞术进行BMSCs表型鉴定。（2）采用10%D-氨基半乳糖1-4g/kg/次、12小时一次和0.005%脂多糖20μg/kg,经腹腔注射制备大鼠ALF模型,观察造模后大鼠肝功能、肝组织病理损害程度。（3）通过尾静脉和门静脉注射的方式移植BMSCS。66只大鼠随机平均分为对照组、尾静脉移植、门静脉组。各途径组同种异体移植BMSCs,移植BMSCs数量为1.4×107个/kg,对照组给予等体积生理盐水腹腔注射。于移植后24h、72h、120h、168h收集血液样本和肝组织标本。检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）,比较BMSCs移植前后各组肝功能的改善情况。（4）用HE染色观察肝脏的病理学变化。用TUNEL法检测肝细胞凋亡。采用ELISA、RT-PCR方法测定各组血清及肝组织内CD163、IL-10的水平。用原位杂交、Western blot方法检测肝组织基质细胞衍化生长因子-1α （SDF-1α）蛋白的表达水平；用免疫荧光组织化学法、RT-PCR方法检测肝组织血管内皮生长因子VEGF蛋白的表达；采用免疫组化、Western blot方法检测肝组织Caspase-1、IL-18蛋白的表达水平。结果：（1）原代培养的大鼠BMSCs传代后,高表达CD29和CD90,不表达CDllb和CD45。用DAPI进行BMSCs标记,荧光显微镜下观察可见所有BMSCs均已标上蓝色荧光。（2）采用了D-氨基半乳糖模型（D-Gal）/脂多糖（LPS）诱导的大鼠ALF模型。模型建立后,组织HE染色出现典型急性肝损伤表现,肝衰竭对照组大鼠血清ALT. AST水平和肝细胞凋亡较BMSCs移植组明显升高,且有时间依赖性,这些结果支持了建模成功。（3）ALF对照组大鼠血清ALT、AST水平随病程逐渐升高,在移植后120h、168h,尾静脉、门静脉组移植组血清ALT、AST水平与对照组的差别均有统计学意义（P<0.01）,尾静脉与门静脉移植组之间血清ALT, AST水平的差别无统计学意义（P>0.05）。（4）BMSCs移植后168h,尾静脉与门静脉移植组大鼠肝组织均可见大量DAPI阳性标记的细胞,ALF模型对照组未见DAPIP日性标记的细胞。（5） BMSCs移植后120h、168h,尾静脉移植组、门静脉移植组的炎性细胞浸润明显减少,肝小叶结构逐渐恢复,汇管区可见胆管增生。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况与对照组相比有统计学意义（P<0.05）。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况的差别无统计学意义（P>0.05）。（6）在移植后120h、168h,与对照组相比BMSCs移植组肝细胞凋亡明显减轻（P<0.05）。BMSCs移植后120h尾静脉组、门静脉组细胞凋亡指数分别为22.00±16.84%、20.60±7.60%；移植后168h细胞凋亡指数分别为18.33±8.78%、12.67±8.78%,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。尾静脉和门静脉植组之间肝细胞凋亡改善情况无统计学差异（P>0.05）。（7）原位杂交、免疫荧光、Western blot结果显示：BMSCs移植组中SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平随肝功能的好转逐渐逐渐升高,在移植后120h、168h与对照组相比有显着性差异（P<0.05）。尾静脉和门静脉植组之间肝组织SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平无统计学差异（P>0.05）。相关分析发现肝组织中SDF-1α、VEGF两者表达水平呈正相关（P<0.05）。肝组织中SDF-1α、 VEGF蛋白的表达与肝细胞凋亡之间存在负相关,相关系数分别0.293、-0.274（P<0.05）。（8） ELISA及RT-PCR结果显示：ALF对照组大鼠血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随时间的延长、肝功能的恶化而升高。BMSCs移植组血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随肝功能的好转逐渐降低,在移植后120h、168h与实验组相比有显着差异（P<0.01）。门静脉与尾静脉移植组血清及肝组织中CD163、IL-10的水平之间的差别无统计学意义（P>0.05）。相关分析发现血清及肝组织中CD163、IL-10两者表达水平呈正相关（P<0.05）。CD163IL-10与ALT、AST之间均有明显的相关性（P<0.01）。（9）大鼠肝组织中Caspase-1、IL-18蛋白及蛋白的表达趋势一致,BMSCs移植后大鼠肝组织中Caspase-1和IL-18水平明显下降,在移植后120h、68h、BMSCs移植组中Caspase-1、IL-18蛋白的表达水平与对照组相比有显着差异（P<0.05）。门静脉组与尾静脉移植组之间Caspase-1、IL-18蛋白的表达差别无统计学意义（P>0.05）。尾静脉和门静脉植组之间Caspase-1、IL-18蛋白的表达无统计学差异（P>0.05）。相关分析发现Caspase-1、IL-18两者呈正相关（P<0.05）; Caspase-1、IL-18肝细胞凋亡之间均有明显的相关性（P<0.01）。结论：（1）采用全骨髓贴壁筛选法可以成功分离培养、扩增出高纯度大鼠BMSCs,并保持其原有的生物学特性。DAPI可成功标记BMSCs。（2）采用10%D-Gall.4g/kg/次,间隔12小时,共两次。联合0.005%LPS （10mg/支）20μg/kg、腹腔注射可成功建立大鼠ALF模型。该方法可靠、可重复性强、模型形成稳定、大鼠生存期较长,能满足本研究的需要。