1994-2003年医药生物技术论文统计分析

一、《药物生物技术》1994～2003论文统计分析（论文文献综述）

郭晴艳^[1]（2021）在《发展和应用质谱检测方法开展模型小鼠代谢变化研究》文中进行了进一步梳理质谱分析技术是通过电场和磁场的作用将带电离子按质荷比大小进行分离并检测的方法,它能对化合物进行准确的定性及定量分析,目前已广泛应用于生物样本检测中。串联质谱分析和质谱成像是目前应用最广泛的两种质谱分析技术。串联质谱分析是将两个或两个以上质量分析器在时间或空间上串联形成组合式分析方法,其可应用于治疗药物监测、毒理学检测、内分泌学检测、儿科学检测等领域。质谱成像技术是以质谱技术为基础的成像方法,可直接对生物样本进行扫描,通过特殊软件处理后得到包含各种不同分子空间分布信息的热图,从而实现生物标志物捕获和特定化合物监控,该方法可以在单张组织切片或组织芯片上实现成百上千个不同分子的高通成像及分析。质谱成像技术可应用于临床生物标志物捕获、实时手术实施、3D-MSI、单细胞成像等领域,是目前生命科学研究中重要的分析技术。基于质谱分析技术的强大优势,我们首先应用质谱成像技术对昼夜节律模型小鼠脑组织中代谢变化进行探究,并对潜在的代谢相关分子及其作用进行深入分析。我们通过12 h/12 h循环光照成功构建昼夜节律模型小鼠,之后通过仪器校正、DESI信号优化以及DESI-MSI条件筛选确认小鼠脑组织成像条件,最后对6个不同给光时间点下昼夜节律模型小鼠脑组织切片进行局部及全脑成像。通过DESI-MSI结果人工筛选,我们分别得到了仅在SCN核团特征性分布以及仅在SCN核团无信号的两类离子,基于SCN在昼夜节律系统中发挥的重要作用,我们认为它们是与昼夜节律紧密相关的分子。之后通过量化分析,我们得到了 15个仅在SCN核团特征性分布且具有明显昼夜震荡的分子,包括肉碱、腺苷、磷脂等。其中肉碱以及乙酰肉碱其响应存在与文献报道一致的昼夜震荡现象,且与文献报道的昼夜节律基因Bmal1和Clock的昼夜震荡规律一致。乙酰肉碱是线粒体中脂肪酸β-氧化的关键中间体,它通过将脂肪酸从细胞质运输到线粒体来参与脂肪酸氧化,而它们在SCN核团的昼夜震荡再一次证实其在代谢中的重要作用。而磷脂信号的昼夜震荡表明这些磷脂分子与中央昼夜节律的调控和维持密不可分。另外腺苷是与昼夜节律紧密相关的物质且参与多个重要信号通路,因此我们得到的特异性分布于SCN核团的5-甲基胞苷和腺苷其昼夜震荡现象在一定程度上显示了其与脑中昼夜节律相关信号通路之间的关系,同时也为后续针对核苷与昼夜节律的研究提供依据。而针对串联质谱分析,我们应用三重四极杆线性离子阱质谱仪对模型小鼠内源性神经肽进行定量检测。我们首先通过标准品构建针对特定神经肽的定量检测方法,之后通过蛋白沉淀法对血浆样品进行前处理以去除大部分杂质,最后利用三重四极杆线性离子阱质谱仪对模型小鼠血浆样品中内源性神经肽进行定量检测。通过研究我们发现处于黑暗条件下的小鼠血浆中0T水平个体差异较大,而给予一定时间光照会使小鼠血浆中0T水平整体处于相对较高水平,即缩小其个体差异,最终使小鼠血浆中0T水平趋于一个均一且相对较高水平。另一方面,钠、脱水以及药物IMP21都能调控AVP水平,高浓度钠以及脱水会提高AVP的合成及分泌,而药物IMP21可以补偿由脱水引起的AVP水平升高,且在禁水处理后给予IMP21同时给水会进一步降低由脱水引起的AVP水平升高,该现象与IMP21药物目前的临床应用相吻合。在质谱分析技术的发展和应用之外,我们利用单通道电生理技术对手性药物对镜像M2质子通道的作用进行了探究。我们首先通过化学合成手段分别得到了L-M2和D-M2,之后通过人工构建的磷脂双分子层对化学合成的线性蛋白进行构象恢复,然后利用单通道电生理技术对L-M2和D-M2蛋白的生物学活性和药理学活性进行验证和比较。结果表明,化学合成得到的D-M2蛋白其生物学活性与L-M2无明显区别,且非手性药物金刚烷胺可以同时抑制D-/L-M2蛋白,但对D-M2起效稍慢,而带有手性中心的金刚乙胺可抑制L-M2蛋白电流,但对D-M2起效非常缓慢,且其抑制作用受到电压影响,猜测其对D-M2的抑制作用与电压之间存在竞争关系,是不完全抑制。与其它化学分析手段相比,质谱分析技术以其特有的高灵敏度、高分辨率、高通量等特点成为生命科学研究的重要手段,也将通过不断优化其自身性能进一步助力生物样本的检测与分析,为多肽及生物大分子的分析提供更准确、更直观的结果。

马长路^[2]（2020）在《干酪乳杆菌对高脂膳食仓鼠肠道菌群及脂质代谢的影响与机理研究》文中研究说明血脂水平过高是引起心血管疾病的重要原因。研究表明,降低血清中血脂水平能够显着降低患心血管疾病的风险并降低其死亡率。当前化学药物是治疗心血管疾病的主要方式,化学药物治疗效果明显,但是目前也存在一些不足,比如治疗成本较高、药物长期使用对人体有较大的副作用。乳杆菌属的某些细菌作为人类肠道重要的益生菌,已经被证实具有改善血脂水平的能力,并可以使肠道微生态系统发生长期而有益的变化。但是,乳杆菌如何通过影响肠道微生态改善血清中血脂水平的机理尚不明确,本文以12株来源于传统发酵乳制品、婴儿粪便和青贮玉米饲料中的乳酸菌为研究对象,通过体外胆固醇脱除、胆盐水解酶活力等指标筛选得到3株具有潜在降血脂功能的干酪乳杆菌,通过干酪乳杆菌饲喂仓鼠,利用二代高通量测序技术、基于NMR代谢组学技术和多元统计分析探索干酪乳杆菌对仓鼠肠道微生物区系、代谢产物及血液中血脂指标的影响及其关联机制,旨在揭示干酪乳杆菌通过微生态菌群调节而实现仓鼠体内调节血脂的作用机理。主要结论如下:（1）体外试验筛选到三株（Lactobaillus casei AST18、Lactobaillus casei SY13和Lactobaillus casei CAAS36）降胆固醇的干酪乳杆菌菌株。三株菌对胆固醇脱除能力均在28%以上,具有胆盐水解酶活性,其活性均在0.91 U/mg蛋白以上,具有很好的耐酸、耐胆盐及发挥调节脂质代谢的潜力。（2）将L.casei AST18、L.casei SY13、L.casei CAAS36分别饲喂高脂膳食的仓鼠,发现3株菌可不同程度降低高脂膳食仓鼠血清中TC、TG和LDL-C的水平,同时可降低肝脏TC、TG水平和肝脏指数,缓解了肝脏脂肪堆积,对肝脏组织损伤恢复具有一定调节能力。同时L.casei AST18、L.casei SY13、L.casei CAAS36显着升高高脂膳食仓鼠血清GSH-Px活力和降低MDA水平,具有一定抗氧化能力。另外可增加高脂膳食仓鼠粪便中总胆汁酸排出量,促进了胆固醇向胆汁酸转化,对仓鼠脂质代谢具有一定调节能力。（3）本研究发现高脂膳食导致仓鼠肠道菌群结构更加的脆弱和不稳定,同时降低了仓鼠肠道菌群的多样性。通过饲喂L.casei AST18、L.casei SY13、L.casei CAAS36,仓鼠肠道菌群的多样性均有不同程度的恢复,其中L.casei CAAS36效果最明显。L.casei AST18和L.casei CAAS36均可对高脂膳食仓鼠肠道菌群结构起到一定恢复作用,而且在调节高脂膳食仓鼠肠道菌群时,L.casei CAAS36具有一定的量效关系。研究同时发现,低剂量L.casei CAAS36具有降低仓鼠发生腹泻、肠应激综合征发病率的潜力。（4）基于代谢组学技术探究干酪乳杆菌降血脂功能机制,发现高脂膳食会引起仓鼠脂肪酸代谢、氨基酸代谢、葡萄糖代谢、胆碱代谢、酮体代谢、嘌呤代谢等多条代谢途径发生紊乱,L.casei AST18和L.casei CAAS36可有效调控和恢复高脂膳食引起的脂肪酸代谢、葡萄糖代谢紊乱,具有调节脂质代谢能力。（5）最后利用高通量测序技术和代谢组学技术关联分析以探究前期试验证明调节血脂性能最优的L.casei CAAS36改善仓鼠肠道菌群结构和调控代谢途径的互作机制,发现L.casei CAAS36对于调节并稳定肠道菌群发挥了重要的作用。L.casei CAAS36的处理逆转了由高脂膳食增加的厚壁菌门和拟杆菌门的比率,并且显着增加了产生丙酸的Muribaculaceae的丰度。L.casei CAAS36可一定程度逆转因脂代谢不平衡引起的代谢紊乱。通过调节肠道菌群,产生更多的丙酸和琥珀酸等重要代谢物,这些代谢物对于预防和治疗高脂血症及其并发症发挥了重要作用。综上所述,L.casei CAAS36是一株具有调节高脂膳食宿主肠道菌群和脂质代谢的益生菌。

