一、正常人子宫颈长期器官培养的超微结构研究（论文文献综述）
蔡朋根[1]（2021）在《肝细胞靶向螯合剂的合成与表征及活性研究》文中进行了进一步梳理铜是生命活动所必需的重要元素,而肝脏则是铜在体内存储和代谢的主要器官。铜过载是导致肝癌发生发展的一个重要危险因素,它将引发一系列的严重后果:肝脏部位沉积的铜不仅会直接造成细胞毒性,而且使胞内的H2O2通过Fenton反应产生大量的羟自由基（·OH）,造成细胞膜脂质和线粒体膜脂质的氧化损伤,引起细胞异常增殖,激活致癌基因,最终诱发癌症;而细胞的氧化损伤又进一步加剧肝脏代谢功能障碍,致使更多的铜沉积,导致铜代谢障碍的恶性循环。因此,及时有效地清除肝脏内沉积的铜是恢复铜代谢功能的必要前提,也是遏制正常肝细胞向肝细胞癌转化,预防肝癌发生或扩散的最后屏障。在本文工作中,我们将合成筛选的缩氨基（硫）脲类螯合剂与肝细胞靶向分子乳糖酸进行共价偶联,设计合成了一类高效特异性的肝细胞靶向铜螯合剂。通过质谱（MS）、元素分析、核磁共振碳谱(13C NMR)、核磁共振氢谱（1H NMR）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）等对其分子结构进行表征。然后通过自动电位滴定、紫外光谱（UV）和傅里叶变换红外谱（FT-IR）等方法对螯合剂的结构、性质等方面展开了研究。接着我们通过模拟人体肝癌细胞生理环境,建立了高铜细胞模型,用来研究螯合剂的细胞毒性、螯合剂对细胞内铜的螯合性能、螯合剂对细胞内铜酶活性的影响以及螯合剂对肝癌细胞凋亡周期的影响。研究结果表明:与其他螯合剂相比,我们设计合成的铜螯合剂对铜离子具有一定的选择性,铜协调能力适中,不会干扰如SOD1等铜酶的正常功能;且该螯合剂对细胞毒性较小,并能通过螯合清除细胞内的沉积铜,促进高铜模型下的HepG2细胞凋亡,而且与乳糖酸偶联接枝具有实现肝脏靶向递送药物的潜力。因此,该螯合剂可能是一种缓解或治疗因铜沉积导致肝细胞癌变的潜在靶向药物。
丰颖[2]（2021）在《小剂量雷公藤多苷对人上皮性耐药卵巢癌A2780/DDP细胞的抑制作用及机制研究》文中研究指明研究背景和目的:作为妇科常见的恶性肿瘤,上皮性卵巢癌具有较高的致死率,对广大妇女的身心健康构成了严重的威胁。研究显示,上皮性卵巢癌总体缓解率在10%-35%之间,且缓解期相对短暂。尽管在治疗上皮性卵巢癌方面,已经取得了显着进展,但大多数晚期疾病患者仍然难以避免地经历了复发,最终由于化疗耐药而导致死亡,其中以铂耐药发生率最高。临床上,人上皮性耐顺铂卵巢癌和晚期卵巢癌的治疗一直是个棘手的问题。此外,上皮性卵巢癌的耐顺铂往往表现出多因素的机制,耐药机制比较复杂,目前尚未被完全了解和认识。因此,现阶段治疗铂耐药/铂难治卵巢癌的主要目的是通过序贯单药化疗来维持生活质量和缓解症状,目前的难题仍需要通过创新疗法的临床试验来实现突破。导师带领的课题组一直以来都在中药领域探索,尝试从中药宝库中挖掘出能辅助治疗和改善这些卵巢癌患者疗效的有效中药或中药复合物,期望可以用于这些晚期或耐药卵巢癌的治疗。因此,寻找安全有效的中药用于耐顺铂卵巢癌的治疗意义重大。本研究将小剂量雷公藤多苷（GTW）作用于人上皮性耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞株,通过体内体外实验观察小剂量GTW对人上皮性耐药顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞的生长、侵袭和迁移的抑制作用,并揭示GTW抑制上皮性耐药卵巢癌的作用机制,为GTW临床应用于辅助治疗晚期或上皮性耐药卵巢癌提供实验数据和体内体外评价模型。第一部分GTW对人上皮性耐顺铂卵巢癌细胞的作用目的尝试从细胞水平评价GTW对肿瘤细胞侵袭迁移能力的影响。方法1.A2780/DDP细胞的培养、冻存及计数:将A2780/DDP细胞放置在含有链霉素、10%胎牛血清、青霉素的培养液内进行培养。培养条件:环境温度37℃,5%CO2,90%空气湿度,换液周期为2-3d。当细胞贴壁率达90%左右时,进行细胞消化传代。当细胞形状变为圆形时,加入RPMI-1640培养基,并停止消化。取出上清液,得到细胞沉淀物。按9:1的比例,分别加入胎牛血清900μl和DMSO 100μl制作成细胞冻存液1ml,调节细胞浓度。将调节后的冻存液和细胞沉淀均匀混合后冻存。在细胞沉淀物中加入10%胎牛血清等,打散细胞悬液,调整细胞悬液密度至5×104/ml后进行细胞计数。2.采用CCK8法检测不同浓度GTW、DDP作用于人上皮性耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞株的细胞存活率,并计算GTW、DDP作用于A2780/DDP细胞后的IC50测定。3.采用Transwell迁移、侵袭实验检测不同浓度GTW对A2780/DDP细胞进行干预前后的肿瘤细胞的侵袭、转移能力的变化。分组同前。实验重复3次,取穿膜细胞均值作为反映细胞迁移能力指标。4.采用单向方差分析或双向方差分析进行统计学处理,并以均值表示±SD。P<0.05表示有统计学意义差异。结果1.查阅文献、进行了大量的预实验,并借鉴我们课题组前期研究采用的实验方案,我们选择如下不同浓度梯度的GTW（50μg/ml、200μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml、3200μg/ml）作用于A2780/DDP细胞24h,GTW最低的有效抑制浓度为200μg/ml。随GTW浓度的升高,各实验组的细胞存活率呈进行性降低趋势（P<0.05）,GTW对A2780/DDP细胞生长的抑制作用呈现逐渐增强的趋势,且IC50为882.1 ug/ml。说明GTW呈剂量依赖性抑制A2780/DDP细胞增殖的作用。2.不同浓度DDP（0.625μg/m L、1.25μg/m L、2.5μg/m L、5μg/m L、10μg/m L、20μg/m L）作用A2780/DDP细胞24h,DDP最低有效抑制浓度为1.25μg/m L（P<0.05）。随DDP浓度的升高,细胞存活率逐渐下降（P<0.05）。DDP作用于A2780/DDP细胞上的IC50为1.891μg/m L。表明DDP具有剂量依赖性抑制A2780/DDP细胞增殖的作用。3.小剂量GTW对A2780/DDP细胞的侵袭和迁移能力的抑制作用随着浓度升高而逐渐增强。浓度为200/800/1600/3200μg/m L时,差异显着,具有统计学意义（p<0.05）。结论GTW对A2780/DDP细胞的增殖、迁移和侵袭具有显着的抑制作用,呈剂量依赖性。第二部分GTW通过ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路抑制人上皮性卵巢癌耐顺铂作用的研究目的探讨GTW是否能够通过抑制ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路来抑制上皮间质转化,从而增强DDP的敏感性,抑制肿瘤细胞侵袭转移及耐顺铂作用。方法1将A2780/DDP细胞进行基本分组,分为空白对照组、GTW组、DDP组和GTW+DDP组。分别用si RNA-ILK、si RNA-Slug、AKT抑制剂、GSK3β抑制剂作用于各基本分组后,并通过Transwell实验对细胞的变化（侵袭、迁移）情况进行检测。2用Western blot法测定各组细胞ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路相关蛋白E-cadherin、N-cadheriin、ILK、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、slug的表达情况。3采用单向方差分析或双向方差分析进行统计学处理,并以均值表示±SD。P<0.05表示有统计学意义差异。结果1.与正常对照组相比,DDP组、GTW组、GTW+DDP组能够有效抑制Slug的表达,并且GTW+DDP组抑制作用明显（P<0.005）。转染si RNA-Slug后,N-cadherin的表达进一步下调,而E-cadherin表达进一步上调,以GTW+DDP组尤为显着,差异具有统计学意义（P<0.005）。说明si RNA-Slug协同增强了GTW+DDP组对A2780/DDP细胞的侵袭迁移能力的抑制作用（P<0.005）。2.在si RNA-ILK转染后,A2780/DDP细胞的迁移和侵袭能力减弱。与正常对照组相比,DDP组、GTW组以及GTW+DDP组A2780/DDP细胞的迁移和侵袭受到不同程度的抑制,以GTW+DDP组抑制作用明显（P<0.005）。与正常对照组相比,未转染前,各组ILK、p-AKT、p-GSK3β和Slug的表达下调。尤其在GTW+DDP组,抑制作用最为显着,差异具有统计学意义（P<0.005）。转染si RNA-ILK沉默ILK后,ILK、p-AKT、p-GSK3β和Slug的水平下调更为显着,N-cadherin的表达进一步下调,而E-cadherin的表达进一步上调,以GTW+DDP组尤为显着,差异具有统计学意义（P<0.005）。说明si RNA-ILK协同增强了GTW+DDP组的抑制作用。3.AKT抑制剂（MK2206）可抑制A2780/DDP细胞的生长,且呈剂量依赖性。AKT抑制剂协同促进了GTW、DDP和GTW+DDP对A2780/DDP细胞迁移和侵袭能力的抑制作用,差异显着,具有统计学意义（P<0.005）。AKT抑制剂促进了GTW组、DDP组和GTW+DDP组的p-AKT、p-GSK3β、ILK蛋白水平的进一步下调。促进了各组A2780/DDP细胞的E-cadherin水平的上调及N-cadherin水平的进一步下调,差异显着,具有统计学意义（P<0.005）。4.GSK3β抑制剂可抑制A2780/DDP细胞的生长,且呈剂量依赖性。GSK3β抑制剂协同促进了GTW、DDP和GTW+DDP对A2780/DDP细胞迁移和侵袭能力的抑制作用,以GTW+DDP组抑制作用最为显着,具有统计学意义（P<0.005）。GSK3β抑制剂诱导了GTW组、DDP组和GTW+DDP组slug、p-GSK3β水平的上调,但不影响p-AKT、ILK。GSK3β抑制剂协同促进了各组细胞的E-cadherin水平上调、N-cadherin水平下调,差异明显,具有统计学意义（P<0.05）。结论1.GTW可协同DDP抑制人上皮性耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞增殖、迁移和侵袭,增加A2780/DDP细胞对顺铂的敏感性。2.GTW通过靶向调控ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路,对耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞的增殖、迁移、侵袭产生有效抑制。通过靶向调控ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路,EMT相关蛋白E-cadherin的水平上调,N-cadherin、ILK、p-Akt、p-GSK3β和Slug的水平下调,以GTW+DDP组尤为明显,说明GTW可通过ILK/AKT/GSK3β/Slug途径靶向抑制肿瘤细胞的EMT来增强对DDP的敏感性,从而抑制肿瘤细胞的耐顺铂作用。第三部分GTW抑制人上皮性耐顺铂卵巢癌裸鼠体内成瘤作用的研究目的通过构建荷耐顺铂人上皮性卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤模型,尝试通过体内实验进一步证实GTW可通过抑制ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路,抑制EMT,从而抑制肿瘤细胞EMT相关转移及化疗耐药（DDP-耐药）。方法1.取4～6周龄体重15～20 g的雌性裸鼠48只,按每组12只,随机分为四组,驯化一周。2.取人上皮性耐顺铂卵巢癌A2780/DDP常规培养,在裸鼠腹腔建模时候,取0.2ml的细胞悬液进行接种,密度控制在每ml细胞数量为2×107个。接种满96 h后,在裸鼠尾静脉处抽血0.2ml,离心后吸出血清,-80℃保存,备用。抽血完毕后,当肿瘤体积达到50mm3时,接受以下处理:（1）对照组:每隔一天取生理盐水0.2 ml对裸鼠进行灌胃处理,持续10次。（2）GTW组:1 mg/kg/d GTW生理盐水稀释成终体积0.2 ml,腹腔注药,持续14次。（3）DDP组:顺铂4 mg/kg/d,腹腔注射给药,第1、8天给药,总共用药2天。（4）GTW+DDP组:1 mg/kg/d GTW生理盐水稀释成终体积0.2 ml,腹腔注药,持续14次。在第1天、第8天,按照4 mg/kg/d的剂量腹腔注射DDP,总共用药2天。3.接种后,每天观察荷瘤裸鼠的活动情况、肤色、精神状态,并在接种的第7天起,对荷瘤裸鼠的体重、腹围进行隔日观察,当荷瘤裸鼠的腹围增大时,认为腹腔转移瘤产生。实验截止到最后一次给药后第二天。每周测量两次肿瘤体积,并称重小鼠。实验第22天时,每组取3只小鼠进行安乐死后解剖,观察腹腔成瘤、成瘤位置,统计肠系膜上肿瘤的数量,取下肠系膜以及上面的腹腔转移瘤进行称重。同时留取移植瘤标本,保持无菌,-80℃保存。其余小鼠用于评估生存曲线。4.采用ELISA法检测GTW、DDP及两者联用治疗荷瘤裸鼠后,血清肿瘤标志物CA125、HE4水平的变化5.