（3） BMSCs尾静脉、门静脉移植后,BMSCs可以归巢到ALF大鼠肝脏。（4） BMSCs移植能够促进ALF大鼠肝功能的恢复,减轻肝脏组织炎症坏死程度,BMSCs对ALF大鼠具有一定治疗作用。（5）尾静脉移植、门静脉移植途径均能有效改善ALF大鼠的肝功能、减轻肝脏病理损害程度。但二种途径相比差异无统计学意义。（6） BMSCs移植可减少ALF肝脏免疫炎症反应,抑制肝细胞凋亡。（7） BMSCs可以特异归巢至损伤肝脏,促进VEGF的分泌、并促进肝细胞增殖及肝脏血管再生、促进肝脏组织修复。（8） CD163. IL-10水平随肝组织炎症程度改善而下降,反映了肝功能的急剧恶化和疾病严重程度。BMSCs移植能降低CD163、IL-10水平,调节促炎与抗炎因子达到新的平衡。CD163、IL-10可作为早期评估患者肝移植预后观察的敏感血清标志蛋白的指标。（9）Caspase-1和IL-18在肝衰竭、肝细胞凋亡的发病过程中起重要作用。BMSCs移植能降低Caspase-1、IL-18水平。Caspase-1和IL-18可望成为急性肝衰竭的预测因子和未来的治疗靶点。
季茹[9]（2013）在《肝脏脱细胞生物支架的制备及诱导骨髓间充质干细胞肝向分化的研究》文中指出肝移植是目前针对终末期肝病的有效治疗方式。然而，供肝短缺、手术并发症、慢性排斥反应和医疗成本高等限制因素迫使研究者开始寻求新的替代治疗，并诞生了肝脏组织工程和再生医学这一新兴研究领域。在过去的数十年中，尽管研究人员在仿生三维动态培养方面取得了较大进展，但仍难于完全模仿肝脏细胞外基质（ECM）的复杂微环境。目前，全器官脱细胞支架正逐渐受到研究者的关注。脱细胞是指去除脏器中细胞成分，并且最大程度地保留脏器的大体形态、ECM成分和超微结构。一些研究成功地将功能性实质细胞或特定干/祖细胞种植于脱细胞ECM，为组织工程和再生医学研究提供新的研究平台。脱细胞支架研究的一个难题是脱细胞方案的选择和优化。近年来，研究人员已通过比较研究对心脏、肾脏、肺和膀胱等器官的脱细胞方案进行了改进。目前，文献中已报道了多种方案制备脱细胞肝支架（DLB），但尚无研究对上述方案制备DLB的理化性质、细胞相容性和免疫原性进行比较。该研究领域的另一难题是如何获取足够数量且功能完备的肝细胞。由于自体肝组织获取和体外维持肝细胞特性等方面存在困难，从干/祖细胞获取肝细胞成为目前该领域关注的研究热点。其中，间充质干细胞（MSCs）被认为是最具治疗潜力的细胞类型之一。目前已有多项研究证实了MSCs在特定培养条件下可诱导分化为类肝细胞。但诱导成功率较低，并且诱导的类肝细胞只具有成熟肝细胞的部分标志物和功能。因此，对MSCs肝向分化诱导方案和培养条件还需要进一步研究。近期一些研究证实组织特异性ECM可促进干/祖细胞定向分化。本研究将探讨DLB是否能够体外诱导MSCs向肝系细胞分化。本研究利用三种文献报道的洗脱方案（CHAPS、SDS和Triton X-100方案）和一种新建立的方案（NP-40方案）制备大鼠DLB，全面评估DLB的结构特点和生化特性及其细胞相容性和免疫原性，为DLB制备方案的改进提供依据；本课题还利用大鼠DLB制成的三维支架，为小鼠MSCs提供体外培养和诱导分化微环境，为体外高效诱导MSCs向肝系细胞分化寻找新的方法；最后，将体外预分化的MSCs移植给CCl4致肝纤维化小鼠，进一步观察DLB体外诱导分化MSCs的在体功能，并对其治疗作用机制进行探讨。主要研究成果如下：1.除CHAPS方案外，SDS、Triton X-100和NP-40方案均成功制备出符合脱细胞标准的大鼠DLB，但不同方案制备的DLB在超微结构、ECM成分、细胞相容性和免疫原性存在明显差异；与SDS和Triton X-100方案相比，NP-40方案制备的DLB具有更好的细胞支持作用和体内重塑结局；另外，统计学分析发现DLB体内重塑结局与DNA残留量、M2巨噬细胞数量和M2:M1细胞比值具有显着相关性。2.从GFP基因敲入C57BL/6小鼠体内成功分离和培养出骨髓干细胞，表达MSCs的细胞形态和表面标志物；NP-40制备的DLB为种植的MSCs提供了三维生长微环境；与DLB和培养瓶（TCF）静止培养相比，动态培养的DLB显着提高MSCs的细胞存活率和增殖速度。3.动态培养肝支架（DCS）本身或联合肝细胞诱导生长因子（GF），均能体外诱导MSCs向肝系细胞分化；与TCF培养相比，DCS培养的细胞表达更高水平的肝细胞标志物（AFP、ALB、CK7、CK8、CK9、CK19、肝细胞转录因子和肝细胞代谢酶等），并具有更强的肝细胞相关合成和代谢功能（分泌AFP和ALB、代谢尿素、合成糖原、摄取吲哚氰绿和低密度脂蛋白），以及具有成熟肝细胞超微结构特点。4.与未分化MSCs相比，体外利用GF预处理或DCS联合GF预处理的MSCs在移植给CCl4致肝纤维化小鼠后显着改善小鼠生存率、肝脏功能和纤维化程度；其中DCS联合GF预处理MSCs的归巢效率最高。定植到肝脏的预分化MSCs主要通过旁分泌作用抑制肝星状细胞活化、刺激内源性肝细胞增殖，达到修复肝损伤的目的。上述结果表明，本研究建立了一种新的肝脏脱细胞方案，制备的DLB具有良好的细胞相容性和较低的免疫原性；这种DLB在动态培养条件下可以高效地诱导MSCs向类肝细胞分化、表达更加稳定和丰富的肝细胞功能，并在移植体内后对慢性肝损伤具有较好的治疗作用。总之，这种肝脏脱细胞支架为肝脏组织工程和再生医学提供了一个全新的研究平台，有望为临床治疗终末期肝病提供新的治疗手段。
龚慧宾,张全胜,沈中阳,宋红丽[10]（2011）在《类肝细胞的研究进展》文中研究表明肝脏是体内最重要、最复杂的器官之一,既是机体物质代谢的核心,还具有生物转化、排泄胆汁和免疫等重要功能;肝脏同时也是一个极易受损伤的器官,代谢途径的障碍、病毒感染、毒性物质及肿瘤会导致肝脏功能的不可代偿性缺损甚至累及生命。
二、骨髓间充质干细胞来源类肝细胞的功能和超微结构评估（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、骨髓间充质干细胞来源类肝细胞的功能和超微结构评估（论文提纲范文）