陈宵^[3]（2020）在《鹅膏毒肽所致肝损伤的代谢组学研究以及毒理学作用机制验证》文中进行了进一步梳理在我国,蘑菇中毒死亡率和病死率均居食物中毒的首位[1]。据中国疾病预防控制中心全国突发公共卫生事件报告管理信息系统显示,2004-2014年我国大陆地区共报告蘑菇中毒病例3701例,死亡786例,病死率高达21.24%[1]。在蘑菇中毒中,约90%的死亡是由含鹅膏毒肽类毒素的蘑菇引起的[2]。鹅膏毒肽类毒素按照氨基酸组成和结构分为鹅膏毒肽（Amatoxins）、鬼笔毒肽（phallotoxins）和毒伞素（Virotoxins）三类,其中最主要的致死毒素是鹅膏毒肽[3]。但目前,关于鹅膏毒肽的研究尚不充分,针对该类毒素中毒治疗的争议大。分析原因,可能主要在于:（1）鹅膏毒肽在多个属的蘑菇中均有发现,而每个属的蘑菇又含有除鹅膏毒肽外的其它毒素,这些毒素间复杂的联合作用带来了临床诊断和鉴别诊断上的困难;（2）毒理学作用机制和路径研究不充分,导致效应靶点选择不明确,非特异性地盲目寻找治疗药物难以起到针对性的治疗效果;（3）缺少源于中毒机制和路径的用于早期诊断的效应生物标志物,临床上通常无法开展快速的鹅膏毒肽中毒诊断。临床常用的肝损伤指标包括谷丙转氨酶（Cereal third transaminase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、红细胞血清总胆红素（Totalbilirubin,TBIL）等,但这些指标缺乏特异性,且多在病程的中晚期表现异常,对早期干预意义有限。鉴于此,本研究主要从以下3个方面开展工作:（1）对国内外文献进行系统综述和Meta分析,根据文献对鹅膏毒肽中毒的治疗措施进行分类,对鹅膏毒肽中毒患者的不同临床治疗方法和效果进行系统评估,基于横断面研究的系统文献综述和定量分析可全面揭示鹅膏毒肽中毒治疗的现状和问题并为鹅膏毒肽中毒后现有治疗方式的选择提供证据支持;（2）构建鹅膏毒肽中毒的动物和细胞模型,探讨凋亡（特别是早期凋亡）在鹅膏毒肽诱导的肝损伤中的作用,并研究相关的上下游关键蛋白的变化,进一步补充和完善鹅膏毒肽的体内毒作用链条;（3）应用代谢组学技术,对鹅膏毒肽中毒小鼠的肝脏全代谢谱进行系统分析,筛选并分析不同中毒周期机体的不同表观变化,找出差异代谢物以及相关的富集通路,为临床提供可能的鹅膏毒肽中毒效应标志物,以期做到早诊断早干预、降低含鹅膏毒肽类毒素蘑菇中毒的死亡率。第一部分基于Meta分析的不同治疗方案对鹅膏毒肽中毒的定量疗效评估目的:对鹅膏毒肽中毒患者的不同临床治疗方法及其效果进行评估。方法:检索PubMed、Embase、OVID、万方和中国知网（CNKI）,收集整理数据,并对文献进行综述,根据文献对鹅膏毒肽中毒的治疗措施进行分类。同时,根据数据异质性情况,分别采取随机效应模型或固定效应模型进行Meta分析,同步进行偏倚评估和敏感性分析。结果:本研究共检索到文献2659篇,最终纳入Meta分析的文献70篇。模型结果显示,鹅膏毒肽中毒治疗后的总病死率为16.9%,其中亚组α-鹅膏毒肽中毒总病死率为26.3%。在单独一种治疗方式下,鹅膏毒肽中毒治疗后总病死率为21.4%,其中单独支持治疗的病死率（38.4%）明显高于单独药物治疗（8.3%）和单独解毒治疗（14%）;在两种治疗方式组合使用后,总病死率为16.8%,其中亚组分析提示支持治疗+药物治疗后的病死率为15.6%,解毒治疗+药物治疗的病死率为16.2%;当解毒治疗、支持治疗和药物治疗联合使用后的总病死率较低,为15.1%。从地理因素看,亚洲患者中毒治疗后的病死率（28.4%）要高于欧洲（12.5%）和北美洲（16.9%）。结论:鹅膏毒肽中毒病死率高,治疗效果不佳,且各大洲之间存在明显差异。药物、解毒和支持治疗联合应用治疗效果最好。第二部分ROS/p53介导的线粒体凋亡途径是α-鹅膏毒肽所致肝损伤的早期事件目的:α-鹅膏毒肽被认为是鹅膏毒肽最主要组分,本部分主要探讨凋亡在α-鹅膏毒肽诱导的肝损伤中的作用以及上游激活信号。方法:BALB/c小鼠被随机分为3个剂量组（0、0.23和0.35 mg/kg）,每组6只。首先通过TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法观察α-鹅膏毒肽中毒小鼠在不同时间段（4、8、12、24、48和72h）的整体死亡和损伤情况。然后评估小鼠肝组织中氧化酶和抗氧化酶,包括过氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）和丙二醛（malondialdehyde,MDA）的活性以及参与凋亡的相关蛋白质的表达情况（细胞色素C,Caspase 8,Caspase 9和Caspase 3）。体外模型中,在不同时间点（6、12、24和36h）,用梯度浓度（0、2和5μM）的α-鹅膏毒肽对L-02细胞进行染毒。分别通过相差显微镜、细胞增殖/毒性试剂盒（CCK-8）和FITC膜联蛋白V+7-AAD凋亡检测试剂盒观察和检测染毒的L-02细胞的死亡和凋亡情况;并用免疫印迹分析（Western Blotting,WB）检测p53蛋白和线粒体凋亡途径下游相关蛋白（细胞色素C、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase 9和Cleaved-Caspase 3）的表达水平;接着通过检测细胞间总活性氧（Intercellular total reactive oxygen species,ROS）以及线粒体活性氧（Mitochondrial reactive oxygen species,mtROS）水平,分析氧化损伤与α-鹅膏毒肽所致肝细胞凋亡的关系;最后,使用标准抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）从侧面验证活性氧在α-鹅膏毒肽诱导的L-02细胞毒性中的作用。结果:1.α-鹅膏毒肽对小鼠肝组织和L-02细胞均造成损伤染毒小鼠出现明显的中毒表现,并且大部分在中毒72h以后死亡;另外,随着α-鹅膏毒肽染毒浓度的增加和（或）处理时间的延长,肝细胞（L-02细胞）的生长受到明显的抑制,显微镜下肝细胞生长密度显着下降,并最终死亡。0.23 mg/kg和0.35 mg/kg是理想的动物模型浓度,2 μM和5 μM是理想的细胞模型浓度。2.α-鹅膏毒肽通过线粒体凋亡途径诱导肝细胞凋亡α-鹅膏毒肽可通过诱导细胞凋亡导致肝脏损伤,并且α-鹅膏毒肽诱导的细胞凋亡主要通过线粒体凋亡途径发生。α-鹅膏毒肽染毒后小鼠肝脏组织（TUNEL染色）以及L-02细胞（FITC膜联蛋白V+7-AAD凋亡检测试剂盒）凋亡细胞数量增多,与对照组相比差异显着（P<0.05）。线粒体凋亡通路蛋白水平也发生改变,包括细胞色素C、Caspase-9、激活态的Caspase-3以及促凋亡蛋白的表达（如phosph-p53和Bax）的显着增加（P<0.05）,和抗凋亡蛋白（Bcl-2）的表达减少（P<0.05）。3.氧化应激可能是α-鹅膏毒肽所致肝细胞凋亡的早期生物学事件随着α-鹅膏毒肽染毒时间的延长（4,8,12,24,48和72h）,ROS、SOD和CAT的活性逐渐降低,氧化应激产物特别是MDA的活性显着升高,各时间点染毒组与对照组相比,差异均有显着性（P<0.05）。染毒细胞总ROS以及mt-ROS显着增加,提示氧化损伤在中毒机制中的重要作用。添加ROS抑制剂后中毒指标（细胞存活率、细胞凋亡情况以及线粒体凋亡途径相关蛋白水平的改变）的逆转也证实了这一结论。结论:α-鹅膏毒肽可触发细胞的凋亡过程,包括改变p53和Bax、Bcl-2的蛋白表达水平,从而激活线粒体凋亡途径相关Caspase级联反应。ROS作为一种上游信号分子,参与α-鹅膏毒肽诱导的细胞凋亡。第三部分线粒体功能障碍引起的能量失衡是导致α-鹅膏毒肽所致肝损伤的主要原因目的:在第二部分的研究过程中,发现染毒后肝脏组织出现广泛的中央小叶坏死区,且肝细胞炎性浸润情况严重。对肝细胞死亡机制的探索中,研究又发现细胞坏死在染毒后期占据主要原因,提示凋亡的研究不足以作为主因解释α-鹅膏毒肽所致肝损伤,需要进一步的深入挖掘与探索。作为人体内最为重要的代谢器官之一,肝脏损伤会引起全身性的代谢变化。因此研究肝脏的损伤机制时,不能仅关注肝细胞本身,要了解体内各种代谢产物在疾病发生、发展过程中的变化规律。故本部分研究利用代谢组学技术对α-鹅膏毒肽染毒小鼠肝脏进行全代谢谱分析,寻找差异代谢物及其所在富集通路的同时,从点到面探索可能的损伤途径及损伤的剂量-效应和时间-效应趋势,并通过分子生物学试验加以验证,从而补充完善所涉及的路径,构建调控网路。方法:本部分研究分别从体内动物和体外细胞两个研究层面入手,筛选并验证了α-鹅膏毒肽所致肝损伤乃至肝衰竭的可能作用通路。1.在通过肝脏生化酶指标和细胞存活率等指标确定构建的细胞和动物模型成功后,首先用免疫组化法和免疫印迹法观察了肝损伤过程中的炎症浸润标志蛋白（包括NF-κB p65,磷酸化NF-κB p65,IKBα和磷酸化IKBα等蛋白）的表达并用坏死相关试剂盒通过流式细胞仪分析了细胞的坏死情况。2.建立以气相色谱-飞行时间质谱联用（gas chromatography-time-of-flight mass spectrometer,GC-TOF/MS）技术为基础的α-鹅膏毒肽中毒小鼠肝脏代谢组学研究模型,分析α-鹅膏毒肽对肝脏代谢谱的影响,结合单因素及多元统计分析方法,并比对专业标准品数据库,筛选和鉴定出差异代谢产物,最后通过通路富集找出目标代谢通路。然后根据GC-TOF/MS结果提供的相关线索,结合分子生物学技术对差异代谢通路进行验证和深入研究。结果:1.肝细胞坏死和继发反应是α-鹅膏毒肽引起死亡的重要原因与前一部分试验结果相似,染毒小鼠出现明显中毒表现,染毒细胞出现明显存活率降低表现。同时,根据流式细胞仪分析结果,α-鹅膏毒肽染毒后,细胞主要处于坏死或凋亡晚期。与对照组相比,α-鹅膏毒肽染毒组的细胞坏死率从24h开始显着增加（P<0.05）。免疫组织化学试验结果显示,与对照组相比,α-鹅膏毒肽染毒组肝细胞NF-κB阳性染色明显增加（P<0.05）,表明细胞核中活化的NF-κB的显着增多,且该趋势具有时间依赖性。同样地,在免疫印迹试验中,与对照组相比,α-鹅膏毒肽染毒组的NF-κB和下游蛋白IκB-α的磷酸化水平随时间显着升高（P<0.05）。2.α-鹅膏毒肽对肝组织代谢谱的影响2.1 总体情况分析对所有分组进行总体研究,通过主成分分析（Principal components analysis,PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least-squares discrimination analysis,PLS-DA）模型,研究发现早期小鼠肝脏小分子代谢物的变化主要集中在α-鹅膏毒肽染毒后8h到12h,而在染毒48h之后,小鼠肝脏经历了第二阶段的变化。2.2 α-鹅膏毒肽染毒小鼠肝脏潜在效应生物标志物及其相关网络分析1)α-鹅膏毒肽染毒小鼠模型的肝脏全代谢谱分析结果显示,在8h、12h和48h时染毒组与对照组的代谢产物存在显着差异。2)在α-鹅膏毒肽染毒后8h-12h期间,小鼠肝脏发生了第一阶段的变化。代谢途径富集分析（MPEA）显示淀粉和蔗糖代谢、泛酸和辅酶a生物合成以及精氨酸生物合成三个途径上的代谢产物发生了显着变化。筛选出D-葡萄糖、D-麦芽糖、葡萄糖6-磷酸酯、异麦芽糖、海藻糖、α-酮戊二酸、鸟氨酸、β-丙氨酸、泛酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、富马酸和N-乙酰谷氨酸为参与该途径的高度显着化合物,与对照组相比,染毒组13种代谢物的含量均发生显着变化（P<0.05）。然后观察了小鼠在暴露于α-鹅膏毒肽48h后的新变化。除了前面提到的淀粉和蔗糖代谢以及精氨酸生物合成外,柠檬酸循环（TCA循环）和半乳糖代谢也发生了显着变化。同样,在这两个途径中筛选了新出现的高丰度代谢物,包括柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、丙酮酸和D-半乳糖等（与对照组相比,P<0.05）。3.线粒体功能障碍是α-鹅膏毒肽引起肝细胞坏死的重要原因代谢组学的结果和对细胞死亡机制的探索表明,线粒体功能障碍可能是α-鹅膏毒肽引起肝细胞损伤和肝衰竭的主要原因。线粒体功能障碍可能涉及的途径包括:抑制呼吸链导致三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）耗竭,线粒体氧化应激增加、线粒体通透性转变（MPT）导致的肝细胞坏死等。因此,本部分研究检测了线粒体过渡孔的通透性（mPTP）,细胞内ATP水平,mtROS的生成,并使用 JC-1 量化了线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,△ψm）,从侧面反映了 mPTP的开放程度。结果显示,α-鹅膏毒肽显着降低了△ψm,同时导致mPTP通透性增加、ATP降低以及mtROS升高,与对照组相比差异均有显着性（P<0.05）。而且所有结果均与时间有关,尤其是24h后变化更为明显。结论:α-鹅膏毒肽染毒小鼠肝脏代谢异常,提示淀粉和蔗糖代谢、泛酸和辅酶a生物合成、精氨酸生物合成以及柠檬酸循环（TCA循环）四个途径上的代谢产物发生了显着变化。线粒体功能障碍可能是α-鹅膏毒肽诱导的肝脏代谢紊乱以及肝细胞坏死的主要原因。