用Western Blot检测人上皮性耐顺铂卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤组织中E-cadherin、N-cadheriin、ILK、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、slug蛋白表达水平的改变6.采用单向方差分析或双向方差分析进行统计学处理,并以均值表示±SD。P<0.05表示有统计学意义差异。结果1.裸鼠腹腔内成瘤后,各组肿瘤体积及重量均有不同程度改变。各组瘤体积:对照组平均为1916.463±52.491mm3,DDP组平均为1014.021±52.553mm3,GTW组平均为1196.322±51.681mm3,DDP+GTW组平均为680.321±33.652mm3。对照组的肿瘤体积最大,DDP组、GTW组及联合组瘤体积均明显小于对照组,结果具有统计学意义（P<0.05）,其中DDP+GTW组的减小程度最明显。而GTW组和DDP组瘤体积次之（P<0.05）。各组瘤重:对照组平均重0.8210±0.1260g,DDP组平均重0.4797±0.0054g,GTW组平均重0.5413±0.049g,DDP+GTW组平均重0.2777±0.0046g。对照组的肿瘤重量最大,GTW组、DDP组及联合（DDP+GTW）组瘤重均明显小于对照组（P<0.05）,结果具有统计学意义。其中DDP+GTW组瘤体重量的减小程度最明显。而GTW组和DDP组瘤重次之（P<0.05）。2.各组瘤生存期方面,对照组的肿瘤生存期的均值和中位数分别为34.6天、37天,DDP组的肿瘤生存期的均值和中位数分别为41.4天、44天,GTW组的肿瘤生存期的均值和中位数分别为39.8天、40天,联合（DDP+GTW）组的肿瘤生存期的均值和中位数分别为46.6天、49天。DDP+GTW组的生存期最长,生存期最长可以达到50天。3.采用ELISA法检测各组中的CA125、HE4水平时发现:和对照组进行比较,GTW组、DDP及GTW+DDP组使得荷瘤裸鼠血清肿瘤标志物CA125、HE4水平明显下降,以GTW+DDP组下降明显,差异有统计学意义（p<0.05）。4.采用Western Blot法检测人上皮性耐顺铂卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤组织中E-cadherin、N-cadheriin、ILK、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、slug蛋白表达水平的改变。结果显示:GTW组和DDP组移植瘤组织中的E-cadherin水平均上调,N-cadherin、ILK、p-AKT p-GSK3β和Slug水平均下调。DDP+GTW对肿瘤组织中上述相关蛋白表达的调控作用更为明显,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论体内实验再一次证实:GTW可通过抑制ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路,抑制EMT,从而抑制肿瘤细胞EMT相关转移及化疗耐药（DDP-耐药）
刘晗[3]（2021）在《GPR37通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路促进非小细胞肺癌进展的机制研究》文中提出世界卫生组织（World Health Organization,WHO）2020年统计数据显示,全球有60个国家的癌症相关死亡首要病因是肺癌。在我国,肺部肿瘤高居国民新发肿瘤第一位,肺癌已经成为严重威胁人类健康的公共安全问题。G蛋白偶联受体（G proteincoupled receptor,GPCR）是真核生物中最大的一类膜蛋白家族。GPCR基因表达的改变和信号转导的失调已被认为是恶性肿瘤的标志,而GPR37属于GPCR的一员,但其在肿瘤中尤其是在非小细胞肺癌（Non-small cell lung carcinoma,NSCLC）中的作用目前仍鲜为人知。（1）GPR37在NSCLC中的数据挖掘与分析及临床验证鉴于国内外尚没有GPR37在NSCLC中表达及其作用机制的研究,我们首先通过对公共数据库肿瘤基因组图谱计划（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中的数据进行筛选,发现GPR37在多种肿瘤中表达存在差异,其中GPR37在肺腺癌（Lung adenocarcinoma,LUAD）和肺鳞癌（Lung squamous cell carcinoma,LUSC）的肿瘤组织中表达明显高于正常组织,差异有统计学意义（P<0.001）。我们应用基因表达谱交互式分析2（Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2,GEPIA2）的Survival Analysis模块进行GPR37的总体生存期（Overall survival,OS）的分析发现GPR37高表达组的预后较GPR37低表达组的预后差,差异有统计学意义（P<0.05）。随后,我们通过收集我中心明确诊断为NSCLC的20例患者信息进行临床验证,发现GPR37在肿瘤组织中的表达明显高于成对的癌旁组织（P<0.001）同时通过细胞学实验发现GPR37在NSCLC细胞系中均呈现出高表达,且与正常人肺细胞之间存在统计学差异（P<0.001）。（2）GPR37对于NSCLC生物学功能的影响本研究通过构建GPR37过表达及敲低的慢病毒包装质粒,转染A549、H1299、H460细胞,得到稳定表达的GPR37过表达组（GPR37组）,过表达空载体对照组（Vector组）,GPR37敲低组（sh GPR37）及GPR37敲低对照组（sh-Mock组）。我们通过对上述不同组别进行GPR37对于NSCLC生物学功能影响的实验。结果显示,以A549细胞系为例,细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK8）实验检测发现,在相同条件下,GPR37组的细胞活力数量明显高于Vector组,有显着性差异（P<0.001）,sh GPR37组的细胞活力数量明显低于sh-Mock组,有显着性差异（P<0.001）。通过克隆形成实验发现,GPR37组的克隆形成能力明显强于Vector组,有显着性差异（P<0.05）,sh GPR37组的克隆形成能力明显弱于sh-Mock组,有显着性差异（P<0.05）。通过5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（5-Ethynyl-2’-deoxyuridine,EDU）实验发现,GPR37组的DNA合成能力明显强于Vector组,有显着性差异（P<0.01）,sh GPR37组的DNA合成能力明显弱于sh-Mock组,有显着性差异（P<0.05）。通过流式细胞荧光分选技术（Fluorescence-activated cell sorting,FACS）检测细胞凋亡发现,GPR37组的细胞凋亡率略低于Vector组,考虑GPR37过表达后可一定程度减少细胞的凋亡,但统计学无显着性差异,而sh GPR37组的细胞凋亡率明显高于sh-Mock组,统计学有显着性差异（P<0.01）。通过细胞划痕实验发现,GPR37组的细胞迁移能力明显强于Vector组,有显着性差异（P<0.001）,sh GPR37组的细胞迁移能力明显弱于sh-Mock组,有显着性差异（P<0.01）。通过Transwell实验发现,GPR37组的细胞穿过基质胶和滤膜的侵袭能力明显强于Vector组,统计学上有显着性差异（P<0.001）,sh GPR37组的细胞穿过基质胶和滤膜的侵袭能力明显弱于sh-Mock组,统计学上有显着性差异（P<0.05）。我们还通过CCK8实验观察在不同组中加入由低到高的梯度浓度的化疗药物顺铂后,在不同浓度作用下,GPR37组的细胞活力明显强于Vector组,有显着性差异,sh GPR37组的细胞活力明显弱于sh-Mock组,有显着性差异。通过FACS实验观察不同组中加入1.0 ug/ml浓度的化疗药物顺铂,发现GPR37组的抗凋亡能力明显强于Vector组,有显着性差异（P<0.01）,sh GPR37组的抗凋亡能力明显弱于sh-Mock组有显着性差异（P<0.01）。H1299和H460细胞系的结果与A549细胞系趋势相似。上述实验证明GPR37基因的过表达可促进NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭能力,抑制细胞凋亡,并一定程度上增加对化疗药物的耐药性。而GPR37基因的敲低则可抑制NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭能力,可促进细胞凋亡,并一定程度上增加对化疗药物的敏感性,从而可能成为NSCLC潜在的治疗靶点。在动物在体实验中,通过裸鼠皮下成瘤,发现GPR37组的肿瘤体积及重量均明显高于Vector组（P值均小于0.001）,而sh GPR37的肿瘤体积及重量均明显低于sh-Mock组,差异有统计学意义（P值均小于0.001）,证明GPR37过表达可促进NSCLC的成瘤和生长,而GPR37基因的敲低则后可抑制NSCLC的成瘤和生长。上述所有实验均重复三次及以上。（3）GPR37促进NSCLC进展的机制研究最后我们通过GPR37对于诱导上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transitions,EMT）,激活PI3K/Akt/m TOR通路和Raf/MEK/ERK通路促进肿瘤的进展进行了分子学机制的研究。我们发现在A549细胞系中,GPR37组相对于Vector组的E-Cadherin表达下降,而N-Cadherin和Vimentin的表达出现了上调。sh GPR37组相对于sh-Mock组的E-Cadherin表达出现了上调,而N-Cadherin和Vimentin的表达则出现了下降。H1299和H460细胞系的结果与A549相似。说明GPR37促进了EMT的发生,而当GPR37敲低后,会抑制EMT的发生。同时,我们还对GPR37与PI3K/Akt/m TOR,GPR37与Raf/MEK/ERK信号转导通路之间的影响进行了研究。我们发现,GPR37组的P-AKT,P-PI3K,P-m TOR,P-p70S6K,P-EIF4EBP1的表达较Vector组明显升高,反之,在sh GPR37组中,P-AKT,P-PI3K,P-m TOR,P-p70S6K,P-EIF4EBP1的表达较sh-Mock组明显下降,证明了GPR37可使PI3K/Akt/m TOR通路中的关键蛋白发生活化,促进该通路的激活。H1299和H460细胞系的结果相似。同时,本实验通过测定Raf/MEK/ERK信号转导通路的关键蛋白表达情况发现,在三种细胞系中均得到了类似的结果,即GPR37组的P-Raf1,P-MEK1,P-ERK表达较Vector组明显升高,sh GPR37组的P-Raf1,P-MEK1,P-ERK的表达较sh-Mock组明显下降。这也证明了GPR37可使Raf/MEK/ERK通路中的关键蛋白发生磷酸化从而促进通路的激活,而GPR37的敲低,则可抑制PI3K/Akt/m TOR与Raf/MEK/ERK的激活,抑制NSCLC的进展。上述所有实验均重复三次及以上。综上所述,本研究发现GPR37在NSCLC的患者中表达明显高于正常人群,且GPR37的高表达预示着较差的预后。GPR37基因的过表达可促进NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭能力,抑制细胞凋亡,并增加对化疗药物的耐药性,促进NSCLC的体内生长,诱导EMT发生,同时可激活PI3K/Akt/m TOR与Raf/MEK/ERK信号转导通路。而GPR37基因的敲低则可抑制NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭能力,促细胞凋亡,并一定程度上增加对化疗药物的敏感性,影响NSCLC的体内生长,减少EMT的发生,并主要对PI3K/Akt/m TOR与Raf/MEK/ERK信号转导通路产生抑制作用。因此,这些结果表明,GPR37在NSCLC的进展中起着促癌作用,而敲低GPR37可抑制NSCLC的进展,可作为NSCLC潜在的治疗靶点。