（1）hucMSCs来源的外泌体促进大鼠肝切除术后肝再生的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照缩略表 |
| 前言 |
| 一、研究意义 |
| 二、国内外研究现状分析 |
| 三、MSC-Exo在肝再生研究中的优势与不足 |
| 四、本研究拟解决的科学问题 |
| 第一章 hucMSCs的培养及其来源的外泌体的分离鉴定 |
| 引言 |
| 1.1 实验材料和器材 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 hucMSCs来源的外泌体促进大鼠肝脏切除术后肝再生及减轻肝脏缺血再灌注损伤的实验研究 |
| 引言 |
| 2.1 实验动物、试剂与耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 hucMSCs通过递送miR-124促进大鼠肝再生的作用及机制研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论及展望 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附表一 组织标本(外泌体干预组/对照组)miRNA微阵列结果 |
| 附表二 miRDB、DIANA tools、TargetScan 三个在线工具预测miR-124的潜在靶点结果 |
| 附表三 本研究中所使用的引物列表 |
| 综述 MSC-EVs在肝脏相关领域中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）人脐带间充质干细胞治疗小儿心脏扩大伴心衰类心肌病的单中心、非随机、开放性真实世界研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 对象与方法 |
| 1.1 心脏扩大伴心衰类心肌病的诊断标准 |
| 1.2 纳入标准和排除标准 |
| 1.3 分组 |
| 1.4 心脏扩大伴心衰类心肌病的治疗方法 |
| 1.5 测定指标 |
| 1.6 疗效判定指标 |
| 1.7 伦理审批 |
| 1.8 统计学方法 |
| 结果 |
| 2.1 心肌病患儿的基线资料 |
| 2.2 心肌病患儿治疗后的生存质量 |
| 2.3 心肌病患儿治疗前后 NYHA 心功能分级的比较 |
| 2.4 心肌病患儿治疗后外周静脉血 NT-pro BNP 的比较 |
| 2.5 心肌病患儿治疗前后超声心动图比较 |
| 2.6 心肌病患儿的安全性指标 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表(附录) |
| 致谢 |
（3）ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 腹腔镜微创技术简介 |
| 1.1.1 腹腔镜微创技术的发展简介 |
| 1.1.2 腹腔镜肝切除术的发展应用 |
| 1.1.3 腹腔镜微创技术的客观评价 |
| 1.1.4 腹腔镜微创技术的发展方向 |
| 1.2 肝脏缺血再灌注损伤 |
| 1.2.1 肝脏缺血再灌注损伤的发生机制 |
| 1.2.2 肝脏缺血再灌注损伤的预防治疗 |
| 1.2.3 探究肝脏缺血再灌注损伤的实验动物模型 |
| 1.3 间充质干细胞概述 |
| 1.3.1 干细胞的生物学特性与分类 |
| 1.3.2 间充质干细胞的由来与定义 |
| 1.3.3 间充质干细胞生物学功能 |
| 1.3.4 间充质干细胞作用机制 |
| 1.3.5 干细胞临床应用的安全性 |
| 1.4 间充质干细胞条件培养基 |
| 1.4.1 间充质干细胞的旁分泌作用 |
| 1.4.2 间充质干细胞条件培养基的治疗作用 |
| 1.4.3 脂肪间充质干细胞条件培养基 |
| 1.4.4 脂肪间充质干细胞条件培养基的临床应用 |
| 1.5 目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 试验器材 |
| 2.1.3 试验药品及试剂 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 小型猪脂肪间充质干细胞的分离培养 |
| 2.2.2 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的鉴定 |
| 2.2.3 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的评估 |
| 2.2.4 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取制备 |
| 2.2.5 小型猪腹腔镜下肝缺血再灌注合并部分切除模型的建立 |
| 2.2.6 腹腔镜建立肝缺血再灌注合并部分切除模型的安全性监测 |
| 2.2.7 小型猪ADSC-CM对血液常规指标的影响 |
| 2.2.8 小型猪ADSC-CM对肝组织形态学观察 |
| 2.2.9 小型猪ADSC-CM对肝脏酶谱的影响 |
| 2.2.10 小型猪ADSC-CM对肝脏氧化应激的影响 |
| 2.2.11 小型猪ADSC-CM对炎症反应的影响 |
| 2.2.12 小型猪ADSC-CM对肝细胞凋亡的影响 |
| 2.2.13 小型猪ADSC-CM对肝再生的影响 |
| 2.2.14 小型猪ADSC-CM成分检测 |
| 2.2.15 数据统计分析方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 小型猪脂肪间充质干细胞的分离培养和形态比较 |
| 3.2 小型猪脂肪间充质干细胞的鉴定 |
| 3.2.1 表面抗原的鉴定 |
| 3.2.2 成骨分化能力的鉴定 |
| 3.2.3 成脂分化能力的鉴定 |
| 3.2.4 成肝分化能力的鉴定 |
| 3.3 改良后小型猪脂肪间充质干细胞的评估 |
