一、Effects of dl-praeruptorin A on nucleus factor-κB and tumor necrosis factor-α expression in ischemia-reperfusion hearts（论文文献综述）
姜玲玲[1]（2021）在《激活素A与TNF-α在成纤维细胞活化调控中的相互拮抗作用研究》文中提出肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是公认的致炎细胞因子,可作用于多种细胞。激活素A属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员,被认为是诱导组织纤维化的重要细胞因子,可促进M2型巨噬细胞活化,并抑制细菌脂多糖（LPS）活化M1型巨噬细胞。成纤维细胞是机体参与炎症应答的重要细胞,也是组织创伤修复的主要功能细胞,其异常活化则会导致组织瘢痕形成或纤维化。在机体炎症应答时,组织中TNF-α和激活素A水平均升高。然而,激活素A能否作为TNF-α的天然拮抗剂发挥抗炎作用,以及激活素A与TNF-α能否协同调控成纤维细胞活化,仍不清楚。因此,本研究首先选用TNF-α活性测定靶细胞L929细胞（小鼠成纤维细胞系）探讨激活素A与TNF-α调控小鼠成纤维细胞活化的联合作用及相关机制,并进一步应用原代培养细胞确定激活素A与TNF-α对人成纤维细胞活性的联合调控作用。一、研究方法1.小鼠成纤维细胞活性检测CCK-8法和实时细胞分析（RTCA）检测小鼠L929细胞增殖和黏附;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA检测细胞分泌白细胞介素-6（IL-6）和TGF-β1水平;RT-PCR和Western blotting检测细胞外基质及相关蛋白酶mRNA和蛋白表达水平;Transwell小室法和微流控技术分析细胞迁移能力。2.小鼠成纤维细胞活化机制分析流式细胞术检测L929细胞内钙离子水平及细胞膜相关受体表达水平;RT-PCR和Western blotting检测Smad和MAPK信号通路相关分子mRNA和蛋白表达水平。3.人牙周韧带成纤维细胞培养体外组织块贴壁法培养人牙周韧带细胞（hPDLCs）;采用免疫细胞化学染色鉴定细胞。4.人成纤维细胞活性检测CCK-8法和RTCA分析hPDLCs增殖和黏附;ELISA检测细胞分泌IL-6和TGF-β1水平;RT-PCR和Western blotting检测细胞外基质及相关蛋白酶mRNA和蛋白表达水平;Transwell小室法和微流控技术分析细胞迁移能力。5.人成纤维细胞活化机制分析RT-PCR和Western blotting检测hPDLCs的Smad和MAPK信号通路相关分子mRNA和蛋白表达水平。二、研究结果1.激活素A与TNF-α对小鼠L929成纤维细胞活性影响1.1 TNF-α抑制L929细胞增殖并诱导其凋亡,而激活素A拮抗TNF-α上述作用。1.2 TNF-α诱导L929细胞分泌炎性介质NO和IL-6,但激活素A抑制TNF-α此作用。1.3激活素A促进L929细胞分泌TGF-β1,TNF-α则抑制激活素A诱导的TGF-β1分泌。1.4激活素A上调L929细胞FN、Col I及MMP-2 mRNA表达,而TNF-α下调激活素A诱导的FN和MMP-2 mRNA高表达;TNF-α促进MMP-9 mRNA表达,而激活素A抑制TNF-α诱导的MMP-9 mRNA表达升高。Western blotting证实激活素A上调L929细胞MMP-2蛋白表达,TNF-α则抑制激活素A诱导的MMP-2蛋白表达升高;TNF-α上调L929细胞MMP-9蛋白表达,而激活素A下调TNF-α诱导的MMP-9蛋白高表达。1.5激活素A与TNF-α单独应用均可增强L929细胞黏附能力,两者联合具有协同增强作用。1.6激活素A诱导L929细胞迁移,TNF-α则抑制L929细胞向激活素A趋化迁移。2.激活素A与TNF-α调控小鼠成纤维细胞活化机制2.1激活素A诱导L929细胞内钙离子水平升高,而TNF-α可削弱其作用。2.2激活素A对L929细胞膜TNFR1和TNFR2表达无明显影响,但TNF-α下调细胞膜ActRⅡA表达。2.3激活素A对L929细胞Smad信号相关分子表达无显着影响,但显着上调L929细胞p-ERK1/2蛋白水平;TNF-α上调p-ERK1/2和p-JNK蛋白水平,但激活素A与TNF-α联合作用后,p-ERK1/2蛋白水平较TNF-α单独作用明显降低。2.4 ERK抑制剂FR180204不仅抑制激活素A引起的L929细胞p-ERK1/2蛋白水平升高,也显着削弱激活素A诱导的L929细胞迁移。3.激活素A与TNF-α对人成纤维细胞活性影响3.1体外组织块贴壁法成功培养hPDLCs,免疫细胞化学染色显示细胞抗角蛋白染色呈阴性,抗波形丝蛋白染色呈阳性,符合成纤维细胞特征。3.2 TNF-α抑制hPDLCs增殖并促进其分泌IL-6,而激活素A拮抗TNF-α上述作用。3.3激活素A促进hPDLCs分泌TGF-β1,但此效应可被TNF-α抑制。3.4激活素A促进hPDLCs的FN、Col I和MMP-9 mRNA表达,而TNF-α下调激活素A诱导的MMP-9 mRNA高表达。Western blotting结果同样显示激活素A上调hPDLCs的MMP-9蛋白表达,而TNF-α则下调激活素A诱导的MMP-9蛋白表达升高。3.5激活素A与TNF-α均可提高hPDLCs黏附活性,两者联合具有协同增强作用。3.6激活素A诱导hPDLCs迁移,而TNF-α抑制激活素A诱导的hPDLCs迁移。4.激活素A与TNF-α调控人成纤维细胞活化机制4.1激活素A对hPDLCs的Smad信号相关分子表达无显着影响,而TNF-α下调ActRⅡA表达。4.2激活素A上调hPDLCs的p-ERK1/2和p-p38蛋白水平,而TNF-α拮抗激活素A引起的ERK1/2和p38磷酸化水平升高。三、结论综上所述,激活素A属于新的成纤维细胞趋化因子,并且激活素A与TNF-α对成纤维细胞活性调控作用不同,两者联合作用成纤维细胞主要表现为相互拮抗效应,其拮抗作用不通过经典Smad信号通路,而是通过ERK信号介导。上述结果提示,激活素A可能作为TNF-α的天然拮抗剂在炎症活动期发挥抗炎作用,而TNF-α可能通过拮抗激活素A作用发挥抗纤维化效应,两者的作用平衡可能是影响成纤维细胞活性的关键因素。本研究不仅揭示激活素A与TNF-α共同调控成纤维细胞活化具有重要的生物学意义,也为进一步探索成纤维细胞介导疾病的治疗药物靶点提供新的思路和研究基础。
李相国[2]（2021）在《基于TLR4/NF-κB通路探究鬼箭羽醇提物对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响与机制》文中研究指明目的:通过TLR4/NF-κB通路探究鬼箭羽醇提物（Ethanolic Extracts of Euonymus Alatus,EEEA）对大鼠脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI）的影响及作用机制。方法:150只SD雄性大鼠,随机分为假手术组（Sham operation group,SG）、模型组（Model group,MG）、瑞舒伐他汀组（Rosuvastatin Calcium group,RG）、鬼箭羽醇提物低、中、高剂量组（EEEA-L、EEEA-M、EEEA-H）,每组25只。EEEA-L、EEEA-M、EEEA-H分别按0.05g·kg-1、0.1g·kg-1、0.2g·kg-1的剂量给予EEEA混悬液灌胃,RG按5mg·kg-1的剂量给予瑞舒伐他汀钙片混悬液灌胃,SG、MG给予等容量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃,每日1次,连续给药7d。末次给药后2h,制备MCAO/R模型。再灌注后24h,对大鼠进行m NSS评分。取脑组织做TTC染色计算脑梗死体积百分比,HE染色法观察缺血侧皮质区病理形态变化,采用ELISA法检测血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的变化,采用Western Blot法及RT-q PCR法检测脑缺血半暗带区TLR4、NF-κBp65蛋白及mRNA的表达水平。结果:（1）mNSS评分结果示:与SG比较,其他各组大鼠神经功能缺损评分显着升高（P<0.05）;与MG比较,EEEA-H大鼠神经功能缺损评分明显降低（P<0.05）。（2）TTC染色结果示:与MG相比,EEEA-M、EEEA-H大鼠脑梗死体积百分比显着降低（P<0.05）。（3）HE染色结果示:SG神经元细胞均匀分布,细胞形态正常。MG脑组织出现坏死液化,形成网状软化灶,神经元数目减少,结构排列紊乱。EEEA各组脑组织软化灶、镂空状空洞、固缩变性神经元呈现剂量依赖性的减少,且正常的神经元数目也呈剂量依赖性的明显多于MG组。（4）ELISA结果示:与SG比较,MG大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量显着升高（P<0.05）;与MG相比,EEEA各组和大鼠血清TNF-α和IL-1β含量明显降低（P<0.05）,EEEA-M、EEEA-H大鼠血清IL-6含量也明显降低（P<0.05）。（5）Western Blot结果示:与SG比较,其他各组大鼠的TLR4、NF-κBp65蛋白表达均明显升高（P<0.05）;与MG相比,EEEA各组大鼠的TLR4蛋白表达显着下降（P<0.05）,EEEA-M、EEEA-H大鼠的NF-κBp65蛋白表达也明显降低（P<0.05）。（6）RT-q PCR结果示:与SG比较,其余各组大鼠TLR4、NF-κBp65的mRNA表达显着升高（P<0.05）;与MG相比,EEEA各组大鼠的TLR4、NF-κBp65的mRNA表达明显降低（P<0.05）。结论:EEEA可呈剂量依赖性减轻CIRI模型大鼠的神经功能缺损症状,减少脑梗死体积,改善缺血侧皮质区的病理损伤程度,从而发挥神经保护作用。其机制可能与抑制TLR4、NF-κBp65蛋白和mRNA的表达和降低血清TNF-α、IL-6和IL-1β含量水平有关。
