一、逆转录病毒产生耐药性的新机制（论文文献综述）
张丽娜,徐淑静,刘新泳,展鹏[1]（2021）在《以金属离子依赖性蛋白为靶标的抗病毒药物研究进展》文中研究指明如何克服病毒的耐药性和降低药物不良反应一直是抗病毒药物研究的重要任务。结构生物学的快速发展发现了许多抗病毒的新靶标,增加了治愈病毒感染的希望。某些金属蛋白在病毒的核酸复制、蛋白质水解等生命周期中发挥着重要的作用,因此金属蛋白是抗病毒感染的有效靶标。本文作者精选近几年最具代表性的研究实例,介绍了多个病毒金属蛋白的结构和功能,并从药物化学的角度总结了多种以金属离子依赖性蛋白为靶标的抑制剂的研究进展。
张莹,侯凌欣,鞠翰,刘新泳,展鹏[2]（2021）在《以聚合酶为靶标的抗病毒药物研究进展》文中认为病毒聚合酶是一类十分重要的合成病毒自身遗传物质的蛋白质,因其相对保守而成为抗病毒药物研发的重要靶点。不同病毒聚合酶的结构和功能有着许多相似之处,因此针对某一种病毒聚合酶设计的抑制剂往往对其他病毒也有较好的抑制作用。本文作者精选了近年以聚合酶为靶点的抗病毒药物的经典案例,介绍了不同病毒聚合酶的结构和功能,并从药物化学的角度综述了多种病毒聚合酶抑制剂的研究进展。
梁至[3]（2021）在《海洋候选药物PA/GPA抗肾癌机制和早期ADMET研究》文中研究说明肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）组织中高水平的活性氧（ROS）使其对传统的放疗和化疗药物均不敏感,迫切需要寻找针对新靶点、具有新结构的肾癌治疗药物。海洋微生物天然产物是新颖药源分子的重要来源,本论文从海洋天然产物中筛选抗肾癌新药,并遵从新药研发“Fail early,Fail cheap”这一原则,将ADMET研究引入药物研发过程,对药物进行早期成药性评价,形成一个从海洋候选药物抗肾癌新靶标筛选、新机制研究到成药性评价的完整研究体系。抗肾癌新靶标筛选:本课题组与合作者从两株海洋放线菌中发现了 33个粉蝶霉素类（Piericidins）候选化合物,包括21个新结构化合物,其中PA三糖糖苷是首次报道。PA及其单糖苷GPA作为产量最大的粉蝶霉素类（PAs）化合物,对ACHN肾癌细胞的IC50分别达0.4 μM和0.2μM,抗肾癌活性显着优于索拉菲尼（P<0.001）。因此,挖掘PA/GPA抗肾癌新靶点是开发PAs抗肾癌候选药物的首要任务。本研究首先利用蛋白配体垂钓技术发现ACHN细胞中过氧化物氧化还原酶蛋白1（PRDX1）与PA有直接相互作用。PRDX1在体内主要发挥清除ROS从而维持机体稳态的功能;当胞内ROS水平异常升高或PRDX1蛋白浓度增加时,PRDX1形成二聚体或十聚体,作为功能调节蛋白调控NF-κB等蛋白的活性,或发挥分子伴侣作用,同时失去氧化还原酶活性。据文献报道,PRDX1在不同肿瘤组织中的高表达促进肿瘤的发生发展,而与大部分实体瘤相反,PRDX1在肾癌组织中低表达,因此阐明PRDX1与ROS的关系对挖掘PA/GPA抗肾癌新机制至关重要。抗肾癌新机制研究:利用临床人肾细胞癌样本,联合2个队列的肾细胞癌与癌旁组织转录组数据证实PRDX1在肾癌组织中低表达（P<0.0001）。PA对ACHN细胞转录组数据分析发现PA能上调PRDX1的表达。对此我们设计并构建了 PRDX1敲低ACHN稳转细胞株用于考察上调的PRDX1对ROS水平的影响。实验结果表明,PA/GPA能显着下调ACHN细胞内ROS水平,当PRDX1蛋白表达被抑制后,PA/GPA下调ROS的作用消失。由此,我们确认PRDX1是PA/GPA的作用靶标。作为一类多功能蛋白,PRDX1的酶活性和蛋白调节功能在维持机体稳态中起关键作用。我们检测了 PRDX1蛋白Tyr194磷酸化,发现PA/GPA能抑制蛋白磷酸化,使PRDX1总蛋白水平增加。