| 3.3.1 增殖能力的比较 |
| 3.3.2 迁移能力的比较 |
| 3.4 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取制备 |
| 3.4.1 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的提取 |
| 3.4.2 小型猪脂肪间充质干细胞条件培养液的浓缩 |
| 3.5 腹腔镜建立肝损伤模型安全性监测结果 |
| 3.6 血液常规指标检测结果 |
| 3.6.1 白细胞(WBC) |
| 3.6.2 中性粒细胞(NE) |
| 3.6.3 淋巴细胞(LY) |
| 3.7 肝组织形态学观察结果 |
| 3.7.1 肝脏病理结构观察结果 |
| 3.7.2 肝脏超微结构观察结果 |
| 3.8 术后肝脏酶谱检测结果 |
| 3.8.1 谷丙转氨酶(ALT) |
| 3.8.2 谷草转氨酶(AST) |
| 3.8.3 碱性磷酸酶(ALP) |
| 3.8.4 乳酸脱氢酶(LDH) |
| 3.8.5 总胆红素(TBIL) |
| 3.8.6 总蛋白(TP) |
| 3.9 肝组织氧化应激检测结果 |
| 3.9.1 丙二醛(MDA) |
| 3.9.2 超氧化物歧化酶(SOD) |
| 3.9.3 过氧化氢酶(CAT) |
| 3.9.4 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) |
| 3.9.5 髓内过氧化物酶(MPO) |
| 3.10 炎症反应水平检测结果 |
| 3.10.1 血清炎症相关指标检测结果 |
| 3.10.2 肝脏组织炎症相关基因水平检测结果 |
| 3.11 肝细胞凋亡水平检测结果 |
| 3.11.1 肝脏组织凋亡相关酶活性检测结果 |
| 3.11.2 肝脏组织凋亡相关基因水平检测结果 |
| 3.11.3 肝脏组织凋亡相关蛋白水平检测结果 |
| 3.11.4 肝脏组织Fas和Fasl免疫组织化学染色结果 |
| 3.11.5 肝脏组织TUNEL染色结果 |
| 3.12 肝脏再生水平检测结果 |
| 3.12.1 血清再生相关指标检测结果 |
| 3.12.2 组织再生相关基因检测结果 |
| 3.12.3 组织再生相关蛋白检测结果 |
| 3.12.4 肝脏组织Ki67免疫组织化学染色结果 |
| 3.13 小型猪ADSC-CM成分分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 ADSCs培养方法的改良 |
| 4.2 ADSC-CM对肝脏缺血再灌注损伤的研究基础 |
| 4.3 ADSC-CM对小型猪肝脏功能的影响 |
| 4.4 ADSC-CM对小型猪氧化应激的影响 |
| 4.5 ADSC-CM对小型猪炎症反应的影响 |
| 4.6 ADSC-CM对小型猪细胞凋亡的影响 |
| 4.7 ADSC-CM对小型猪肝脏再生的影响 |
| 4.8 小型猪ADSC-CM成分分析的探讨 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（4）淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 研究背景 |
| 一、补肾中药调控干细胞的相关研究 |
| 1. 淫羊藿对干细胞的调控 |
| 2. 其他补肾中药对干细胞的调控 |
| 二、HGF在干细胞领域的研究进展 |
| 1. HGF的概述 |
| 2. HGF对干细胞的影响 |
| 三、线粒体自噬的研究进展 |
| 1. 线粒体自噬的概述 |
| 2. 中药调控线粒体自噬 |
| 第二部分 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路增强人脐带间充质干细胞抗凋亡能力的实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 1. 实验细胞 |
| 2. 实验仪器 |
| 3. 实验试剂与耗材 |
| 4. 主要试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. MTS法测细胞活力 |
| 3. CCK8法测细胞活力 |
| 4. BrdU掺入试验测细胞增殖率 |
| 5. 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 6. western blot(化学)方法检测蛋白表达 |
| 7. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 8. 质粒提取与细胞转染 |
| 9. ELISA法测蛋白表达 |
| 10. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 淫羊藿素促进人脐带间充质干细胞的细胞活力与增殖活性 |
| 2. HGF/c-Met通路在人脐带间充质干细胞中具有抗凋亡作用 |
| 3. 淫羊藿素通过HGF/c-Met通路抑制人脐带间充质干细胞凋亡 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞线粒体自噬的实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 1. MTS法测细胞活力 |
| 2. western blot(荧光)方法检测蛋白表达 |
| 3. qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 4. MitoTracker与目标蛋白共标记进行免疫荧光显微镜检测 |
| 5. 线粒体膜电位检测(JC-1) |
| 6. 电镜检测 |
| 7. 统计学方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 自噬抑制剂3-MA对无血清培养人脐带间充质干细胞的影响 |