刘莹[4]（2020）在《阴道菌群特点及差异细菌生物膜促进宫颈癌变的机制研究》文中提出[目 的]高危型人乳头瘤病毒（High risk human papillomavirus,HR-HPV）感染是宫颈癌的病因,但是并非所有的感染者都会患宫颈癌。多数感染者,病毒会被自身的免疫系统清除,只有持续感染才会发展成宫颈癌。机体清除HPV的能力极易受到阴道微生态的影响。阴道菌群失调作为主要的协同因素,促使HR-HPV长期感染宫颈并最终导致癌变。本研究对从HR-HPV初次感染宫颈,到发展为宫颈癌过程中的不同阶段的阴道菌群进行检测,获得总的菌群信息。研究阴道菌群变化与HR-HPV感染和宫颈癌之间的关系,目的在于阐明阴道菌群在宫颈癌发生、发展过程中的变化特点,并寻找最可能的差异细菌进一步研究。为宫颈癌的防治寻找新的思路。[方法]收集云南省肿瘤医院（昆明医科大学第三附属医院）2017年12月-2018年12月符合入组标准的90例女性阴道分泌物拭子,单纯HR-HPV感染30例,HR-HPV感染并诊断为宫颈上皮内瘤变患者（Cervical intraepithelial neoplasia,CIN）30例,HR-HPV感染并诊断为宫颈鳞状细胞癌Ib1期患者30例。同时选取同期在妇科门诊体检的健康女性30例,HR-HPV均为阴性。提取阴道分泌物总DNA进行高通量测序,对测序结果进行生物信息学分析和统计学处理。从HR-HPV感染状态和宫颈病变程度两方面分析阴道菌群的结构差异和变化特点,并最终筛选出最可能的差异细菌进一步研究。[结 果]◆健康女性、HR-HPV（+）女性阴道菌群中乳酸杆菌占绝对优势（丰度>50%）。HR-HPV（+）女性乳酸杆菌在门、纲、目、科水平上较正常女性丰度有所下降,但是未出现统计学差异（P>0.05）;两组样本的菌群分布在门、纲、目、科、属、种六个水平上均具有统计学差异（P<0.05）;◆菌群多样性分析发现:健康女性、HR-HPV（+）女性的chao指数和ace指数相当,差异无统计学意义（P>0.05）,说明两组样本中总的菌群数量一样多。HR-HPV（+）女性shannon指数明显高于健康女性（P<0.05）,simpson指数明显低于健康女性（P<0.05）。说明HPV（+）女性阴道菌群结构组成具有明显多样性、复杂性和不均匀性;◆单纯HR-HPV（+）、宫颈癌前病变、宫颈癌患者阴道菌群均以乳酸杆菌占绝对优势（丰度>50%）。随着疾病的进展,乳酸杆菌丰度有所下降,但是未出现统计学差异（P>0.05）;三组样本菌群构成在门、纲、目、科、属、种六个水平上明显不同,差异具有统计学意义（P<0.05）;◆菌群多样性分析发现:单纯HR-HPV（+）、宫颈癌前病变、宫颈癌患者阴道菌群的chao指数、ace指数差别无统计学意义（P>0.05）,表明三组样本阴道菌群的丰富度（即数量）相当。shannon指数、simpson指数差异有统计学意义（P<0.05）,表明三组样本菌群多样性存在差异。组内比较发现:单纯HR-HPV感染组与宫颈癌前病变组无论是在丰富度上（chao指数、ace指数）还是在多样性上（shannon指数、simpson指数）均无统计学差异（P>0.05）。说明这两组菌群结构相似,可以归为非癌组。而宫颈癌组与HR-HPV感染组、宫颈癌前病变组比较,在菌群多样性上（shannon指数、simpson指数）具有明显的统计学差异（P<0.05）,并且随着疾病的进展,差异越显着（P<0.05）;◆差异分析发现:阴道加德纳菌是HR-HPV感染和宫颈癌患者阴道菌群中的主要差异细菌（P<0.05）;[结论]乳酸杆菌是女性阴道的绝对优势菌群。阴道菌群结构的变化,特别是菌群多样性、复杂性的增加与HR-HPV感染以及宫颈癌变有关。阴道加德纳菌是HR-HPV感染、宫颈癌患者阴道菌群中的主要差异细菌,是HR-HPV长期感染宫颈并诱发癌变的主要协同因素。[目 的]第一部分研究发现,阴道加德纳菌是HR-HPV感染和宫颈癌患者阴道菌群中的主要差异细菌。研究表明,阴道加德纳菌具有较强的生物膜形成能力,在女性阴道中主要以生物膜形式存在。本部分研究拟于在体外建立阴道加德纳菌生物膜模型,对其成膜规律、形成特点和空间结构进行描述。探讨随女性月经周期,发生规律性变化的雌激素水平对阴道加德纳菌生物膜形成的影响。目的在于阐明阴道加德纳菌生物膜形成特点,为下一步成功提取成熟生物膜建立基础。同时初步探讨雌激素对阴道加德纳菌生物膜形成的影响,为临床治疗阴道加德纳菌感染寻找新的途径。[方法]首先,在体外以96孔板为载体建立阴道加德纳菌生物膜模型。结晶紫半定量法检测生物膜形成量,从而描述其生物膜形成规律。其次,模拟女性体内雌二醇浓度,用含有不同浓度雌二醇（100pmol/L、200pmol/L、400pmol/L、1000pmol/L）的培养基,体外培养阴道加德纳菌生物膜,结晶紫半定量法检测不同浓度雌二醇对阴道加德纳菌生物膜形成的影响。之后,在体外以金属钛片为载体建立阴道加德纳菌生物膜模型,在扫描电镜下观察其空间结构和特点以及不同浓度雌二醇对其空间结构和特点的影响。激光共聚焦显微镜测量不同浓度雌二醇对阴道加德纳菌生物膜形成厚度、活/死菌比例的影响。[结 果]◆阴道加德纳菌12h开始逐渐形成生物膜,24h进入快速生长期,96h生物膜生成量达高峰（P<0.05）,之后不再增加（P>0.05）;◆96h时,阴道加德纳菌生物膜呈现典型的三维立体结构,呈现“蘑菇云”状层叠,中间有大量通道和细胞外基质,至此成熟生物膜己形成;◆不同浓度的雌二醇对阴道加德纳菌生物膜形成具有抑制作用（P<0.05）,随着雌二醇浓度的增加（100pmol/L、200pmol/L、400pmol/L、1000pmol/L）抑制作用逐渐增强（P<0.05）,400pmol/L与1000pmol/L雌二醇浓度的抑制作用相当（P>0.05）,400pmol/L是抑制阴道加德纳菌生物膜形成的最适浓度;◆激光共聚焦显微镜观察,在相同时间点随着雌二醇浓度的增加,阴道加德纳菌生物膜厚度逐渐变薄（P<0.05）。在相同浓度下,随着时间的延长阴道加德纳菌生物膜逐渐变厚（P<0.05）;◆扫描电镜、激光共聚焦显微镜下观察,发现相同时间点时,100pmol/L组的生物膜比200pmol/L的生物膜成熟（P<0.05）、200pmol/L组的比400pmol/L组的成熟（P<0.05）;[结 论]阴道加德纳菌可以在聚乙烯、金属钛表面形成致密的生物膜,但生物膜生长速度较慢,成膜时间较长。雌二醇可以抑制阴道加德纳菌生物膜的形成,抑制作用与作用时间和浓度相关。雌二醇主要通过抑制阴道加德纳菌形成厚度、延缓生物膜形成进程、影响生物膜内部结构而发挥作用的。适当浓度的雌二醇可以作为治疗阴道加德纳菌生物膜感染的可选药物。[目 的]第二部分实验已经成功建立阴道加德纳菌生物膜体外模型,证实了雌二醇对阴道加德纳菌生物膜的形成具有抑制作用。本部分研究拟于在成功建立阴道加德纳菌生物膜体外模型的基础上,提取成熟生物膜。将阴道加德纳菌生物膜与宫颈癌前细胞（H8细胞）共培养,研究阴道加德纳菌生物膜对宫颈癌前细胞的生物学功能和上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transformation,EMT）相关标志物的影响,目的在于探讨阴道加德纳菌生物膜促进宫颈癌变的初步分子机制。同时,研究不同浓度雌激素对宫颈癌前细胞上皮间质转化的影响,为进一步评价雌激素治疗阴道加德纳菌生物膜感染的安全性提供依据。[方 法]首先,在体外成功培养阴道加德纳菌生物膜,并提取成熟生物膜。用含有不同浓度阴道加德纳菌生物膜的培养基体外培养H8细胞,CCK8法检测H8细胞增殖能力,Transwell法检测H8细胞迁移能力。利用RT-PCR、Western-blot方法检测不同浓度阴道加德纳菌生物膜刺激下,H8细胞上皮标志物E-cadherin、间质标志物N-cadherin、Snail、Vimentin的表达情况。将不同浓度的雌二醇（Opmol/L、200pmol/L、400pmol/L、800pmol/L）与 H8 细胞共培养,利用 RT-PCR 法检测H8细胞上皮标志物E-cadherin、间质标物Vimentin的表达情况。[结 果]◆阴道加德纳菌生物膜抑制H8细胞增殖（P<0.05）,对H8细胞迁移无影响（P>0.05）;◆阴道加德纳菌生物膜诱导H8细胞在基因水平上低表达上皮标志物E-cadherin（P<0.05）,高表达间质标志物 N-cadherin、Snail、Vimentin（P<0.05）;◆阴道加德纳菌生物膜诱导H8细胞在蛋白水平上低表达上皮标志物蛋白E-cadherin,高表达间质标志物蛋白 N-cadherin、Snail、Vimentin;◆不同浓度的雌二醇对H8细胞EMT相关标志物的表达无影响（P>0.05）;[结 论]阴道加德纳菌生物膜对宫颈癌前细胞具有一定的细胞毒作用。阴道加德纳菌生物膜通过诱导宫颈癌前细胞发生上皮间质转化而发挥促癌作用。雌二醇不能诱导宫颈癌前细胞发生上皮间质转化,用于治疗阴道加德纳菌生物膜感染具有一定的安全性。[目 的]第三部分研究发现,阴道加德纳菌生物膜是通过诱导宫颈癌前细胞发生EMT而发挥促癌作用。EMT作为诱发细胞癌变的关键步骤已被学术界认可,但是其在阴道加德纳菌生物膜诱导宫颈癌变中的作用机制和信号调控尚不明确。本部分实验在之前建立的“阴道加德纳菌生物膜诱导H8细胞EMT”模型的基础上,进一步研究阴道加德纳菌生物膜诱发EMT的详细信号转导过程,旨在为阴道加德纳菌生物膜作为临床预防和治疗宫颈癌的新靶点提供科学依据。[方法]首先利用免疫荧光法检测阴道加德纳菌生物膜作用后,H8细胞的TLR4、P-Smad2/3蛋白的表达情况,初步探讨其在阴道加德纳菌生物膜诱导H8细胞发生EMT中的变化趋势。利用RT-PCR、Western-blot方法研究TGF-β1/Smad信号通路在阴道加德纳菌生物膜诱导的H8细胞EMT过程中的作用,进一步通过抑制TLR4蛋白的表达,研究TLRU对H8细胞EMT及TGF-β1/Smad信号通路的调控作用。[结 果]◆免疫荧光显示,阴道加德纳菌生物膜上调H8细胞TLR4、P-Smad2/3蛋白的表达;◆在“阴道加德纳菌生物膜诱导的H8细胞EMT”模型中加入0.1ng/ml TGF-βi（EMT阴性对照浓度）,可以显着增强H8细胞的EMT（P<0.01）。提示阴道加德纳菌生物膜诱导H8细胞发生EMT是通过TGF-β1/Smad信号通路发挥作用的;◆在“阴道加德纳菌生物膜+0.1ng/ml TGF-βi”的H8细胞EMT模型中加入TLR4抑制剂,可以逆转H8细胞的EMT（P<0.01）,证实了阴道加德纳菌生物膜诱导H8细胞的EMT是受到TLR4调控的;◆在“阴道加德纳菌生物膜+0.1ng/ml TGF-β1”的H8细胞EMT模型中加入TLR4抑制剂后,p-Smad2/3的表达显着下调,证实了 TGF-β1/Smad是其下游信号通路,受到TLR4调控;[结 论]阴道加德纳菌生物膜是通过TLR4-TGF-β1/Smad信号通路诱导H8细胞发生EMT,是阴道加德纳菌生物膜协同HR-HPV感染人宫颈上皮细胞并促发癌变的主要机制,可以作为预防和治疗宫颈癌的潜在靶点。
叶聪[5]（2020）在《邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）通过Hippo-YAP信号诱导血管瘤细胞增殖的机制》文中进行了进一步梳理研究背景血管瘤是由血管内皮细胞增殖形成的一种肿瘤,75%80%的血管瘤患者为女性。它被认为是最常见的良性肿瘤,此外,血管瘤患者不需要任何治疗,因为它们多年来自发消退。然而,仍有10%的血管瘤会急剧增长甚至成为生命危险。快速增殖的一个阶段是血管瘤的主要特征,然而,造成这种快速增殖的原因没有得到很好的说明。因此,迫切需要对涉及血管瘤进展的风险因素进行更多研究。邻苯二甲酸酯用于各种食品包装,家用产品,医疗器械,药物配方和工业塑料。世界上每年生产约600万吨邻苯二甲酸酯。人类通过皮肤,吸入和摄入吸收暴露于邻苯二甲酸酯。邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Dioctyl phthalate,DEHP）是邻苯二甲酸酯中使用最多的一种,它可以使医疗器械变得更加灵活。人类可能通过塑料医疗设备暴露于高水平的DEHP。在与血清,血液和其他亲脂性流体接触后,DEHP很容易从塑料中浸出,作为高度疏水的材料。一旦DEHP进入人体后,迅速代谢成其活性代谢产物邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）[Mono（2-ethylhexyl）phthalate,MEHP],然后被优先吸收。最近,研究表明DEHP和MEHP都可以通过触发细胞增殖,迁移和侵袭来促进肿瘤进展。邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[Di（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP]是一种广泛使用的增塑剂,可代谢为邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）[Mono（2-ethylhexyl）phthalate,MEHP]。吸入是两种邻苯二甲酸酯的重要暴露途径,它们对肺部的影响包括炎症,扩大的空域和细胞分化变化,已经表明这表明肺泡上皮细胞是邻苯二甲酸酯的靶标。然而,MEHP在HA进展中的潜在作用和相关机制并未得到很好的说明。DEHP被广泛用于生产聚氯乙烯医疗材料的研究。它可以被代谢成MEHP,已被认为是MEHP对人体毒性最大的代谢产物。最近,研究表明DEHP和MEHP均可促进肿瘤通过触发细胞增殖,迁移和侵袭而进展。MEHP是一种破坏内分泌的化学物质,已广泛用于生产食品和饮料,粘合剂,油漆和牙科密封胶的塑料容器。越来越多的证据表明MEHP对人体健康具有负面影响。MEHP具有出色的稳定性。迄今为止,MEHP已成为世界范围内广泛用于工业产品的产品,包括洗涤剂,酚醛树脂,电镀溶剂和热敏纸。流行病学研究表明,MEHP可以在人的尿液和血液中被广泛检测到。例如,来自美国和亚洲的81%尿液样本中含有可检测的MEHP,这表明MEHP的生物安全性是公共卫生的紧迫问题。越来越多的证据表明,MEHP在体内和体外具有很强的雌激素反应,导致内分泌功能的破坏。新兴的报道表明,MEHP会触发乳腺癌细胞的增殖,迁移和侵。