戴策[3]（2021）在《ACY1215在大鼠脊髓损伤中通过抑制NF-κB和STAT3信号通路发挥抗炎及神经保护作用》文中指出研究背景:脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）是一种严重的创伤性中枢神经损伤疾病,其病因多为跌倒或交通事故。脊髓组织受外力的机械性压迫或者牵扯后,脊髓完整性受损。脊髓组织局部损伤后会发生一系列的病理改变,集中表现为炎症爆发,轴突脱髓鞘,胶质瘢痕形成。当前脊髓损伤的治疗效果较差,如何减轻脊髓损伤后的病理损伤的进程成为改善预后的研究焦点。因此寻找一种有效的治疗性小分子用于减轻炎症,保护神经显得尤为迫切。研究目的:本研究旨在探索选择性组蛋白去乙酰化酶6抑制剂ACY1215在大鼠脊髓损伤模型及星形胶质细胞模型是否具有抗炎、抑制瘢痕以及神经保护的作用。研究方法:选取6周龄SD（Sprague Dawley）大鼠T10节段脊髓组织,提取大鼠原代星形胶质细胞,使用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光染色法对星型胶质细胞进行细胞鉴定。在体外实验中,我们向培养集中加入脂多糖（LPS）刺激星形胶质细胞以模拟脊髓损伤的炎症环境。随后使用不同浓度ACY1215处理星形胶质细胞,并使用CCK8法对不同药物浓度下的星形胶质细胞进行活力鉴定,从而筛选出适用于星形胶质细胞的无毒浓度范围。在体外实验中,我们设置了空白组、LPS刺激组、LPS+5μM ACY1215组以及LPS+10μM ACY1215四个实验组。使用Real-time PCR法对肿瘤坏死因子α（TNFα）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、GFAP的基因转录水平检测,再用Western blotting法对TNFα、IL-1β、IL-6、GFAP、p-STAT3、STAT3、NF-κB P65、p-NF-κB P65、p-IKK、IKK、IκB、p-IκB进行蛋白表达水平检测。在体内实验中,我们取8周龄SD大鼠,使用Allen’s法制备大鼠脊髓损伤模型,根据不同处理方法我们将大鼠分为假手术组、损伤组、损伤后不同浓度的腹腔注射ACY1215处理组。28天后取大鼠脊髓损伤部位组织。我们使用Real-time PCR法及Western blotting法检测损伤组织中炎症因子（TNFα、IL-1β、IL-6）、髓鞘碱性蛋白（MBP）、GFAP、神经丝蛋白（NF-H）的m RNA及蛋白表达水平。最后我们使用劳克坚牢蓝（Luxol Fast Blue、LFB）髓鞘染色法,检测不同处理组的脱髓鞘水平。研究结果:我们的体外实验结果表明,ACY1215可以减轻LPS诱导的星形胶质细胞炎症因子及GFAP的产生,并可以抑制LPS激活的NF-κB及STAT3信号通路相关蛋白的磷酸化激活。在体内试验中,ACY1215同样抑制了损伤组织中的炎症因子及GFAP的释放,同时我们还发现,代表神经修复和再髓鞘化的NF-H、MBP表达量增加。组织染色也进一步证实,ACY1215处理组再髓鞘化水平较高。研究结论:以上研究结果表明ACY1215在大鼠脊髓损伤病理过程中发挥了抑制炎症,减少瘢痕形成以及促进神经修复的保护作用,且这种保护作用可能与其抑制NF-κB及STAT3信号通路相关。
曾曦[4]（2020）在《丹参酚酸A对脂多糖诱导的急性肾损伤的改善作用及分子机制研究》文中研究表明研究目的:本研究旨在探讨传统中药丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）中的活性成分丹酚酸A（Salvianolic acid A,SA）对脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）诱导的小鼠急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）的改善作用及相关作用机制。研究方法:动物实验:将32只雄性BALB/C小鼠（18±22g）随机分为4组,每组8只。空白对照组、LPS刺激的模型组、丹酚酸A+LPS治疗组、地塞米松（DEX）+LPS阳性对照组。造模前,通过灌胃给药的方式,预给药丹酚酸A+LPS治疗组丹酚酸A（60 mg/kg）1小时,阳性对照组通过腹腔注射方式给予地塞米松（5 mg/kg）1小时后,除空白对照组以外,其余组腹腔注射LPS（10 mg/mL）刺激18小时,18小时后用10%水合氯醛麻醉小鼠,集中处死。将小鼠肾脏石蜡包埋、切片后,苏木素-伊红（H&E）染色观察肾小管损伤情况;免疫组化法观察巨噬细胞在身损伤部位的聚集情况;血浆肌酐（Serum creatinine,Scr）和血尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）试剂盒检测Scr和BUN水平的变化;酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠血清中促炎因子肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factorα,TNF-α）和小鼠白介素-6（Interleukin-6,IL-6）释放水平。细胞实验:通过体外培养巨噬细胞系RAW264.7,用MTT法筛选出丹酚酸A最适给药浓度。将细胞分为空白对照组、LPS刺激的模型组、丹酚酸A+LPS治疗组、丹酚酸A单独给药组。造模前,分别给予丹酚酸A+LPS治疗组和丹酚酸A单独给药组丹酚酸A（10μM）1小时,LPS（1μg/mL）刺激18小时后,检测细胞上清液中TNF-α及IL-6释放水平;通过免疫印迹法（Western blot）检测炎症介质环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）、炎症相关信号通路Toll样受体4（Toll like receptor 4,TLR4）、髓样分化因子（Medullary differentiation factor,MyD88）、内质网应激相关蛋白p-PERK、CHOP、p-elF2α、elF2α以及丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路的蛋白表达情况;此外,通过流式细胞仪检测一氧化氮（Nitric oxide,NO）、活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的释放情况及细胞内Ca2+的释放情况,并通过免疫荧光法检测NF-κB/p65细胞核定位情况;计算机辅助模拟实验进一步观察丹酚酸A和LPS与TLR4结合位点的关系。结果:体内动物实验中,在LPS诱导的急性肾损伤小鼠模型中,采用H&E染色法观察肾脏组织学的形态变化以及肾小管损伤情况。与正常对照组肾小管相比,模型组肾小球明显萎缩、空泡化。与预期一样,丹酚酸A和DEX均可显着减轻LPS诱导的模型小鼠肾脏损伤。用血浆肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）试剂盒测定肾功能情况,结果与H&E染色法一致,丹酚酸A和DEX组均明显降低了Scr和BUN水平（p<0.01）。此外,丹酚酸A可显着抑制肾损伤小鼠血清中的炎性细胞因子TNF-α和IL-6的释放（p<0.01）。免疫组化的结果显示,急性肾损伤组肾脏组织中F4/80阳性巨噬细胞的聚集明显增多,而丹酚酸A和DEX均减少了F4/80阳性巨噬细胞浸润。总之,丹酚酸A通过抑制肾小球萎缩、降低Scr和BUN水平,显着改善LPS诱导的肾损伤。同时,丹酚酸A能显着降低血清炎性细胞因子的释放,阻断巨噬细胞在受损肾组织中的炎性浸润,提示丹酚酸A通过炕沿机制来改善肾损伤。体外实验研究中,通过MTT法检测丹酚酸A对巨噬细胞的最适给药浓度,根据MTT筛选结果,丹酚酸A的浓度在10μM时没有细胞毒性可以用于后续实验。在后续的研究中,通过Griess试剂盒以及NO流式荧光探针DAF-FM检测亚硝酸盐的生成情况,结果表明LPS刺激巨噬细胞RAW264.7中的NO的大量释放,而丹酚酸A给药组能够明显抑制LPS诱导NO的释放。Western blot结果表明,丹酚酸A能够显着抑制LPS诱导的巨噬细胞中COX-2以及i NOS的表达（p<0.01）,同时能够抑制LPS诱导的巨噬细胞上清液中促炎症因子TNF-α和IL-6的释放,这与体内实验的结果一致。Western blot结果显示,在RAW 264.7细胞中,丹酚酸A能显着抑制LPS激活的TLR4/MyD88通路的蛋白表达（p<0.01）。此外,沉默TLR4能够显着降低炎症因子TNF-α和IL-6的释放,这提示TLR4在炎症过程中的调节作用。内质网应激与许多急性疾病相关,在目前的研究中,Ca2+过载,PERK-EIF2α-CHOP通路与LPS诱导的内质网应激反应相关,而丹酚酸A预处理能够逆转这些现象。此外,氧化应激也参与急性肾损伤的发生发展过程,而丹酚酸A和ROS清除剂NAC均能减少LPS诱导的ROS生成。此外,Ca2+螯合剂BAPTA-AM和活性氧清除剂NAC都能抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症因子的释放。LPS能够激活巨噬细胞MAPK通路,丹酚酸A对JNK1/2的磷酸化有明显抑制作用（p<0.01）,但对ERK1/2和p38MAPK无明显影响。免疫荧光结果显示,丹酚酸A可显着抑制LPS诱导的NF-κB/p65向细胞核的转位。计算机辅助模拟实验表明,丹酚酸A和TLR4结合位点与LPS发生竞争性抑制,从而抑制LPS诱导的炎症信号通路TLR4的激活,抑制炎症的发生。结论及意义:基于以上研究背景,丹酚酸A可能对炎症性急性肾损伤具有潜在的治疗作用。综上所述,丹酚酸A可作为抑制炎症反应预防急性肾损伤的潜在治疗药物,能够为临床治疗急性肾损伤提供一定的理论依据和潜在治疗药物。
肖姣[5]（2020）在《PDE4抑制剂FCPR16对TNF-α诱导的神经损伤的保护作用及机制研究》文中认为目的:神经炎症是脑缺血、阿尔茨海默病等急、慢性神经系统疾病中常见的一种病理特征。在大脑受到微生物感染或各种不良刺激时,小胶质细胞活化并产生大量的炎症因子。磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4,PDE4）在小胶质细胞高度表达。抑制小胶质细胞中PDE4的活性,可通过减少炎症因子的转录及剪切成熟而发挥抗神经炎症的作用。但PDE4抑制剂能否直接对抗炎症因子引起的神经元损伤,还研究较少,其机制也还不清楚。FCPR16是本实验室合成的新型PDE4抑制剂,对PDE4D亚型具有较高的选择性。我们前期的研究显示:在抑郁症模型中FCPR16可减少M1型小胶质细胞的比例,从而减少炎症因子的产生。但FCPR16能否对抗炎症因子诱导的神经元损伤还不清楚。传统的炎症模型多采用细菌细胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）来构建。鉴于神经系统疾病的炎症大多是无菌性炎症,以炎症因子大量增加为特征。因此,本项目拟直接采用与临床实际情况更接近的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α,TNF-α）来诱导神经元损伤。我们以HT-22海马神经元细胞系为研究对象,用TNF-α建立神经损伤模型,探索FCPR16能否对抗TNF-α诱导的神经损伤及其可能的作用机制。方法:（1）不同浓度TNF-α（0.1-100 ng·mL-1）处理HT-22细胞24 h,获得TNF-α损伤细胞的量效关系,建立神经损伤模型。在其基础上给予不同浓度的FCPR16（1.5-100 μM）预处理1 h,采用CCK-8法检测细胞存活力,考察FCPR16能否对抗TNF-α引起的细胞损伤。（2）采用流式细胞术检测细胞的凋亡比例;采用Hoechst染色检测HT-22细胞核形态变化;采用PI染色检测细胞死亡率;采用Western blot检测凋亡相关蛋白的表达。通过以上指标考察FCPR16能否对抗TNF-α引起的细胞凋亡。（3）通过转染PDE4B siRNA（siPDE4B）来进一步验证PDE4B在敲低条件下对神经元细胞的作用。利用Lippofectamine 2000在HT-22细胞内转染siPDE4B（100 nM）并给予 TNF-α（1.5 ng·mL-1）处理;采用 Western blot 检测凋亡相关蛋白的表达水平,采用PI染色检测siPDE4B对HT-22细胞死亡率的影响。（4）用 1.5 ng·mL-1 TNF-α 处理 HT-22 细胞不同时间（1-12 h）,获得 TNF-α影响细胞突触相关蛋白表达的时效关系。在其基础上给予FCPR16（50 μM）预处理 1 h,采用 Western blot 检测 FCPR16 对生长相关蛋白-43（growth associated protein-43,GAP-43）、突触蛋白1（Synapsin 1）及脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）表达水平的影响。通过以上指标评价FCPR16对HT-22细胞突触相关蛋白表达的影响。（5）FCPR16作用的信号通路研究:①采用Western blot检测FCPR16对HT-22细胞内c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-termminal kinase,JNK）磷酸化水平的影响。