| 2. 淫羊藿素增加无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体蛋白 |
| 3. 淫羊藿素抑制无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体自噬 |
| 4. 淫羊藿素提高无血清培养人脐带间充质干细胞的线粒体膜电位 |
| 四、讨论 |
| 第四部分 淫羊藿素预处理人脐带间充质干细胞蛋白质组学分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 1. 蛋白浓度测定结果 |
| 2. 差异蛋白筛选结果 |
| 3. 生物信息学分析 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（5）人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1. 乙型肝炎病毒 |
| 1.1 HBV的起源与进化 |
| 1.2 HBV的病毒结构 |
| 1.3 HBV的基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.4 HBV的感染机制和生命周期 |
| 2. 乙型肝炎病毒感染及其造成的相关肝脏疾病 |
| 2.1 HBV感染的主要宿主 |
| 2.2 HBV的全球流行状况 |
| 2.3 HBV感染的自然历史过程 |
| 2.4 HBV感染慢性化诱发的相关肝脏疾病 |
| 2.5 HBV感染的诊断和治疗 |
| 3. 乙型肝炎病毒感染细胞模型 |
| 3.1 基于人肝癌细胞系的HBV稳定复制细胞系 |
| 3.2 基于原代人肝细胞和原代树鼩肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.3 基于人肝脏祖细胞系HepaRG的HBV感染细胞模型 |
| 3.4 基于受体过表达的人肝癌细胞系的HBV感染细胞模型 |
| 3.5 基于受体过表达的原代猪肝细胞和原代猴肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.6 基于人干细胞分化获得类肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 4. 乙型肝炎病毒感染动物模型 |
| 4.1 灵长类HBV感染模型 |
| 4.2 树鼩HBV感染模型 |
| 4.3 土拨鼠替代模型 |
| 4.4 北京鸭替代模型 |
| 4.5 HBV转基因小鼠 |
| 4.6 基于病毒基因组转染的HBV复制小鼠模型 |
| 4.7 人类肝脏单嵌合小鼠模型支持HBV感染及抗病毒研究 |
| 4.7.1 免疫缺陷小鼠和细胞移植 |
| 4.7.2 uPA缺陷的免疫缺陷小鼠模型 |
| 4.7.3 HSV-tk/NOG小鼠模型 |
| 4.7.4 Fa~(-/-)Rag2~(-/-)IL2rg~(-/-)(FRG)小鼠模型 |
| 4.7.5 FRGS小鼠模型 |
| 4.8 人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型支持HBV相关疾病研究 |
| 4.8.1 AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型 |
| 4.8.2 人肝和人免疫系统双嵌合的FRGN和uPA-NOG小鼠 |
| 4.8.3 A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠 |
| 4.8.4 HIS-Hep-FRGN小鼠 |
| 4.8.5 HIS-HUHEP-uPA/NRG小鼠 |
| 5. 人骨髓间充质干细胞的生物学特性 |
| 5.1 人骨髓间充质干细胞的发现 |
| 5.2 人骨髓间充质干细胞的分离纯化和体外培养 |
| 5.3 人骨髓间充质干细胞的多向分化分化潜能和免疫调节功能 |
| 5.4 人骨髓间充质干细胞移植治疗暴发性肝衰竭的分子机制 |
| 6. 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 7. 研究中用到的主要仪器、耗材和试剂 |
| 7.1 主要仪器 |
| 7.2 常规耗材 |
| 7.3 生物化学与细胞生物学常规基础试剂 |
| 7.4 定性和定量检测试剂盒 |
| 7.5 实验用主要溶液及培养基配制 |
| 7.6 常规PCR引物 |
| 7.7 常规抗体和荧光素 |
| 7.8 实验动物和细胞 |
| 8. 常规分子生物学及细胞生物学实验方法 |
| 8.1 ELISA/CLEIA检测 |
| 8.2 Western Blot检测 |
| 8.3 细胞免疫荧光实验 |
| 8.4 免疫组化和病理学染色实验 |
| 8.5 常规流式细胞技术 |
| 8.6 常规哺乳动物细胞培养方法 |
| 9. hBMSC-FRGS小鼠模型构建和鉴定 |
| 9.1 hBMSCs分离、传代培养、冻存、复苏和鉴定 |
| 9.2 FHF-FRGS小鼠的构建及hBMSCs移植手术 |
| 9.3 肝脏灌流分离肝内实质细胞和非实质细胞 |
| 9.4 分离鉴定人源细胞及检测相关标志物 |
| 9.5 鉴定人源肝细胞和鼠源肝细胞是否发生融合 |
| 10. HBV感染相关病毒学和病理学检测 |
| 10.1 不同基因型HBV病毒生产与纯化 |
| 10.2 HBV蛋白与核酸检测方法 |
| 10.3 hBMSC-FRGS小鼠人源免疫反应分析 |
| 10.4 肝硬化诊断方法 |
| 11. 数据处理与统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 hBMSCs移植暴发性肝衰竭FRGS小鼠 |
| 12.1 hBMSCs表型鉴定 |
| 12.2 hBMSCs移植拯救FHF-FRGS小鼠免于死亡 |