为了进一步探讨PRDX1蛋白浓度的升高是否影响其过氧化物酶活性,我们检测了PRDX1的总体酶活性,发现500 nM PA/GPA处理后PRDX1酶活性分别提高至1.36倍和1.60倍（P<0.01）。利用表面等离子共振技术（SPR）发现PA/GPA与PRDX1蛋白可直接结合,这可能是抑制Tyr194磷酸化保持过氧化物酶活性的原因。此外,细胞共定位技术发现PA/GPA能促使PRDX1入核,抑制NF-κB的表达,发挥功能调节蛋白的作用。由此,我们证明了 PA/GPA抗肾癌新机制与靶向PRDX1增强其ROS清除能力相关,这一新机制的发现为抗肾癌天然产物的研发提供了新的研究思路。ADME/T成药性评价:为了进一步证实PA/GPA的抗肾癌效果,我们构建了 ACHN细胞荷瘤裸鼠,在PA/GPA给药三周后,肿瘤体积明显下降,分别减少至50%（P<0.01）和41%（P<0.001）,同时伴随着肝毒性的发生。因此,我们继续通过ADME/T研究挖掘PA/GPA肝毒性靶点,探讨PAs化合物的毒效关系。结合PA对ACHN细胞的定量蛋白质组和转录组数据分析发现,PA对胆汁分泌通路具有显着影响。SPR研究发现PA直接结合肝脏核受体LXRα,调控CYP7A1和LDLR,增加胆固醇吸收并抑制其代谢,加剧肝脏胆固醇堆积,引起肝细胞的线粒体毒性导致细胞凋亡。PA/GPA的药动学结果表明PA可聚集在肝脏产生肝毒性（肝脏药物浓度达血浆29倍）,而GPA在肝脏内转化为PA（转化率高达29.6%）。我们将5个PA类苷元和12个糖苷PA类似物与LXRα做SPR和分子对接实验,发现糖基的存在阻碍化合物与LXRα蛋白结合。这极大可能是GPA无LXRα结合活性,但在肝脏转化为苷元产生肝损伤的重要原因。同时,我们利用人肝微粒体酶和重组人CYP/UGT纯酶孵育体系证实PA主要发生Ⅱ相代谢,UGT1A7、1A8、1A9和1A10是其主要代谢酶（代谢率均>40%）。综上,本研究联合多组学技术,基于药物ADMET特性阐明了粉蝶霉素类候选化合物的抗肾癌新机制和药物毒效关系,证实GPA 比 PA具有更优的成药性,为寻找成药性更好的抗肾癌候选药物奠定了基础。我们立足于本论文的研究结果,通过对PA类候选化合物进行结构优化,以期提高PA类候选化合物的肾癌靶向性和生物利用度,同时显着降低肝毒性,进一步推动我国具有自主知识产权的抗肾癌原创靶向药物的研发。
肖遵强[4]（2021）在《槲皮素通过靶向人抗原蛋白R抑制肝癌进展的机制研究》文中认为目的 研究槲皮素通过靶向作用于人抗原蛋白R（HuR）降低非编码RNA LINC01123的稳定性,并抑制肝癌细胞的增殖及转移的作用。进一步探索槲皮素抗肝癌的机制,为中药治疗肝癌提供新思路。方法1.使用不同浓度的槲皮素处理Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞,通过CCK-8试验,EdU试验,克隆平板实验,流式实验,证明槲皮素可以抑制肝癌细胞的增殖,并诱导肝癌细胞凋亡。2.使用不同浓度的槲皮素处理Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞,通过划痕实验,迁移实验,侵袭实验,证明槲皮素可以抑制肝癌细胞的迁移及侵袭性。3.建立裸鼠荷瘤模型,观察槲皮素是否可以在体内抑制肿瘤的生长。4.通过生信分析及临床资料分析,研究LINC01123在肝癌组织中的表达量与预后的关系。5.在Hep3B,HepG2和Huh7细胞中过表达或敲低LINC01123,通过CCK-8实验,EdU试验,transwell试验及建立裸鼠荷瘤模型,进一步证明LINC01123在体内及体外可促进肝癌的增殖转移。6.通过生信分析,RNA免疫共沉淀实验及双荧光素酶报告基因检测系统实验寻找LINC01123的靶点。7.通过生信分析及双荧光素酶报告基因检测系统实验寻找miR-34a-5p的靶点。8.