②给予FCPR16以及JNK抑制剂SP600125（1 μM）预处理1 h后,TNF-α（1.5 ng·mL-1）刺激 12 h,采用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测细胞毒性,采用Western blot检测JNK抑制剂对细胞凋亡相关蛋白表达的影响。③采用Western blot和免疫荧光染色检测FCPR16对核因子-κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）核转位的影响。④采用Western blot检测一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）的表达水平,利用活性氧染色试剂盒检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生水平,用ELISA试剂盒检测3-三硝基酪氨酸（3-Nitrotyrosine,3-NT）水平,采用丙二醛（malondialdehyde,MDA）检测试剂盒测定MDA水平。⑤分别采用Western blot及免疫荧光染色检测内质网应激相关蛋白的表达。结果:（1）不同浓度（0.1-100ng·mL-1）TNF-α处理HT-22细胞24h,可剂量依赖性地降低细胞活力,在1.5 ng·mL-1浓度时,细胞存活率为50-60%;而FCPR16则呈浓度依赖性地增加HT-22细胞的活力。（2）在TNF-α建立的HT-22细胞神经损伤模型中,FCPR16能显着降低细胞早期及晚期细胞的凋亡率、改善细胞核形态并显着下调Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 8 的表达水平。（3）在TNF-α引起的神经炎症条件下,敲减PDE4B显着降低HT-22细胞Cleaved caspase 3 及 Cleaved caspase 8 的水平及 PI 阳性细胞数。（4）1.5 ng·mL-1 TNF-α处理HT-22细胞后,TNF-α呈时间依赖性地降低突触相关蛋白GAP-43及Synapsin 1的表达,而给予FCPR16后,突触相关蛋白GAP-43、Synapsin 1及BDNF表达水平显着上升。（5）与TNF-α模型组相比,FCPR16显着降低JNK的磷酸化水平,而对总JNK的蛋白表达没有显着影响,JNK抑制剂SP600125显着降低LDH的释放水平,降低Cleaved caspase 3的表达。在TNF-α处理后,核NF-κB p65表达显着增加,而FCPR16显着降低核内NF-κB p65表达水平。我们同时发现FCPR16能显着降低iNOS表达水平、减少ROS的产生并降低3-NT和MDA水平。（6）TNF-α对内质网应激相关蛋白葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated p rotein78 kD,GRP78）及真核起始因子 2α（eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α）的磷酸化水平没有影响,也未观察到FCPR16对eIF2α磷酸化水平的影响。结论:PDE4抑制剂FCPR16能拮抗TNF-α引起的HT-22神经细胞损伤,其机制可能是FCPR16阻断了 TNF-α对JNK和NF-κB/iNOS信号通路的激活,从而减少活性氧的产生,降低神经元细胞凋亡率,并减轻突触损伤。
余沈桐[6]（2019）在《缺氧通过SIRT1影响结直肠癌的进展》文中进行了进一步梳理近年来,结直肠癌已跃居全球第三高发的恶性肿瘤。尽管不断更新的治疗方法使结直肠肿瘤患者的预后水平有所提高,但其中位生存期也仅约为18至22个月。因此,深入揭示结直肠癌发生发展的分子机制至关重要。结直肠癌是一种实体瘤。随着瘤体的不断增大,肿瘤中心部位组织常常处于缺乏血供的缺氧状态。肿瘤组织为了适应缺氧的微环境,会通过改变基因表达谱来调整其生物学行为。缺氧性肿瘤微环境能够通过诱导上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）、激活细胞自噬、促进炎细胞浸润等过程,促进肿瘤的发生和进展。沉默信息调节因子1（Silencing information regulator 1,SIRT1）是一种NAD+依赖的去乙酰化酶,通过催化组蛋白与非组蛋白发生去乙酰化调控多种信号途径,在细胞增殖、分化、凋亡、衰老及应激等过程中发挥重要作用。SIRT1在肿瘤的发生和进展过程中也同样起到重要作用,然而其到底是作为促癌因子抑或是抑癌因子而发挥作用,至今仍存在许多争议。大量研究表明,SIRT1能够对自噬的上游分子、起始复合物、自噬相关蛋白（Autophagy-related proteins,ATGs）等发挥去乙酰化作用,参与细胞自噬过程的调控。此外,SIRT1还能够通过与E-cadherin、vimentin、c-Myc、NF-κB（Nuclear factor-κB）、TGF-β（Transforming growth factor-β）等发生相互作用,对肿瘤的侵袭和迁移过程产生影响。在缺氧组织中,SIRT1受到HIF-1α（Hypoxia-inducible factor-1α）、Sp1和NF-κB等转录因子的调控,其表达水平的升高在心肌、肝和脑组织的缺血再灌注过程中发挥重要的保护作用;在肿瘤组织中,缺氧性微环境同样能够通过改变SIRT1的表达水平,影响肿瘤细胞的生物学行为。因此,本研究拟探讨缺氧条件下结直肠癌细胞中SIRT1表达水平的改变及其对细胞侵袭迁移、自噬的影响和相关分子机制。为了探究SIRT1在结直肠癌缺氧性微环境中表达水平的改变,我们以结直肠癌细胞系HCT116和SW480为研究对象,利用Western blot和real-time PCR对缺氧（1%O2）条件培养的肿瘤细胞进行了SIRT1表达水平检测,结果发现SIRT1 mRNA和蛋白表达水平随着缺氧时间的延长而降低,且在氯化钴模拟的化学性缺氧模型中也得到了相似的结果,表明缺氧能够抑制SIRT1的表达。通过对结直肠癌患者临床标本进行分析,发现与正常结直肠和癌旁组织相比,SIRT1在结直肠癌中的表达显着降低。为了明确缺氧影响SIRT1表达的具体机制,我们构建了含有不同长度SIRT1启动子序列截短体（自上游-1000 bp开始逐步截短）的双荧光素酶报告基因质粒;报告基因实验表明,缺氧影响SIRT1表达的核心转录调控区域位于其上游-100bp序列;利用生物信息学的方法,我们初步确定可能参与该调控过程的两个转录因子:EGR1（Early growth reponse 1）和USF2（Upstream stimulatory factor 2）,并利用已知转录因子Sp1作为阳性对照。研究结果表明,EGR1不仅能够调控SIRT1的转录水平,而且其转录激活作用超过Sp1,但未发现USF2对SIRT1具有转录调控作用;结合Western blot和染色质免疫共沉淀检测,我们发现EGR1在缺氧条件下表达降低,且与SIRT1上游-100 bp序列的结合明显减少;最后,针对该区域启动子进行点突变,我们发现EGR1结合于SIRT1上游-80-72 bp和-21-13 bp富含GC的模体（motif）上。由此,我们证实在缺氧条件下,EGR1调控SIRT1转录过程、影响SIRT1表达。为明确缺氧条件下SIRT1表达水平的改变是否对结直肠癌细胞生物学行为产生影响,我们分别构建了SIRT1敲减和过表达的稳定转染细胞株（HCT116 sh-SIRT1、SW480 Lenti-SIRT1）。利用Transwell方法,发现缺氧能够促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移,SIRT1敲减细胞和SIRT1抑制剂（EX527）处理细胞的侵袭和迁移能力明显增强,而SIRT1过表达细胞和SIRT1激动剂（SRT1720）处理细胞的侵袭和迁移能力显着受到抑制。利用Western blot和real-time PCR对肿瘤细胞NF-κB及其下游分子进行检测,结果显示在缺氧条件下,NF-κB p65亚基310位赖氨酸乙酰化程度增加、MMP-2和MMP-9表达水平增加;低表达SIRT1的HCT116细胞NF-κB的乙酰化水平、MMP-2和MMP-9的表达水平较亲本细胞明显升高,提示低表达的SIRT1可能通过激活NF-κB通路,促进MMP-2和MMP-9的表达,进而影响结直肠癌细胞的侵袭和迁移。此外,我们对缺氧条件下肿瘤细胞自噬流的改变也进行了初步探究。Western blot和透射电镜结果表明,缺氧能够使自噬底物p62明显减少、LC3-I/II转换增强;细胞内自噬溶酶体的形成增多,细胞器形态出现异常改变。与亲本细胞相比,过表达SIRT1的细胞p62表达水平增加、LC3-I/II转换受到抑制、细胞内自噬溶酶体数量减少。为了进一步观测细胞内自噬流的情况,我们采用GFP-mRFP-LC3荧光双标腺病毒感染细胞,结果显示SIRT1过表达细胞自噬体与溶酶体融合受到抑制,自噬流被阻断。以上结果提示SIRT1参与缺氧状态下结直肠癌细胞自噬的调控,但具体机制如何,有待于我们进一步研究。综上所述,我们发现SIRT1能够影响缺氧条件下结直肠癌的进展,首次阐明EGR1参与缺氧条件下SIRT1转录抑制过程的调控,提出缺氧通过EGR1-SIRT1-NF-κB途径调控结直肠癌的侵袭和迁移,且SIRT1介导了缺氧条件下结直肠癌细胞自噬过程的调控。该研究丰富了SIRT1在结直肠癌发生和进展中的作用,为结直肠癌的临床治疗提供了可能的靶点。
MEI Xiao-Dan,CAO Yan-Feng,CHE Yan-Yun,LI Jing,SHANG Zhan-Peng,ZHAO Wen-Jing,QIAO Yan-Jiang,ZHANG Jia-Yu[7]（2019）在《Danshen: a phytochemical and pharmacological overview》文中进行了进一步梳理Danshen, the dried root or rhizome of Salvia miltiorrhiza Bge., is a traditional and folk medicine in Asian countries, especially in China and Japan. In this review, we summarized the recent researches of Danshen in traditional uses and preparations, chemical constituents, pharmacological activities and side effects. A total of 201 compounds from Danshen have been reported, including lipophilic diterpenoids, water-soluble phenolic acids, and other constituents, which have showed various pharmacological activities, such as anti-inflammation, anti-oxidation, anti-tumor, anti-atherogenesis, and anti-diabetes. This article intends to provide novel insight information for further development of Danshen, which could be of great value to its improvement of utilization.