但是,邻苯二甲酸MEHP对HA进展的潜在影响尚未很好地说明其作用机制,故而成我目前的研究焦点。1、邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）促进血管瘤细胞（HA）的体外增殖和迁移的机制目的:探究邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）促进血管瘤细胞的体外增殖和迁移的机制。方法:血管瘤细胞用于我们的实验,将其保存在含有15%胎牛血清和青霉素/链霉素（100μg/ml）的改良的Eagle培养基中。在细胞生长期间每天更换培养基,当细胞达到80-90%汇合时,将细胞悬液以1:3的比例传代培养。根据实验要求将培养细胞分为两组:对照组（正常培养的细胞系作为实验对照）,MEHP诱导组（将细胞5 x 104细胞/每孔接种到6孔板中。温育8小时后,将细胞用10 nM MEHP处理并培养24小时）。逆转录定量PCR（RT-qPCR）实时分析YAP、IRF-1的mRNA表达情况;蛋白印迹分析细胞中相关蛋白表达情况;划痕侵袭实验检测细胞的迁徙情况;通过凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡和相对活力;MTT实验比较细胞增殖情况;结果:MEHP诱导组较对照组YAP、IRF-1mRNA表达升高（P<0.05）。MEHP可以通过IRF-1增加YAP的转录。对照组较MEHP诱导组E-钙粘着蛋白表达升高（P<0.05）,MEHP诱导组较对照组MMP9蛋白表达升高（P<0.05）。说明了MEHP促进细胞上皮间质转化过程。对照组较MEHP诱导组细胞迁移数量减少（P<0.05）,MEHP诱导组较对照组细胞侵袭数量增多（P<0.05）。说明MEHP可诱导细胞的迁移侵袭。细胞在培养24小时和72小时根据制造商的规程使用凋亡检测试剂盒进行检测细胞凋亡情况,24小时对照组较MEHP诱导组细胞凋亡率升高（P<0.05）,第72小时MEHP诱导组较对照组细胞凋亡率降低（P<0.01）。在不同培养后第10小时,对照组与MEHP诱导组相比细胞增殖力无差异（P>0.05）,24小时和36小时时MEHP诱导组较对照组细胞增殖数目升高（P<0.05）,到第三天检测时发现对照组较MEHP诱导组较细胞增殖情况降低（P<0.01）。细胞暴露与MEHP情况下增殖能力加强。结论:MEHP可通过上调YAP表达促进HA细胞的增殖,并促进上皮间质转化过程相关的因子E-钙粘着蛋白、MMP9的表达。2、通过抑制YAP阻断MEHP触发的血管瘤细胞（HA）增殖的机制目的:探究通过抑制YAP阻断MEHP触发的HA细胞增殖的机制。方法:HemEC来源为在我院收录诊治的7例HA婴儿患者中分离出来,在应用于实验之前,细胞传代培养不能超过五次。在标准条件下,在补充有10%热灭活的胎牛血清,0.25%真菌区和1%庆大霉素的α-MEM中培养HemEC。根据实验要求,将元代培养的细胞进行培养后不同处理:对照组（取正常原代培养的HemEC细胞用于培养计数、观察）,MEHP处理组（对照组细胞在刚开始培养时给予一定浓度的MEHP诱导处理,然后继续培养）,YAP沉默组（用针对YAP的siRNA转染细胞,抑制YAP的表达）。通过MTT细胞增殖检测测定不同时间段MEHP干预及YAP表达受限对细胞的影响情况;细胞凋亡检测试剂盒和2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基检测各组细胞凋亡及活力情况;通过细胞划痕平面迁移实验检测细胞的迁移活性。蛋白印迹分、RNA提取和半定量RNA分析、酶联免疫吸附实验检测各组细胞中YAP、CTGF、ANKRD1表达情况。结果:在第12小时MEHP干预组较YAP沉默组细胞增殖升高（P<0.05）,对照组与MEHP干预组比较无差异（P>0.05）。第24小时对照组和MEHP干预组较YAP沉默组细胞增殖升高（P<0.05）。72小时MEHP干预组较对照组、YAP沉默组细胞增殖情况升高（P<0.05）,YAP沉默组较对照组细胞增殖降低（P<0.05）。细胞经过MEHP处理后诱导其增殖,而YAP表达受到抑制后其细胞的增殖能力下降。MEHP干预组较对照组和YAP沉默组细胞凋亡降低（P<0.05）,MEHP干预组较YAP沉默组细胞凋亡（P<0.01）,说明MEHP抑制细胞凋亡或者YAP表达降低促进了细胞凋亡。对照组和YAP沉默组较MEHP干预组细胞活力降低（P<0.05）,其中MEHP干预组较YAP沉默组细胞活力升高（P<0.01）。MEHP干预组较对照组和YAP沉默组细胞迁移升高（P<0.05）,YAP沉默组较对照组细胞迁移数量降低（P<0.05）。YAP沉默组较MEHP干预组细胞迁移数量降低（P<0.01）。MEHP干预组较对照组YAP、CTGF、ANKRD1蛋白表达升高（P<0.05）,YAP沉默组较对照组YAP、CTGF、ANKRD1蛋白表达降低（P<0.05）。MEHP干预组较对照组和YAP沉默组YAP、CTGF、ANKRD1mRNA表达升高（P<0.05）,对照组较YAP沉默组YAP、CTGF、ANKRD1mRNA表达升高（P<0.05）。说明YAP表达抑制后,其靶基因CTGF、ANKRD1的表达也受到了抑制。MEHP干预组较对照组和YAP沉默组中YAP、CTGF、ANKRD1水平含量升高（P<0.05）,对照组较YAP沉默组YAP、CTGF、ANKRD1水平含量升高（P<0.05）。结论:MEHP可通过上调YAP的表达促进HA细胞的增殖和迁移,YAP可作为血管瘤治疗的潜在靶点。3、MEHP通过降低HA细胞中LATS1（Ser909）的磷酸化水平调节HA细胞的活化和功能的机制目的:本研究旨在探讨MEHP通过降低HA细胞中LATS1（Ser909）的磷酸化水平调节HA细胞的活化和功能的机制。方法:2017年1月至2019年5月在我院被确诊为HA的组织样本和正常皮肤组织。从3例婴儿的增殖期血管瘤中分离出的内皮细胞（HemEC）用于本次实验。根据实验要求,将HA患者肿瘤样本及正常健康皮肤组织样本分成HA组和健康组,用于相关的指标分析研究。将培养的血管瘤细胞分为对照组（常规培养肿瘤细胞系,没有进行处理）和MEHP处理组（对照组肿瘤细胞培养的基础上用一定浓度的MEHP诱导处理细胞12小时）。维替泊芬+MEHP处理组（MEHP处理组的基础上使用是YAP–TEAD的抑制剂维替泊芬）,用于探讨MEHP诱导后对HemECs增殖影响。RT-qPCR实时分析两组细胞中LATS1（Ser909）、LATS2（Ser872）的mRNA表达情况;MTT测定不同时期的HemECs增殖情况;蛋白质印迹分析两组细胞中PCNA的表达情况;流式细胞术检测ROS。结果:RT-qPCR实时分析两组细胞中LATS1（Ser909）、LATS2（Ser872）的mRNA表达情况,MEHP处理组较对照组LATS1（Ser909）、LATS2（Ser872）的mRNA表达降低（P<0.05）,表明,MEHP处理可以降低LATS1/2（Ser909/Ser872）的磷酸化。不同时间内通过MTT测定两组细胞的增殖情况,第1小时对照组与MEHP处理组比较无差异（P>0.05）,第12小时、36小时MEHP处理组较对照组细胞增殖能力升高（P<0.05）,第72小时MEHP组较对照组胞增殖能力升高（P<0.01）。YAP是Hippo通路最重要的转导子,可以调节器官大小和肿瘤发生,蛋白印迹检测YAP在健康和肿瘤组中的表达情况,发现HA组较健康组YAP的蛋白表达升高（P<0.05）。蛋白质印迹分析两组细胞中PCNA的表达情况,MEHP处理组较对照组PCNA表达升高（P<0.05）,流式细胞术检测ROS,对照组较MEHP处理组ROS含量升高（P<0.05）。结论:MEHP可增加HA细胞的增殖与活力。
薛俊杰[6]（2020）在《Micro-RNA在肿节风多糖促进骨骼肌损伤及修复过程中的作用和机制研究》文中研究指明研究目的:骨骼肌损伤是运动损伤中常见的损伤,关于其治疗一直是一个研究热点。本研究通过离心运动复制大鼠骨骼肌损伤模型,观察肿节风多糖对大鼠骨骼肌愈合过程中micro-RNA、炎症因子、超微结构的变化,探讨肿节风多糖在骨骼肌运动损伤愈合中的作用及可能机制。研究方法:选用24只8周龄Wistar健康雄性大鼠,按照体重随机分为4组,每组6只。分组:安静对照组（A）、离心损伤组（B）、自然恢复组（C）、肿节风干预组（D）。通过大强度离心运动建立运动损伤模型,用时四周,每周运动时间、速度不断递增。造模成功后,再进行为期一周的灌药及自然恢复。用戊巴比妥钠进行麻醉,腹腔注射。腹主动脉取血,离心得到血清后置于超低温冰箱保存;迅速取少量比目鱼肌,放入多聚甲醛中进行固定;取比目鱼肌,如米粒大小快速投入3%的戊二醛固定液中固定;再取比目鱼肌,快速放入EP管锡纸包裹置于超低温冰箱等待匀浆。（1）血清CK、LDH、MDA、T-AOC采用比色法进行检测。（2）骨骼肌中的miR-155-5p、miR-133a-5p、SOCS1m RNA、IL-1βm RNA采用RT-PCR法检测。（3）骨骼肌中SOCS1蛋白表达水平采用免疫组化、Western-Blot实验法检测。（4）骨骼肌Pax7蛋白表达水平采用免疫荧光法检测。（5）制作电镜切片,进行骨骼肌形态学观察。研究结果:1.与A组相比,损伤后B组的血清CK、LDH含量明显升高,差异极显着（P<0.01）。恢复后C组与A组相比,CK、LDH水平含量仍然偏高,差异显着（P<0.05或P<0.01）;且D组与A组相比,无差异（P>0.05）。2.与A组相比,损伤后B组的血清MDA含量明显升高,差异极显着（P<0.01）。恢复后C组的MDA水平与A组相比,MDA含量仍然偏高,差异显着（P<0.05）;且D组与A组相比,无差异（P>0.05）。T-AOC的含量各组之间无差异（P>0.05）,没有统计学意义。3.与A组相比,损伤后B组的骨骼肌miR-155-5p表达水平明显升高,差异极显着（P<0.01）。恢复后C组的骨骼肌miR-155-5p表达水平与A组相比,骨骼肌miR-155-5p表达水平仍然偏高,差异极显着（P<0.01）;且D组与C组相比,差异显着（P<0.05）。miR-133a-5p的表达各组之间无差异（P>0.05）,没有统计学意义。4.与A组相比,损伤后B组的SOCS1m RNA、SOCS1蛋白表达水平明显升高,差异极显着（P<0.01）。恢复后C组的SOCS1m RNA、SOCS1蛋白表达水平与A组相比,SOCS1m RNA、SOCS1蛋白表达水平仍然偏高,差异显着（P<0.05或P<0.01）;且D组与A组、B组、C组相比,差异极显着（P<0.01）,且SOCS1m RNA、SOCS1蛋白表达水平明显升高。5.与A组相比,损伤后B组的大鼠骨骼肌IL-1βm RNA表达水平明显升高,差异极显着（P<0.01）,具有统计学意义;恢复后,C组与A组相比,大鼠骨骼肌IL-1βm RNA表达水平仍然偏高,且差异极显着（P<0.01）。D组大鼠骨骼肌IL-1βm RNA表达水平降低,与A组无差异（P>0.05）。6.与A组相比,损伤后B组的Pax7蛋白表达水平明显升高,差异显着（P<0.01）。恢复后C组的Pax7蛋白表达水平与A组相比,Pax7蛋白表达水平仍然偏高,差异极显着（P<0.01）;且D组与A组相比,差异极显着（P<0.01）,且Pax7蛋白表达水平依旧偏高,D组与B组相比,差异极显着（P<0.01）。D组与C组相比,差异显着（P<0.05）。7.通过电镜观察,发现A组大鼠骨骼肌肌节、Z线排列整齐,线粒体工整的排列在Z线两侧,大小均一。B组与A组比较,肌节发生扭曲,大面积肌丝断裂,结构紊乱,线粒体肿胀。在C组中,Z线依旧处于断裂状态。在D组中,Z线排列清晰工整。肌节没有断连、扭曲现象,线粒体排列整齐。研究结论:1.Wistar雄性大鼠进行四周连续大强度离心运动可以有效的建立骨骼肌损伤模型。2.骨骼肌损伤后,大鼠血清中的CK、LDH、MDA的含量明显增多,骨骼肌组织的miR-155-5p、IL-1βm RNA、SOCS1蛋白、SOCS1m RNA、Pax7的表达水平明显升高。电镜观察,骨骼肌纤维受损明显。3.肿节风多糖干预恢复后,大鼠血清中的CK、LDH、MDA的含量明显减少,骨骼肌组织中的miR-155-5p、IL-1βm RNA、Pax7的表达水平明显降低,且SOCS1蛋白、SOCS1m RNA的表达水平进一步升高。电镜观察肿节风多糖干预后,肌纤维恢复明显。4.肿节风多糖对于治疗运动性的骨骼肌损伤具有一定的效果,其机制可能与miR-155-5p/SOCS1/IL-1β信号通路相关。