通过TUFT1的挽救实验来证明LINC01123可通过miR-34a-5p/TUFT1轴促进肝癌的进展。9.通过生信分析,探究HuR与LINC01123表达量的相关性,通过RNA免疫共沉淀实验探究两者是否可以直接结合。10.在Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞中过表达或敲低HuR,检测LINC01123的RNA稳定性及表达量,探索HuR能否通过增加LINC01123的稳定性,促进LINC01123 的表达。11.通过生信分析,探索HuR是否是槲皮素的作用靶点。12.通过在Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞中过表达HuR,探索槲皮素是否通过靶向作用于HuR下调LINC01123的表达,从而发挥抗肝癌的作用。结果1.槲皮素可以通过剂量依赖的方式抑制Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞的增殖。2.槲皮素可以通过剂量依赖的方式抑制Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞的转移。3.槲皮素可以在体内实验中抑制肝癌的生长。4.LINC01123在肝癌组织中高表达,并与患者的不良预后相关。5.在Huh7细胞中敲低LINC01123的表达后,可以明显抑制Huh7细胞的增殖,侵袭及迁移,在HepG2及Hep3B细胞中过表达LINC01123可以促进HepG2,Hep3B细胞的增殖,侵袭及迁移。同时,LINC01123的沉默可以抑制体内实验中肝癌的生长。6.通过生信分析发现LINC01123与miR-34a-5p的表达量成反比,通过双荧光素酶报告基因检测系统和RNA免疫共沉淀实验可以证明LINC01123和miR-34-5p直接结合。7.通过生信分析发现miR-34-5与TUFT1的表达量成反比,通过双荧光素酶报告基因检测系统可以证明miR-34-5p和TUFT1直接结合。8.过表达miR-34-5p可以逆转LINC01123促进肝癌细胞增殖,迁移及侵袭的作用,过表达TUFT1可以逆转miR-34-5p抑制肝癌细胞增殖,迁移及侵袭的作用。9、HuR和LINC01123在肝癌组织中的表达量呈正相关关系,RNA免疫共沉淀实验证明HuR可以和LINC01123直接结合。10.在Hep3B,Huh7和MHCC97h细胞中过表达或敲低HuR的表达量,可以同向调控LINC01123的表达量,敲低HuR可以降低LINC01123的稳定性。11.通过生信分析及分子对接,可以证明HuR是槲皮素的潜在作用靶点。12.在Hep3B,Huh7,MHCC97h细胞中过表达HuR,可以逆转不同浓度的槲皮素对Hep3B,Huh7,MHCC97h细胞的增殖抑制和转移抑制的作用。结论 本研究发现LINC01123在肝癌中高表达,与患者预后不良相关,并可通过调节miR-34a-5p/TUFT1轴促进肝癌细胞的增殖及转移。HuR可与LINC01123结合,增加LINC01123的稳定,并促进其表达。HuR作为槲皮素的潜在靶点之一,槲皮素可通过靶向HuR,降低LINC01123的稳定性并抑制肝癌细胞的增殖与转移。本研究首次发现了中药单体槲皮素通过作用于LncRNA治疗肝癌的机制,为中药治疗肝癌提供了新的思路。