桑成林[8]（2018）在《TNF-α调控Semaphorin Ⅲ家族蛋白参与绝经后骨质疏松发生的机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分:绝经后骨质疏松疾病中TNF-α通过JNK信号途径上调Semaphorin3D蛋白表达诱导破骨细胞分化一、研究目的骨质疏松严重威胁中老年人健康,是全球性的公共卫生问题。女性绝经后诱导形成的骨质疏松症是目前研究最多,同时也是发病率最高的骨质疏松症类型。绝经后骨质疏松（Postmenopausal osteoporosis,PMOP）是一种与雌激素缺乏直接相关,以全身性骨量减少及骨组织显微结构破坏为特征,导致骨脆性增加和易于骨折的代谢性骨病。然而迄今有关PMOP发病的确切机制尚未完全阐释。雌激素减少导致破骨细胞的过度活跃是PMOP发生的重要机制之一。伴随妇女更年期雌激素水平的下降,促进了T细胞及成骨细胞等产生刺激破骨细胞分化和活化的细胞因子。体内的雌激素主要是通过这些细胞因子等途径间接调节破骨细胞的形成。目前发现,在这些因子中TNF-α作为PMOP发生的核心因素,其对破骨细胞分化的正向调控是PMOP中破骨细胞分化增加的重要原因。由于TNF-α对破骨细胞调控方式的多样性和调控机制的复杂性,其确切的调控机制仍需进一步探索。目前,越来越多的研究证实SemaphorinsⅢ（Sema3）家族蛋白在骨代谢紊乱以及骨质疏松疾病中具有重要功能。基因敲除Sema3A的小鼠骨质明显的减少。1,25-二羟基维生素D3（1,25-（OH）2D3）能够上调成骨细胞中Sema3B的表达,从而间接促进破骨细胞的分化引起骨吸收增加。然而,目前尚不清楚SemaⅢ家族蛋白是否也参与了PMOP中TNF-α对破骨细胞分化的调节作用。本研究拟通过体内及体外实验,结合分子生物学技术,应用基因沉默及过表达等干预手段,筛选PMOP中参与TNF-α诱导破骨细胞分化的SemaⅢ家族蛋白;明确SemaⅢ家族蛋白在TNF-α促进破骨细胞分化中的作用;探索TNF-α通过SemaⅢ家族蛋白促进破骨细胞分化的作用。本研究的完成对于探索绝经后骨质疏松的发生机制、寻找新的治疗靶点提供重要的理论依据。二、研究方法1、培养正常小鼠来源的破骨细胞,通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）技术对破骨细胞形成的标志性基因（TRAP、c-Fos和NFATc-1）表达检测等方法,明确TNF-α对破骨细胞分化的影响。2、在TNF-α促进RANKL诱导破骨细胞分化的过程中,通过qRT-PCR技术检测SemaⅢ家族蛋白（Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D和Sema3E）表达量的变化,并进一步检测SemaⅢ家族蛋白受体（Plx-A1、Plx-A2、Plx-A3、Plx-A4、NPR1和NPR2）表达量的改变。3、构建假手术组（Sham operation,Sham）小鼠、去卵巢组（Ovariectomized,OVX）小鼠、OVX+PBS小鼠及OVX+TNF-α中和性抗体（anti-TNF-α）小鼠模型,通过酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）实验检测各组模型小鼠血清中TNF-α水平的变化,并通过微计算机断层扫描技术（micro computed tomography,micro-CT）技术确定模型构建是否成功。4、通过TRAP染色观察Sham组、OVX组、OVX+PBS组及OVX+anti-TNF-α组小鼠股骨干骺端的破骨细胞数量变化。5、分离各组模型小鼠股骨及胫骨骨髓源性巨噬细胞（Bone marrow macrophages cells,BMMs）,体外诱导分化为成熟的破骨细胞,qRT-PCR及蛋白免疫印迹（Western blot）技术检测破骨细胞中Sema3D表达量的变化。6、应用Sema3D过表达及shRNA慢病毒载体感染破骨细胞前体细胞,通过TRAP染色及qRT-PCR检测破骨细胞形成的标志性基因（TRAP、c-Fos和NFATc-1）表达等方法,明确过表达/基因沉默Sema3D对细胞核因子κB受体活化因子（Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL）诱导的破骨细胞分化的影响,并进一步观察过表达/基因沉默Sema3D对TNF-α正向调控RANKL诱导破骨细胞分化的影响。7、通过CCK-8（Cell Counting Kit）活力测定实验、脱氧尿嘧啶核苷（EdU）荧光染色实验和CFSE荧光强度测定实验,观察过表达/基因沉默Sema3D对TNF-α诱导的破骨细胞前体细胞增殖的影响。8、通过Western Blot技术检测TNF-α对RANKL诱导破骨细胞分化的不同时间点中（5 min,15 min,30 min,60 min）p38、p65和JNK信号途径的影响。9、应用SB203580、BAY 11-7082、SP600125分别阻断p38、NF-κB以及JNK信号途径,通过qRT-PCR及Western blot技术检测TNF-α对Sema3D表达的影响。10、通过TRAP染色以及TRAP标志性基因的检测（TRAP,c-Fos和NFATc1）,观察阻断JNK信号途径后过表达Sema3D对破骨细胞分化的影响。11、构建了壳聚糖包被siRNA-Sema3D的纳米颗粒,通过尾静脉注射OVX小鼠。应用micro-CT逐层扫描技术观察Sham组,OVX组,OVX+siRNA-Sema3D组及OVX+siRNA-NC组小鼠的骨组织形态学改变。三、结果1、TNF-α能够增加TRAP阳性染色的破骨细胞数量,并且够促进破骨细胞中TRAP,NFATc1和c-Fos基因的表达,提示TNF-α能够促进RANKL诱导的破骨细胞形成。进一步研究发现,TNF-α通过作用于破骨细胞分化的早期阶段促进破骨细胞的形成。2、在TNF-α正向调控破骨细胞形成过程中SemaⅢ家族蛋白中的sema3D表达量增加最明显,并且TNF-α诱导的sema3D表达量的增加存在时间依赖性。此外,我们发现TNF-α在促进破骨细胞分化的过程中SemaⅢ家族蛋白受体NPR1的表达量明显减少,而Plx-A3的表达量轻微的减少。3、过表达Sema3D后能够明显的促进RANKL诱导破骨细胞分化,而阻断Sema3D后RANKL诱导的破骨细胞分化明显减少。此外,过表达Sema3D后能够明显的促进TNF-α正向调控RANKL诱导的破骨细胞分化,而阻断Sema3D后能够缓解TNF-α诱导的破骨细胞分化,提示Sema3D在TNF-α诱导破骨细胞分化的过程中具有重要功能。4、TNF-α能够明显的促进破骨细胞前体细胞的增殖,而基因沉默Sema3D后能够明显缓解TNF-α诱导的破骨细胞前体细胞增殖,这些结果证明Sema3D介导了TNF-α对破骨细胞前体细胞增殖的调控。过表达或基因沉默Sema3D后并未影响细胞的凋亡。5、在TNF-α正向调控RANKL诱导破骨细胞分化的过程中p38、p65和JNK信号途径被进一步的激活。应用SP600125阻断JNK信号途径后,能够明显的缓解TNF-α对Sema3D表达的促进作用。阻断JNK信号途径能够明显的缓解TNF-α诱导的破骨细胞分化,而阻断JNK信号途径后过表达Sema3D能够促进破骨细胞的形成。6、阻断内源性Sema3D后能够明显减少OVX诱导的小鼠骨质疏松,并且降低了小鼠血清中骨吸收指标CTX-1的水平。四、结论1、TNF-α是导致绝经后骨质疏松中破骨细胞分化增加、骨吸收增强的重要因素。雌激素缺乏后导致TNF-α水平升高,过量的TNF-α能够促进RANKL诱导的破骨细胞分化,并且这种诱导作用发生在破骨细胞分化的早期阶段。2、在TNF-α促进RANKL诱导的破骨细胞分化过程中,Sema3D的表达量明显增加。Sema3D的增加一方面通过促进破骨细胞前体细胞的增殖增加破骨细胞的数量,另一方面通过促进RANKL诱导的破骨细胞分化影响破骨细胞的形成。3、TNF-α通过激活JNK途径上调了Sema3D的表达。体内抑制Sema3D能够有效缓解OVX诱导的小鼠骨质疏松。第二部分:绝经后骨质疏松中TNF-α通过抑制Wnt/β-catenin信号途径下调Semaphorin3B表达抑制成骨细胞分化一、研究目的骨质疏松严重威胁中老年人健康,是全球性的公共卫生问题。女性绝经后诱导形成的骨质疏松症是目前研究最多,同时也是发病率最高的骨质疏松症类型。在我国60岁以上的女性中,骨质疏松的患病率高达40%-50%,其中约30%-50%将经历骨质疏松相关的骨折,这严重地影响老年人的身体健康及生活质量,甚至缩短寿命。与绝经相关的骨质疏松症是不可忽视的重要保健课题,探索其确切的发病机制对于PMOP的防治具有重要意义。骨骼是一种时刻发生着动态衍变的器官,而保持其生物结构的整体性和稳定性均需要依赖于骨重塑这样一种动态调节过程。骨重构是一个旧骨吸收与新骨形成的动态调节过程。研究证实,在绝经后骨质疏松发病过程的早期,破骨活动加强,成骨也随之代偿性加强,但随着病程的进展,成骨活动受到抑制,从而导致成骨破骨的平衡被打破,引起骨量丧失。研究发现,妇女更年期雌激素水平的下降,引起了一些炎症因子水平的变化。在这些因子中TNF-α是PMOP发生的核心因素。成骨细胞是由MSCs分化而来,而TNF-α可以通过其受体TNFR1来抑制MSCs的成骨分化。TNF-α对MSCs成骨分化的抑制作用是PMOP中骨形成减少的重要原因。然而,TNF-α抑制MSCs向成骨细胞分化的确切机制尚未完全阐释。SemaⅢ家族蛋白在骨稳态的调节中具有重要作用。研究发现,Sema3A能够促进成骨细胞的分化抑制破骨细胞的形成。Sema3E能够抑制小鼠成骨细胞的迁移并抑制破骨细胞的形成。此外,成骨细胞特异性高表达Sema3B的转基因小鼠,骨矿化明显增强。尽管这些研究证实SemaⅢ家族蛋白与骨代谢密切相关,然而目前尚不清楚SemaⅢ家族蛋白是否也参与了PMOP中TNF-α抑制MSCs向成骨细胞的分化。本研究拟通过体内及体外实验,结合分子生物学技术,应用基因沉默及过表达等干预手段,筛选PMOP中参与TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化的SemaⅢ家族蛋白;明确SemaⅢ家族蛋白在TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化中的功能;探索TNF-α通过SemaⅢ家族蛋白抑制BMMSCs向成骨细胞分化的分子机制。本研究的完成有助于阐释PMOP的发病机制,尤其是TNF-α相关的骨形成减少的分子机制。二、研究方法1、培养正常小鼠骨髓来源的MSCs（BMMSCs）细胞,在TNF-α抑制BMSCs向成骨细胞分化的不同时间点（0天、3天、7天、14天）,通过qRT-PCR技术检测SemaⅢ家族蛋白（Sema3A、Sema3B、Sema3C、Sema3D和Sema3E）表达量的变化,并通过Western blot技术进一步验证Sema3B在此过程中表达量的变化。2、构建Sham小鼠、OVX小鼠、OVX+PBS小鼠及OVX+anti-TNF-α小鼠模型,通过micro-CT技术确定模型构建是否成功,通过Elisa实验检测各组模型小鼠血清中TNF-α水平的变化,并通过免疫组化技术观察各组模型小鼠股骨干骺端TNF-α表达量的变化。3、构建TNF-α中和抗体抑制OVX诱导骨质疏松的小鼠模型,免疫组化技术观察各组模型小鼠股骨干骺端Sema3B表达量的变化,qRT-PCR技术检测SemaⅢ家族蛋白受体（Plx-A1、Plx-A2、Plx-A3、Plx-A4、NPR1和NPR2）表达量的变化。4、分离各组模型小鼠的BMMSCs,qRT-PCR技术检测细胞中Sema3B表达量的变化。5、分离各组模型小鼠的BMMSCs,体外成骨诱导分化培养不同的时间点（7天、14天）,qRT-PCR技术、western blot技术检测细胞中Sema3B表达量的变化,Elisa实验检测细胞培养液中TNF-α含量的变化。6、应用Sema3B过表达及shRNA慢病毒载体感染BMMSCs细胞,通过ALP染色、ALP活力测定、茜素红染色以及成骨细胞标志性基因（Runx2,Osterix和Osteocalcin）检测等方法,明确过表达/基因沉默Sema3B对BMMSCs向成骨细胞分化的影响,并进一步观察过表达/基因沉默Sema3B对TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化的影响。7、通过CCK-8活力测定实验、EdU荧光染色实验和CFSE荧光强度测定实验,观察过表达/基因沉默Sema3B对TNF-α抑制的BMMSCs细胞增殖的影响。