郭红军[7]（2020）在《经典的Wnt/β-catenin信号通路与宫颈癌顺铂耐药的关系研究》文中研究说明研究目的和意义宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一,严重危害女性健康和生命安全。化疗是宫颈癌重要的辅助治疗手段,其效果对于降低患者死亡率,延长生存期和改善生活质量十分关键。铂类是宫颈癌治疗的一线化疗药物,尤其是顺铂在宫颈癌治疗中显示出良好的效果。然而由于肿瘤异质性、个体差异等因素,化疗效果具有不确定性,肿瘤耐药是导致宫颈癌化疗失败的最主要原因。目前关于宫颈癌耐药的详细机制尚未完全察明,探索耐药产生的原因、寻找解决耐药性的方法是当前肿瘤研究的热点和难点。Wnt/β-catenin是最经典的信号通路之一,与肿瘤的发生发展密切相关,多项研究发现在卵巢癌、肾癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等人类肿瘤中均存在Wnt通路过度激活,认为Wnt/β-catenin途径可能是众多肿瘤发生的共同通路。化疗耐药是宫颈癌患者治疗失败和预后不良的最主要原因,查明宫颈癌的化疗耐药机制,加深对宫颈癌耐药过程中复杂信号通路网络调控的认识,能为宫颈癌耐药研究提供新的视角。本研究欲探讨Wnt/β-catenin信号通路在宫颈癌顺铂耐药中所发挥的作用及其作用机制。研究结果对于寻找宫颈癌耐药相关的潜在分子靶点,寻找解决耐药性的方法具有重要价值,未来可能给宫颈癌的临床治疗带来重大突破和进展。研究方法第一部分:以原发性宫颈癌患者组织和复发性顺铂耐药宫颈癌组织为研究对象,通过RNA-seq测序分析两组中的基因表达差异,通过免疫组化、qPCR以及Western blot等分子生物学手段做进一步的验证,通过TCGA数据库分析差异表达基因与病人预后的关系。第二部分:采用大剂量冲击诱导法,用终浓度为10 μ g/ml的顺铂溶液诱导人宫颈癌SiHa、HeLa、C33A和CaSki细胞系,建立相应的宫颈癌顺铂耐药细胞模型,比较宫颈癌细胞和耐药细胞在形态、耐药性及其他生物学特性方面的差异。第三部分:用β-catenin真核表达载体和Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939单独或联合处理宫颈癌顺铂耐药细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot检测不同处理后宫颈癌顺铂耐药细胞中β-catenin及Wnt/β-catenin通路上Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测顺铂诱导下各组细胞的凋亡率,MTT法检测各组细胞的增殖情况。第四部分:用皮下注射法诱导建立宫颈癌顺铂SiHa耐药细胞裸鼠皮下移植瘤模型,将裸鼠随机分为对照组、顺铂组、β-catenin+顺铂组和XAV939+顺铂组,给予相应干预后,观察裸鼠一般情况和移植瘤生长情况,测量瘤体积,绘制移植瘤生长曲线,21天后处死动物,取肿瘤组织,Tunel检测移植瘤凋亡,免疫组化检测核蛋白K i-67表达,Western Blot检测Wnt/β-catenin通路上Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled 蛋白的表达。研究结果第一部分:RNA-seq分析发现在3例复发性顺铂耐药患者宫颈癌组织中存在Wnt/β-catenin信号通路的异常激活。应用免疫组化、qPCR和Western blot等实验方法进一步验证发现,与正常宫颈组织相比,β-catenin在原发性宫颈癌组织中表达增高,而在复发性顺铂耐药的宫颈癌组织中β-catenin的表达较上述2组异常增高（P<0.05）,Western blot结果还表明Wnt/β-catenin信号通路下游靶蛋白Survivin在复发性顺铂耐药的宫颈癌组织中的表达显着上调（P<0.05）。通过分析TCGA数据库分析宫颈癌组织中β-catenin和Survivin表达与病人生存曲线的关系,结果发现宫颈癌组织中β-catenin和Survivin的表达与患者生存时间呈负相关,β-catenin和Survivin的表达越高,病人生存时间越短。第二部分:1.经诱导建立的宫颈癌SiHa/DDP、HeLa/DDP、C33A/DDP和CaSki/DDP细胞系的RI分别为12.34,7.92,7.13和17.65,表现出对顺铂中到重度耐药。2.SiHa/DDP、HeLa/DDP、C33A/DDP 和 CaSki/DDP 细胞和各自亲本细胞在顺铂诱导下的凋亡率分别为（3.3±0.64）%vs.（36.9±2.56）%,（8.56±1.27）%s.（47.55±3.78）%,（22.71±4.19）%vs.（47.44±6.97）%和（12.38±3.56）%vs.（58.44±5.63）%,耐药细胞凋亡率均显着低于其相应的亲本细胞（P<0.01）。3.SiHa、HeLa、C33A和CaSki细胞系中β-catenin mRNA和蛋白水平均较正常宫颈鳞状上皮细胞（Ect1/E6E7）显着升高（P<0.05）,SiHa、HeLa、C33A和CaSki顺铂耐药细胞系中β-catenin mRNA和蛋白水平均较其亲本细胞进一步升高（P<0.05）。第三部分:1.在SiHa、HeLa、C33A和CaSki顺铂耐药细胞中过表达β-catenin,其下游信号因子 Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled mRNA和蛋白水平均显着升高（P均<0.05）,Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV939处理后,4 种耐药细胞系中 Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled 的 mRNA和蛋白水平均呈现下降趋势。2.细胞增殖和凋亡结果显示,随着时间的延长,4种宫颈癌顺铂耐药细胞中β-catenin组细胞增殖能力最强,凋亡不明显,而β-catenin+XAV939组,增殖减弱,凋亡明显,XAV939明显抑制了细胞增殖,并诱导细胞凋亡。第四部分:1.动物实验结果显示,成功构建了宫颈癌顺铂耐药SiHa细胞裸鼠皮下移植瘤模型,与对照组相比,顺铂组和XAV939+顺铂组裸鼠移植瘤体积较对照组和β-catenin+顺铂组明显下降,XAV939+顺铂组移植瘤体积较顺铂组明显下降;对照组和β-catenin+顺铂组无明显差异,移植瘤体积整体变化从大到小依次为对照组/β-catenin+顺铂组>顺铂组>XAV939+顺铂组。2.顺铂组、β-catenin+顺铂组、XAV939+顺铂组和对照组的凋亡指数分别为（16.26±1.34）%,（7.96±0.53）%、（27.33±1.78）%和（6.54±0.32）%。XAV939+顺铂组凋亡指数高于顺铂组（P<0.05）,且两者均高于对照组（P<0.05）;β-catenin+顺铂组凋亡指数与对照组无显着差异（P>0.05）。3.免疫组化结果显示顺铂组移植瘤中Ki-67蛋白表达的平均光密度为（0.038+0.0120）,较对照组降低（P<0.05）,XAV939+顺铂组Ki-67蛋白表达的平均光密度为（0.024±0.008）,较对照组和顺铂组降低（P均<0.05）。4.对照组和 β-catenin+顺铂组中 Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled的蛋白表达水平无显着差异（P>0.05）,β-catenin+顺铂组β-catenin、Survivin、c-myc和MMP-2的蛋白水平较顺铂组显着升高（P<0.05）;XAV939+顺铂组β-catenin、Survivin、c-myc蛋白水平较顺铂组则显着降低（P<0.05）。研究结论1.在复发性顺铂耐药的宫颈癌组织中存在Wnt/β-catenin信号通路的异常激活,而该通路在正常宫颈组织和原发性宫颈癌组织中的表达则比较弱,提示Wnt/β-catenin与宫颈癌顺铂耐药有密切关系。临床大数据研究显示Wnt/β-catenin激活与生存期存在负相关。2.Wnt/β-catenin信号通路在宫颈癌顺铂耐药细胞中异常活化,且其通路上关键因子Survivin、c-myc、cyclin D1、MMP-2、Frizzled转录水平和蛋白表达上调。3.Wnt/β-catenin信号通路过度激活能提高宫颈癌顺铂耐药性,增强细胞的增殖活力,降低细胞凋亡,促进肿瘤的生长;抑制Wnt/β-catenin信号通路后能降低宫颈癌细胞对顺铂的耐药性,促进细胞凋亡,抑制裸鼠移植瘤的生长。4.动物实验表明Wnt/β-catenin信号通路活化降低宫颈癌耐药细胞对顺铂的敏感性;抑制Wnt/β-catenin信号通路能提高宫颈癌对顺铂的敏感性,促进顺铂的抗癌效果,Wnt/β-catenin抑制剂和顺铂两者联用能促进顺铂的抗癌效果。
杨婷[8]（2020）在《不孕不育患者分离脲原体的分子流行病学特征及比较基因组学研究》文中进行了进一步梳理背景与目的:脲原体（Ureaplasma spp.,UU）是人类泌尿生殖道常见的共生型微生物,常寄居于人体泌尿生殖道粘膜表面,可引起多种感染性疾病。随着UU多位点分型方案的建立,研究人员对少部分UU感染人群进行了分子流行病学研究,并且发现UU不同亚组菌株与疾病的关系存在差异。本研究旨在明确UU在女性不孕患者和男性不育患者的克隆分布情况,以及UU不同亚组菌株间的基因背景学差异,为UU的致病机制研究提供新的思路。方法:1.使用支原体培养试剂盒,分别对浙江大学附属邵逸夫医院确诊的226例女性不孕患者和武警上海市总队医院确诊的480例男性不育患者进行UU筛查。对培养阳性的UU菌株进行种群鉴定,并对单一感染菌株进行多位点序列分型研究;比较分析UU在女性不孕患者和男性不育患者的分布情况;比较分析男性不育患者UU阴性组和阳性组的精液参数,包括精子浓度、精子总活力、前向运动力、非前向运动力和不动精子率。2.选择菌株UPA106（属于亚组A）、UUR132（属于亚组2）和UUR315（属于亚组1）,使用二代Illumina和三代Nanopore高通量测序技术对三株菌进行基因组测序。分别选择标准菌株UPA ATCC 27815和UUR ATCC 33699作为微小脲原体（Ureaplasma parvum,UPA）和解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum,UUR）的参考菌株,分析三株临床菌株和两株参考菌株的全基因组共线性关系和直系同源基因簇;分析UPA106与NCBI Gen Bank数据库中14株UPA的单核苷酸多态性;分析UU132、UUR315和NCBI Gen Bank数据库中18株UUR的单核苷酸多态性;分别分析15个毒力因子在三株菌的变异情况。分别选择与三株菌亲缘关系最近的标准菌株作为参考,进行多带抗原（multiple banded antigen,MBA）家族基因的共线性比对。使用单克隆抗体6522检测三株菌中MBA的表达情况,并对蛋白条带进行质谱检测。使用微量肉汤稀释法研究三株菌对喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类和氨基糖苷类抗生素的耐药情况,并对耐药株进行耐药机制分析。结果:1.女性不孕和男性不育患者分离脲原体的分子流行病学特征（1）女性不孕患者中检测到101株UU,其中85株UPA,11株UUR,5株混合感染株。在85株UPA中发现24个e ST型,e ST16和e ST41是优势克隆株;在11株UUR中发现10个e ST型,e ST82是优势克隆株。（2）男性不育患者中检测到104株UU,其中78株UPA,24株UUR,2株混合感染株。在78株UPA中检出32个e ST型,e ST16和e ST41为优势克隆株;在24株UUR中共检出16个e ST型,e ST82是优势克隆株。（3）在女性不孕患者和男性不育患者中,UPA的检出率均高于UUR。与男性不育患者相比,UUR在女性不孕患者的检出率偏低（P<0.05）,并且未检测到UUR的亚组2。（4）与阴性组相比,精子浓度、总活力和前向运动力在UU各亚组呈现不同的变化趋势,但是差异均没有统计学意义（P>0.05）,非前向运动力在UUR的亚组2出现明显减低（P<0.05）。2.脲原体不同亚组菌株的基因组学特征和比较基因组学分析（1）UPA106、UUR132和UUR315的染色体均为单个闭合环状结构,基因组全长在741,809853,955bp,GC含量在25.5%左右,预测的基因数是627699个。（2）三株临床菌株和两株标准参考菌株的基因组共线性关系良好。在5株菌株中共有652个基因簇,其中541个基因簇（82.98%）构成UU的核心基因。UPA106、UUR132和UUR315分别与菌株ATCC 27818、ATCC 27618和1000间的SNP差异最小。（3）三株菌的谷胱甘肽过氧化物酶编码基因、硫氧还蛋白编码基因和脲酶家族基因均未检测到错义突变。在UPA106和UUR132的O-唾液酸糖蛋白酶编码基因分别检测到点突变A661G（I221V）和G709A（A237T）;在UPA106的硫氧还蛋白二硫化物还原酶编码基因中观察到点突变A425G（Y142C）;在UUR132的丝氨酸/苏氨酸激酶的编码基因观察到点突变A148G（S50G）;在UPA106、UUR132和UUR315的溶血酶编码基因分别检测到点突变A55G（I19V）、A981T（K327N）和A981T（K327N）。（4）在UPA106和菌株ATCC 27818、UUR132与菌株ATCC 27618的MBA家族基因线性比对中均发现,mba基因的N端与基因间区发生了DNA倒置。在UPA106,倒置后的基因与相邻的A0412基因产生基因融合,形成UPA106的mba基因。在UUR132,倒置后的基因与插入的0418基因产生基因融合,形成UUR132的mba基因。在两菌株mba基因的下游均不包含串联重复序列。UUR315和ATCC33696的比对分析发现,mba的N端发生了突变,导致翻译提前终止“MKLLKKKSFFFQNTKKQLFS*”。mba（A0418）的C端发生了DNA倒置,倒置后的C端序列出现在UUR315的02080基因。在UUR315的02090基因中发现了两段包含相同串联重复序列（QAMVQQAQKN）的插入片段。此外,在三株菌mba基因两侧的基因均发现了C端串联重复数目的变异。单克隆抗体6522在UPA106、UUR132和UUR5中分别检测到3个、3个和6个蛋白条带。质谱结果显示,UPA106和UUR132中分子量最大条带分别对应01920基因编码的MBA蛋白和02045基因编码的MBA蛋白。（5）UPA106和UUR132对左氧氟沙星耐药,UUR132对红霉素耐药,三株菌均对四环素敏感。在UPA106的par E基因发现点突变G1343A（R448K）,在UUR132的par C基因发现点突变C248T（S83L）。在UUR132的L4、L22和23S rRNA基因均未找到耐药相关突变。结论:1.UU在女性不孕患者和男性不育患者中呈现以优势克隆为主的多克隆分布,优势克隆是e ST16、e ST41和e ST82。2.除MBA家族基因外,UU的毒力因子都很保守,尤其是脲酶家族基因。3.UU中MBA家族基因的突变机制复杂多样。MBA的保守N端可以发生突变,造成该片段的缺失;MBA的N端和C端均可以发生DNA倒置突变;mba基因座内任何下游包含串联重复序列的基因均可以发生C端串联重复数目的突变。插入突变也是MBA的突变机制。