孙林[5]（2021）在《新型HIV-1衣壳蛋白抑制剂和RNase H抑制剂的设计、合成与生物活性评价》文中研究表明艾滋病（AIDS）的主要致病原为人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）。临床上通常将至少三种作用于HIV-1生命周期不同阶段的药物联合应用来治疗艾滋病,称为“高效抗逆转录病毒疗法”（HAART）。但是,由于HIV-1具有潜伏性,因此需要长期甚至终生接受药物治疗,这不可避免地带来了严重的耐药性等问题。因此,瞄准具有成药潜力的新靶标,尤其是在HIV-1生命周期的多个环节中扮演重要角色的蛋白或酶,如衣壳蛋白（CA）和核糖核酸酶H（RNase H）,研发具有新结构、新机制的药物来丰富临床治疗方案,是解决现有药物耐药难题的有效策略。HIV-1 CA是构成一个成熟的病毒颗粒所必需的结构蛋白,并将病毒基因和关键酶包裹其中。此外,CA在病毒复制的早期和晚期阶段还发挥重要的调控作用,与HIV-1的复制及感染性密切相关。目前已有多类CA抑制剂见诸报道,其中作用于CA六聚体相邻亚基N末端-C末端（NTD-CTD）界面的抑制剂尤为引人关注。NTD-CTD界面作用对于CA组装至关重要,干扰该界面可影响CA内在的柔韧性,继而破坏病毒颗粒的完整性。PF74是第一个与NTD-CTD界面的共晶结构得到解析的化合物,但是其存在药理活性低、代谢不稳定等缺陷,未能进入临床研究。最终吉利德公司在PF74基础上经过大量的结构优化发现了抗病毒活性突出的GS-6207,目前已处于临床研究阶段。但是其合成复杂、分子量大、溶解度差、临床研究已诱发病毒耐药等缺陷,使得开发新结构类型的HIV-1 CA抑制剂尤为迫切。HIV-1 RNase H能特异性地水解在逆转录过程中新生成的RNA/DNA杂合链中的RNA链。其一旦受到抑制,逆转录过程将难以延续。目前见诸报道的RNase H抑制剂大都存在抗病毒活性弱和细胞毒性大等缺陷,尚未有RNase H抑制剂进入到临床研究阶段。RNase H作为金属依赖性蛋白,使得对其进行计算机模拟研究存在局限性,从而为基于靶标的药物设计带来困难。而通过对结构多样的化合物库进行细胞水平的抗HIV表型筛选并辅之作用机制研究,以发现具有新作用机制（如RNase H抑制活性）的先导化合物,不失为一种行之有效的途径。一、含三氮唑的苯丙氨酸类HIV-1衣壳蛋白抑制剂的设计、合成与活性评价本章以GS-CA1和GS-6207所共有的PF74苯丙氨酸基本骨架为研究起点,借鉴课题组前期发现的化合物13m的结构特征,综合运用基于靶标的药物设计原理以及骨架跃迁、生物电子等排替换等药物化学策略,将13m的1-（萘-2-亚甲基）-1H-1,2,3-三唑替换为4-苯基-1H-1,2,3-三唑,并在末端苯环上进行多样性导向的取代基修饰,以克服CA柔性靶标与小分子结合模式的难预测性,并丰富此类抑制剂的构效关系,设计并合成了 IA系列共39个结构新颖的含三氮唑的苯丙氨酸类HIV-1 CA抑制剂。体外抗HIV-1活性筛选发现,IA系列大部分化合物表现出中等的抗病毒活性（EC50=3.13μM～14.81 μM）。其中,IA-6a-9、IA-6a-10、IA-6a-11 和 IA-5b 的抗 HIV-1 活性（EC50分别为 3.13 μM、3.30μM、3.46 μM 和 3.30 μM）最为突出,但仍弱于先导 PF74（EC50=0.28μM）。SPR 实验结果显示,IA-6a-9、IA-6a-10和IA-5b与CA六聚体结合的KD值彼此接近（分别为6.04 μM、4.99 μM和4.00μM）,与三者抗病毒活性趋势一致,初步验证了作用靶点。作用阶段确证实验结果表明IA-6a-9具有抑制HIV-1复制早期和晚期双重阶段的作用特征,且其更倾向于抑制晚期阶段（IC50=0.32 μM）,与PF74活性相当（IC50=0.23 μM）。进一步的机制实验表明,IA-6a-9几乎不影响p24产量和体外CA装配。IA-6a-9的分子动力学模拟显示其与CA形成氢键的频率较低,这可能是其活性弱的原因之一。此外,IA-6a-9在人肝微粒体和血浆中的代谢稳定性与PF74相当或略有提升。总之,IA系列系统的构效关系（SAR）分析及分子动力学模拟结果,为下一轮化合物的结构优化提供了有益的指导。