| 12.3 hBMSC-FRGS小鼠实现人源肝细胞嵌合 |
| 12.4 hBMSC-FRGS小鼠实现多种人源免疫细胞嵌合 |
| 12.6 嵌合肝脏内的人源肝和鼠源肝细胞未发生融合 |
| 12.7 hBMSC-FRGS小鼠长期安全性评估 |
| 12.8 FHF肝脏微环境是hBMSCs转分化的关键驱动因素 |
| 12.9 第一部分小结 |
| 第二部分 hBMSC-FRGS小鼠支持慢性化HBV感染 |
| 13.1 hBMSC-FRGS小鼠支持多种基因型HBV感染 |
| 13.2 hBMSC-FRGS小鼠支持C基因型HBV感染慢性化 |
| 13.3 第二部分小结 |
| 第三部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠免疫病理生理学研究 |
| 14.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠肝人源内免疫细胞变化 |
| 14.2 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内人源细胞因子变化 |
| 14.3 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠发生重症肝炎 |
| 14.4 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠产生特异性针对HBV抗原的T细胞 |
| 14.5 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠血清HBV特异性抗体水平变化 |
| 14.6 第三部分小结 |
| 第四部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠诱发人源肝硬化 |
| 15.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清学肝硬化指标变化 |
| 15.2 HBV感染肝hBMSC-FRGS小鼠组织学肝硬化指标变化 |
| 15.3 肝硬化区域种属特异性鉴定 |
| 15.4 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 16. HBV细胞模型和动物模型的发展历程 |
| 17. 基于间充质干细胞的人类肝脏再生和免疫系统重建 |
| 18. HBV感染慢性化和诱导肝脏疾病发生的关键机制 |
| 19. 新型HBV抗病毒治疗策略与关肝脏疾病的防治措施 |
| 第五章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间科研成果 |
（6）双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记BMSCs移植治疗大鼠肝脏缺血再灌注损伤的MR活体示踪（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分 双模态对比剂Molday ION~(TM) EverGreen标记大鼠骨髓间充质干细胞及体外MR成像研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 主要试剂和实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 检测指标 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 大鼠BMSCs的培养及鉴定 |
| 3.2 BMSCs的Molday ION~(TM) EverGreen标记效率 |
| 3.3 20 μg/ml Molday ION~(TM) EverGreen标记P3代BMSCs台盼蓝染色 |
| 3.4 HOECHST33342/PI染色激光扫描共聚焦检测不同浓度Molday ION~(TM)EverGreen标记细胞16 h后的BMSCs存活率 |
| 3.5 Molday ION~(TM) EverGreen-BMSCs体外MR成像 |
| 4 讨论 |
| 4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养、传代 |
| 4.2 骨髓间充质干细胞的鉴定 |
| 4.3 骨髓间充质干细胞的标记 |
| 4.4 Molday ION~(TM) EverGreen标记骨髓间充质干细胞的标记效果探讨及MR体外成像 |
| 4.5 Molday ION~(TM) EverGreen标记骨髓间充质干细胞后细胞的活力和存活率检测 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 同种异体肝门静脉移植Molday ION~(TM) EverGreen标记的BMSCs治疗大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型的MR活体示踪研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物及分组 |
| 2.2 主要试剂和实验仪器 |
| 2.3 模型建立方法 |
| 2.4 细胞标记及移植 |
| 2.5 磁共振成像 |
| 2.6 检测指标 |
| 2.7 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 动物模型大体情况 |
| 3.2 大鼠缺血再灌注损伤后不同恢复时间MR活体示踪及受损肝脏微血管渗透性的变化 |
| 3.3 术后不同时间ALT、AST检测结果比较 |
| 3.4 BMSCs标记和肝脏移植结果 |
| 3.5 肝组织普鲁士蓝染色结果 |
| 3.6 肝组织病理学改变 |