赵扬^[4]（2020）在《药物Ⅰ期临床试验质量管理模式研究》文中进行了进一步梳理【目的】药物Ⅰ期临床试验的主要内容是探究药物的安全性及药物代谢动力学特征,以指导下一阶段的临床试验。在药物Ⅰ期临床试验中,新化合物首次应用于人体,具有较高的风险,同时常有大量健康受试者参与,需要在试验病房由专门的研究团队开展试验与医疗监护,故其质量管理更为独特。国内外学者的相关研究均针对药物Ⅰ期临床试验质量管理的某个方面或环节,宏观系统性的质量管理研究很少,尤其是宏观与微观视角下的系统性实证研究更加缺乏。本研究在文献研究和法律法规回顾梳理的基础上,通过专家法、横断面调查、典型案例及数理分析等,构建宏观视角下的药物Ⅰ期临床试验质量管理模型,和微观视角下的药物Ⅰ期临床试验质量管理评价指标体系,并提出药物Ⅰ期临床试验质量提升的建议,以期填补药物临床试验质量管理模式的相关研究不足,实践上满足现代药物研发管理的迫切需要（如2020年新冠疫苗的研发管理）。【方法】通过文献检索等方法,选择美国国立医学图书馆临床试验注册信息平台（clinicaltrials.gov）与我国“临床试验登记与信息公示平台”（www.chinadrugtrials.org.cn）两个数据平台中2013年3月-2018年9月药物Ⅰ期临床试验信息作为资料来源与数据源,并结合文献研究,总结分析国内外药物Ⅰ期临床试验特征、相关法律法规及监管情况,归纳质量管理要素。在文献综述基础上,基于全面质量管理理论和利益相关者理论,自编结构化问卷。问卷采用Likert5点计分法（评分越高质量越好）,从药物Ⅰ期临床试验整体质量、受试者权益得到充分保护、药物Ⅰ期临床试验质量保证体系建设、试验病房建设与管理水平、试验实施的风险管理等五个方面对药物Ⅰ期临床试验质量进行评价。同时,采用Likert5点计分法对政府监管、行业管理、医疗机构管理、研究团队管理、申办方/CRO管理等5类宏观管理影响因素对药物Ⅰ期临床试验质量影响的大小进行评价。使用此问卷调研药物Ⅰ期临床试验相关人员,最终收集604份有效问卷。应用Mplus7.4和SPSS19.0对问卷进行信效度分析,应用SPSS19.0进行药物Ⅰ期临床试验质量和5类影响因素影响的描述性分析、相关分析和有序多分类Logistic回归分析,采用Mplus7.4构建药物Ⅰ期临床试验质量和5类影响因素之间的结构方程模型。通过德尔菲法构建了药物Ⅰ期临床试验质量管理的指标体系,并在22家医疗机构内进行实证研究,对综合评分法、综合指数法、TOPSⅠS法等方法的评估结果进行Spearman相关性分析,分别计算相关系数（r）和p值,评价指标体系的实用性。在北京大学第一医院进行了典型案例研究,分析药物Ⅰ期临床试验质量管理特征,为提出政策建议打下基础。【结果】药物Ⅰ期临床试验开展现状:与欧盟国家、日本、美国及全球平均水平比较,我国药物Ⅰ期临床试验数量较少（中国1458项、欧盟国家2741项、日本344项、美国6388项）、盲法使用比例较低（中国28%、欧盟国家37%、日本42%、美国36%、全球平均水平38%）、试验方案设计随机化比例较高（中国62%、欧盟国家45%、日本42%、美国42%、全球平均水平43%）、使用健康受试者比例较高（中国56%、欧盟国家47%、日本33%、美国32%、全球平均水平37%）、申办方几乎全部为企业（中国96%、欧盟国家60%、日本59%、美国57%、全球平均水平42%）。药物Ⅰ期临床试验质量管理模式框架:通过对药物Ⅰ期临床试验开展情况,以及相关法律法规和监管情况的回顾梳理,初步整理归纳出药物Ⅰ期临床试验质量管理要素清单:（1）在宏观层面,药物Ⅰ期临床试验质量管理的利益相关方包括政府监管、行业组织管理、医疗机构管理、申办方（包括CRO）管理及研究团队管理。（2）在微观层面,药物Ⅰ期临床试验质量管理的主要环节包括Ⅰ期临床研究室建设与管理;申办方与研究单位的质量保证体系建设;试验方案设计与试验实施中的风险管理;试验过程的各项工作制度、SOP制定与执行等。基于专家咨询法,构建了包括以上质量管理要素的药物Ⅰ期临床试验质量管理模型框架与问卷。药物Ⅰ期临床试验质量管理模型:通过问卷调查,发现药物Ⅰ期临床试验整体质量总体评分为3.81分（总分5分）,介于较好和一般之间;试验实施的风险管理评分相对较低,受试者权益保护评分相对最高。在描述性及单因素分析、多因素回归分析的基础上,通过探索性因子分析、验证性因子分析和结构方程模型构建了药物Ⅰ期临床试验质量管理模型。结构方程模型拟合良好:RMSEA=0.057,TLⅠ=0.971,CFⅠ=0.974。除研究团队外（β=0.055,P=0.468）,政府监管（β=0.249,P<0.001）、行业监管（β=0.344,P<0.001）、医疗机构管理（β=0.203,P=0.023）和申办方/CRO管理（β=-0.253,P=0.005）均显着影响药物Ⅰ期临床试验质量,有序多分类Logistic回归分析结果与结构方程模型一致。此外,结构方程模型显示,影响药物Ⅰ期临床试验质量的各类影响因素之间也相互作用:政府监管与行业管理、医疗机构管理、研究团队管理、申办方/CRO管理之间显着相互影响（β=0.664,0.661,0.569,0.560,p<0.001）;医疗机构管理与行业管理、研究团队管理、申办方/CRO管理之间显着相互影响（β=0.729,0.766,0.790,p<0.001）;行业管理与研究团队管理、申办方/CRO管理之间显着相互影响（β=0.644,0.663,p<0.001）;研究团队管理与申办方/CRO管理之间显着相互影响（β=0.777,p<0.001）。药物Ⅰ期临床试验质量管理的指标体系:通过两轮德尔菲法形成了包括4个一级指标:Ⅰ期临床研究室建设与管理、质量保证体系、试验设计与风险管理、试验过程管理;15个二级指标及73个三级指标,两轮专家咨询表回收率均为100%,一级和二级指标权威系数均大于0.7,专家意见协调系数为0.387（P<0.01）。应用上述指标体系,对22家医院开展实证研究,其中19家医院总评分达到良好（评分4分以上,5分满分）,3家医院接近良好（评分3.88-3.99分）。各指标中申办方/CRO质量保证和风险管理得分较低（评分低于4分,5分满分）。应用直接加和法、TOPSⅠS法、综合指数法对评价结果进行相关分析,直接加和法和TOPSⅠS法的评价结果的相关系数为0.954,直接加和法和综合指数法的评价结果的相关系数为0.994。药物Ⅰ期临床试验质量管理案例研究:结果显示,扁平化的组织架构、优秀的复合型研究团队、严谨高效的伦理审查以及有效的风险防控对药物Ⅰ期临床试验质量管理提升发挥着积极影响。【结论与建议】1.本研究首次构建了多方参与、综合管理为特点的药物Ⅰ期临床试验质量管理模型,结果显示政府监管、行业管理、医疗机构管理、研究团队和申办方/CRO管理等为药物Ⅰ期临床试验质量的影响因素,各影响因素之间存在相互作用。政府监管、行业管理和医疗机构正向影响药物Ⅰ期临床试验质量;研究团队对试验质量影响不显着,说明研究团队人员在临床试验质量管理中的作用尚未得到充分激发;申办方/CRO管理对药物Ⅰ期临床试验质量的影响系数为负值,揭示了申办方/CRO在质量管理中的责任缺失。上述结论可为药物Ⅰ期临床试验质量的宏观管理提供依据。2.构建了药物Ⅰ期临床试验质量管理评价指标体系,覆盖药物Ⅰ期临床试验质量管理的关键环节,有良好的信度和效度,可以作为药物Ⅰ期临床试验质量管理的测评工具。实证研究结果显示,申办方/CRO质量保证和风险管理是药物Ⅰ期临床试验质量管理需要继续加强的两个方面。3.提升药物Ⅰ期临床试验质量管理建议:进一步加强政府对临床研究质量监管体系建设的主导作用,建立临床研究体系建设的有效协调机制,完善相关法律法规与技术指导文件,创新监管模式提升药物Ⅰ期临床试验质量监管效力,建立覆盖申办方/CRO监管的全方位药物Ⅰ期临床试验监管体系;鼓励和推动行业组织积极参与药物Ⅰ期临床试验质量体系建设,参与制定相关技术指导原则,开展监查稽查,建设受试者招募数据库和区域伦理中心,开展培训工作;医疗机构正确把握药物Ⅰ期临床试验发展方向,关注药物Ⅰ期临床试验质量体系建设,严格落实各项质量要求。【创新与不足】构建了多方参与、综合管理为特点的药物Ⅰ期临床试验质量的管理模型;构建了覆盖药物Ⅰ期临床试验质量管理的关键环节、有良好的信度和效度的药物Ⅰ期临床试验质量管理评价指标体系,这些成果丰富了药物临床试验的全面质量管理理论的模型与工具,为药物Ⅰ期临床试验质量的持续改进提供微观与宏观循证依据。由于调查对象为中国临床试验的机构,在其他国家或地区的推广性可能存在局限。

戴诗雨^[5]（2020）在《病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究》文中认为病毒样颗粒（Virus-Like Particle,VLP）是由一个或多个病毒结构蛋白组装形成的颗粒状结构,与天然病毒粒子形态、抗原性相似。VLP缺失病毒的遗传物质,没有复制和感染能力。VLP的免疫原性良好,研制快速,制备成本较低并且安全,在应对新发、突发病毒疾病的疫苗研制中具有独特优势。杆状病毒表达系统是常用的真核表达系统之一,广泛应用于蛋白功能研究,抗原及疫苗制备。我们利用杆状病毒表达系统构建了几种危害人类健康的病毒VLPs,并初步探究了其作为候选疫苗的免疫原性。寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）是蚊传黄病毒,近年发现其感染与新生儿小头畸形有关,且能引起格林-巴利综合征等神经系统疾病。目前,对于ZIKV引起的疾病,尚无有效的疫苗和特异性治疗药物,ZIKV严重危害人类健康。我们利用杆状病毒表达系统,构建了表达ZIKV pr ME蛋白的重组病毒。经蔗糖密度梯度离心,从感染的昆虫细胞中纯化得到由ZIKV pr M蛋白和E蛋白自组装形成的ZIKV VLPs。以ZIKV pr ME VLPs免疫小鼠能够诱导小鼠产生中和抗体,及ZIKV特异的体液和细胞免疫反应,表现出良好的免疫原性,为以VLP为基础的ZIKV疫苗研发奠定了基础。我们也构建了表达ZIKV囊膜蛋白E的重组病毒,结果显示在昆虫细胞中囊膜蛋白E可以不依赖于pr M蛋白共表达组装成与ZIKV病毒粒子形态类似的VLP,并且释放到胞外。E蛋白保留膜融合活性,可以诱导合胞体形成,这一现象同样适用于包括日本脑炎病毒、登革热病毒和蜱传脑炎病毒在内的黄病毒。基于杆状病毒表达黄病毒囊膜蛋白E诱导合胞体形成的现象,我们还建立了靶向黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。脊髓灰质炎病毒（Poliovirus,PV）是脊髓灰质炎（简称脊灰）的病原体。目前脊灰没有特异治疗方法,只能通过接种疫苗来预防。目前世界上普遍使用的脊灰疫苗有两种,即口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（OPV）和灭活脊髓灰质炎疫苗（IPV）。自从1988年世界卫生组织（WHO）发起全球消灭脊灰行动以来,世界各国大力推广OPV的使用,2015年和2019年,WHO先后宣布Ⅱ型和Ⅲ型脊灰野病毒的消灭。在根除脊灰的最后阶段,OPV和IPV都不可避免存在安全性问题,面临着免疫策略调整的挑战,在无PV的环境下生产疫苗更安全可靠。我们利用杆状病毒表达系统共表达PV的P1和3CD蛋白,P1前体可以被3CD蛋白酶成功剪切成衣壳蛋白VP0、VP1和VP3,经过蔗糖密度梯度离心结合氯化铯密度梯度离心可以纯化出PV VLPs,与天然PV病毒颗粒的形态、大小相似。克里米亚刚果出血热病毒（Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus,CCHFV）是一种高致病性病毒,可以导致克里米亚刚果出血热,一种以出血为典型特征的蜱媒自然疫源性疾病。CCHFV感染能引起人发热、出血以及多器官的功能衰竭,进而导致死亡,致死率高达30%-50%,没有有效的抗CCHFV的药物和疫苗,CCHFV是人类健康的潜在威胁。在我国病毒分类目录中,CCHFV属于第一类危害程度的病毒;在国外,CCHFV是生物安全4级的病毒。CCHFV在体外通过细胞培养进行病毒的分离和扩增较困难,极大限制了CCHFV的研究进展。我们构建重组病毒在昆虫细胞中共表达CCHFV的膜蛋白和核衣壳蛋白,或者单独表达膜蛋白。通过蔗糖密度梯度离心,成功从感染的细胞中制备出CCHFV VLPs。CCHFV病毒粒子表面是膜蛋白Gn和Gc,为了形成感染性病毒粒子,膜蛋白前体在细胞内经过复杂的剪切、加工和定位从而形成结构蛋白Gn和Gc,非结构蛋白GP160,GP85,GP38和NSm。在整个生命周期中CCHFV膜蛋白Gn和Gc在病毒入侵、膜融合、致病性、宿主选择和免疫逃逸等方面有重要作用。对CCHFV膜蛋白Gn和Gc宿主互作蛋白的研究,探索CCHFV与宿主的相互作用有利于了解CCHFV的分子生物学,找到病毒感染的关键宿主因子。为了研究CCHFV膜蛋白Gn/Gc与宿主的相互作用,我们首先制备了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的单克隆抗体。以原核表达的Gn/Gc胞外区作为免疫原免疫小鼠,通过有限稀释法,以真核表达的Gn/Gc蛋白作为检测抗原,经ELISA方法初筛融合上清,结合蛋白免疫印迹分析和细胞免疫荧光检测。经过综合评定和比较,筛选出8株Gn单克隆化的杂交瘤细胞和10株Gc单克隆化的杂交瘤细胞。分别以不同截短形式的Gn/Gc原核表达蛋白为抗原,对融合上清的识别区段进行鉴定,最终鉴定出2株Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体及其识别的抗原表位。为了探索膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,我们以带有Twin-strep标签的Gn或Gc作为诱饵蛋白,对样品进行细胞亲和纯化-质谱（AP-MS）鉴定。共鉴定出45个Gn或Gc相关宿主蛋白,结合生物信息学深入挖掘和分析,并通过免疫荧光等方法对质谱结果有效性进行验证。综上所述,我们利用杆状病毒表达系统成功构建了ZIKV VLPs,PV VLPs和CCHFV VLPs。对ZIKV VLPs免疫原性的初步探索表明其有良好的免疫原性,有希望成为ZIKV候选疫苗。基于杆状病毒表达的黄病毒E蛋白诱导合胞体的现象,建立了针对黄病毒E蛋白的抗病毒药物筛选平台。筛选出2株CCHFV Gn单克隆抗体和1株Gc单克隆抗体。并通过蛋白质组学和生物信息学鉴定分析了CCHFV膜蛋白Gn/Gc的宿主互作蛋白,可以促进全面地了解膜蛋白Gn/Gc与宿主的关系,对认识CCHFV感染相关过程,后续功能分析及药物靶点设计具有重要指导意义。