8、QRT-PCR技术检测TNF-α对BMMSCs细胞中Wnt/β-catenin信号途径的几个关键蛋白分子DKK-1,GSK-3β和β-catenin表达的影响。9、分别应用Licl（20 mM）和BIO（5μM）激活BMMSCs细胞中的Wnt/β-catenin信号途径,并给与10 ng/ml的TNF-α处理24 h。Western blot实验检测BMMSCs细胞中Sema3B表达量的变化。三、结果1、TNF-α在抑制BMMSCs向成骨细胞分化的过程中sema3A,sema3C,sema3D和sema3E的表达量并没有发生明显的变化,而sema3B的表达量明显的减少且具有时间依赖性。2、OVX组小梁骨密度（BMD）和静态微观结构参数（Tb.Th、BV/TV和Tb.N）明显小于Sham组,OVX+anti-TNF-α组小鼠骨量相对于OVX组小鼠明显增加。OVX组小鼠相对于Sham组小鼠小梁骨变细、数量减少,TNF-α中和抗体能够缓解OVX引起的小鼠股骨干骺端小梁骨结构的变化。3、OVX组小鼠TNF-α水平明显高于Sham组小鼠,而应用TNF-α中和抗体能够有效地降低OVX组小鼠的TNF-α水平;OVX组小鼠相对于Sham组小鼠股骨干骺端TNF-α的表达明显增加,而应用TNF-α中和抗体能够明显减少TNF-α表达。4、OVX组小鼠相对于Sham组小鼠股骨干骺端Sema3B的表达明显减少,而OVX小鼠应用TNF-α中和抗体后能够明显增加Sema3B的表达;相对于Sham组小鼠,OVX组小鼠来源的BMMSCs（OVX-MSCs）中Sema3B的表达量明显减少,而TNF-α中和抗体的应用能够明显的增加OVX小鼠BMMSCs中Sema3B的表达。5、各组模型小鼠的BMMSCs,即（Sham-MSCs,OVX-MSCs,OVX+anti-TNF-α-MSCs）,通过体外成骨诱导分化培养7天和14天,结果显示相对于Sham-MSCs组,OVX-MSCs组中Sema3B的表达量明显减少,而OVX+anti-TNF-α-MSCs组相对于OVX-MSCs组Sema3B的表达明显增加;OVX-MSCs组相对于Sham-MSCs组细胞培养液上清中TNF-α的含量明显增加,而OVX+anti-TNF-α-MSCs组相对于OVX-MSCs组细胞培养液上清中TNF-α的含量明显减少。6、各组模型小鼠的BMMSCs细胞中,SemaⅢ家族蛋白受体NRP1,Plx-A1和Plx-A4表达量明显减少,而Plx-A3的表达量明显的增加。7、过表达Sema3B后能够明显的促进BMMSCs的成骨分化,而阻断Sema3B后BMMSCs的成骨分化明显减少;此外,过表达Sema3B后能够明显的缓解TNF-α抑制的BMMSCs向成骨细胞分化,而阻断Sema3D后能够促进TNF-α抑制的BMMSCs向成骨细胞分化。8、TNF-α能够明显的抑制BMMSCs细胞的增殖,而过表达Sema3B后能够明显缓解TNF-α对BMMSCs细胞增殖的抑制作用。9、TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化的过程中,DKK-1,GSK-3β和β-catenin的蛋白表达量明显降低,表明TNF-α能够明显的抑制BMMSCs细胞中Wnt/β-catenin信号途径。10、Wnt/β-catenin信号途径的激活能够明显的缓解TNF-α对BMMSCs细胞中Sema3B表达的抑制作用,提示TNF-α通过抑制Wnt/β-catenin信号途径负向调控Sema3B的表达。四、结论1、TNF-α是导致绝经后骨质疏松疾病中BMMSCs向成骨细胞分化抑制、骨形成减少的重要因素。在TNF-α抑制BMMSCs向成骨细胞分化过程中,Sema3B的表达量明显减少。Sema3B表达量的降低一方面通过影响BMMSCs的增殖来减少成骨细胞形成的数量,另一方面通过抑制BMMSCs细胞向成骨细胞分化影响骨形成。2、TNF-α抑制MSCs细胞向成骨细胞分化的过程中,DKK-1,GSK-3β和β-catenin的蛋白表达量明显降低,提示TNF-α能够明显的抑制MSCs细胞中Wnt/β-catenin信号途径。而Wnt/β-catenin信号途径的激活能够明显的缓解TNF-α对MSCs细胞中Sema3B表达的抑制作用,提示TNF-α通过抑制Wnt/β-catenin信号途径负向调控Sema3B的表达。
朱琳琳[9]（2017）在《HMGB1参与重度子痫前期发病机制及蓝萼甲素调节滋养细胞HMGB1表达的研究》文中认为研究背景子痫前期（preeclampsia,PE）是妊娠期特有的系统性疾病,以孕期出现高血压和蛋白尿为主要特征,可伴有多脏器功能损害,是产科常见疾病,发病率3%5%,且近年呈增高趋势。重度子痫前期（severe preeclampsia,sPE）是导致孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一,探讨其发病机制在临床预防与治疗中具有极其重要的意义和价值。近年研究显示,母体适度的炎症反应有利于维护正常妊娠过程,但炎症反应过度则会打破母胎界面免疫平衡,损伤内皮细胞、影响胎盘血管重铸,并导致滋养细胞功能紊乱、迁移受限,因此炎症反应是PE的重要病理基础。高迁移率簇蛋白1（high mobility group box 1,HMGB1）属于炎性细胞因子,参与介导炎症反应。近年研究显示,HMGB1在胎盘组织中也有表达,且在胎盘炎症局部表达升高。作为一种多功能蛋白质,HMGB1通过与其细胞表面受体结合,经过信号转导,促进炎症反应的发生和发展。晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycationend products,RAGE）与HMGB1具有极高亲和力,是HMGB1的主要受体。HMGB1通过与RAGE结合,活化核转录因子-κB（nuclear-κB,NF-κB）等信号通路,刺激炎性因子分泌,NF-κB作为炎性因子网络的中心环节与各种炎性介质协同作用,产生级联放大效应。如何调控HMGB1及其炎症反应信号通路的表达,对PE发病机制的研究及临床防治具有重要的意义和价值。调节炎症反应的药物种类繁多,但多具有细胞毒性,在抗炎的同时往往对机体也会造成一定伤害,而天然动、植物中存在多种毒性低且具有抗炎功能的活性成分。本研究选取的蓝萼甲素（Glaucocalyxin A,GLA）就属于香茶菜的活性成分之一。香茶菜属植物在我国分布广泛,民间当作草药使用历史悠久,中医认为香茶菜具有清热解毒、抗菌消炎、活血化瘀及抗肿瘤等多种功效。这些功效的发挥主要依靠香茶菜富含的多种活性成分,其中最主要的活性成分是对映-贝壳杉烷型二萜化合物,本课题研究选取的GLA就是典型的二萜化合物。这类化合物表现出良好的生物学活性,如抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化与免疫调节功能,其中抗炎作用研究较少、机制不清,引起了国内外药学界的极大关注。本课题检测sPE患者胎盘HMGB1-RAGE炎症反应信号通路相关分子的表达,并以滋养细胞为载体,在细胞水平进一步探讨HMGB1-RAGE信号通路的作用机制,在验证临床标本实验结果的同时,进一步阐明HMGB1调节滋养细胞炎症反应及其生物学行为的作用机制。此外,本课题以滋养细胞为载体,以GLA为调节物,进一步阐明HMGB1核浆转移参与滋养细胞炎症反应的机制以及GLA的抗炎机理,为HMGB1参与PE发病机制提供更多实验依据,为GLA的临床应用与PE的临床防治提供新的线索与实验基础。鉴于香茶菜植物资源极其丰富,对其抗炎机制的研究具有较好的开发应用前景。第一部分HMGB1信号通路在重度子痫前期患者胎盘中表达的研究目的探讨HMGB1信号通路相关因子HMGB1、RAGE、NF-κBp65在重度子痫前期发病机制中的作用,为进一步研究子痫前期的发病机制提供实验基础,为寻求子痫前期的分子标志物提供实验依据。方法1.实验分为sPE组与正常对照组:2010年10月至2014年4月间在郑州大学第三附属医院住院,临床诊断为重度子痫前期的患者64例作为sPE组,同期正常晚孕产妇61例作为正常对照组。收集两组孕产妇的胎盘与外周静脉血。2.联合哈佛大学麻省总医院肿瘤生物学实验室构建绒毛滋养细胞（villoustrophoblast,VT）组织芯片和绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast,EVT）组织芯片。3.Real time PCR检测sPE组与正常对照组胎盘中HMGB1、RAGE、NF-κBp65转录水平上的表达。4.Western blotting检测sPE组与正常对照组胎盘中HMGB1、RAGE蛋白水平上的表达。5.免疫组化检测组织芯片上HMGB1、RAGE的表达与定位。6.ELISA检测sPE组与正常对照组血清中HMGB1的表达水平。7.采用SPSS 21.0系统软件进行统计学分析,数据采用（?）±s表示,并进行正态性检验;两组数据间的比较方法为双侧Student’s t检验或Mann-Whitney’s U检验,免疫组化结果分析采用卡方检验,以α=0.05作为检验水准。结果1.组织芯片构建:H&E染色结果显示,98.98%（97/98）的VT组织芯片样本和86.36%（76/88）的EVT组织芯片样本保留有目的组织且染色效果好。2.Real time PCR结果:sPE组与正常对照组胎盘中,HMGB1 mRNA的相对表达量分别为1.13±0.15、0.82±0.12;RAGE mRNA的相对表达量分别为1.50±0.17、0.92±0.13;NF-κB p65 mRNA的相对表达量分别为2.24±0.24、1.12±0.16。与正常对照组相比,sPE组胎盘中HMGB1 mRNA表达升高,差别有统计学意义（P<0.05）,而RAGE、NF-κB p65 mRNA水平升高更为明显,差别有显着统计学意义（P<0.01）。3.Western blotting结果:sPE组与正常对照组胎盘中,HMGB1蛋白的相对表达量分别为0.43±0.08、0.30±0.07;RAGE蛋白的相对表达量分别为0.69±0.11、0.38±0.11。与正常对照组相比,sPE组胎盘中HMGB1蛋白表达升高,差别有统计学意义（P<0.05）,RAGE蛋白升高更为显着,差别有显着统计学意义（P<0.01）。4.组织芯片结果:sPE组与正常对照组胎盘中,绒毛滋养细胞及绒毛外滋养细胞均表达HMGB1、RAGE。正常对照组中,HMGB1主要表达于滋养细胞的细胞核,sPE组中,HMGB1在滋养细胞的细胞质中表达明显升高,表现出明显的核浆转移现象,与正常对照组相比,差别有统计学意义（χ2=5.19,P<0.05）。RAGE则主要表达于滋养细胞的细胞质和细胞膜,sPE组的阳性表达率明显高于正常对照组,差别有显着统计学意义（χ2=12.12,P<0.01）。5.ELISA结果:sPE组产妇血清HMGB1水平为（12.05±1.90）ng/ml,而正常对照组产妇血清HMGB1水平为（9.47±1.45）ng/ml,差别有统计学意义（P<0.05）。小结HMGB1-RAGE炎症反应信号通路参与了重度子痫前期的发病,HMGB1有望成为重度子痫前期的血清学分子标志物。第二部分HMGB1调节滋养细胞炎症反应及其生物学行为的研究目的在细胞水平探讨HMGB1调节炎症反应通路信号分子（RAGE、NF-κB）的表达,验证第一部分临床标本实验结果的同时,进一步阐明HMGB1调节滋养细胞炎症反应与生物学行为的作用机制,为进一步研究子痫前期的发病机制提供新的实验依据。方法1.体外培养人绒毛膜癌滋养细胞系JAR细胞株（JAR细胞可替代正常胎盘滋养细胞,作为滋养细胞信号转导、增殖、凋亡等生物学行为研究的模型）。2.构建HMGB1真核表达质粒（p HMGB1-EGFP）和HMGB1-siRNA,并将p HMGB1-EGFP和HMGB1-siRNA分别转染JAR细胞,构建JAR细胞HMGB1过表达与低表达状态。3.HMGB1过表达实验分三组:空白对照组（不加处理因素）、空质粒对照组（转染p IRES2-EGFP质粒）、HMGB1质粒转染组（转染p HMGB1-EGFP质粒）。HMGB1低表达实验分四组:空白对照组（不加处理因素）、HMGB1-siRNA1组（转染HMGB1-siRNA1）,HMGB1-siRNA2组（转染HMGB1-siRNA2）,HMGB1-siRNA3组（转染HMGB1-siRNA3）。利用real time PCR与western blotting检测HMGB1真核表达质粒作用的最佳时间,以及HMGB1-siRNA最佳抑制序列和最佳作用时间。