| 3.7 肝细胞凋亡情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 骨髓间充质干细胞移植与肝脏缺血再灌注损伤 |
| 4.2 BMSCs移植与双模态示踪 |
| 4.3 缺血再灌注损伤与微血管渗透性改变 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（7）聚合物短纤维作为可注射药物载体和细胞球培养支架的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 三维类组织的体外构建 |
| 1.1.1 体内组织和器官的结构特点 |
| 1.1.2 体外构建三维类组织的方法 |
| 1.1.3 体外构建三维类组织的应用 |
| 1.2 细胞球体 |
| 1.2.1 细胞球体的特点 |
| 1.2.2 细胞球体的构建方式 |
| 1.2.3 细胞球体用于药物筛选体外模型 |
| 1.2.4 细胞球体用于组织修复和细胞治疗 |
| 1.3 电纺丝纤维的生物医学应用 |
| 1.3.1 电纺纤维的特点 |
| 1.3.2 电纺纤维作为药物载体的研究现状 |
| 1.3.3 电纺纤维作为组织工程的支架 |
| 1.4 课题的立题意义和研究内容 |
| 1.4.1 研究目的和意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 论文的创新点 |
| 第二章 短纤维培养原代肝细胞球体用于体外药物筛选 |
| 2.1 实验部分 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 短纤维的制备 |
| 2.1.3 短纤维表面修饰半乳糖和RGD |
| 2.1.4 短纤维的表征 |
| 2.1.5 短纤维与原代肝细胞的共培养 |
| 2.1.6 原代肝细胞球体的表征 |
| 2.1.7 原代肝细胞球体功能的测定 |
| 2.1.8 原代肝细胞球体药物代谢表征 |
| 2.1.9 药物代谢的诱导和抑制实验 |
| 2.1.10 数据统计分析 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 短纤维的表征 |
| 2.2.2 短纤维长度对肝细胞球体功能的影响 |
| 2.2.3 短纤维长度对原代肝细胞球体形貌的影响 |
| 2.2.4 半乳糖和RGD接枝密度对肝细胞球体功能的影响 |
| 2.2.5 表征原代肝细胞球体 |
| 2.2.6 原代肝细胞球体用于药物代谢研究 |
| 2.2.7 诱导剂和抑制剂对原代肝细胞球体药物代谢的影响 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 原代肝细胞和HepG2细胞球体作为体外葡萄糖和脂质代谢模型 |
| 3.1 实验部分 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 短纤维的制备和表征 |
| 3.1.3 原代肝细胞和人肝癌细胞球体培养 |
| 3.1.4 肝细胞球体的表征 |
| 3.1.5 肝细胞球体的功能和活力表征 |
| 3.1.6 肝细胞球体研究葡萄糖代谢 |
| 3.1.7 肝细胞球体研究脂质代谢 |
| 3.1.8 肝细胞球状体的酶活性分析 |
| 3.1.9 肝细胞球体的激素响应和药物敏感性表征 |
| 3.1.10 肝细胞球体葡萄糖代谢和脂质代谢相关基因的表达 |
| 3.1.11 数据统计分析 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 肝细胞球体的表征 |
| 3.2.2 肝细胞球体肝特异性功能的表征 |
| 3.2.3 肝细胞球状体的葡萄糖代谢 |
| 3.2.4 肝细胞球体对葡萄糖代谢激素的响应 |
| 3.2.5 肝细胞球体的脂质代谢表征 |
| 3.2.6 肝细胞球体的PEPCK和AMPK酶活性 |
| 3.2.7 肝细胞球体对血糖调节药物和降脂药物的响应 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 瘤内注射载药短纤维的抗肿瘤效果 |
| 4.1 实验部分 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 载药短纤维的制备 |
| 4.1.3 载药短纤维的表征 |
| 4.1.4 载药短纤维的体外药物释放 |
| 4.1.5 载药短纤维的细胞毒性和细胞凋亡 |
| 4.1.6 瘤内注射载药短纤维对肿瘤进行治疗 |
| 4.1.7 载药短纤维的体内抗肿瘤效果 |
| 4.1.8 药物和短纤维在组织及肿瘤内的分布 |
| 4.1.9 肿瘤组织学分析 |
| 4.1.10 数据统计分析 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 载药短纤维的表征 |
| 4.2.2 载药短纤维的体外药物释放 |
| 4.2.3 载药短纤维的细胞毒性和细胞凋亡 |
| 4.2.4 短纤维释放的药物在组织中的分布 |
| 4.2.5 纤维释放药物和载药短纤维在肿瘤中的空间分布 |
| 4.2.6 载药短纤维抑制肿瘤生长 |
| 4.2.7 载药短纤维对动物存活率和体重的影响 |
| 4.2.8 载药短纤维对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 体外三维培养MCF-7细胞球体构建类肿瘤模型 |
| 5.1 实验部分 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 载药短纤维的制备 |
| 5.1.3 载药短纤维的表征 |
| 5.1.4 载药短纤维促肿瘤细胞增殖 |
| 5.1.5 肿瘤细胞球体的培养 |
| 5.1.6 肿瘤细胞球体的表征 |
| 5.1.7 肿瘤细胞球体的基因表达分析 |
| 5.1.8 肿瘤细胞球体的致瘤性 |