赵良中^[6]（2020）在《靶向PHD2胞内抗体对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用及机制研究》文中研究指明由病毒感染、肝毒素、酒精摄入或药物引起的肝损伤已成为世界范围内严重的人类健康问题,其发病率不断上升。目前,除了肝移植治疗急性肝衰竭和终末期慢性肝损伤外,没有有效的治疗方法。然而,由于供体组织的来源有限且成本高昂,严重限制了通过肝移植进行的治疗。因此,迫切需要探索新的有效的预防和治疗策略。过量服用对乙酰氨基酚（4’羟基乙酰苯胺,扑热息痛,APAP）已成为药物引起的急性肝衰竭的最常见原因。APAP诱导急性肝损伤（APAP-induced liver injury,AILI）的研究显示,血管生成和氧化还原稳态在肝保护和修复中起着重要作用。低氧诱导因子-1（HIF-1）是一种转录因子,在调节血管生成、氧化还原稳态和能量平衡相关基因的表达中发挥关键的调节作用。在包括急性肝损伤在内的急性组织损伤过程中,HIF-1作为急性低氧应激最敏感的因子,它的上调是促进血管生成和组织损伤修复的关键。HIF-α上的脯氨酸残基可以被细胞内的脯氨酰羟化酶（PHDs）羟化,羟化后的HIF-α通过泛素-蛋白酶体途径降解,因此,PHD是调节细胞中HIF-α稳定性的限速酶。其中PHD2是催化HIF-1α脯氨酸羟化的关键限速酶。研究表明,抑制PHD2的活性导致HIF-1α的稳定,从而增强了HIF-1下游大量靶基因的诱导,这些基因调节广泛的低氧反应,如血管生成,能量补偿,氧化还原,pH稳态以及许多其他过程,最终改善急慢性低氧时组织损伤。因此,PHD2已成为促进血管生成和组织损伤修复的一个潜在靶点。鉴于目前PHDs抑制剂缺乏特异性和靶向性,会产生大量的毒副作用,因此如何获得高效特异抑制PHD2活性的抑制剂备受关注。由于抗体具有高特异性和高亲和性作用特点,近年来备受关注。随着抗体工程技术的发展,派生出来的胞内抗体技术,通过对抗体分子的适当修饰,实现细胞内重要靶分子的表型敲除。为此,本研究利用胞内抗体技术制备了一种在细胞内靶向失活PHD2的胞内单链抗体,并对其生物学活性和在APAP肝损伤中的作用进行研究。课题组前期研究中纯化了人源PHD2蛋白,以此蛋白为抗原,通过噬菌体库筛选的方法获得了抗PHD2单链抗体（scFv）,并且通过可溶性表达、纯化及ELISA分析,发现此scFv能够特异性结合重组PHD2。本研究为了靶向失活细胞内的PHD2,以抗PHD2的scFv基因为模板,用内质网（ER）滞留信号序列修饰,从而制备了内质网滞留型的抗PHD2胞内抗体（ER-INP）,检测此胞内抗体是否会在细胞中成功表达,并对其活性进行表征,然后探讨了ER-INP在小鼠APAP诱导的急性肝损伤中的作用和可能的机制。取得如下结果:一、成功构建了内质网滞留型的抗PHD2胞内抗体（ER-INP）。以抗PHD2人源单链抗体scFv基因为模板,通过PCR引入滞留于内质网的细胞内定位信号和E-tag序列,成功制备内质网滞留型抗PHD2胞内抗体基因ER-INP,并将其克隆入真核表达载体中构建重组人ER-INP真核表达载体pER-INP。将pER-INP转染进细胞中,RT-PCR、免疫荧光和Western blot实验分析结果表明,引入内质网定位信号和E-tag序列的抗PHD2胞内抗体基因能够在细胞中有效表达和实现目标蛋白的内质网定位。二、抗PHD2胞内抗体特异性结合细胞内PHD2并抑制其脯氨酰羟化酶活性。将pER-INP转染进细胞中,免疫共沉淀实验、Western blot和免疫荧光实验分析抗PHD2胞内抗体的作用效能。结果表明,细胞内表达的抗PHD2胞内抗体ER-INP能够识别并结合细胞内的PHD2蛋白,抑制PHD2脯氨酰羟化酶活性,即抑制其羟化HIF-1α的Pro564和Pro402的活性,明显上调HIF-1α的蛋白水平。三、抗PHD2胞内抗体在体外和体内均显示出明显的促血管生成活性。为了检测ER-INP在体外和体内是否具有促血管生成活性,分别采用划痕实验检测人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的迁移能力,3D培养模型来检测HUVEC的成管能力,利用鸡胚绒毛尿囊膜（CAMs）模型来检测其体内血管生成情况。通过实时定量PCR、Western blot和ELISA等实验方法分析HIF-1下游促血管生成相关靶基因的表达。实验结果表明ER-INP的表达显着促进了HUVEC的迁移和管状形成能力,并增强了鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成能力。此外,实时定量PCR检测结果表明ER-INP促进了HIF-1下游促血管生成相关靶基因VEGF、ANGPTL-2、MMP-2和MMP-13等的表达,而且Western blot和ELISA结果表明ER-INP显着提高VEGF、MMP-2和MMP-13等促血管生成因子的蛋白水平。四、抗PHD2胞内抗体保护APAP诱导的急性肝损伤。将带有GFP的对照质粒尾静脉注射入小鼠体内,发现从注射后的第1天到第3天可以检测到该蛋白的表达,第3天在肝脏中的表达达到最高水平,由此推测该表达载体携带的ER-INP基因尾静脉注射入小鼠体内后可能主要在肝脏中表达,并在第3天达到最高水平;和对照组相比,正常小鼠尾静脉注射表达ER-INP的质粒不影响肝脏的组织形态学以及小鼠血清谷丙转氨酶（alanine transaminase,ALT）和谷草转氨酶（aspartate transaminase,AST）水平,总之ER-INP不损害小鼠肝脏,并且ER-INP可以在小鼠肝脏中成功表达;小鼠腹腔注射250 mg/kg剂量的APAP溶液,于注射后24 h,48 h和72 h处死小鼠,发现24 h达到肝损伤的高峰期,表现为ALT和AST水平显着升高以及肝脏小叶中央区出现明显的坏死,而尾静脉注射表达靶向PHD2胞内抗体ER-INP质粒预处理48 h后再给予APAP,可显着抑制APAP引起的血清ALT和AST的升高以及肝小叶中央区的坏死也明显改善。五、ER-INP对APAP诱导急性肝损伤的保护作用机制。一方面,ER-INP预处理的APAP肝损伤小鼠肝组织出现了明显促血管生成效应,表现为免疫组化结果显示肝脏中血管新生标志分子CD31表达明显上调,同时具有促血管生成作用的HIF-1α水平显着上调,Western blot和ELISA结果显示HIF-1下游与血管生成密切相关的VEGF和MMP-2的蛋白表达水平明显上调,实时定量PCR结果显示HIF-1下游与血管生成密切相关的VEGF、ANGPTL-2和MMP-2的基因转录水平明显上调;另一方面,ER-INP预处理有利于维持APAP肝损伤小鼠肝组织的氧化还原稳态,表现为ER-INP预处理显着抑制肝脏氧化应激标志分子丙二醛（malondialdehyde,MDA）的水平,Western blot结果显示ER-INP预处理显着抑制了内质网应激标志分子葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulated protein 78,GRP78）水平的升高,然而显着增强抗氧化酶即过氧化物氧化还原酶4（peroxiredoxin 4,PRDX4）的活性和显着抑制抗氧化分子即谷胱甘肽（L-glutathione,GSH）的消耗。总之,ER-INP可能通过促进血管生成和维持氧化还原稳态来保护APAP诱导的急性肝损伤。综上所述,成功制备在细胞内特异性结合PHD2的胞内抗体ER-INP,靶向PHD2的胞内抗体能够在体内外抑制PHD2活性,提高HIF-1α的稳定性,促进HIF-1下游靶基因的转录激活,可能通过促进血管生成和维持氧化还原稳态来保护APAP诱导的肝损伤,这为组织损伤和局部缺血性疾病的临床治疗开辟了新途径,为新药研发提供了新思路和实验依据。

令小东^[7]（2020）在《鲫鱼抵御杀鲑气单胞菌感染的分子机制及重组腺病毒候选疫苗的研究》文中提出杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）是鱼类疖病的病原体,给鲑科鱼类的养殖造成了严重的经济损失。过去几十年,虽然在预防疖病方面做了大量的研究,但该病原仍在渔场肆意流行。因此,急需开发经济有效的疫苗来预防杀鲑气单胞菌的感染。另外,随着多种新亚型的出现及宿主范围逐年扩大,其对世界范围内其他海水和淡水鱼类的养殖也造成了巨大的威胁。目前,虽然已有非典型菌株感染鲫鱼的报道,但鲫鱼抵御感染的免疫机制和组织病理学变化仍不清楚。为明确一株新分离非典型杀鲑气单胞菌的生物学特性和被感染鲫鱼的免疫应答机制,以及研究针对鲑科鱼类杀鲑气单胞菌感染的候选疫苗,本研究采用全基因组测序、转录组学、组织病理学、重组腺病毒以及其他分子生物学技术进行了以下四个方面的研究:（1）采用第二代全基因组测序技术,对鲫鱼体内分离的一株杀鲑气单胞菌进行全基因组测序。通过对基因组组分的分析和基因功能注释发现,该菌株的平均GC含量为58.6%,全基因组总长度4656393bp,编码基因的个数为4226个。发现了109个非编码RNA,包括102个tRNA,占总基因组的0.1723%;7个sRNA,占总基因组的0.0227%。8个基因岛,总长度为97861bp,以及一个前噬菌体,总长度为29875bp。分泌蛋白预测发现具有信号肽结构的蛋白374个,具有跨膜结构的蛋白1032个。分泌系统蛋白预测发现,T2SS型效应蛋白13个,T6SS型效应蛋白5个,T3SS型效应蛋白127个。发现了424个毒力因子,主要包括溶血素、O抗原、鞭毛运动蛋白、S层蛋白、OmpA、T3SS、胞外多糖、荚膜多糖等。也注释到30种耐药相关的基因,主要抵抗氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素、大环内酯类、氯霉素等。以上结果为进一步功能基因组学的研究及制定新的预防和治疗方案提供了理论基础。（2）基于转录组学和组织病理学方法,分析了鲫鱼感染杀鲑气单胞菌的免疫应答和组织损伤情况。结果显示,在感染第5天的鲫鱼头肾组织中,共鉴定出6579个差异表达基因（DEGs）,其中3428个基因表达下调,3151个基因表达上调。进一步的GO和KEGG注释和分析表明,这些DEGs主要富集在酶调节活性、对氧化应激的反应、铁离子稳态等分子功能;以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、NF-κB、toll样受体（TLR）、核苷酸寡聚化结构域（NOD）样受体（NLR）等免疫相关信号通路。鲫鱼感染后所有DEGs中发现的4个C型溶菌酶基因均显着上调。而且,被感染的鱼体表有严重的出血,肠、肝、脾、肾均有不同程度的炎性损伤,尤其是肠黏膜上皮杯状细胞增生和肾小管上皮细胞变性坏死最为严重。随着杀鲑气单胞菌感染浓度的增加,累积死亡率增加,后肠及头肾组织病变程度也加重。另外,四个免疫相关基因（TNF-α、IL-1β、IL-11、C-lysozyme）的相对表达水平与对照组相比均出现显着差异（P<0.05）。因此,这些基因和信号通路的调控对于维持机体内环境的稳态和抵抗病原菌感染具有重要的作用。另外感染鲫鱼的组织病变特征和其他鱼类并不相同,这为鲫鱼抵御非典型杀鲑气单胞菌感染的免疫应答机制和组织病理学鉴别诊断提供了重要的科学依据。（3）在以上研究的基础上,通过采用荧光定量PCR、免疫印迹、原核表达、体外抑菌等试验方法,进一步对鲫鱼感染杀鲑气单胞菌后C型溶菌酶的表达特征及抗菌特性进行了研究。结果显示,杀鲑气单胞菌感染的鲫鱼肝脏、脾脏、肾脏以及后肠中C型溶菌酶的基因和蛋白表达均显着上调,其中肝脏C型溶菌酶的基因上调最为显着,是未感染的15倍。另外,通过原核表达的重组C型溶菌酶对杀鲑气单胞菌具有明显的抑菌活性,且随着重组溶菌酶剂量的增加,培养皿上可见的抑菌圈半径变大。当用40μg的重组溶菌酶时,抑菌圈平均半径达到0.92cm。因此,鲫鱼的C型溶菌酶在抵御杀鲑气单胞菌的感染中发挥了重要的作用。这些研究不但揭示了鲫鱼被杀鲑气单胞菌感染后C型溶菌酶的免疫应答特征,而且重组的溶菌酶为今后解决细菌的耐药性提供了一定的科研基础。（4）通过重组腺病毒技术,我们成功构建了能表达保护性抗原A层蛋白的重组腺病毒。免疫虹鳟鱼后,测定外周血液中特异性抗体水平及免疫保护率。同时,通过荧光定量PCR检测免疫前后头肾和后肠中IgM和IgT的相对表达水平。免疫印迹结果表明,重组腺病毒可感染HEK-293细胞并表达A层蛋白（由Vapa编码）。攻毒后28天鱼的存活率显示,与对照组（76.6%）和空载体组（73.6%）的累积死亡率相比,免疫接种的实验组死亡率（40%）显着降低。更重要的是,它还能显着增加外周血中的特异性抗体水平。以及免疫后头肾和后肠中IgM和IgT的相对表达水平均不同程度的增加,尤其IgT在后肠中的倍增最为显着。因此,重组腺病毒的接种可以激活虹鳟鱼的体液免疫应答,而且对杀鲑气单胞菌的感染具有免疫保护作用。总之,该研究为预防杀鲑气单胞菌的感染提供了一种候选疫苗,并为进一步研究虹鳟鱼抗体介导的适应性免疫应答机制奠定了理论基础。