二、含苯磺酰胺的苯丙氨酸类HIV-1衣壳蛋白抑制剂的设计、合成与活性评价第二章中IA系列的SAR分析和分子动力学模拟说明了氢键作用对于提升化合物活性的重要性。在本轮的结构改造中,我们通过基于靶标的药物设计,在PF74骨架基础上,首先将吲哚环替换为含有更多氢键供受体的苯磺酰胺得到ⅡA系列,再运用成环策略得到含苯并噻二嗪环的ⅡB系列,最后在ⅡB结构基础上运用骨架跃迁和生物电子等排策略得到含4-苯磺酰基哌嗪酮环的ⅡC系列,共计3个系列37个结构新颖的含苯磺酰胺的CA抑制剂。体外抗HIV-1实验结果显示,除了 ⅡA-31丧失活性外,其余所有衍生物对HIV-1 NL4-3均表现出中等至优异的抑制活性（EC50=90 nM～10.81μM）。通过从 ⅡA（EC50=5.61 μM～10.81 μM）到 ⅡB（EC50=2.11μM～5.96μM）再到 ⅡC 系列（EC50=90 nM～1.06 μM）的分层次结构优化,活性也得到逐步提升,验证了化合物设计的合理性。由此可见,哌嗪酮片段的引入是ⅡC系列具有高活性的关键。值得一提的是,ⅡC-31（EC50=90nM）作为本章抗病毒活性最好的CA抑制剂,是先导PF74（EC50=520nM）的近6倍。SPR实验显示,ⅡA-3a、ⅡA-3k、ⅡB-2a、ⅡB-2d对CA六聚体的结合亲和力（KD分别为11.80 μM、7.99 μM、1.19 μμM和1.30 μM）与其抗病毒活性趋势近乎一致,初步验证了 CA为其作用靶点。ⅡC-31对病毒复制的早期和晚期阶段均表现出最好的抑制活性（IC50分别为8.96 nM和0.24 μM）,其早期抑制活性是先导PF74（IC50=56nM）的6.25倍,这与二者的抗病毒活性水平差距一致（90 nM vs520 nM）。在ⅡA-3k、ⅡB-2a和ⅡC-31存在下,所产生的病毒p24含量相比对照DMSO仅略有改变。在体外CA装配实验中,ⅡA-3k、ⅡB-2a和ⅡC-31明显抑制了 CA的组装,而PF74则可以显着加快组装过程。此外,共晶结构显示ⅡC-31可以同时精准的结合到CA六聚体的6个相邻亚基界面,与PF74构象基本相同。ⅡC-31中新引入的哌嗪酮基团有较高的概率与Arg173、Lys70以及Gln63等形成额外氢键作用力,为其出色的抗病毒活性提供了合理的解释。随后对ⅡC-31 进行了初步的临床前成药性评价:首先,在人肝微粒体和血浆中,ⅡC-31相比PF74代谢稳定性略有提高;其次,在SD大鼠的体内药代动力学实验中,ⅡC-31表现出良好的体内PK性质和口服生物利用度（t1/2=1.2 h,F=23.0%）;最后,在昆明小鼠的急毒实验中,ⅡC-31在1000 mg/kg的单次灌胃剂量下无明显的急性毒性。综上,本研究验证了基于PF74的苯丙氨酸优势结构骨架,通过结构优化来提高化合物的抗病毒活性与成药性的可行性。ⅡC-31可以作为结构新颖的先导分子供进一步研究。三、香豆素酰胺类抗HIV-1 RNase H先导化合物的发现发挥药理活性的先导化合物是新药创制的物质基础,而基于化合物库的筛选是先导化合物发现的主要途径。特别是,本课题组经过多年积累获得的大量骨架新颖、结构多样且具有良好成药性的小分子,为表型筛选发现结构新颖的抗HIV先导化合物提供了物质保证。文献调研发现,羟基香豆素骨架具有RNase H抑制活性,同时香豆素及其衍生物可以发挥诸如抗病毒等药理活性。为了提高RNaseH抑制剂的命中率,同时降低活性筛选工作量,在本研究中,我们选取了 in-house化合物库中一类羟基香豆素酰胺类化合物（DW系列）,首先进行了细胞水平的抗HIV-1表型筛选。实验结果显示,DW-3、DW-4、DW-11、DW-25和DW-31对双突变株RES056的抑制活性（EC50 分别为 121.86 μM、101.15 μM、208.95 μM、28.56 μM 和 82.78μM）与野生株 ⅢB（EC50 分别为 113.32 μM、107.91 μM、213.06μM、19.63 μM和123.46μM）接近或相当,显示该类化合物具有显着的抗耐药潜力。