| 5.1.9 数据统计分析 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 药物浓度对肿瘤细胞增殖的影响 |
| 5.2.2 载药短纤维的表征 |
| 5.2.3 载药短纤维对肿瘤细胞增殖的影响 |
| 5.2.4 肿瘤细胞球体的表征 |
| 5.2.5 肿瘤细胞球体的组织学评价 |
| 5.2.6 肿瘤细胞球体的增殖效果 |
| 5.2.7 肿瘤细胞球体恶性肿瘤因子基因的表达 |
| 5.2.8 表征肿瘤细胞球体的上皮间充质转化和癌症干细胞表型 |
| 5.2.9 肿瘤细胞球体在体内的成瘤表征 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 可注射凝胶携载干细胞球体和短纤维用于软骨缺损和关节炎的治疗 |
| 6.1 实验部分 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 载药短纤维的制备 |
| 6.1.3 短纤维的表征 |
| 6.1.4 水凝胶的制备 |
| 6.1.5 可注射凝胶的表征 |
| 6.1.6 载药短纤维及凝胶包裹载药短纤维的药物释放 |
| 6.1.7 干细胞球的体外培养 |
| 6.1.8 干细胞球体的体外软骨分化 |
| 6.1.9 软骨缺损和关节炎的治疗 |
| 6.1.10 软骨缺损的修复效果和组织学评价 |
| 6.1.11 修复缺损软骨的生物化学和生物力学分析 |
| 6.1.12 检测关节炎中的炎症表达 |
| 6.1.13 数据统计分析 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 水凝胶的表征 |
| 6.2.2 短纤维增强水凝胶力学强度的表征 |
| 6.2.3 水凝胶的形貌表征 |
| 6.2.4 短纤维和水凝胶性质对BMSC分化成软骨的影响 |
| 6.2.5 考察骨髓间充质干细胞体外软骨分化效果 |
| 6.2.6 缺损软骨修复效果的评估 |
| 6.2.7 修复软骨组织的生物化学和生物力学分析 |
| 6.2.8 塞来昔布体外药物释放及细胞毒性 |
| 6.2.9 关节炎中炎症的抑制效果 |
| 6.2.10 骨关节炎的治疗效果 |
| 6.3 本章小结 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
（8）骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 国内外研究概况 |
| 第一部分 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（9）肝脏脱细胞生物支架的制备及诱导骨髓间充质干细胞肝向分化的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、肝脏组织工程与再生医学研究 |
| 1. 组织工程与再生医学的发展 |
| 2. 肝脏胚胎发育和调控机制 |
| 3. 种子细胞类型和来源 |
| 4. 生物人工肝 |
| 5. 细胞移植治疗 |
| 6. 肝脏组织工程 |
| 二、全器官脱细胞生物支架 |
| 1. 脱细胞支架的制备 |
| 2. 脱细胞支架的灭菌 |
| 3. 脱细胞支架的鉴定 |
| 4. 脱细胞支架的结构和功能 |
| 5. 全器官组织工程的研究进展 |
| 6. 脱细胞支架的研究前景 |
| 三、干/祖细胞肝向分化的体外诱导和鉴定 |
| 1. 体外诱导分化的常见方案 |
| 2. 肝向分化程度的检测手段 |
| 3. 干/祖细胞肝向分化的调控机制 |
| 实验一 DLB 制备及其细胞相容性和免疫原性的研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 DLB 体外诱导 MSCS 向肝系细胞分化的研究 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 DLB 预处理 MSCS 对慢性肝纤维化的治疗作用 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（10）类肝细胞的研究进展（论文提纲范文）
| 1 体外实验研究 |
| 2 体内实验研究 |
| 3 肝卵圆细胞与类肝细胞的联系与区别 |
| 4 展望 |
四、骨髓间充质干细胞来源类肝细胞的功能和超微结构评估（论文参考文献）
- [1]hucMSCs来源的外泌体促进大鼠肝切除术后肝再生的机制研究[D]. 宋晓静. 兰州大学, 2021(09)
- [2]人脐带间充质干细胞治疗小儿心脏扩大伴心衰类心肌病的单中心、非随机、开放性真实世界研究[D]. 单光颂. 青岛大学, 2020(01)
- [3]ADSC-CM对小型猪腹腔镜肝IRI合并部分肝切除保护作用的研究[D]. 焦智慧. 东北农业大学, 2020(04)
- [4]淫羊藿素调控人脐带间充质干细胞的凋亡及线粒体自噬的机理研究[D]. 王璐. 广州中医药大学, 2019(08)
- [5]人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究[D]. 袁伦志. 厦门大学, 2019(08)
- [6]双模态对比剂Molday IONTM EverGreen标记BMSCs移植治疗大鼠肝脏缺血再灌注损伤的MR活体示踪[D]. 杨荣. 浙江大学, 2019(03)
- [7]聚合物短纤维作为可注射药物载体和细胞球培养支架的研究[D]. 韦佼君. 西南交通大学, 2018
- [8]骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究[D]. 袁淑芳. 新疆医科大学, 2013(02)
- [9]肝脏脱细胞生物支架的制备及诱导骨髓间充质干细胞肝向分化的研究[D]. 季茹. 第四军医大学, 2013(02)
- [10]类肝细胞的研究进展[J]. 龚慧宾,张全胜,沈中阳,宋红丽. 天津医科大学学报, 2011(02)