夏婧^[8]（2019）在《基于科学的新创企业（NSBFs）成长期战略适应研究 ——技术资源的影响》文中进行了进一步梳理有组织的创业活动在大学技术商业化从实验室到商业市场过程中成为重要的催化中介,这种趋势导致了基于科学的新创企业（New science-based firms,NSBFs）的兴起。基于科学的新创企业是致力于实现大学科学技术商业化的企业。基于科学的新创企业在发展过程中,需要完成任务、众多挑战和克服困难,面对不断持续变化的环境,以及技术开发的不确定性。战略适应是新创企业应对不确定环境做出的反应,把不断变化的环境信号释义为企业多样和频繁的战略行动,能更好地应对环境变化,获得战略优势。具有较高战略适应能力的企业在不确定的环境中更能获得竞争优势和更高的企业绩效。基于资源基础理论,引发思考影响基于科学的新创企业战略适应的主要因素是什么?对于具有技术优势的基于科学的新创企业而言,企业核心或独特的技术资源对企业战略适应的作用不可忽视。因此,论文围绕研究影响基于科学的新创企业战略适应的主要因素,提出论文的主要研究问题:（1）影响基于科学的新创企业生存和发展的主要因素是什么;（2）如何测量主要因素和分析它对基于科学的新创企业成长期战略决策的影响;（3）基于科学的新创企业技术资源如何影响成长期战略适应。基于科学的新创企业依赖于科学研究和技术研发。大学学术研究者主导从创意产生开始到实现产品和服务的商业化的一系列过程。在成长过程中,学术研究者扮演着学术研究者、企业创建者和企业管理者等多重角色,并且他们的决策是在学术环境与产业环境交互影响的情形下做出的。然而,基于科学的新创企业成长过程,以及技术如何推动企业成长有待进一步探讨。基于科学的新创企业成长是一个动态演化的过程,面对不断持续变化的环境和技术开发的不确定性。在不同阶段的发展目标不同,战略决策也不尽相同,技术资源在各阶段的作用就会存在差异。因此,基于科学的新创企业成长活动中,能够有目的和有针对性的去满足技术资源对企业不同发展阶段战略决策至关重要。分析了基于科学的新创企业在初创期和成长期不同的成长特征,介于技术资源在基于科学的新创企业成长期的作用,认识到企业核心或独特的技术资源对企业战略决策的作用不可忽视,引发了对基于科学的新创企业发展成长动态过程,以及技术资源重要作用的分析和讨论。通过对基于科学的新创企业成长过程及影响因素的探索和讨论,研究发现科学研究为基于科学的企业提供知识基础,企业可以迅速把握技术的更新脉搏离不开充足的科学知识和丰富的基础性研究,开发新产品和服务,开拓新的产品市场,实现持续发展和快速成长。基于科学的新创企业在初创期的主要任务是发展核心技术,在此阶段的战略行动集中于核心技术研发,进行技术资源的积累。基于科学的新创企业的成长期是企业的战略选择阶段,需要应对环境变化,做出正确的战略选择,识别机会和实现企业盈利。企业将依据已有的关键资源,采取一系列的战略行动。因此,基于科学的新创企业在初创期形成的技术资源对成长期战略行动的作用效果和作用机理是企业成长期战略适应表现的重要问题,有待进一步揭示。论文从问题导向出发,通过认识-发现-分析的递进式研究逻辑,开展了三部分工作,形成论文主要的三个章节:（1）认识技术资源在基于科学的新创企业动态成长过程中的重要性;（2）发现技术资源是影响战略决策的主要因素;（3）分析基于科学的新创企业技术资源对战略适应的影响。具体研究内容的安排如下:首先,对基于科学的新创企业的概念、特点和动态性,以及基于科学的新创企业成长理论进行了阐述;然后,对资源基础理论进行了阐述,总结整理了学者们对技术资源如何影响基于科学的新创企业的研究;最后,阐述了战略适应的概念,从战略管理的角度总结整理了学者们对基于科学的新创企业成长期战略适应性理论研究。第二,阐述了基于科学的新创企业成长过程关键节点,从而提出基于科学的新创企业成长过程模型,运用案例研究方法,演绎过程模型,探讨学术研究者的行为活动和角色,以及技术资源在企业成长过程中的重要作用,丰富了对基于科学的新创企业相关研究。基于成长过程的动态性,通过总结整理了基于科学的新创企业成长过程和影响因素相关文献,构建了基于科学的新创企业系统动力学分析模型。通过分解系统动力学模型命题,运用案例研究对命题进行演绎,阐述了系统动力学模型的合理性和有效性。最后,总结了基于科学的新创企业成长过程的动态性,认识和理解了技术资源在基于科学的新创企业动态成长过程中的重要性,分析了基于科学的新创企业在初创期和成长期不同的成长特征,介于技术资源在基于科学的新创企业成长期的作用,引发了技术资源对成长期战略适应影响的关注和思考。第三,阐述了技术资源对企业成长各阶段的影响,然后总结和整理学者们对技术资源的划分基础上,本文把技术资源分为技术深度和技术宽度两个维度,在学者们对技术深度和宽度的测量研究基础上,测量和分析了基于科学的新创企业技术资源深度和技术宽度,为实证研究技术资源对基于科学的新创企业成长期战略适应的影响提供了理论基础。最后,实证研究样本采用新三板挂牌的医药制造产业中,处于成长期的基于科学的新创企业,探讨技术深度与宽度对基于科学的新创企业成长期战略适应的影响。因为,专利是企业技术知识的表现形式,通过国际专利分类和专利IPC代码识别计算企业挂牌时的技术深度和技术宽度。战略适应表现为一系列的战略行动,从而对企业在新三板挂牌时点之后的各类战略行动数量进行汇总,并计算企业的战略行动多样性和频次。用回归分析实证研究方法,分析基于科学的新创企业技术深度和宽度对战略适应的影响,探讨企业技术知识结构如何影响基于科学的新创企业成长期战略适应,丰富了战略管理理论。