4.JAR细胞转染p HMGB1-EGFP质粒,构建HMGB1过表达状态:利用real time PCR与western blotting分别检测细胞中RAGE mRNA与蛋白的表达;利用荧光素酶报告基因检测JAR细胞NF-κB的相对表达活性;采用WST-1法检测HMGB1对JAR细胞增殖的影响;通过流式细胞仪检测HMGB1对JAR细胞凋亡的作用。5.JAR细胞转染HMGB1-siRNA,构建HMGB1低表达状态:利用real time PCR与western blotting分别检测细胞中RAGE mRNA与蛋白的表达;采用WST-1法检测HMGB1对细胞增殖的影响;通过流式细胞仪检测HMGB1对细胞凋亡的作用。6.采用SPSS 21.0系统软件进行统计学分析,数据采用（?）±s表示,并进行正态性检验;两组数据间的比较方法为双侧Student’s t检验或Mann-Whitney’s U检验,多组间比较采用方差分析,以α=0.05作为检验水准。结果1.pHMGB1-EGFP及HMGB1-siRNA转染p HMGB1-EGFP质粒转染JAR细胞48h,三组细胞HMGB1 mRNA/蛋白的相对表达量分别为:空白对照组（1.47±0.17）/（0.8±0.09）,空质粒对照组（1.52±0.20）/（0.86±0.14）,HMGB1质粒转染组（3.08±0.33）/（1.65±0.22）。与空白对照组及空质粒对照组相比,HMGB1质粒转染组JAR细胞HMGB1 mRNA与蛋白的表达均显着升高,差别有显着统计学意义（P<0.01）,故以p HMGB1-EGFP真核表达质粒转染JAR细胞48h,作为后续实验的检测时间点。3个HMGB1-siRNA片段分别转染相应组JAR细胞72h,各组细胞HMGB1mRNA/蛋白的相对表达量分别为:空白对照组（7.02±0.99）/（0.31±0.05）,HMGB1-siRNA1组（1.06±0.47）/（0.02±0.01）,HMGB1-siRNA2组（4.21±0.72）/（0.18±0.04）,HMGB1-siRNA3组（1.18±0.54）/（0.1±0.03）。与空白对照组相比,HMGB1-siRNAl组中HMGB1 mRNA与蛋白的表达降低最为显着,差别有显着统计学意义（P<0.01）,故以转染JAR细胞72h作为后续实验的检测时间点,HMGB1-siRNAl片段作为后续实验的干扰片段。2.HMGB1调节JAR细胞中RAGE与NF-κB表达p HMGB1-EGFP质粒转染JAR细胞48h,三组细胞RAGE mRNA/蛋白的相对表达量分别为:空白对照组（1.07±0.13）/（0.49±0.11）,空质粒对照组（1.11±0.15）/（0.59±0.10）,HMGB1质粒转染组（1.73±0.23）/（1.44±0.19）。与空白对照组及空质粒对照组相比,HMGB1质粒转染组细胞RAGE mRNA与蛋白的表达均显着升高,差别有统计学意义（P<0.05,0.01）,而空白对照组与空质粒对照组之间差别无统计学意义（P>0.05）。HMGB1-siRNA1转染JAR细胞72h,两组细胞RAGE mRNA/蛋白的相对表达量分别为:空白对照组（1.06±0.13）/（0.98±0.08）,HMGB1-siRNA1转染组（0.50±0.11）/（0.12±0.04）。与空白对照组相比,HMGB1-siRNA1转染组中RAGE mRNA与蛋白的表达均明显降低,差别有显着统计学意义（P<0.01）。p HMGB1-EGFP质粒转染JAR细胞48h,利用荧光素酶报告基因检测空白对照组、空质粒对照组、HMGB1质粒转染组细胞NF-κB的相对表达活性,结果分别为:140±16、144±17、221±20。与空白对照组及空质粒对照组相比,HMGB1质粒转染组JAR细胞NF-κB表达活性明显增强,差别有显着统计学意义（P<0.05）,而空白对照组与空质粒对照组之间差别无统计学意义（P>0.05）。3.HMGB1影响JAR细胞的增殖与凋亡p HMGB1-EGFP质粒、HMGB1-siRNA1分别转染相应组JAR细胞后,每隔12h检测细胞增殖率。结果显示:空白对照组、空质粒对照组、HMGB1质粒转染组、HMGB1-siRNA1转染组之间,JAR细胞增殖率无明显差异（P>0.05）。p HMGB1-EGFP质粒转染JAR细胞48h,三组细胞的凋亡率分别为:空白对照组（8.90±0.32）%、空质粒对照组（8.67±0.67）%、HMGB1质粒转染组（6.49±0.48）%。与空白对照组及空质粒对照组相比,HMGB1质粒转染组JAR细胞凋亡率降低,差别有统计学意义（P<0.05）,而空白对照组与空质粒对照组之间差别无统计学意义（P>0.05）。HMGB1-siRNA1转染JAR细胞72h,空白对照组与HMGB1-siRNA1转染组的细胞凋亡率分别为（9.32±0.99）%、（11.98±1.15）%。与空白对照组相比,HMGB1-siRNA1转染组JAR细胞凋亡率升高,差别有统计学意义（P<0.05）。小结1.HMGB1可以上调滋养细胞RAGE受体的表达并与之结合,激活信号通路中的NF-κB,增强滋养细胞的炎症反应,参与子痫前期的发病,为阐明子痫前期炎症反应学说提供了新的实验依据。2.HMGB1能够抑制滋养细胞的凋亡,提示HMGB1在调节滋养细胞功能参与子痫前期发病中的作用具有双面性,为子痫前期发病机制的研究及临床防治提供了新的线索和方向。第三部分蓝萼甲素调节滋养细胞HMGB1表达的研究目的进一步探讨JAR细胞受到外因刺激后,HMGB1在细胞中的表达与分布,为深入研究HMGB1调节滋养细胞炎症反应的机制,以及HMGB1参与子痫前期的发病机制提供更多实验依据;探讨GLA对滋养细胞HMGB1信号通路的调节作用,为GLA抗炎机制的研究及子痫前期的临床防治提供实验基础。方法GLA调节JAR细胞HMGB1、NF-κB的表达实验设5组:对照组、0.01μg/ml GLA组、0.1μg/ml GLA组、1μg/ml GLA组、10μg/ml GLA组。体外培养人JAR细胞,不同终浓度GLA（0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml）刺激培养相应组细胞48h,对照组不加任何处理因素。real time PCR检测5组细胞HMGB1mRNA水平表达差异;western blotting检测5组细胞HMGB1蛋白水平表达差异;利用荧光素酶报告基因检测5组细胞NF-κB的表达活性。GLA调节JAR细胞HMGB1的分布实验设2组:对照组、0.1μg/ml GLA组。p HMGB1-EGFP转染2组细胞后,0.1μg/ml GLA组加终浓度0.1μg/ml GLA刺激培养JAR细胞48h,对照组不加GLA,激光共聚焦检测HMGB1在细胞中的分布情况,ELISA检测培养液中HMGB1水平。采用SPSS 21.0系统软件进行统计学分析,数据采用（?）±s表示,并进行正态性检验;两组数据间的比较方法为双侧Student’s t检验或Mann-Whitney’s U检验,多组间比较采用单因素方差分析,以α=0.05作为检验水准。结果1.GLA调节JAR细胞HMGB1 mRNA的表达GLA刺激培养48h,对照组、0.01μg/ml GLA组、0.1μg/ml GLA组、1μg/ml GLA组、10μg/ml GLA组细胞HMGB1 mRNA的相对表达量分别为:0.59±0.05、0.82±0.06、1.23±0.07、0.43±0.04、0.22±0.03。0.01μg/ml与0.1μg/ml GLA对HMGB1mRNA的表达有促进作用,其中0.1μg/ml GLA的促进作用最强;1μg/ml与10μg/ml GLA对HMGB1表达表现为抑制作用,尤以10μg/ml GLA的抑制作用最为显着,与对照组相比,差别均有统计学意义（P<0.05,0.01）。2.GLA调节JAR细胞HMGB1蛋白的表达GLA刺激培养48h,对照组、0.01μg/ml GLA组、0.1μg/ml GLA组、1μg/ml GLA组、10μg/ml GLA组细胞HMGB1蛋白的相对表达量分别为:0.64±0.05、0.86±0.06、1.20±0.06、0.31±0.04、0.12±0.02。0.01μg/ml与0.1μg/ml GLA对HMGB1蛋白的表达有促进作用,而0.1μg/ml GLA的促进作用最强;1μg/ml与10μg/ml GLA对HMGB1蛋白的表达表现为抑制作用,而10μg/ml GLA的抑制作用最为显着,与对照组相比,差别均有统计学意义（P<0.05,0.01）。3.GLA调节JAR细胞NF-κB的表达活性GLA刺激培养48h,对照组、0.01μg/ml GLA组、0.1μg/ml GLA组、1μg/ml GLA组、10μg/ml GLA组细胞荧光素酶相对活性分别为:130±10、170±12、230±13、110±7、70±5。统计学结果分析:0.01μg/ml与0.1μg/ml GLA能够刺激JAR细胞NF-κB活性,尤以0.1μg/ml GLA的促进作用最强,与对照组相比,差别有显着统计学意义（P<0.01）;但随着GLA浓度的升高,JAR细胞NF-κB活性呈现出下降趋势,10μg/ml GLA则显现出显着的抑制作用,与对照组相比,差别有显着统计学意义（P<0.01）。4.GLA调节JAR细胞中HMGB1蛋白的分布GLA刺激培养48h,0.1μg/ml GLA组:JAR细胞的细胞质中HMGB1表达显着增多,表现出明显的核浆转移现象;细胞培养液HMGB1水平为（9.11±0.50）ng/ml,对照组:HMGB1主要存在于细胞核内,细胞培养液HMGB1水平为（7.14±0.42）ng/ml,两组结果比较,差异有统计学意义（P<0.05）。小结1.本部分研究进一步证实,滋养细胞受到刺激后,HMGB1可从细胞核转移入细胞质,并以自分泌和旁分泌的方式释放到细胞外,引发滋养细胞的炎症反应。提示HMGB1的核浆转移参与了子痫前期的发病机制,为子痫前期炎症反应学说提供了新的实验依据。2.明确GLA调节滋养细胞HMGB1及NF-κB的表达具有剂量依赖效应,阐明GLA可以通过HMGB1信号通路调节滋养细胞炎症反应,为研究GLA的抗炎机制与子痫前期的临床防治提供了新的线索和实验基础。结论1.HMGB1-RAGE炎症反应信号通路参与了重度子痫前期的发病,HMGB1有望成为重度子痫前期的血清学分子标志物。2.HMGB1可以上调RAGE受体的表达并与之结合,激活信号通路中的NF-κB,增强滋养细胞的炎症反应,参与子痫前期的发病机制;但HMGB1能够抑制滋养细胞凋亡,提示HMGB1在调节滋养细胞功能参与子痫前期发病机制中的作用可能是把“双刃剑”。3.GLA可以诱导HMGB1的核浆转移,通过HMGB1信号通路调节滋养细胞炎症反应,且具有剂量依赖效应,为GLA抗炎机制的研究与子痫前期的临床防治提供了新的线索和实验基础。
张建情[10]（2017）在《Pd-Ia通过PPARα通路抑制LPS诱导的HUVECs炎症反应的机制研究》文中指出目的:动脉粥样硬化（As）作为冠心病、脑中风等多种缺血性心脑血管疾病的主要病理基础,控制其发生、发展是防治这些心脑血管疾病的根本性战略措施。目前研究表明,As是一种慢性血管炎症,血管内皮细胞损伤是As发生的关键因素。内皮细胞损伤后会产生大量的炎症因子,进而促进单核细胞黏附、聚集和激活,启动As的发生。白花前胡甲素（Pd-Ia）是一种钙通道阻滞剂和钾通道开放剂。研究表明,Pd-Ia可以改善急性缺血再灌注心肌中的炎症反应和细胞凋亡。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARα）是核受体超家族成员之一,其可通过抑制NF-κB和AP-1信号通路而发挥抗炎作用。我们的前期实验结果表明,Pd-Ia能够抑制脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的炎症反应。本课题主要探究Pd-Ia是否通过PPARα通路抑制LPS诱导的HUVECs的炎症反应。方法:体外培养HUVECs,给予LPS（1μg/mL）和不同浓度的Pd-Ia（10,20,40μM/L）,应用 Real-time PCR 检测 Pd-Ia 对 Icam、Vcam、E-selectin、MCP-1、MCP-2表达的影响;应用免疫荧光、Western blot检测Pd-Ia对PPARα、NF-κB分布和表达的影响;利用siRNA和药物阻断PPARα通路等方法,明确PPARα在Pd-Ia调节NF-κB信号通路中的作用;利用药物阻断PKA活性,初步探讨Pd-Ia对PPARα活性的影响。结果:1、Pd-Ia可以抑制趋化因子MCP-2和黏附因子Vcam的表达。2、Pd-Ia通过PPARα调节NF-κB信号通路。3、Pd-Ia通过激活PKA调节PPARα的活性。4、Pd-Ia也可以通过MAPK中P38、ERK通路发挥抗炎作用。结论:Pd-Ia能够通过PPARα/NF-κB通路抑制LPS诱导的HUVECs的炎症反应;Pd-Ia可能通过PKA影响PPARα的活性。上述研究结果提示,Pd-Ia有望成为治疗动脉粥样硬化性疾病的潜在药物。