分析还发现该类活性化合物符合经典的HIV-1 RNase H抑制剂药效团模型。于是进行了HIV-1RNase H抑制实验,结果显示DW-3、DW-4、DW-25、DW-31均能表现出不同水平的RNase H抑制活性（9.9 μM～68.5 μM）。以上实验结果表明此类化合物可通过作用于RNase H来发挥抗病毒活性。为了进一步提高香豆素类HIV-1 RNase H抑制剂的抗病毒活性,我们基于筛选发现的活性化合物结构,以药效团模型和RNaseH靶标结构为指导,综合运用骨架跃迁和生物电子等排策略设计合成了 36个结构新颖的香豆素类化合物。体外抗HIV-1实验显示有8个化合物表现出了不同水平的细胞活性（EC50=3.94μM～237.34 μM）,且细胞毒性极低（CC50>220 μM）。其中化合物ⅢB-2a活性最为突出,其抗HIV-1野生株活性（EC50=3.94 μM）是其他化合物的12～60倍,是先导化合物DW-4（EC50=101.15 μM）的近26倍。抗HIV-1突变株活性结果显示ⅢB-2a对5种单突变株抗耐药性良好,大多保持在个位数的耐药倍数（RF=1.43～11.27）,与上市药物依曲韦林（ETV）接近或相当（RF=0.85～4.09）,显着优于奈韦拉平（NVP）（RF=1.29～45.26）和依法韦仑（EFV）（RF=1.59～86.23）。随后的RNaseH抑制实验表明,在100 μM初筛浓度下,大部分化合物都表现出了中等及以上的靶标抑制率（57.4～87.2%）,此外,ⅢB-2a表现出了最优的RNase H抑制活性（IC50=12.3 μM）,初步验证了此类化合物可以通过抑制RNase H来发挥抗病毒作用。总之,IIIB-2a可以作为香豆素酰胺类抗RNase H先导化合物继续结构优化,以进一步提高活性和成药性。综上,本论文针对抗艾滋病临床疗法中存在的药物严重耐药性问题,从开发HIV-1新靶标——CA和RNase H抑制剂两方面入手,在基于结构的药物设计与化合物库表型筛选等药物设计和发现方法指导下,综合运用生物电子等排替换、骨架跃迁等药物化学策略,设计并合成了含三氮唑的、含苯磺酰胺的苯丙氨酸类HIV-1 CA抑制剂以及香豆素酰胺类HIV-1 RNase H抑制剂,共计6个系列112个结构全新的化合物。经细胞水平和酶水平的活性测试,以及人肝微粒体和血浆稳定性测试、大鼠PK实验等,发现了多个具有良好抗病毒活性和成药性的抗HIV-1先导化合物。本论文还成功解析了 ⅡC-31与CA六聚体的复合晶体结构,初步阐明了含哌嗪酮化合物发挥高效抗病毒活性的分子机制,为后续基于靶标的合理药物设计奠定了结构生物学基础。
魏粉菊[6]（2021）在《基于优势骨架的新型HIV-1/HBV RNase H抑制剂的设计、合成及活性评价》文中研究表明逆转录病毒包括人类免疫缺陷病毒1型和2型（分别为HIV-1和HIV-2）和乙肝病毒（HBV）在内的许多重要的人类病原体。其中,HIV-1、HBV分别是艾滋病（AIDS）和乙肝（CHB）的主要病原体。在全球范围内,艾滋病毒感染人数居高不下,其中,约有10%的HIV感染者并发感染HBV,严重威胁着人类的健康与生命。尽管高效抗逆转录病毒疗法（HAART）和核苷酸类似物疗法分别在控制HIV病毒载量、抑制HBV的增殖和降低肝脏相关并发症的发生等方面发挥了十分重要的作用,但是长期用药所产生的耐药性以及蓄积毒性限制了当前疗法的广泛应用,因此,研发具有新靶标、新机制的高效、低毒、抗耐药性的新型抗HIV/HBV药物显得尤为重要。HIV和HBV逆转录酶（RTs）由两种酶组成:DNA聚合酶和核糖核酸酶H（RNase H）,它们在逆转录过程中以协调的方式促进双链病毒DNA的产生。