张润军^[9]（2019）在《pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究》文中进行了进一步梳理研究背景:心血管疾病（CVD）是全世界发病率和死亡率的主要原因。据估计,心血管病每年可导致1790万人死亡,约占全球死亡总数的31%。研究表明,血管炎症与多种心血管疾病的发病机制密切相关,如动脉粥样硬化、心肌梗死、再狭窄、颅内动脉瘤和主动脉瘤、卒中和外周动脉疾病。通过调节参与炎症反应的不同分子和细胞过程,已经有大量的治疗方法被研究用来预防和治疗心血管病。尽管在临床前研究方面取得了重大成果,但大多数已检测的抗炎药物的理想疗效尚未在临床实践中得到充分证明。在很大程度上,这可能与治疗分子递送到血管炎症部位的效率低下有关,这是由于它们的非特异性分布和从循环中被快速消除造成的。即使是炎症血管内局部吸收的药物,由于扩散不受控制,滞留时间也很短。近年来,基于纳米粒的靶向治疗被认为是一种很有前景的策略,可以特异性地递送不同的治疗和成像药物,用于检测或治疗血管炎症。尤其广泛的纳米粒已被设计作为靶向载体治疗动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭、缺血再灌注损伤、严重的肢体缺血、再狭窄、腹主动脉瘤和缺血性卒中。在这些例子当中,聚合脂质纳米粒、脂质体、重组高密度脂蛋白、来源于细胞的囊泡、无机纳米粒和金属纳米粒以及混合纳米粒被用于递送治疗药物,从小分子药物、多肽/蛋白质到核酸,治疗与血管炎症相关的心血管疾病。除了通过受损的内皮细胞层或EPR效应被动靶向到血管病变部位,纳米粒还可通过调节它们的物理性质（如几何结构和顺应性）,分子基团的修饰或特殊细胞膜的功能化,使血管靶向效率得到进一步提高。另一方面,可以根据血管炎症部位异常变化的生物化学信号,设计合成纳米粒的组成成份,有针对性地释放药物载荷。然而,这些血管靶向纳米治疗的转化仍然具有很大的挑战性。虽然直接调控抗原特异性亲和力可以增强纳米粒在血管的聚集,但仅用分子基团修饰后,纳米粒的靶向效率仍然非常有限。对于以细胞膜为基础的仿生策略衍生的纳米药物治疗,其相对复杂的配方流程和不明确的成分可能会妨碍其后续的大规模生产和临床研究。此外,需要进一步改进对感兴趣的血管病变部位的不可控的释放。越来越多的证据表明,双重或多重刺激响应性纳米粒能够在其作用的部位更精准地控制负载药物的释放,大大提高了药物的递送效率。在这方面,对多种生物化学信号或生物化学/物理信号敏感的纳米粒已被广泛用于肿瘤、糖尿病、炎症等多种疾病的靶向治疗。然而,基于这些响应性纳米粒治疗的临床转化并不简单,在很大程度上主要是由于更复杂的药物研发,尤其是在可重复性和质量控制方面。此外,针对目前大多数靶向血管的响应性纳米载体,体内安全性是另外一个重要的问题,尤其对于慢性疾病的治疗,因为大多数静脉注射纳米粒被单核吞噬细胞系统清除并聚集于肝脏和脾脏等器官。因此,亟待开发能够响应与血管炎症相关的生物化学信号,具有理想的靶向能力和良好的药物控释性能且更为有效和安全的纳米药物递送平台。通过对环糊精的化学功能化,最近开发了一系列在酸性和氧化应激条件下具有高度可调控水解行为的响应性材料。体外细胞培养和不同动物模型的在体实验研究结果证明,基于这些载体材料构建的纳米粒对低pH值和高ROS刺激具有较好的响应性及良好的生物安全性。鉴于血管内皮损伤后局部存在炎症微酸性环境和增高的氧化应激,通过整合优化活性氧和pH响应性的环糊精材料的比例,构建活性氧和pH双响应性纳米粒,可以作为一种新型有效和安全的纳米平台,用于血管炎症部位的药物递送。此外,结合分子靶向策略还可以进一步增强血管的靶向性和体内双响应性纳米粒治疗的有效性。本研究课题基于前期合成的pH响应性和活性氧（ROS）响应性的载体材料,以雷帕霉素为模型药物,构建了pH和ROS双响应的纳米药物递送系统,在大鼠颈动脉球囊损伤的血管炎症模型中,通过与非响应性、pH或ROS单一响应性纳米粒治疗比较,考察和评价了pH和ROS双响应性纳米粒的治疗优势以及双响应性主动靶向载药纳米粒在体防治血管再狭窄的效果。研究内容:1.基于β-CD的载体材料的合成1.1 pH响应性β-环糊精材料（ACD）的合成先将1 g β-CD 溶解在8 mL无水DMSO中,然后加入4 mL的2-甲氧基丙烯（MP）,磁力搅拌溶解并与有机试剂充分混匀,最后加入16 mg的吡啶对甲苯磺酸盐（PTS）。室温条件下反应3 h,然后加入0.3 mL三乙胺终止反应。得到的产物加超纯水沉淀,离心,洗涤3次冻干得到白色粉末。1.2 活性氧响应性β-环糊精材料（OCD）的合成将5.55 g 4-PBAP加入到36 mL无水二氯甲烷（DCM）中充分溶解,然后加入7.65 g 1,1’-羰基二咪唑（CDI）。室温条件下磁力搅拌反应0.5 h,再加入40 mL DCM,用30 mL超纯水洗涤三次。再用饱和NaCL洗涤有机相,无水Na2SO4干燥,真空浓缩得到 CDI 活化的 PBAP（CDI-PBAP）。随后,将 250 mg β-CD 和 1.52 g CDI-PBAP 加入至20 mL无水二甲基亚砜中,再加入800 mg DMAP反应过夜。最后,加入超纯水沉淀、离心收集,洗涤三次后冻干得到白色粉末。采用FT-IR和1H NMR对合成的上述两种响应性载体材料进行表征。2.不同纳米粒的制备采用纳米沉淀/自组装法制备基于不同材料的载RAP纳米粒。具体过程如下:精确称取 50 mg PLGA,ACD,OCD或ACD/OCD以不同的质量比混合（80:20、60:40、50:50、40:60、20:80）的载体材料和10 mg RAP共同溶于2 mL有机溶剂中,得到有机相。对于PLGA和ACD纳米粒,使用乙腈;OCD纳米粒,使用无水甲醇;ACD/OCD采用1:1（v/v）无水甲醇和乙腈混合溶剂制备有机相。另将0.6 mL卵磷脂无水乙醇溶液（10mg/mL）和9 mg DSPE-PEG2000溶解在10 mL的去离子水中,油浴加热至65℃ 1 h。然后,将有机相缓慢加入至上述的预热溶液中,磁力搅拌2 h。最后获得的纳米粒溶液用去离子水透析24 h,冻干后即得到不同的载RAP纳米粒（RAP/ACD NP,RAP/AOCD NP,RAP/OCD NP及RAP/PLGA NP）。空白纳米粒,Cy5或Cy7.5荧光标记的纳米粒均通过类似的方法制备获得3.不同纳米粒的表征不同NPs在水溶液中的粒径及粒径分布,Zeta电位通过马尔文粒径仪检测。取新鲜制备的纳米混悬液,滴加到载膜铜网上,室温晾干后透射电子显微镜下观察纳米粒子形态并拍照采集图像。同样将制备好的纳米粒混悬液滴加至云母片,喷金晾干后采用透射电子显微镜观察纳米粒形态并拍照采集图像。载RAP纳米粒在加入适量无水甲醇和乙腈混合溶液后离心,取上清通过高效液相色谱法（HPLC）检测RAP载药量。此外,Cy5或Cy7.5的含量通过荧光光谱仪测定。4.不同空白纳米粒体外水解实验将不同的纳米粒分别分散于pH 5、pH 6、pH 7.4以及加入1 mM H202 0.01 M的PBS缓冲液中。37℃孵育不同时间后,于设定时间点采集样品测定纳米粒溶液在500 nm波长处的透光率。最后,根据透光率计算纳米粒的水解百分比。5.载雷帕霉素纳米粒的体外药物释放实验将新鲜制备冻干的pH/ROS双响应性载RAP纳米粒5 mg分别分散在8 mL不同pH值（pH 5、pH 6、pH 7.4）以及加入 1 mM H2O2 0.01 M 的 PBS 缓冲液中,置于37℃孵箱内震荡混匀。在既定的不同时间点,将含有纳米粒的溶液以19118 g离心,取适量上清液并补充等量相同介质。HPLC检测RAP药物浓度,绘制纳米粒的药物累积释放曲线。单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP仍用相同的方法检测其不同时间点的累积药物释放量,绘制相应药物释放曲线。6.纳米粒的细胞吞噬实验将鼠主动脉血管平滑肌细胞株（MOVAS）以2×105个/孔的密度接种于12孔板中,孵育24小时后,去除培养基并加入相同浓度的Cy5荧光标记的不同纳米粒,在37℃条件下与平滑肌细胞孵育不同的时间。观察前,用溶酶体探针LysoTracker Green染色标记晚期核内体和溶酶体,DAPI染色细胞核。采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察并采集荧光图像。同样,在平滑肌细胞孵育24小时后,加入不同浓度梯度的Cy5标记基于不同载体制备的纳米粒与细胞共同孵育6小时后,考察细胞对纳米粒的剂量依赖性吞噬。另外,通过流式细胞术定量细胞对Cy5标记的不同纳米粒的吞噬,荧光活化细胞分选（FACS）测定荧光强度。考察孵育时间及纳米粒剂量对血管平滑肌细胞吞噬行为的影响。7.不同载雷帕霉素纳米粒体外抑制rVSMCs增殖和迁移的作用研究MOVAS细胞以5000个/孔的密度接种于96孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组仅加入PDGF-BB,继续培养24h后,用CCK-8法检测细胞活性。采用8 μm孔径的Transwell小室评价载不同RAP纳米粒对PDGF-BB诱导的大鼠VSMCs迁移的影响。将MOVAS细胞以2×105个/孔的密度接种于12孔板中。37℃卵孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB（20 ng/mL）及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP 及 RAP/AOCD NP）与平滑肌细胞共同孵育。阳性对照组加入PDGF-BB,而正常对照组不加PDGF-BB和游离的雷帕霉素。6 h后,胰酶消化收集细胞,200μL培养基重悬,将不同治疗组的细胞分别加至Transwell上室,下室则加入600 μL含0.5%FBS和20 ng/mL PDGF-BB的培养基。孵箱内静置8 h后,用棉签轻轻擦去Transwell膜上方未迁移的细胞。4%多聚甲醛固定细胞,0.1%结晶紫染色。最后光学显微镜下观察拍照,随机选取5个视野计数染色细胞的数量并进行统计学分析。8.细胞周期检测MOVAS细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板,37℃孵箱培养24 h后,改为含有0.5%FBS的新鲜DMEM培养基,同时加入血小板源生长因子PDGF-BB及RAP终浓度为1 μM的不同载RAP纳米药物（RAP,RAP/PLGA NP,RAP/ACD NP,RAP/OCD NP及RAP/AOCD NP）。正常对照组加入培养基,阳性对照组加入PDGF-BB。细胞与不同载药纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化并收集细胞,70%乙醇固定,4℃孵育过夜。通过洗涤后,将不同载药纳米粒干预的细胞与RNase在37℃条件下孵育30分钟,然后用碘化丙啶在4℃避光条件下进行细胞染色30分钟。最后通过流式细胞术检测平滑肌细胞在G1、S、G2/M期的比例并进行统计分析。9.免疫印迹分析将MOVAS细胞分别与不同载RAP纳米粒共同孵育24 h后,胰酶消化细胞,加入细胞裂解液,使细胞完全裂解,然后4℃条件下,12000 g离心30 min,收集上清,用BCA试剂盒测定蛋白浓度,进一步通过Western blotting检测细胞周期相关蛋白的表达水平。将含有50 μg蛋白的样本在10%十二烷基磺酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶上分离,电泳转移到硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶封闭,在4℃条件下,将膜与一抗体孵育过夜:（1）Cyclin D1 抗体,稀释1:200;（2）p27kip1抗体,稀释1:250;（3）β-actin抗体,稀释1:1000。然后在37℃条件下,将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗共同孵育1 h,二抗稀释倍数为1:1500。洗涤三次后,通过增强型化学发光试剂盒荧光成像显示特异性条带,同时进行半定量分析。10.不同纳米粒的细胞毒性实验研究将MOVAS细胞以10000个/孔的密度接种于96孔板,培养24 h后,加入不同浓度梯度的空白纳米粒（PLGA NP,ACD NP,OCD NP及AOCD NP）,共同孵育24 h后,CCK-8法检测细胞的活性。11.SD大鼠颈动脉球囊损伤再狭窄模型的建立雄性SD大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉起效后,颈部脱毛备皮,消毒,行颈前部正中切口,钝性分离皮下软组织及颈前肌肉组织,暴露颈动脉分叉,游离左侧颈总动脉及颈内、颈外动脉,将2F Fogarty取栓球囊导管由颈外动脉切口插入至颈总动脉近心端,PTCA压力泵以适当压力充盈球囊,旋转并回撤球囊至颈外动脉,重复三次,完全剥脱颈总动脉血管内皮。然后,尾静脉注射伊文思蓝评价血管内皮损伤情况。12.颈动脉损伤部位酸性炎症微环境和氧化应激水平的考察与评价采用细胞内pH荧光探针BCECF-AM对颈动脉损伤部位组织的pH值变化进行定性评价。在颈动脉球囊损伤模型建立后,于不同时间点取材损伤的颈动脉组织,O.C.T.包埋后,冰冻组织切片（8 pm）。然后,用10 μM ROS荧光探针DCFDA或5μM超氧阴离子荧光探针DHE分别对组织切片进行染色,检测球囊损伤局部组织ROS及超氧阴离子水平。另外,采用相应诊断试剂盒分别对损伤局部组织过氧化氢（H202）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活性进行检测。ELISA试剂盒分别检测丙二醛（MDA）和髓过氧化物酶（MPO）的表达水平。同样,典型促炎细胞因子α-肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素1 β（IL-1 β）的表达水平也通过ELISA试剂盒分别检测。13.靶向Ⅳ型胶原的双响应性载RAP纳米粒的构建将靶向血管内皮下Ⅳ型胶原的多肽（KLWVLPKGGGC-Am）溶解在含有5 mmol/L EDTA的中性PBS缓冲液中,以二硫键/TCEP摩尔比1:1的比例,加入适量的TCEP断键溶液还原。然后,将多肽和DSPE-PEG-MAL以5:4的摩尔比,在4%乙醇溶液中,室温条件下磁力搅拌反应4h,合成KLWVLPKGGGC-DSPE-PEG三嵌段共聚物,未结合的游离肽通过透析去除。最后,将载体材料OCD/ACD以80:20质量比,DSPE-PEG-peptide/DSPE-PEG以1:9摩尔比混合,采用纳米沉淀自组装的方法,制备靶向IV型胶原的双响应性载RAP纳米粒。14.靶向纳米粒体外胶原结合实验的研究将Ⅳ型胶原溶解在0.25%醋酸中,配制浓度为0.5 mg/mL的胶原溶液。将100μL胶原溶液加入到96孔板中,4℃条件下孵育过夜。在胶原涂层或没有胶原涂层的孔板中先用50%血清封闭1 h后,再加入100μL用25%牛血清配制的Cy7.5荧光标记的双响应性靶向纳米粒（Cy7.5/TAOCD NP）,纳米粒浓度（0.2 mg/ml）。孵育1 h后,用包含0.05%吐温20的PBS缓冲液洗板3次。最后,通过IVIS光谱系统观察并拍摄孔板荧光图像。15.纳米粒体内靶向血管内皮损伤部位的研究大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉分别注射Cy7.5荧光标记的不同纳米粒（Cy7.5/PLGA NP,Cy7.5/ACD NP,Cy7.5/OCD NP 及 Cy7.5/AOCD NP）,在体循环8 h后,取材完整的颈动脉及主要脏器,进行小动物活体荧光成像（IVIS）观察纳米粒在血管内皮损伤部位的荧光强度及组织分布情况并进行定量分析。另外,在颈动脉球囊损伤后,经尾静脉注射Cy7.5荧光标记的双响应性纳米粒（Cy7.5/AOCD NP）,在预设不同观察时间点取材损伤的颈动脉组织,离体成像观察和定量分析荧光强度,评价纳米粒的靶向和滞留时间变化情况。16.靶向纳米颗粒与损伤颈动脉的特异性结合的评价在大鼠颈动脉球囊损伤模型建立后,即刻经尾静脉注射Cy5荧光标记的靶向纳米粒（Cy5/TAOCD NP,25 μg/kg）。在体循环0.5 h后,给予安乐死,取材颈动脉组织,Tissue-Tek O.C.T.包埋,冰冻组织切片（5μm）,FITC标记的抗体染色血管内皮下IV型胶原,DAPI染核后,盖玻片封片,通过CLSM观察颈动脉组织荧光分布及靶向纳米粒与胶原共定位情况。17.不同载雷帕霉素纳米粒对SD大鼠颈动脉球囊损伤的疗效评价将30只雄性SD大鼠随机分为6组（n=5）,包括假手术组（正常组）、生理盐水治疗组（模型组）,以及RAP/PLGA纳米粒组、RAP/ACD纳米粒组、RAP/OCD纳米粒组及RAP/AOCD纳米粒组。除假手术组外,其余各组大鼠均按上述方法实施颈动脉球囊损伤。在颈动脉球囊血管成形术后,分别于术后即刻（0d）,4 d,8 d,12 d尾静脉注射RAP终浓度为1 mg/kg的不同载RAP纳米粒。在另一项单独设计的实验研究中,RAP/AOCD纳米粒或RAP/TAOCD纳米粒在大鼠颈动脉球囊损伤后即刻（0 d）,5 d,10 d分别以终浓度1 mg/kg的RAP经尾静脉注射给药。在血管成形术后第14 d,给予大鼠安乐死。原位灌注后取材损伤的颈动脉段及主要脏器,进行组织学和免疫组化研究,考察相关标志物表达水平。18.双响应性纳米粒的急性毒性和载雷帕霉素纳米药物治疗对SD大鼠的长期毒性评价实验12只雄性SD大鼠（180-250g）随机分为4组（n=3）。在AOCD纳米粒组,尾静脉注射不同剂量（250、500或1000 mg/kg）AOCD纳米粒。正常对照组给予尾静脉注射生理盐水。仔细观察各组动物的相关毒性症状和行为活动状况。在规定的时间点称量检测体重变化。在给药后第14 d,给予大鼠实施安乐死,即刻采集血样进行血液学和生化相关指标分析。收集主要脏器并称重,分析计算脏器指数（每只大鼠的器官重量与体重之比）,同时制作组织切片H&E染色观察其病理变化。健康雄性SD大鼠16只,体重（180-250 g）随机分为4组（n=4）。空白纳米粒组按11.5 mg/kg AOCD NP治疗（相当于RAP纳米粒的治疗剂量1 mg/kg）,另外两组分别按1 mg/kg RAP/AOCD NP或 3 mg/kg RAP/AOCD NP,尾静脉注射,每周 2 次,连续 12周。正常对照组大鼠则给予静脉注射生理盐水。治疗期间,每天动态观察各组动物死亡率、外貌、全身状况和行为异常等情况。每周记录食物和水的消耗以及体重变化情况。第12周,给予安乐死。采集血液样本,化验分析具有代表性的血液学和生化指标。取主要脏器包括心、肝、脾、肺、肾并称重计算脏器指数。同时制备组织学切片,H&E染色观察病理变化。另外,用抗CD3抗体和抗CD19抗体对脾脏组织切片进行免疫组化染色,评价长期载RAP纳米药物对SD鼠免疫功能的影响。19.双响应性载雷帕霉素纳米粒长期治疗后小鼠脾脏T、B淋巴细胞的定量研究实验将24只雄性C57BL/6J小鼠（18-22 g）随机分为4组（n=6）。正常对照组给予生理盐水,空白纳米粒组按11.5 mg/kg（相当于载RAP纳米粒治疗剂量1 mg/kg）剂量尾静脉注射AOCD NP。另外两组小鼠分别给予RAP/AOCD NP,1 mg/kg或3 mg/kg,尾静脉注射,每周2次,连续给药12周。在治疗期间,观察小鼠的一般身体状况的任何变化,包括外貌,摄食、饮水,行为活动及死亡率等。第12周,对小鼠实施安乐死。取脾脏并将分离的脾脏组切成小块,加入无菌PBS缓冲液,对组织进行彻底研磨,然后在淋巴细胞分离培养基中离心收集细胞。将FITC标记的抗CD3抗体及PE标记的抗CD19抗体在4℃条件下,与脾脏组织提取的淋巴细胞共同避光孵育30 min后,用流式细胞染色缓冲液洗涤细胞2次,PBS缓冲液重悬细胞。最后,采用流式细胞仪对脾脏组织中T细胞和B细胞的百分率进行定量分析,评价RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统的影响。研究结果:1.pH和ROS双响应性纳米粒的制备基于β-环糊精（β-CD）,通过单步缩醛化反应合成pH响应性的载体材料（ACD）,傅里叶红外光谱和核磁共振氢谱检测证实ACD被成功合成。根据ACD 1H NMR谱计算,环缩醛与线性缩醛的摩尔比约为0.62,缩醛化度约为90%。此外,（OCD）通过在β-CD分子上将氧化敏感性苯硼酸酯单元4-PBAP以羰基键合的方式引入β-CD合成ROS响应性载体材料,1H NMR谱证实,每个β-CD分子大约有7个PBAP单元。采用改良的纳米沉淀/自组装法制备基于上述两种不同响应性的载体材料的双响应性纳米粒,将ACD和OCD以不同重量配比,构建了 pH/ROS双响应性纳米粒。基于ACD/OCD的不同纳米粒,在质量比为 100:0、80:20、60:40、50:50、40:60、20:80、0:100 时,分别命名为 ACD NP、AOCD8020 NP、AOCD6040 NP、AOCD5050 NP、AOCD4060 NP、AOCD2080 NP和OCD NP。透射电镜（TEM）观察,在不考虑组成分差异的情况下,所制备的纳米粒均为球形,形态规则,粒径均一。马尔文粒径电位检测显示所有制备的纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到186±4 nm。不同纳米粒的粒径分布相对较窄。提示ACD与OCD载体材料具有良好的混合相容性。2.不同双响应性纳米粒的体外水解特性基于载体材料ACD和OCD构建的pH/ROS双响应纳米粒的体外水解,在含有1mM H2O2及不同pH值的PBS缓冲液中进行。对于ACD NP,在pH 5或pH 6的微酸性条件下均表现出明显的快速水解,而H2O2的存在对其水解几乎无任何影响,具有良好的响应低pH的特性。相对于ACD NP,OCD NP的水解则与pH无关,在H202存在的条件下,OCD NP水解迅速。相比在不同的pH值,OCD NP在pH值为5、6或7.4时均表现出类似的水解特性。基于载体材料ACD和OCD构建的双响应性纳米粒,它们的水解行为依赖于pH和H202,通过在含有1 mM H2O2及不同pH条件的PBS缓冲液中,比较基于不同比例ACD和OCD载体材料制备的双响应性纳米粒水解试验的结果,提示基于ACD/OCD的纳米粒具有pH和ROS双重响应的能力。AOCD2080 NP和AOCD8020 NP在1 mM H2O2和pH 5、6或7.4环境中,表现出更为理想的双响应的特性。此外,在H202存在的情况下,AOCD2080 NP在不同pH值条件下表现出较好的水解行为,因此,AOCD2080纳米粒进一步被用于后续的课题研究。采用基于ACD和OCD的复合材料,成功地构建了 pH/ROS双响应性纳米药物递送平台。值得注意的是,通过改变ACD/OCD的质量比,可以很容易地调控制备得到的纳米载体的精确的水解敏感性。3.pH和ROS双响应性载药纳米粒的制备和表征通过不同响应性空白纳米粒制备响应的载RAP纳米粒。同时,利用PLGA制备了非响应性载药纳米粒作为对照。与相应的空白纳米粒相似,四种载药纳米粒Zeta-potential均为负值,平均流体力学粒径变化范围从121±2到179±6 nm。RAP/PLGA纳米粒、RAP/ACD纳米粒、RAP/OCD纳米粒、RAP/AOCD纳米粒的载药量分别为4.5±0.4%、9.4±0.2%、8.2±0.1%、8.7±0.4%。通过体外药物释放实验研究检测了不同纳米药物的响应性释放行为。对于RAP/AOCD NP,与中性（pH=7.4）PBS缓冲液相比,RAP的释放在微酸性（pH=5或pH=6）PBS缓冲液中明显加快。同时,无论在上述三种不同pH值的PBS缓冲液中,在1mM H2O2存在的条件下都显着增加了载药纳米粒的药物释放速度。因此,RAP/AOCD NP表现出理想的pH/ROS双响应的释药能力,这与相应的空白纳米粒AOCD2080 NP的双响应性水解特性相吻合。另外,单一响应性载药纳米粒RAP/ACD NP和RAP/OCD NP药物释放也同样符合相应纳米载体的水解性能。通过利用基于pH响应性和ROS响应性材料设计的纳米复合材料可以简单、成功地构建出pH/ROS双响应性载RAP纳米粒。4.体外rVSMCs对双响应纳米粒的摄取Cy5标记的双响应性纳米粒（Cy5/AOCD NP）与VSMCs孵育1 h后,VSMCs中的荧光信号随着Cy5/AOCD纳米粒的剂量的增加而明显增强,提示细胞对纳米粒的内吞呈现剂量依赖性的特点。与激光共聚焦显微镜观察结果一致,流式细胞术荧光激活细胞分选（FACS）定量进一步证实了 VSMCs对Cy5/AOCD NP的有效细胞摄取呈剂量依赖的方式。在相同剂量的Cy5/AOCD NP下,随着孵育时间的延长,Cy5荧光在VSMCs中的分布也随之增加。而且,通过溶酶体探针Lysotracker对晚期核内体和溶酶体进行染色,发现血管平滑肌中内吞Cy5/AOCD NP从核内体/溶酶体转运到细胞质中（核内体/溶酶体逃逸现象）。同样,FACS的分析表明,随着孵育时间的增加,VSMCs内吞Cy5/AOCDNP的作用增强。这些结果充分表明,大鼠VSMCs可以有效地内吞基于ACD和OCD材料构建的pH/ROS双响应性纳米粒。在酸性和氧化应激微环境的亚细胞细胞器中,与pH响应性或ROS响应性的纳米粒相比,双响应性纳米粒能够更快地释放负载的药物分子。5.双响应性载药纳米粒的体外生物学效应不同响应性纳米粒的细胞毒性均较PLGA纳米粒低。载雷帕霉素纳米粒在相对低剂量下具有较低的细胞毒性。经RAP原料药和不同的RAP纳米粒治疗24小时,可显着抑制VSMCs的迁移。值得注意的是,与游离RAP相比,所有载药纳米粒都显示出明显更强的抑制VSMCs迁移效果。此外,响应性载药纳米粒对VSMCs迁移的抑制作用比非响应性载药纳米粒（RAP/PLGA NP）更为显着。值得注意的是,双响应性纳米药物治疗（RAP/AOCD NP）的抑制血管平滑肌细胞增殖的效果最好,与单一响应性纳米粒治疗相比差异显着。而且,不同载药纳米粒治疗对细胞周期的影响的实验表明,载RAP纳米粒主要通过抑制细胞G1/S的转化从而抑制VSMCs的增殖。载RAP纳米粒使细胞周期停滞在G1期的机制研究表明,双响应性载RAP纳米粒抑制VSMCs增殖通过上调p27Kip1和下调cyclin D1表达使细胞停滞于G1期。6.双响应性载RAP纳米粒在体靶向治疗血管再狭窄以大鼠颈动脉球囊损伤为模型,建立大鼠血管炎症性疾病模型,并通过Evan’s蓝染色证实明显的内皮剥脱损伤。pH敏感性荧光探针检测颈动脉损伤局部pH值的变化显示:正常动脉显示明显的绿色荧光,而球囊损伤后第1、7、14天分离的动脉组织荧光信号明显较弱,表明损伤动脉中存在相对酸性的微环境。用DHE和DCFHDA荧光探针对大鼠颈动脉冰冻组织切片进行染色,与正常动脉相比,球囊损伤后第1天颈动脉荧光强度轻度升高。而在损伤后第7天和第14天,可以观察到明显的增强荧光。这些结果证实动脉损伤部位存在氧化应激,很大程度与炎症的进展有关。双响应性纳米粒对损伤颈动脉的靶向性研究表明,纳米粒对内皮损伤的颈动脉具有靶向性,定量分析显示,非响应性纳米粒和响应性纳米粒治疗组间差异并无统计学意义。载RAP纳米粒给血管再狭窄治疗带来不同程度的获益,颈动脉管腔面积显着增加,而内膜面积和增殖指数明显减少,中膜面积无明显变化。在各组载RAP纳米粒的治疗中,双响应性载药纳米粒疗效最佳。在不同的载RAP纳米粒治疗后,免疫组织化显示:总α-SMA阳性细胞数量明显减少。此外,所有纳米药物治疗组的PCNA均显着降低,但以RAP/AOCD NP组的效果最好。MMP-2结果与PCNA相似。而且,在给予响应性载药纳米粒治疗的大鼠动脉中的8-OHdG表达显着降低。定量分析显示,在双响应性载药纳米粒治疗后,动脉组织中典型的氧化应激相关标志物,包括H202、MDA和MPO的水平显着降低。另一方面,损伤颈动脉SOD活性明显降低,经RAP/AOCD NP治疗后,SOD活性得到有效恢复。同时,与模型组相比,组织损伤部位的促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子（TNF-α）和白介素（IL）1 β的表达水平在RAP/AOCD NP治疗后也发生了显着降低。7.pH和ROS双响应性靶向Ⅳ型胶原的载药纳米粒的制备与表征通过巯基-马来酰亚胺键合,将多肽KLWVLPKGGGC与DSPE-PEG结合。通过类似改良的纳米沉淀法/自组装法成功构建了靶向Ⅳ型胶原、p H-/RO S-双响应性纳米粒（TAOCDNP）。经TEM和SEM检测,TAOCDNP呈球形,具有较窄的粒径分布。平均流体力学直径131 nm,Zeta电位-27.2±0.3 mV。雷帕霉素可以包载到TAOCD NP中,形成一种靶向、双响应性载药纳米粒（RAP/TAOCD NP）,球形结构、粒径分布窄,能够有效负载雷帕霉素。8.TAOCD NP的体内外靶向能力评价与非靶向NPs（AOCD NP）相似。共聚焦显微镜观察和流式细胞术定量分析均显示VSMCs对Cy5/TAOCD NP的吞噬呈剂量依赖性和时间依赖性方式。这些结果证实了靶向肽的加入对AOCD NP的细胞摄取行为没有显着影响。Cy7.5/TAOCD NP在体外对ⅣV型胶原的粘附表明,引入到TAOCD NP上的靶向肽维持了其对ⅣV型胶原的特异性结合能力。TAOCD NP在体靶向能力表明,Cy7.5/TAOCD NP组在血管内皮损伤部位的荧光强度明显高于Cy7.5/AOCD NP组。动脉组织切片的显微镜观察也显示Cy5/TAOCD NP有相对较强的荧光。大鼠颈动脉冰冻组织切片Ⅳ型胶原抗体免疫荧光染色显示损伤动脉中Ⅳ型胶原（绿色荧光）与红色Cy5荧光共定位,而正常动脉中未见Cy5荧光。总之,这些结果证明,经靶向Ⅳ型胶原多肽修饰可显着增强pH和ROS双响应性纳米载体对损伤颈动脉的被动靶向聚集。9.双响应性载RAP靶向纳米粒靶向治疗血管再狭窄颈动脉H&E染色显示,RAP/AOCD NP或RAP/TAOCD NP治疗均能明显抑制血管新生内膜增生。与RAP/AOCD NP治疗组相比,RAP/TAOCD NP组在增加管腔面积、减少内膜面积及降低增殖指数方面均有显着差异。同样,免疫组化分析显示,与RAP/AOCD NP相比,RAP/TAOCD NP能更有效抑制VSMCs在血管内膜的增殖,显着降低了 MMP-2和8-OHdG的表达。这些结果表明,pH-/ROS-双响应性纳米药物治疗的体内防治血管再狭窄效果可以通过靶向单元修饰进一步增强。10.安全性评价将不同浓度的AOCD NP与红细胞孵育2 h,即使在浓度为2 mg/mL时,直接观察和定量分析均未见溶血。体内急性毒性试验显示,所有AOCD NP组均正常摄食和饮水,无异常行为。所有AOCD NP治疗大鼠的脏器指数（主要脏器）均与生理盐水组相当。此外,AOCD NP组血常规及肝功能,生化等相关指标与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义此外,对主要脏器的病理组织切片H&E染色表明,AOCD NP治疗的大鼠没有明显的病理改变。另外,对双重响应性载药纳米粒（RAP/AOCD NP）也进行了体内安全性研究。生理盐水组与空白纳米粒（AOCDNP）组及RAP/AOCDNP组脏器指数无显着差异。同样,经AOCD NP或RAP/AOCD NP治疗的大鼠在血常规及肝肾功能相关的生物标志物方面与生理盐水组比较,各组间差异无统计学意义。主要脏器的H&E染色切片显示几乎没有损伤。此外,鉴于RAP的免疫抑制活性,长期应用双响应载RAP纳米粒对大鼠脾脏T、B淋巴细胞数量无明显影响。而且,对C57BL6J小鼠进行类似的纳米粒长期给药治疗后,流式细胞术检测小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量,结果显示在RAP/AOCD NP作用下,小鼠脾脏中T细胞和B细胞的数量并没有显着变化。这些结果提示,相对低剂量的RAP/AOCD NP治疗对适应性免疫系统没有显着的负面影响。总体而言,AOCDNP和RAP/AOCD NP均具有出良好的生物安全性。研究结论:1.通过联合基于β环糊精合成的pH响应性和ROS响应性材料,同时设计了一种简单和有效的方法成功构建了 pH和ROS双响应的纳米载体。2.通过优化pH响应性材料（ACD）和ROS响应性材料（OCD）的投料质量比,制备了最佳的pH和ROS响应能力的纳米粒。3.双响应性纳米粒AOCD NP能够有效地负载RAP,在低pH值或ROS较高的环境下,触发RAP/AOCD NP释放负载的RAP。RAP/AOCD NP可以通过被rVSMCs有效内吞并在亚细胞细胞器的敏感释放,增强药物分子在细胞内的递送。相比于游离RAP,非响应性和单响应性载RAP纳米粒,RAP/AOCD NP显着的抑制了血管平滑肌细胞的增殖和迁移。4.AOCD NP能够靶向聚集在大鼠颈动脉球囊损伤的部位,通过在动脉损伤部位被动靶向和触发释放RAP,与其他载药纳米粒比较,RAP/AOCD NP在大鼠中表现出更理想的抗再狭窄作用。5.通过靶向ⅣV型胶原多肽的修饰,进一步提高了AOCD NP的靶向能力,成功制备了 pH/ROS双响应的靶向纳米递送平台TAOCD NP。负载RAP的TAOCD NP比相比RAP/AOCD NP,更有效地抑制了大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成。6.AOCD NP和RAP/AOCD NP均具有良好的生物安全性。本课题研究设计的pH/ROS双响应纳米载体和构建的纳米药物递送系统有望进一步用于治疗血管再狭窄和其他与血管炎症相关的心血管疾病。