二、Effects of dl-praeruptorin A on nucleus factor-κB and tumor necrosis factor-α expression in ischemia-reperfusion hearts（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Effects of dl-praeruptorin A on nucleus factor-κB and tumor necrosis factor-α expression in ischemia-reperfusion hearts（论文提纲范文）
（1）激活素A与TNF-α在成纤维细胞活化调控中的相互拮抗作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 文献回顾 |
| 1.1 激活素 |
| 1.1.1 激活素分子特征 |
| 1.1.2 激活素受体及信号转导 |
| 1.1.3 激活素生物学作用 |
| 1.2 肿瘤坏死因子-α |
| 1.2.1 TNF-α来源 |
| 1.2.2 TNF-α受体及信号转导 |
| 1.2.3 TNF-α生物学活性 |
| 1.3 成纤维细胞 |
| 1.3.1 成纤维细胞形态 |
| 1.3.2 成纤维细胞功能 |
| 1.3.3 成纤维细胞原代培养 |
| 1.4 本课题研究内容和意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究意义 |
| 第2章 激活素A与TNF-α调控小鼠成纤维细胞活化 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 细胞 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞增殖分析 |
| 2.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.3 细胞形态学分析 |
| 2.2.4 RTCA检测细胞黏附 |
| 2.2.5 NO含量分析 |
| 2.2.6 ELISA |
| 2.2.7 RT-PCR |
| 2.2.8 Western blotting |
| 2.2.9 细胞迁移分析 |
| 2.2.10 钙离子流量分析 |
| 2.2.11 细胞膜受体表达分析 |
| 2.2.12 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 激活素A与TNF-α对L929细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 激活素A与TNF-α对L929细胞凋亡的影响 |
| 2.3.3 激活素A与TNF-α对L929细胞形态的影响 |
| 2.3.4 激活素A与TNF-α对L929细胞NO产生的影响 |
| 2.3.5 激活素A与TNF-α对L929细胞IL-6产生的影响 |
| 2.3.6 激活素A与TNF-α对L929细胞分泌TGF-β1 的影响 |
| 2.3.7 激活素A与TNF-α对L929细胞生成细胞外基质的影响 |
| 2.3.8 激活素A与TNF-α对L929细胞黏附的影响 |
| 2.3.9 激活素A与TNF-α对L929细胞迁移的影响 |
| 2.3.10 激活素A与TNF-α对L929细胞内钙信号的影响 |
| 2.3.11 激活素A与TNF-α对L929细胞膜相关受体表达的影响 |
| 2.3.12 激活素A与TNF-α对L929细胞Smad通路相关信号分子表达的影响 |
| 2.3.13 激活素A与TNF-α对L929细胞MAPK信号通路蛋白表达的影响 |
| 2.3.14 ERK抑制剂对激活素A诱导L929 细胞迁移的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 激活素A与TNF-α对L929细胞的生物学作用 |
| 2.4.2 激活素A与TNF-α调控L929细胞活性的信号转导机制 |
| 第3章 激活素A与TNF-α调控人成纤维细胞活化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 hPDLCs体外培养 |
| 3.2.2 hPDLCs的增殖分析 |
| 3.2.3 hPDLCs的形态学分析 |
| 3.2.4 RTCA检测hPDLCs黏附活性 |
| 3.2.5 ELISA |
| 3.2.6 RT-PCR |
| 3.2.7 Western blotting |
| 3.2.8 细胞迁移分析 |
| 3.2.9 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 体外培养hPDLCs生长、形态及鉴定 |
| 3.3.2 激活素A与TNF-α对hPDLCs增殖的影响 |
| 3.3.3 激活素A与TNF-α对hPDLCs形态学变化的影响 |
| 3.3.4 激活素A与TNF-α对hPDLCs产生IL-6 的影响 |
| 3.3.5 激活素A与TNF-α对hPDLCs分泌TGF-β1 的影响 |
| 3.3.6 激活素A与TNF-α对hPDLCs生成ECM的影响 |
| 3.3.7 激活素A与TNF-α对hPDLCs黏附的影响 |
| 3.3.8 激活素A与TNF-α对hPDLCs迁移的影响 |
| 3.3.9 激活素A与TNF-α对hPDLCs的Smad通路相关信号分子表达的影响 |
| 3.3.10 激活素A与TNF-α对hPDLCs的MAPK信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 人牙周韧带细胞的体外培养及实验细胞的选择 |
| 3.4.2 激活素A与TNF-α对hPDLCs的生物学作用 |
| 3.4.3 激活素A与TNF-α调控hPDLCs活性的信号转导机制 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）基于TLR4/NF-κB通路探究鬼箭羽醇提物对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响与机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 主要研究内容 |
| 第一节 EEEA对 CIRI大鼠行为学及病理组织学的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 第二节 EEEA 对 CIRI 大鼠血清中炎症因子的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 第三节 EEEA 对 CIRI 大鼠 TLR4、NF-κBp65 蛋白和 mRNA 的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 1 实验方法学分析 |
| 1.1 阳性药物的选择 |
| 1.2 取材时间点的选择 |
| 2 EEEA抗 CIRI有效性讨论分析 |
| 2.1 EEEA对 CIRI大鼠神经功能的影响 |
| 2.2 EEEA对 CIRI大鼠脑梗死体积的影响 |
| 2.3 EEEA 对 CIRI 模型大鼠缺血侧皮质区病理形态变化的影响 |
| 3 EEEA抗 CIRI的作用机制讨论分析 |
| 3.1 EEEA对 CIRI大鼠炎症因子的影响 |
| 3.2 EEEA对 CIRI大鼠TLR4、NF-κBp65 蛋白和mRNA的影响 |
| 结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 脑缺血再灌注损伤的炎症机制与治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果、参加学术会议及获奖 |
| 致谢 |
（3）ACY1215在大鼠脊髓损伤中通过抑制NF-κB和STAT3信号通路发挥抗炎及神经保护作用（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 2.材料及方法 |
| 2.1 主要实验试剂 |
| 2.2 主要仪器设备 |
| 2.3 实验所需试剂配置 |
| 2.3.1 细胞实验相关 |
| 2.3.2 蛋白印迹实验相关 |
| 2.4 大鼠原代星形胶质细胞的提取与培养 |
| 2.5 免疫荧光 |
| 2.6 大鼠脊髓损伤模型的建立及处置 |
| 2.6.1 大鼠脊髓损伤模型的建立 |
| 2.6.2 大鼠脊髓损伤模型的取材 |
| 2.7 劳克坚牢蓝(Luxol Fast Blue、LFB)髓鞘染色 |
| 2.8 CCK8 法测细胞活性 |
| 2.9 RT-qPCR |
| 2.9.1 RNA的提取 |
| 2.9.2 荧光定量PCR检测 |
| 2.10 Western blotting |
| 2.10.1 组织蛋白的提取 |
| 2.10.2 细胞蛋白的提取 |
| 2.10.3 蛋白印迹实验 |
| 2.11 数据收集及统计分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 大鼠原代星形胶质细胞的鉴定 |
| 3.2 损伤后大鼠脊髓组织中HDAC6 的表达增加以及cck8 法测定细胞毒性 |
| 3.3 ACY1215 抑制脂多糖(LPS)刺激的星形胶质细胞中炎性细胞因子和GFAP的表达 |
| 3.4 ACY-1215 抑制LPS激活的大鼠星形胶质细胞中NF-κB和 STAT3 信号通路 |
| 3.5 ACY1215 降低脊髓损伤后组织炎性细胞因子的表达 |
| 3.6 ACY1215 可以减少脊髓损伤后神经胶质瘢痕的形成,降低组织脱髓鞘的程度,促进神经修复 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 HDAC在脊髓损伤中的研究进展 |
| 参考文献 |
（4）丹参酚酸A对脂多糖诱导的急性肾损伤的改善作用及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 主要仪器 |
| 2 主要试剂及实验药品 |
| 3 动物实验 |
| 3.1 动物:小鼠饲养 |
| 3.2 小鼠分组及造模 |
| 3.3 小鼠的组织处理及血样提取 |
| 3.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中TNF-α及 IL-6 的水平以及血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)的含量 |
| 3.5 免疫组化法观察各组小鼠肾脏组织中巨噬细胞标记分子F4/80抗体的蛋白表达 |
| 3.5.1 包埋切片 |
| 3.5.2 切片脱蜡至水 |
| 3.5.3 抗原修复 |
| 3.5.4 过氧化氢孵育 |
| 3.5.5 山羊血清封闭 |
| 3.5.6 一抗孵育 |
| 3.5.7 二抗孵育 |
| 3.5.8 DAB 显色 |
| 3.5.9 苏木素复染 |
| 3.5.10 脱水、透明、封片 |
| 3.5.11 镜检 |
| 3.6 H&E染色法观察各组小鼠肾脏的组织形态学变化 |
| 4 细胞培养 |
| 5 MTT法检测RAW264.7 细胞活力 |
| 6 Griess试剂盒检测细胞内一氧化氮(NO)的释放情况 |
| 7 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中炎症因子释放水平 |
| 8 活性氧(ROS)的检测 |
| 9 细胞内钙离子的检测 |
| 10 免疫印迹检测RAW264.7细胞内相关标志物分子的蛋白表达 |
| 11 免疫荧光检测NF-κB/p65入核情况 |
| 12 统计学处理 |
| 结果 |
| 1 丹酚酸A能够明显减轻LPS诱导的小鼠肾脏损伤程度 |
| 2 丹酚酸A可显着抑制LPS诱导的小鼠血肌酐和尿素氮的释放水平 |
| 3 丹酚酸A可显着降低血清中炎症因子的释放和炎性巨噬细胞在肾损伤部位的浸润 |