其中,RNase H是核酸内切酶,在核心催化域内,HBV约有23%的氨基酸序列与HIV一致。RNase H通过切割RNA/DNA杂合双链中的RNA,促进病毒双链DNA的合成。尽管目前文献报道了多种RNase H活性抑制剂,但是,由于其中大多数存在细胞毒性大、抗病毒活性差等缺点,迄今为止该类抑制剂尚未被批准应用于临床,因此,开发特异性高、细胞毒性低、抗病毒活性强的新型RNase H抑制剂仍然是当前抗病毒药物研究的主要方向。基于HIV/HBV RNase H核心催化域的结构以及功能的相似性,本论文基于课题组前期发现的抗病毒优势骨架,分别采用“双翅膀”取代修饰、优势取代基杂合等策略对新型HIV/HBV RNase H抑制剂的研究进行了全面的探索。新型多酚类HIV-1 RNase H抑制剂的设计、合成与活性评价。自然界中的多酚类化合物种类数不胜数,分布广泛,具有抗氧化、抗肿瘤以及抗病毒等生物活性。本课题组早期通过探索发现了具有酶抑制活性的多酚类HIV-1 RNase H抑制剂11,但因其极性大、膜通透性差,导致其细胞水平的抗病毒活性弱。与此同时,HIV-1 RNase H活性位点的配体结合口袋较浅,因此靶向蛋白-溶剂开口区,通过引入延展性结构对先导化合物进行结构改造,形成新的“附着力”,是提高病毒抑制活性、改善理化性质的有效途径。基于此分析,我们以11为先导化合物,根据蛋白-溶剂开口区的结构特征,保留优势的金属螯合骨架,分别在哌嗪环的C2、C3位引入优势疏水侧链,形成“双翅膀”型取代基,使分子呈现“Y”型构象,同时对引入取代基的多样性进行探讨,设计合成了一系列共20个新型多酚类衍生物。抑酶活性结果显示,与阳性对照β-侧柏酚（IC50=1.98±0.22 μM）相比,11个目标化合物表现出更佳的抑制活性,其中,化合物IA-6抑制活性最佳,达到0.067±0.02 μM,约为β-侧柏酚的30倍。分子模拟表明,多酚金属螯合基团可与两个Mg2+形成关键的金属螯合作用,两条侧链分别朝向不同的蛋白-溶剂界面,稳定小分子与蛋白质的结合构象,其中,新引入的呋喃基甲胺基朝向H539,可与之形成额外的疏水作用。不幸的是,该类化合物未表现出细胞水平抗病毒活性,但是值得肯定的是,这一系列化合物中大部分具有很低的细胞毒性,优于对照拉米夫定（3TC）和奈韦拉平（NVP）,具有进一步开发的潜力。新型羟基喹唑啉类HIV-1 RNase H抑制剂的设计、合成与活性评价。在新药研发的过程中,药物小分子结构的复杂性影响其与目标蛋白的亲和力,其中,Fsp3（sp3杂化碳原子的分数,即sp3杂化碳原子数/总碳数）通过确定分子的碳饱和度,表征分子空间结构的复杂性,对药物药效的提高发挥着十分重要的作用。通过提高Fsp3值,使其在三维空间上更舒展,占据更大的空间,是改善目标化合物理化性质的有效方法。本论文针对课题组早期发现的新型羟基喹唑啉类RNase H抑制剂所表现出的细胞渗透性差、抗病毒活性弱等缺点,以43为先导化合物,在保留羟基喹唑啉优势骨架的基础上,一方面,借鉴Fsp3概念,引入柔性的饱和杂环取代基,提高Fsp3值,改善理化性质;另一方面,借鉴优势疏水性取代基,对43进行系统的侧链修饰,丰富取代基的结构类型,设计合成了一系列共10个化合物。抑酶活性结果表明,6个化合物的活性较阳性对照β-thujaplicinol有了一定程度的提高,其中化合物Ⅱ-9和Ⅱ-10对于HIV-1 RNase H的抑制活性与先导化合物43相当,IC50值分别为0.99±0.30 μM和0.82±0.29μM。相关的体外抗HIV活性测试正在进行。新型吡啶骈嘧啶酮类HBV RNase H抑制剂的设计、合成及活性评价。药物再定位策略,又称“老药新用”,主要是发现已批准或正在研究的药物在原有药理作用范围外的新用途。