张郑熠^[10]（2019）在《知识基础对知识密集型企业技术追赶影响机制研究》文中提出在创新、竞争全球化的时代背景下,知识密集型企业在经济发展及国家产业升级发展中的重要性越发凸显。业界普遍认为,知识密集型企业,尤其纳米生物等战略新兴行业企业,能为发展中国家的企业跻身领头羊创造机会,并且成为推动发展中国家科技创新及科技成果转化的重要力量。知识在企业竞争中扮演着重要的角色。知识是指企业所涉及的各类技术领域的知识元素集合,包括技术诀窍、运行管理经验等等各方面。知识衡量国家核心竞争力的重要标准,而日益丰富的知识也是企业挖掘并维持竞争优势的源泉。对于知识密集型企业而言,知识更是最具战略意义的核心资源。随着知识经济全球化时代的到来,知识和技术更新速度的不断加快,企业保持可持续竞争优势的平均周期逐渐缩短。中国企业在日益激烈的竞争环境中不仅要考虑如何获取关键知识,更需要考虑如何取得持续竞争优势。而技术创新被普遍认为是中国企业取得持续竞争优势的动力源泉,是经济发展的助力和支撑。在知识经济和市场经济竞争激烈的现实环境下,知识密集型企业充分参与到国内、国际间的市场竞争中。如何开展技术创新活动,实现技术进步甚至技术突破,已经成为众多知识密集型企业共同思考的战略问题。另一方面,技术复杂程度的增加、技术进步与市场需求速率的加快、以及客户对定制化产品和服务的需求日益增加等因素的出现,使得知识密集型企业的技术创新迫在眉睫,如何通过产品创新以及流程创新实现定制化以及服务个性化已成为知识密集型新创企业追赶过程中不可忽视的重要问题。从知识基础与创新模式的角度进行技术追赶的研究,是后发企业在企业创新实践中需要关注的重要话题。当前技术追赶已经从关注“追赶”全球技术前沿（主要涉及技术的“模仿”）发展到基于全球领先（追赶中）产品创新和流程创新的新知识开发的持续发展阶段。但现有的研究虽然对知识基础和技术创新进行了初探,并在技术创新在知识整合、利用方面的所带来竞争优势达成了共识,但更多关注的是自主创新以及模仿创新的选择上,并未对自主创新进行具体研究,企业内部知识基础如何具体作用于企业技术追赶绩效的研究黑箱仍未打开。此外,已有研究对知识存量与技术进步的研究存在分歧,有部分研究认为中国企业的科研存量过少,因而对技术进步没有促进作用,而知识密集型企业以知识、技术密集为特征,在知识基础上具有良好的积累,其知识基础对技术追赶起到重要作用将不同于其他行业。同时,知识密集型企业创新类型方面的研究也未引起学者们的足够重视。目前的研究都缺乏对大型新兴经济体追赶情境特殊性的关注,对于中国技术情境中知识密集型企业是如何选择技术创新从而作用于技术追赶,更是甚少关注。再者,对知识密集型企业技术发展的现有研究大多局限在静态、横向的研究上,而事实上企业根据知识基础对创新类型、模式的选择和应用是不断动态演变的。最后,尽管中国知识密集型企业发展迅速,但关于中国后发企业在前沿技术行业的竞争追赶的研究却相对较少。基于以上现实意义和理论背景,本研究围绕“知识密集型企业技术追赶影响机制”这一基本问题,从知识基础和技术创新类型两个角度出发逐层深入探讨四个子研究问题:（1）中国知识密集型企业的知识基础是如何影响企业的追赶绩效的?（2）知识密集型企业的内部知识基础和技术创新类型作用于企业的技术追赶绩效的影响机制如何?（3）在技术差距和技术发展速度等不同的追赶情景下,知识基础通过技术创新类型间接作用于企业的技术追赶绩效的影响机制有何差异?（4）从动态发展视角看,知识密集型企业的技术追赶过程中,知识基础与技术创新是如何演化的?子研究一通过对四家企业的案例研究,强调了知识密集型企业流程创新和产品创新的重要性以及基于流程创新的发展中国家前沿技术行业追赶的新模式,在这基础上,提出知识密集型企业的知识基础通过产品创新、流程创新影响其技术追赶绩效的机制框架,以此解答中国知识密集型企业如何实现较好的技术追赶。子研究二结合子研究一的初步结论,结合进一步文献展开,通过问卷调查的实证方法,运用探索性因子分子和验证性因子分析构建、验证量表,并采用多元回归分析方法对子研究一得出的知识基础与技术追赶绩效间的关系以及技术创新中介作用进行了验证,深入探讨了企业的知识基础水平通过提高产品创新和流程创新从而影响企业技术追赶的影响机制。子研究三在子研究二的基础上,运用二手数据进行多元回归分析,考察了技术差距和技术发展速度这两个技术追赶情境变量对知识基础-技术创新类型-技术追赶绩效的影响路径的调节作用。鉴于知识密集型企业的技术追赶过程是个动态、不断发展的过程,子研究四在前述机制研究的基础上,通过对三家成功发展的知识密集型企业的案例分析,从动态的视角刻画知识密集型企业向新技术和市场发展过程中知识基础与技术创新的演化过程,以此从动态发展的视角进行研究。四个子研究的研究内容结合实证方法、动态视角共同论述、回答了本研究的核心问题:知识密集型企业的知识基础如何影响技术追赶绩效。本研究通过子研究一对四家中国纳米技术公司案例的深入研究,确定了基于流程的创新（Process-based innovation）在中国新兴行业技术发展和赶超过程中的关键作用,并进一步研究基于流程的创新模式在中国等发展中国家与在发达国家的区别。中国纳米技术公司具备基于流程创新的条件,该条件有利于企业实现定制化目标和实施利基市场战略。产品的定制化、相对较低的价格和较高的利润空间,为发展中国家的企业技术发展提供了克争优势。基于对四家知识密集型企业的影响因素总结,子研究一进一步说明产品创新/流程创新对中国知识密集型企业在知识、专利与技术商业化过程中的重要性,得出知识密集型企业的知识基础可以通过产品创新/流程创新影响企业技术追赶绩效的研究命题。本研究在子研究二中,通过对212家知识密集型企业相关数据的实证分析发现,企业的知识基础对技术追赶绩效的影响是通过产品创新和流程创新为中介实现的。具体而言,本研究从知识基宽度和知识基深度两个维度进行衡量,知识多样性、知识深入掌握通过促进差异化产品生产、提供服务进而正向影响企业的技术追赶绩效;同时知识多样性以及知识深入掌握通过改进生产方法和调整流水线从而影响企业的技术追赶绩效。子研究三通过技术追赶情境的研究,本研究发现在不同的技术环境下,知识密集型企业的知识基础通过技术创新类型间接影响于技术追赶绩效的作用存在差异。技术差距和技术发展速度在知识基础对技术追赶绩效机制中起到调节作用,其中技术差距对知识基宽度通过产品创新作用于技术追赶绩效的影响路径起到正向调节作用,技术发展速度对知识基深度通过产品创新作用于技术追赶绩效的影响路径起到正向调节作用。子研究四通过对三家发展及创新比较成功的知识密集型企业的研究,使得对知识基础、技术创新和技术追赶之间关系的认识得到了加深拓宽:企业会根据技术、市场环境进行主导技术创新类型的选择,从而维持持续竞争优势,对技术追赶产生影响。技术创新会使企业的知识得到不断的利用,从而实现累积,经过一段较长时间积累的知识基础,也会使企业在技术创新的选择中做出相应的调整。且本研究发现知识密集型企业对主导技术创新类型的选择以及创新模式的变化是动态的,并不拘泥于单一类型的运用,可能同时存在几种创新模式。研究表明中国知识密集型企业的技术发展以及后发追赶是一个动态的过程,随着企业自身技术创新能力,即已有知识基础水平的不断变化,企业需要根据其战略需求,选择不同创新类型主导的技术创新模式。通过这四个子研究,本研究围绕知识密集型企业的技术追赶影响机制这一问题,对以下理论进行了拓展和深化。首先,本研究以中国知识密集型企业为样本,再次强调了知识密集型行业不同其他行业,其知识科研存量对企业的技术追赶必然是促进作用,同时引入产品创新与流程创新这对知识密集型企业最关键的技术创新类型作为中介变量,探索知识密集型企业技术发展的核心机制。研究的结果显示对于中国正处于快速发展阶段的知识密集型企业而言,知识基础于技术绩效关系有着关键作用,且研究还打开了内部知识基础如何具体作用于企业技术追赶绩效的研究黑箱,研究表明:流程创新带动和融合型的产品创新有利于中国后发知识密集型企业技术追赶,指出了知识密集型企业技术追赶过程中选择技术创新类型应依循的特定规律,有利于纠正只强调产品创新的错误倾向,也为科研成果商业化提供了思路。其次,本研究探索了知识密集型企业通过基于流程的创新模式（流程创新与产品创新同时进行）来实现技术追赶的作用机制。基于流程的创新为发展中国家的知识密集型企业的技术发展带来了竞争优势,从而在知识密集型企业的技术赶超,甚至跳跃式发展中起着重要作用,其创新特性强调了本土创新对后发企业技术追赶的作用,从而为后发企业技术追赶理论带来新视角以及理论支持。同时,本研究结合动态演化的视角,提出了两种不同技术创新类型主导的创新模式。基于这三种创新模式的展开,本研究推进了中国知识密集型企业创新类型以及创新模式的研究。再者,本研究理论上研究并实证检验了技术情境对知识基础对技术创新影响的调节效应,从而拓宽了以往技术追赶影响因素研究的研究视角。最后,本研究将创新演化思想与知识基础、技术创新类型（模式）研究相融合,强调知识密集型企业技术发展过程中的技术创新类型选择是一个动态过程,且不限于工艺创新、服务创新、产品创新等单一创新类型的应用,更强调的是三者的交织运用。同时研究提出知识密集型企业技术追赶中需要考虑市场以及技术的影响,并提出了三条不同的创新演化路径。这为中国知识密集型企业以及其他后发企业选择追赶创新模式,实现技术追赶提供了新的视角。综上所述,本研究对中国知识密集型企业基于知识基础,通过选择合适的技术创新类型从而构建有效技术创新产出的具体机制和过程进行分析,为正在发展兴起的中国知识密集型企业提供了理论指导。本研究还指出,中国知识密集型企业应将企业的知识基础、所在的具体情境有机结合起来,动态选择适合自身技术发展的创新类型组合和创新模式,且在此过程中注重知识基宽度的拓展和知识基深度的积累。企业需要战略性地关注企业自身的流程创新和产品创新,并根据市场、技术环境及时调整企业技术创新类型组合以持续提升技术绩效。而各类园区需要重视知识密集型企业对流程创新能力的培育,在运用政策引导和激励知识密集型企业积极培育、发展和强化自身知识基础的前提下,鼓励企业加强合作来提升产品创新和流程创新。