游爽[9]（2020）在《Ⅲ型胶原蛋白对大鼠阴道萎缩的作用及机制研究》文中指出随着全球老龄化,联合国提出将健康老龄化作为全球解决老龄化问题的奋斗目标,绝经后女性的健康管理将会是今后的关注问题之一。阴道萎缩（VA）是一种常见于绝经后女性的疾病,由于全身雌激素水平降低,阴道组织的退化的一种常见疾病。主要表现为阴道干涩、瘙痒及性交疼痛,严重影响绝经后女性的生活质量。随着绝经后女性的人数不断增加,到2030年全球绝经后女性数量将增长到大约12亿,我国将达2.8亿,大约有超过40%的绝经后女性会出现阴道萎缩相关症状,其中约只有20%的绝经后女性愿意寻求帮助。目前的主要治疗方式为局部雌激素的补充或非激素类制剂应用以缓解症状,但许多女性因为担心使用雌激素所带来的副反应而不愿意接受雌激素治疗。目前,NAMS将非激素润滑剂推选为一线治疗药物,起到阴道保湿润滑的作用。非激素类药物种类较多,主要有水溶剂型、油基剂型、硅脂剂型、透明质酸等。阴道萎缩与阴道组织中细胞外基质（ECM）含量大量减少密切相关,胶原蛋白作为ECM的主要成分之一,在组织和器官的形成中起着重要的作用,并参与细胞功能的表达、信号传递等。胶原蛋白在生物医学应用中广泛应用的原因是其可以通过其自身聚集和交联形成具有一定强度和稳定性的纤维,同时具有出色的生物相容性和安全性。目前,已经发现28种类型的胶原蛋白,其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型蛋白在人体内含量最丰富,约占总胶原蛋白的80%90%。其中,阴道组织含有大量Ⅲ型胶原蛋白。随着雌激素水平下降,阴道组织中胶原蛋白含量降解增加,生成增加。本课题旨在讨论Ⅲ型胶原蛋白治疗大鼠的阴道萎缩的疗效及可能涉及的相关机制,为阴道萎缩的临床治疗提供理论依据。第一部分建立大鼠阴道萎缩模型目的:通过建立大鼠阴道萎缩模型,为后续治疗提供模型基础。方法:（1）通过去势法建立大鼠阴道萎缩模型,选择6-8周正常雌性SD大鼠10只,将10只大鼠随机分为2组:（1）假手术组（n=5）:麻醉消毒后,开腹暴露30min,关腹;（2）模型组（n=5）:麻醉消毒后,开腹以无齿镊暴露双侧卵巢,分别结扎双侧子宫动脉后,切除双侧卵巢,还纳双侧子宫,缝合切口。（2）去势前后称重,H&E、Masson染色观察阴道上皮和阴道组织中胶原蛋白的变化。结果:经去势法构建的阴道萎缩大鼠模型,体重增加,阴道上皮变薄,结缔组织排列紊乱。结论:阴道萎缩大鼠模型建立。第二部分Ⅲ型胶原蛋白对大鼠阴道萎缩的作用及机制目的:探讨Ⅲ型胶原蛋白治疗阴道萎缩大鼠的疗效,为临床治疗提供理论基础。方法:（1）选择6-8周雌性SD大鼠45只,随机分为5组:（1）假手术组（n=10）;（2）模型组（n=10）:只造模,不做任何治疗处理;（3）胶原蛋白组（n=10）:造模28天后,每日阴道给予Ⅲ型胶原蛋白0.5ml,连续给予14天;（4）雌激素组（n=10）:造模28天后,每日阴道给予雌激素0.5ml,连续给予14天;（5）卡波姆组（n=5）:造模28天后,每日阴道给予卡波姆0.5ml,连续给予14天;（2）生物素标记胶原蛋白在阴道组织中的示踪定位;（3）H&E染色观察阴道上皮厚度;Masson染色观察阴道组织中胶原蛋白排列情况;测定阴道p H值和微生态变化;（4）免疫组化、q PCR测定COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TIMP-1、MMP-1、VEGF、Ki-67、IL-6因子的表达水平;Western blot测定阴道组织中AQP-2因子的表达水平;（5）电镜观察阴道组织微结构的改变;（6）H&E染色观察子宫内膜厚度变化;（7）诱导细胞衰老,观察细胞的增殖和凋亡情况。结果:（1）免疫荧光结果表明:经生物素标记的胶原蛋白在阴道上皮及肌层可见。（2）H&E染色结果表明经雌激素和胶原蛋白治疗后的阴道上皮厚度增厚,厚于模型组,接近假手术组。Masson染色结果表明模型组和卡波姆组结缔组织排列稀疏,经雌激素和胶原蛋白治疗后的阴道组织胶原排列较紧密,接近假手术组。（3）免疫组化和q PCR结果表明,经胶原蛋白和雌激素治疗后的阴道组织中COL-I、COL-Ⅲ、TIMP-1、VEGF、Ki-67表达高于模型组,接近假手术组;模型组阴道组织中MMP-1、IL-6表达高于胶原蛋白组和雌激素组及假手术组。Western blot结果表明,经胶原蛋白和雌激素治疗后的阴道组织中AQP-2蛋白表达水平高于模型组和卡波姆组,接近假手术组。（4）电镜结果表明:去势后,阴道上皮皱壁消失,微绒毛消失,细胞间间距变大;经Ⅲ型胶原蛋白治疗后,阴道上皮出现微绒毛,细胞之间的间距缩小,与假手术组相似。（5）H&E染色观察大鼠子宫内膜结果表明:经胶原蛋白治疗后的子宫内膜厚度与模型组接近,经雌激素治疗后的子宫内膜厚度增厚,与假手术组接近。（6）流式和CCK-8结果显示:Ⅲ型胶原蛋白能够促进D-gal诱导的衰老细胞的增殖,抑制凋亡。结论:胶原蛋白能够定植于阴道上皮及肌层中;能够促进阴道组织中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TIMP-1、VEGF、Ki-67、AQP-2的表达,降低的MMP-1、IL-6表达,从而促进组织中细胞外基质的生成,减少细胞外基质的降解,降低炎症因子的表达,增加组织中水的含量,促进上皮细胞增殖。同时,改善阴道微结构,促进微绒毛的生长,缩小细胞间距离。相比于雌激素,对子宫内膜有一定的安全性,不会导致子宫内膜的异常增生。同时能够促进衰老细胞的增殖,抑制凋亡。
张荣华[10]（2020）在《胰腺癌细胞迁移体对肿瘤微环境中癌细胞与相关免疫细胞表型及功能的相互调控作用研究》文中提出研究背景胰腺癌是一种恶性程度极高、预后差的消化系统恶性肿瘤。胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）为最常见的病理类型。流行病学资料显示,胰腺癌位居我国肿瘤死亡原因第六位,发病率呈上升趋势。多数患者初诊时因肿瘤局部侵犯或远处转移失去手术机会。胰腺癌肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）以大量炎性细胞浸润和广泛纤维化为主要特点。针对胰腺癌TME探索胰腺癌进展机制是目前的研究热点。TME中肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages,TAMs）对胰腺癌发生发展和补体免疫逃逸具有促进作用。细胞外囊泡（extracellularvesicles,EV）参与TME中不同细胞间信号传递和物质交换,是胰腺癌TME中调控TAM分化和功能改变的关键介质。迁移体是近几年新发现的一类依赖细胞运动的EV样结构,其中富集众多信号介导因子、趋化因子和细胞因子等调控蛋白,对生物体发育、信号转导等具有重要意义。胰腺癌细胞产生的迁移体（pancreatic cancer cell-derived migrasome,PCCDM）对 TME 中免疫细胞尤其是TAM的表型及功能的影响,目前缺乏相关研究。研究目的明确PCCDM中调控胰腺癌TME的关键蛋白成分,分析PCCDM对TME中免疫细胞比例变化的影响以及该变化对胰腺癌生长的影响;探究PCCDM对TAM表型及功能的调控作用;探讨PCCDM诱导后的TAM对胰腺癌细胞功能的影响;探究PCCDM诱导后的TAM对T淋巴细胞的影响;探讨PCCDM诱导的TAM对胰腺癌补体免疫逃逸的影响;筛选PCCDM中富集的一些关键蛋白,初步探索PCCDM中对免疫微环境具有调控功能的重要蛋白成分在胰腺癌组织中的表达情况,探究其与患者临床病理特征以及组织中免疫细胞浸润的关系。研究方法1.通过差速离心和密度梯度离心的方法提纯人和小鼠PCCDM,利用电镜和共聚焦显微镜对PCCDM进行超微结构和形态学观察,通过蛋白质谱和蛋白芯片检测PCCDM中富集的细胞因子和趋化因子等调控蛋白,利用共聚焦显微镜观察关键蛋白富集情况。构建免疫健全小鼠胰腺癌腹腔种植瘤模型,通过注射PCCDM构建免疫微环境,探究PCCDM诱导的免疫微环境中免疫细胞比例变化以及该变化对胰腺癌生长的影响。2.利用小鼠巨噬细胞系RAW264.7和骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages,BMDMs）作为巨噬细胞模型,通过共培养的方法探究PCCDM对巨噬细胞形态及趋化能力的影响以及巨噬细胞吞噬PCCDM后表型及功能的变化;通过蛋白芯片和转录组测序对PCCDM诱导后巨噬细胞功能表型进行鉴定和分析。3.利用PCCDM诱导的巨噬细胞和对照组巨噬细胞的培养上清制作条件培养基,通过条件培养基刺激胰腺癌细胞,利用CCK8法检测条件培养基对胰腺癌增殖能力的影响,利用Traswell法检测条件培养基对胰腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。4.通过ELISA检测经PCCDM诱导后巨噬细胞RAW264.7和BMDM培养上清以及小鼠腹腔灌洗液中影响肿瘤免疫关键蛋白的分泌情况;通过小鼠脾脏提纯CD4+和CD8+T淋巴细胞,利用巨噬细胞条件培养基的方法探究PCCDM诱导后巨噬细胞对T细胞增殖能力的影响,应用蛋白抑制剂探究巨噬细胞上清中该调控蛋白对T细胞增殖能力的影响。5.利用人巨噬细胞系THP-1作为巨噬细胞模型,通过胰腺癌条件培养基刺激的方法探究胰腺癌对THP-1表型的影响;利用人新鲜血清构建补体微环境,通过流式细胞术检测M2型巨噬细胞对胰腺癌补体免疫逃逸的影响;通过转录组学测序探究胰腺癌和PCCDM诱导的巨噬细胞基因表达差异以及对补体免疫逃逸的影响机制。6.筛选PCCDM中的对肿瘤免疫具有调控作用的关键蛋白,通过免疫组化染色和数据库的方法探究胰腺癌组织中该蛋白表达情况与患者临床病例特征及预后的关系以及与免疫细胞浸润的关系。研究结果1.胰腺癌细胞在迁移运动中大量产生迁移体,经鉴定发现PCCDM富含CXCL5、TGF-β1、integrin通路蛋白和Rab家族蛋白等多种调控免疫微环境的因子。经PCCDM诱导的小鼠腹腔免疫微环境中免疫细胞浸润增加,其中M2型巨噬细胞比例增加、T细胞比例明显减少,这种变化对小鼠胰腺癌生长具有促进作用。2.PCCDM可被巨噬细胞主动吞噬,并诱导巨噬细胞向PCCDM趋化。PCCDM诱导后的巨噬细胞中CD206+巨噬细胞比例增加,M2型巨噬细胞标记ARG1、IL-10和TGF-βl表达明显升高。蛋白芯片分析显示,在PCCDM诱导后的巨噬细胞中免疫抑制因子（TGF-β1,IL-4,IL-10,CSF1,CSF3,CTLA4和MMP9）以及对肿瘤具有重要作用的趋化因子和受体（CXCL5,CXCL9,CXCL12,CCL4,CCL7,CCL21,CCR3和CCR7）的表达水平较对照组巨噬细胞明显升高。转录组学测序结果显示,PCCDM诱导的巨噬细胞中表达上调的基因与促进肿瘤或免疫抑制相关的,包括IL-6、MMP9、MET、MYC、EGFR、CCL7、CSF3、CCL12、CXCL5、ITGA9、CDH5 和 CD274（即PD-L1）;表达下调的基因中有众多调控免疫细胞增殖和活化的基因,包括CCL24、CX3CL1 和 MHC-II 类蛋白（H2-OA、H2-OB 和 H2-Q6）。3.在RAW264.7和BMDM巨噬细胞模型中,PCCDM诱导后的巨噬细胞对胰腺癌细胞增殖能力和侵袭迁移能力具有促进作用。4.PCCDM诱导后的RAW264.7和BMDM培养上清以及小鼠腹腔灌洗液中ARG1含量显着上升;PCCDM诱导后的巨噬细胞对T细胞增殖能力具有抑制作用,ARG1抑制剂可部分逆转该作用。5.胰腺癌诱导THP-1向M2型巨噬细胞分化,分化后的巨噬细胞通过分泌IL-6上调胰腺癌细胞CD59表达并促进胰腺癌发生补体免疫逃逸;PCCDM诱导后巨噬细胞分泌IL-6;PCCDM参与巨噬细胞对胰腺癌CD59表达和补体免疫的调控过程。6.PCCDM中富含CXCL5,胰腺癌组织和细胞系高表达CXCL5,胰腺癌组织中CXCL5高表达与患者T3分期、N2分期和病理低分化级别具有相关性;高表达CXCL5的患者预后相对较差;在CA242高的患者中CXCL5表达水平为独立危险因素;高表达CXCL5的胰腺癌组织中M2型巨噬细胞、中性粒细胞和IgG+浆细胞浸润增多。研究结论PCCDM中富含CXCL5和TGF-β1等调控蛋白,PCCDM可诱导抑制型免疫微环境促进肿瘤生长;PCCDM诱导的微环境中M2型巨噬细胞增多、T细胞减少;PCCDM可促进巨噬细胞趋化并诱导其转化为M2型巨噬细胞,促进胰腺癌增殖、侵袭和迁移,并通过分泌ARG1抑制T细胞增殖;PCCDM诱导的巨噬细胞通过分泌IL-6促进胰腺癌细胞高表达CD59,进而发生补体免疫逃逸;PCCDM中富含CXCL5,CXCL5高表达的胰腺癌患者预后差,组织中呈现抑制型免疫环境,表现为M2型巨噬细胞、中性粒细胞和lgG+浆细胞浸润增加。针对迁移体的治疗策略研究有可能为胰腺癌综合治疗提供新的思路。