| 4 丹酚酸A对LPS刺激的巨噬细胞具有抗炎作用 |
| 5 丹酚酸A通过靶向TLR4 来阻断My D88 依赖的通路抑制LPS刺激的巨噬细胞 |
| 6 丹酚酸A可降低脂多糖刺激巨噬细胞内质网应激和活性氧生成 |
| 7 丹酚酸A能抑制LPS刺激的JNK1/2 信号通路的激活及阻断NF-κB核易位 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（5）PDE4抑制剂FCPR16对TNF-α诱导的神经损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 PDE4抑制剂FCPR16对TNF-α诱导的神经损伤的保护作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 第二章 PDE4抑制剂FCPR16对TNF-α诱导的神经损伤的保护作用机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 总结 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）缺氧通过SIRT1影响结直肠癌的进展（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 缺氧抑制SIRT1的表达及其机制 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 缺氧通过EGR1/SIRT1/NF-κB途径调控结直肠癌细胞的侵袭和迁移 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 缺氧通过SIRT1调控结直肠癌细胞自噬 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（7）Danshen: a phytochemical and pharmacological overview（论文提纲范文）
| Introduction |
| Traditional Uses |
| Chemical Constituents |
| Diterpenoids |
| Phenolic acids |
| The other components |
| Quality Control |
| The application of analytical methods for the quality evaluation |
| The chemical fingerprint analysis |
| The metabolites analysis in vivo of Danshen decoction or its preparations |
| Pharmacological Activities |
| Anti-inflammation |
| Anti-oxidative activity |
| Antitumor activity |
| Effects on cardiovascular and cerebrovascular |
| Anti-atherogenesis |
| Anti-thrombosis |
| Anti-hypertension |
| Anti-hyperlipidemic |
| Effects on ischaemic stroke |
| Effects on the heart |
| Effects on nervous system |
| Sedative and analgesic activities |
| Effects on neurodegenerative disorder |
| Anti-fibrotic activity |
| Effects on hepatic fibrosis |
| Effects on pulmonary fibrosis |
| Protective effects against renal injury |
| Protective effects against diabetes mellitus |
| Other effects |
| Side Effects |
| Discussions and Conclusions |
（8）TNF-α调控Semaphorin Ⅲ家族蛋白参与绝经后骨质疏松发生的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分：绝经后骨质疏松疾病中TNF-α通过JNK信号途径上调semaphorin3D蛋白表达诱导破骨细胞分化 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 第二部分：绝经后骨质疏松中TNF-α通过抑制Wnt/β-catenin信号途径下调semaphorin3B表达抑制成骨细胞分化 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述一：炎症因子TNF-α与绝经后骨质疏松症关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二：SemaphorinⅢ：新的骨稳态调节因子 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和科研情况 |
| 在读期间担任学术职务 |
| 致谢 |
（9）HMGB1参与重度子痫前期发病机制及蓝萼甲素调节滋养细胞HMGB1表达的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略词及符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分HMGB1信号通路在重度子痫前期患者胎盘中表达的研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分HMGB1调节滋养细胞炎症反应及其生物学行为的研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 蓝萼甲素调节滋养细胞HMGB1表达的研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 实验结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 炎症与子痫前期关系研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介及攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（10）Pd-Ia通过PPARα通路抑制LPS诱导的HUVECs炎症反应的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 动脉粥样硬化 |
| 1.1.1 急性渗出性炎症 |
| 1.1.2 慢性增生性炎症 |
| 1.2 白花前胡甲素(Pd-Ia) |
| 1.2.1 Pd-Ia简介 |
| 1.2.2 Pd-Ia研究进展 |
| 1.3 PPARs |
| 1.3.1 PPARs简介 |
| 1.3.2 PPARα |
| 1.4 与PPAR-α相关的信号通路 |
| 1.4.1 NF-κB信号通路 |
| 1.4.2 AP-1信号通路 |
| 1.4.3 cAMP-PKA信号通路 |
| 1.4.4 MAPK信号通路 |
| 1.5 立题依据 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 实验器材 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 主要溶液的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 人脐静脉内皮细胞的提取 |
| 2.2.2 人脐静脉内皮细胞的传代培养 |
| 2.2.3 人脐静脉内皮细胞的冻存 |
| 2.2.4 人脐静脉内皮细胞的复苏 |
| 2.2.5 RNA的提取 |
| 2.2.6 RNA浓度的测定及逆转录 |
| 2.2.7 Real time PCR |
| 2.2.8 RT-PCR |
| 2.2.9 ELISA |
| 2.2.10 蛋白提取及浓度检测(BCA法) |
| 2.2.11 蛋白免疫印迹(Western Blot) |
| 2.2.12 免疫荧光 |
| 2.3 数据统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 Pd-Ia对炎症相关因子表达的影响 |
| 3.2 Pd-Ia对PPARα的影响 |
| 3.2.1 Pd-Ia对PPARα分布的影响 |
| 3.2.2 Pd-Ia对PPARα表达的影响 |
| 3.3 Pd-Ia通过PPARα通路调节NF-κB活性 |
| 3.3.1 Pd-Ia对NF-κB分布和表达的影响 |
| 3.3.2 干扰PPARα基因后,Pd-Ia对IκBα表达的影响 |
| 3.3.3 阻断PPARα后,Pd-Ia对NF-κB表达的影响 |
| 3.4 Pd-Ia对AP-1信号通路的影响 |
| 3.4.1 阻断PPARα后,Pd-Ia对C-JUN表达的影响 |
| 3.5 阻断PKA后,Pd-Ia对PPARα、IL-6表达的影响 |
| 3.5.1 阻断PKA后,Pd-Ia对PPARα、IL-6表达的影响 |
| 3.6 Pd-Ia对MAPK信号通路的影响 |
| 3.6.1 Pd-Ia对P38信号通路的影响 |
| 3.6.2 Pd-Ia对ERK信号通路的影响 |
| 3.6.3 Pd-Ia对JNK信号通路的影响 |
| 3.6.4 阻断PPARα后,Pd-Ia对P38信号通路的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 结论 |
| 英文缩略语索引 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、Effects of dl-praeruptorin A on nucleus factor-κB and tumor necrosis factor-α expression in ischemia-reperfusion hearts（论文参考文献）
- [1]激活素A与TNF-α在成纤维细胞活化调控中的相互拮抗作用研究[D]. 姜玲玲. 吉林大学, 2021(01)
- [2]基于TLR4/NF-κB通路探究鬼箭羽醇提物对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响与机制[D]. 李相国. 湖北民族大学, 2021(12)
- [3]ACY1215在大鼠脊髓损伤中通过抑制NF-κB和STAT3信号通路发挥抗炎及神经保护作用[D]. 戴策. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]丹参酚酸A对脂多糖诱导的急性肾损伤的改善作用及分子机制研究[D]. 曾曦. 青岛大学, 2020(01)
- [5]PDE4抑制剂FCPR16对TNF-α诱导的神经损伤的保护作用及机制研究[D]. 肖姣. 南方医科大学, 2020(01)
- [6]缺氧通过SIRT1影响结直肠癌的进展[D]. 余沈桐. 中国人民解放军空军军医大学, 2019(06)
- [7]Danshen: a phytochemical and pharmacological overview[J]. MEI Xiao-Dan,CAO Yan-Feng,CHE Yan-Yun,LI Jing,SHANG Zhan-Peng,ZHAO Wen-Jing,QIAO Yan-Jiang,ZHANG Jia-Yu. Chinese Journal of Natural Medicines, 2019(01)
- [8]TNF-α调控Semaphorin Ⅲ家族蛋白参与绝经后骨质疏松发生的机制研究[D]. 桑成林. 中国人民解放军海军军医大学, 2018(01)
- [9]HMGB1参与重度子痫前期发病机制及蓝萼甲素调节滋养细胞HMGB1表达的研究[D]. 朱琳琳. 郑州大学, 2017(11)
- [10]Pd-Ia通过PPARα通路抑制LPS诱导的HUVECs炎症反应的机制研究[D]. 张建情. 厦门大学, 2017(06)