二、《药物生物技术》1994～2003论文统计分析（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、《药物生物技术》1994～2003论文统计分析（论文提纲范文）

（1）发展和应用质谱检测方法开展模型小鼠代谢变化研究（论文提纲范文）

（2）干酪乳杆菌对高脂膳食仓鼠肠道菌群及脂质代谢的影响与机理研究（论文提纲范文）

（3）鹅膏毒肽所致肝损伤的代谢组学研究以及毒理学作用机制验证（论文提纲范文）

（4）药物Ⅰ期临床试验质量管理模式研究（论文提纲范文）

（5）病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究（论文提纲范文）

（6）靶向PHD2胞内抗体对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）

（7）鲫鱼抵御杀鲑气单胞菌感染的分子机制及重组腺病毒候选疫苗的研究（论文提纲范文）

（8）基于科学的新创企业（NSBFs）成长期战略适应研究 ——技术资源的影响（论文提纲范文）

（9）pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究（论文提纲范文）

（10）知识基础对知识密集型企业技术追赶影响机制研究（论文提纲范文）

四、《药物生物技术》1994～2003论文统计分析（论文参考文献）

• [1]发展和应用质谱检测方法开展模型小鼠代谢变化研究[D]. 郭晴艳. 中国科学技术大学, 2021(09)
• [2]干酪乳杆菌对高脂膳食仓鼠肠道菌群及脂质代谢的影响与机理研究[D]. 马长路. 中国农业科学院, 2020(01)
• [3]鹅膏毒肽所致肝损伤的代谢组学研究以及毒理学作用机制验证[D]. 陈宵. 中国疾病预防控制中心, 2020(02)
• [4]药物Ⅰ期临床试验质量管理模式研究[D]. 赵扬. 华中科技大学, 2020(01)
• [5]病毒样颗粒抗原及克里米亚刚果出血热病毒Gn/Gc宿主相互作用组的研究[D]. 戴诗雨. 中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所), 2020(02)
• [6]靶向PHD2胞内抗体对对乙酰氨基酚诱导肝损伤的保护作用及机制研究[D]. 赵良中. 吉林大学, 2020(08)
• [7]鲫鱼抵御杀鲑气单胞菌感染的分子机制及重组腺病毒候选疫苗的研究[D]. 令小东. 甘肃农业大学, 2020(01)
• [8]基于科学的新创企业（NSBFs）成长期战略适应研究 ——技术资源的影响[D]. 夏婧. 重庆大学, 2019(05)
• [9]pH和ROS双响应性靶向纳米药物的构建及其防治血管再狭窄的应用研究[D]. 张润军. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
• [10]知识基础对知识密集型企业技术追赶影响机制研究[D]. 张郑熠. 浙江大学, 2019(02)

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