二、正常人子宫颈长期器官培养的超微结构研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、正常人子宫颈长期器官培养的超微结构研究（论文提纲范文）
（1）肝细胞靶向螯合剂的合成与表征及活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 人体铜离子内稳态失衡与肝细胞毒性机制 |
| 1.1.1 人体内的铜离子的吸收与代谢 |
| 1.1.2 铜代谢紊乱的危害与所引发的疾病 |
| 1.1.3 铜代谢紊乱引发肝细胞毒性的机制 |
| 1.2 螯合剂治疗或缓解肝细胞癌变的研究现状 |
| 1.3 乳糖酸靶向肝细胞的机理 |
| 1.4 缩氨基(硫)脲类螯合剂 |
| 1.5 研究内容与研究意义 |
| 1.5.1 课题来源与思路 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 1.5.3 创新点 |
| 2 肝细胞靶向螯合剂的合成、表征及其结构分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 螯合剂的合成路线 |
| 2.2.1 水杨醛类缩氨基硫脲中间体螯合剂的合成路线 |
| 2.2.2 靶向螯合剂的合成路线 |
| 2.3 中间体螯合剂的合成、表征与筛选 |
| 2.3.1 分析仪器及实验药剂 |
| 2.3.2 中间体螯合剂的合成与表征 |
| 2.3.3 中间体螯合剂的初步筛选 |
| 2.3.3.1 中间体螯合剂与金属离子形成配合物的紫外光谱测定 |
| 2.3.3.2 中间体螯合剂与金属离子的稳定常数的测定 |
| 2.3.3.3 中间体螯合剂与金属离子形成的配合物随p H变化的物种分布图 |
| 2.3.4 中间体螯合剂的初步筛选总结 |
| 2.4 螯合剂的合成与表征 |
| 2.5 螯合剂的结构表征 |
| 2.5.1 中间体螯合剂与螯合剂的红外表征 |
| 2.5.2 不同铜离子浓度对螯合剂紫外吸收曲线的影响 |
| 2.5.3 螯合剂与金属离子配合物的稳定常数测定 |
| 2.5.4 螯合剂与金属离子配合物在不同p H下的物种曲线 |
| 2.5.5 螯合剂-Cu(Ⅱ)配合物的红外图谱表征 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 细胞毒性与性质研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.1.1 实验仪器与实验试剂 |
| 3.2 细胞的培养 |
| 3.2.1 HeLa细胞、huh7.5.1 细胞和HepG2 细胞的培养 |
| 3.2.1.1 复苏细胞 |
| 3.2.1.2 细胞的传代 |
| 3.3 细胞孵育及细胞模型的建立 |
| 3.3.1 高铜细胞模型铜离子浓度培育范围的确定 |
| 3.3.2 高铜细胞模型铜离子最佳孵育浓度的确定 |
| 3.3.3 高铜细胞模型培养时间选择及胞内铜的相对含量的测定 |
| 3.3.4 高铜细胞模型建立总结 |
| 3.4 MTT法检测细胞毒性 |
| 3.4.1 三种螯合剂孵育48 对HeLa细胞的细胞毒性 |
| 3.4.2 螯合剂孵育48 小时对huh7.5.1 细胞的细胞毒性 |
| 3.4.3 螯合剂与铜离子反应的配合物孵育的huh7.5.1 肝癌细胞毒性检测 |
| 3.4.4 螯合剂孵育48 小时对高铜细胞模型下HepG2 细胞的细胞毒性检测 |
| 3.4.5 细胞毒性实验总结 |
| 3.5 螯合剂螯合细胞内的铜离子的能力检测 |
| 3.6 螯合剂对铜酶活性的影响 |
| 3.7 本章小结 |
| 4 细胞凋亡实验 |
| 4.1 引言 |
| 4.1.1 主要仪器和试剂 |
| 4.2 螯合剂对正常huh7.5.1 细胞凋亡周期的影响 |
| 4.3 螯合剂对高铜细胞模型下的huh7.5.1 细胞凋亡周期的影响 |
| 4.4 螯合剂对高铜模型下HepG2 肝癌细胞凋亡周期的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录Ⅰ 质谱(MS)、核磁共振碳谱(~(13)C NMR) 、核磁共振氢谱(~1H NMR)表征图谱 |
| 附录 Ⅱ攻读学位期间所发表的论文、专利及获奖论文 |
| 致谢 |
（2）小剂量雷公藤多苷对人上皮性耐药卵巢癌A2780/DDP细胞的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第1部分 GTW对人上皮性耐顺铂卵巢癌A2780/DDP细胞的作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 研究方法及内容 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同浓度GTW对A2780/DDP细胞生长的抑制作用 |
| 2.2 不同浓度DDP对A2780/DDP细胞生长的抑制作用 |
| 2.3 小剂量GTW对 A2780/DDP细胞迁移、侵袭能力的影响 |
| 2.3.1 Transwell迁移实验 |
| 2.3.2 Transwell 侵袭实验 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第2部分 GTW通过ILK/AKT/GSK3β/Slug信号通路抑制人上皮性卵巢癌耐顺铂作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 研究方法与内容 |
| 2 结果 |
| 2.1 转染si RNA-Slug沉默Slug后,细胞迁移、侵袭能力的变化 |
| 2.2 转染si RNA-ILK沉默ILK后,细胞迁移、侵袭能力的变化 |
| 2.3 应用AKT抑制剂后,细胞迁移、侵袭能力的变化 |
| 2.4 应用GSK3β抑制剂后,细胞迁移、侵袭能力的变化 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第3部分 GTW抑制人上皮性耐顺铂卵巢癌裸鼠体内成瘤作用的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 研究方法与内容 |
| 2 结果 |
| 2.1 GTW、DDP及两者联用治疗对荷瘤裸鼠生长情况以及肿瘤大小重量的影响 |
| 2.2 GTW、DDP及两者联用治疗对荷瘤裸鼠血清肿瘤标志物CA125、HE4 水平的影响 |
| 2.3 GTW、DDP及两者联用后,肿瘤组织中ILK信号通路相关蛋白表达情况的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 总结与展望 |
| 总结 |
| 不足之处与未来展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 上皮性卵巢癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述 铂耐药上皮性卵巢癌研究进展 |
| 参考文献 |
（3）GPR37通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路促进非小细胞肺癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 GPCR概述 |
| 1.2 参与肺癌中GPCR的生物学调节剂与信号传导通路 |
| 1.2.1 趋化因子 |
| 1.2.2 蛋白酶激活受体 |
| 1.2.3 溶血磷脂酸 |
| 1.2.4 前列腺素E2 受体 |
| 1.2.5 Smoothened蛋白 |
| 1.2.6 G蛋白偶联雌激素受体 |
| 1.2.7 质子感应GPCR家族 |
| 1.2.8 G蛋白信号转导调节分子 |
| 1.2.9 游离脂肪酸受体 |
| 1.2.10 MAS相关的G蛋白偶联受体D |
| 1.2.11 神经肽G蛋白偶联受体 |
| 1.2.12 促癌基因 |
| 1.3 GPCR的孤儿受体在肺癌中的异常表达和激活 |
| 1.3.1 人类蛙皮素受体亚型3 |
| 1.3.2 GPR87 |
| 1.3.3 GPR78 |
| 1.3.4 G蛋白偶联受体C类5 组成员A |
| 1.4 结论 |
| 第2章 GPR37在NSCLC中的数据挖掘、分析与临床验证 |
| 2.1 绪论 |
| 2.2 基于网络数据库对于GPR37 的生物信息学研究分析 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 实验结果 |
| 2.3 基于临床样本和NSCLC细胞系中GPR37 的表达验证 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 GPR37 对于NSCLC生物学功能的影响 |
| 3.1 绪论 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 慢病毒包装质粒构建稳定敲低GPR37 的A549 细胞系 |
| 3.3.2 GPR37 对于NSCLC细胞增殖的影响 |
| 3.3.3 GPR37 对于NSCLC细胞凋亡的影响 |
| 3.3.4 GPR37 对于NSCLC细胞迁移的影响 |
| 3.3.5 GPR37 对于NSCLC细胞侵袭的影响 |
| 3.3.6 GPR37 调节NSCLC细胞对顺铂的敏感性 |
| 3.3.7 GPR37 的体内实验研究 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 GPR37 促进NSCLC进展的机制研究 |
| 4.1 绪论 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 GPR37 参与EMT发生 |
| 4.3.2 GPR37 参与调控PI3K/Akt/m TOR通路促进NSCLC进展 |
| 4.3.3 GPR37 参与调控Raf/MEK/ERK通路促进NSCLC进展 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）阴道菌群特点及差异细菌生物膜促进宫颈癌变的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 宫颈病变患者阴道菌群特点及差异细菌筛选 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 阴道加德纳菌生物膜体外模型的建立及影响因素研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 阴道加德纳菌生物膜诱导宫颈癌前细胞发生上皮间质转化而发挥促癌作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 阴道加德纳菌生物膜通过TLR_4-TGF-β_1/Smad信号通路诱导宫颈癌前细胞发生EMT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 阴道加德纳菌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）通过Hippo-YAP信号诱导血管瘤细胞增殖的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言和绪论 |
| 引言 |
| 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 0 引言 |
| 1 血管瘤 |
| 2 血管瘤组织病理学特征 |
| 2.1 梭形细胞血管瘤 |
| 2.2 乳头状淋巴管内血管内皮瘤(PILA) |
| 2.3 Kaposiform hemangioendothelioma |
| 3 DEHP和 MEHP |
| 4 DEHP和 MEHP诱导细胞增殖、迁移和侵袭,促进肿瘤进展 |
| 5 MEHP可通过激活YAP引发血管瘤细胞的增殖 |
| 6 MEHP通过上调Zeb1 引发血管瘤细胞的迁移和侵袭 |
| 7 β-thujaplicin降低MEHP诱导的血管瘤细胞增殖 |
| 8 总结和展望 |
| 第3章 邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)促进HA细胞的体外增殖和迁移的机制研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 RT-PCR实时分析 |
| 3.2.2 MEHP促进细胞上皮间质转化 |
| 3.2.3 MEHP促进细胞侵袭转移 |
| 3.2.4 细胞凋亡及活力检测 |
| 3.2.5 MEHP诱导细胞增殖 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 通过抑制YAP阻断MEHP触发的HA细胞增殖的机制研究. |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验方法 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 MTT细胞增殖检测 |
| 4.2.2 细胞凋亡及活力检测 |
| 4.2.3 细胞侵袭转移测定比较 |
| 4.2.4 Western blotting分析 |
| 4.2.5 RT-PCR实时分析各组细胞的m RNA表达情况 |
| 4.2.6 酶联免疫吸附检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 MEHP通过降低HA细胞中LATS1(Ser909)的磷酸化水平调节HA细胞的活化和功能的机制研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 RT-PCR分析LATS1(Ser909)、LATS2(Ser872)的m RNA表达 |
| 5.2.2 细胞增殖实验检测 |
| 5.2.3 降低YAP表达可促进细胞凋亡 |
| 5.2.4 蛋白印迹检测肿瘤组中YAP蛋白表达情况 |
| 5.2.5 细胞核抗原PCNA及 ROS含量检测 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（6）Micro-RNA在肿节风多糖促进骨骼肌损伤及修复过程中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表(Abbreviations) |
| 1.绪论 |
| 1.1 选题依据 |
| 1.2 研究意义 |
| 1.3 研究设计 |
| 2.文献综述 |
| 2.1 骨骼肌损伤 |
| 2.1.1 骨骼肌损伤概述 |
| 2.1.2 骨骼肌损伤的分类 |
| 2.1.3 骨骼肌损伤机制的研究进展 |
| 2.1.4 离心运动对骨骼肌形态结构的影响 |
| 2.2 骨骼肌损伤的治疗研究进展 |
| 2.2.1 骨骼肌损伤修复的相关方法 |
| 2.2.2 肌卫星细胞对骨骼肌损伤后产生的影响 |
| 2.3 MicroRNA在骨骼肌损伤后修复中与炎症的关系 |
| 2.3.1 MiR-155在骨骼肌损伤后修复中与炎症的关系 |
| 2.3.2 MiR-223在骨骼肌损伤后修复中与炎症的关系 |
| 2.3.3 MiR-133在骨骼肌损伤后修复中与炎症的关系 |
| 2.4 中药通过调节Micro RNAs对机体炎症的影响 |
| 2.5 肿节风的药理作用研究 |
| 2.5.1 肿节风的抑菌与抗炎作用 |
| 2.5.2 肿节风的抗病毒作用 |
| 2.5.3 肿节风的抗肿瘤作用 |
| 2.5.4 肿节风的保肝作用 |
| 2.5.5 肿节风抑制血小板的作用 |
| 2.6 肿节风多糖促进骨骼肌损伤后修复的可能机制 |
| 2.6.1 肿节风多糖对骨骼肌、血液相关生化指标的影响 |
| 2.6.2 肿节风多糖对巨噬细胞的免疫调节作用 |
| 3.研究内容与方法 |
| 3.1 实验对象及分组 |
| 3.1.1 实验对象 |
| 3.1.2 动物分组 |
| 3.2 动物实验模型 |
| 3.2.1 离心运动损伤实验模型 |
| 3.2.2 损伤及损伤后恢复处理 |
| 3.2.3 大鼠样本提取 |
| 3.3 实验仪器、试剂及方法 |
| 3.3.1 实验仪器 |
| 3.3.2 实验试剂 |
| 3.3.3 制作石蜡组织切片 |
| 3.3.4 石蜡切片免疫荧光实验 |
| 3.3.5 石蜡切片免疫组化实验 |
| 3.3.6 大鼠血清CK、LDH、MDA与 T-AOC变化的检测 |
| 3.3.7 大鼠骨骼肌免疫印迹实验 |
| 3.3.8 RT-PCR实验 |
| 3.3.9 大鼠骨骼肌透射电镜实验 |
| 3.4 数据统计分析 |
| 4 研究结果 |
| 4.1 不同组别大鼠血液CK、LDH水平比较 |
| 4.2 不同组别大鼠血液MDA、T-AOC水平的比较 |
| 4.3 不同组别大鼠骨骼肌microRNA-155-5p、microRNA-133a-5p表达水平的结果 |
| 4.4 不同组别大鼠骨骼肌SOCS1m RNA表达水平的比较 |
| 4.5 不同组别大鼠骨骼肌SOCS1蛋白表达水平(免疫印迹)的比较 |
| 4.6 不同组别大鼠骨骼肌SOCS1蛋白表达水平(免疫组化)的比较 |
| 4.7 不同组别大鼠骨骼肌IL-1βm RNA表达水平比较 |
| 4.8 不同组别大鼠骨骼肌Pax7蛋白表达水平(免疫荧光)的比较 |
| 4.9 不同组别大鼠骨骼肌电镜的观察结果 |
| 5 讨论与分析 |
| 5.1 离心运动骨骼肌损伤模型的建立 |
| 5.2 肿节风多糖对大鼠血清中CK、LDH的影响 |
| 5.3 肿节风多糖对大鼠血清中的MDA、T-AOC的影响 |
| 5.4 肿节风多糖对运动损伤大鼠骨骼肌microRNA-155-5p/SOCS1/IL-1β信号通路的影响 |
| 5.5 肿节风多糖对运动损伤大鼠Pax7蛋白表达的影响 |
| 5.6 肿节风多糖对大鼠骨骼肌纤维电镜结构的影响 |
| 6 研究结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的发表论文目录 |
（7）经典的Wnt/β-catenin信号通路与宫颈癌顺铂耐药的关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 前言 |
| Wnt通路与宫颈癌 |
| 第一部分 Wnt/β-catenin信号通路在对顺铂化疗耐药宫颈癌组织中的表达 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 体外建立并鉴定顺铂耐药的宫颈癌细胞株 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 Wntβ-catenin信号通路对宫颈癌细胞顺铂耐药的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 Wnt/β-catenin信号通路在对宫颈癌顺铂耐药细胞裸鼠皮下移植瘤的作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 Wnt传导通路与人类肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的论文和研究成果 |
| 致谢 |
（8）不孕不育患者分离脲原体的分子流行病学特征及比较基因组学研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照 |
| 前言 |
| 第一部分:女性不孕和男性不育患者分离脲原体的分子流行病学特征研究 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 菌株来源 |
| 1.3 试剂与仪器 |
| 1.4 标本采集 |
| 1.5 精液参数指标检测 |
| 1.6 UU的培养和冻存 |
| 1.7 UU基因组提取 |
| 1.8 菌株生物群鉴定 |
| 1.9 菌株eMLST分型 |
| 1.10 PCR反应 |
| 1.11 PCR产物电泳和测序 |
| 1.12 测序数据分析 |
| 1.13 统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 UU在女性不孕患者的流行分布情况 |
| 2.2 UU在男性不育患者的流行分布情况 |
| 2.3 UU在女性不孕患者和男性不育患者的分布比较 |
| 2.4 UU感染与男性不育患者精液参数间的关系 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分:脲原体不同亚组菌株的基因组学特征及比较基因组学分析 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株来源 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 菌株复苏 |
| 1.4 固体培养 |
| 1.5 挑单克隆 |
| 1.6 菌种鉴定 |
| 1.7 菌株扩大培养 |
| 1.8 基因组提取和二代Illumina全基因组测序 |
| 1.9 三代Nanopore全基因组测序 |
| 1.10 全基因组序列拼接 |
| 1.11 基因组的注释和分析 |
| 1.12 免疫印迹实验 |
| 1.13 质谱检测 |
| 1.14 药敏试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 二代全基因组测序DNA样本检测 |
| 2.2 三代全基因组测序DNA样本检测 |
| 2.3 基因组的基本信息 |
| 2.4 共线性关系分析 |
| 2.5 同源基因簇分析 |
| 2.6 基于SNP差异构建系统发育树 |
| 2.7 毒力基因分析 |
| 2.8 药敏结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脲原体致病机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间取得的科研成果 |
（9）Ⅲ型胶原蛋白对大鼠阴道萎缩的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 建立大鼠阴道萎缩模型 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Ⅲ型胶原蛋白对大鼠阴道萎缩的作用及机制 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士研究生期间发表的文章 |
（10）胰腺癌细胞迁移体对肿瘤微环境中癌细胞与相关免疫细胞表型及功能的相互调控作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 PCCDM的产生以及对胰腺癌免疫微环境的总体影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 小鼠PCCDM对巨噬细胞功能的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 PCCDM诱导的巨噬细胞对胰腺癌细胞功能的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 PCCDM诱导的巨噬细胞对T淋巴细胞的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结沦 |
| 第五部分 PCCDM诱导的巨噬细胞对胰腺癌补体免疫逃逸的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第六部分 PCCDM关键蛋白在胰腺癌组织中的表达情况与患者预后以及组织中免疫细胞浸润的关系 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| References |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
四、正常人子宫颈长期器官培养的超微结构研究（论文参考文献）
- [1]肝细胞靶向螯合剂的合成与表征及活性研究[D]. 蔡朋根. 武汉纺织大学, 2021(01)
- [2]小剂量雷公藤多苷对人上皮性耐药卵巢癌A2780/DDP细胞的抑制作用及机制研究[D]. 丰颖. 南昌大学, 2021(01)
- [3]GPR37通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路促进非小细胞肺癌进展的机制研究[D]. 刘晗. 吉林大学, 2021(01)
- [4]阴道菌群特点及差异细菌生物膜促进宫颈癌变的机制研究[D]. 刘莹. 昆明医科大学, 2020
- [5]邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯（MEHP）通过Hippo-YAP信号诱导血管瘤细胞增殖的机制[D]. 叶聪. 吉林大学, 2020(08)
- [6]Micro-RNA在肿节风多糖促进骨骼肌损伤及修复过程中的作用和机制研究[D]. 薛俊杰. 河南大学, 2020(02)
- [7]经典的Wnt/β-catenin信号通路与宫颈癌顺铂耐药的关系研究[D]. 郭红军. 郑州大学, 2020(02)
- [8]不孕不育患者分离脲原体的分子流行病学特征及比较基因组学研究[D]. 杨婷. 浙江大学, 2020(01)
- [9]Ⅲ型胶原蛋白对大鼠阴道萎缩的作用及机制研究[D]. 游爽. 重庆医科大学, 2020(12)
- [10]胰腺癌细胞迁移体对肿瘤微环境中癌细胞与相关免疫细胞表型及功能的相互调控作用研究[D]. 张荣华. 北京协和医学院, 2020(05)