与针对特定适应症开发的全新型药物相比,该策略具有失败风险低、研发时间短等优势,得到了广泛关注。本论文以课题组前期通过药物再定位策略发现的苗头化合物31为先导化合物,结合三点药效团模型,保留吡啶骈嘧啶酮优势骨架,将C4位取代基简化,C6位引入柔性连接链（Linker）和狭长的疏水性侧链,设计合成一系列共14个化合物。遗憾的是,所设计的吡啶骈嘧啶酮类化合物在测试浓度下均未对HBV DNA表现出抑制作用。Caco-2细胞单向渗透性测试实验结果显示,化合物Ⅲ-14表现出较差的细胞渗透性,解释了该系列化合物未在细胞水平表现出预期的HBVDNA抑制活性的原因。相关的HBsAg以及HBeAg抑制活性测试正在进行。
姜向毅[7]（2021）在《靶向于病毒衣壳蛋白以及逆转录酶的抗病毒先导化合物的发现》文中进行了进一步梳理艾滋病（Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS）和乙肝（Viral Hepatitis B）分别是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus,HIV）和乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）引起的严重危害人类健康和社会发展的感染性疾病。现阶段迫切需要研发新型抗病毒药物来治疗这两种疾病,而兼具良好生物活性和成药性的先导化合物的发现是新药研发的基础。因此,本论文聚焦病毒重要靶标衣壳蛋白与逆转录酶,采用药物设计新策略、成药性优化新理念,快速、高效地发现了一批抗病毒活性优良、成药性理想的先导化合物,为安全有效、具有临床应用价值的抗病毒创新药物研发奠定基础。本论文主要工作分为以下三个部分:（1）HBV衣壳蛋白抑制剂NVR 3-778前药的设计、合成以及初步成药性评价HBV衣壳蛋白（Capsid Protein,CA）是组成病毒衣壳的结构蛋白,在病毒生命周期中发挥着至关重要的作用,并且介导病毒与宿主细胞的相互作用,对于维持HBV的感染性与稳定性具有重要意义。因此,HBV衣壳蛋白已成为抗乙肝病毒药物研究领域备受瞩目的新靶标。本论文第二章针对HBV衣壳蛋白抑制剂NVR 3-778水溶性差的缺点,通过前药策略设计合成了NVR 3-778琥珀酸单酯前药I-4。细胞水平的抗病毒活性实验显示I-4抑制HBV复制的活性（EC50=0.246±0.058 μM）略优于 NVR3-778（EC50=0.40±0.13 μM）。在三个 pH（2.0,7.0,7.4）的磷酸盐缓冲液中,前药I-4的溶解度都超过原药NVR3-778百倍以上,对开发新剂型特别是注射制剂具有重要的意义。体外血浆和全血的稳定性试验证明前药I-4与NVR3-778相比更加稳定,为进一步的体内成药性评价提供依据。大鼠体内药代动力学试验表明前药I-4与NVR3-778具有相当的生物利用度,反映出前药I-4在体内与原药NVR 3-778具有相似的抗病毒疗效;并且I-4经过代谢才能产生NVR3-778,可以在一定程度上提高药物的代谢稳定性,降低体内最大药物浓度从而减少刺激性,提高患者的耐受性。综上,琥珀酸单酯前药I-4成功解决了候选药物NVR 3-778存在的水溶性差的问题,在保持其疗效的同时,降低了其毒副作用并提高了代谢稳定性,具有良好的开发前景。（2）靶向可容纳区域I的新型HIV-1 NNRTIs的发现HIV-1逆转录酶（Reverse Transcriptase,RT）在病毒基因组复制过程中发挥关键作用,一直是抗艾滋病药物研发的优选靶点。非核苷类逆转录酶抑制剂（Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs）可以特异性地作用于距离聚合酶活性位点10A的变构口袋（NNRTI-binding pocket,NNIBP）,而不识别正常细胞的聚合酶,因此具有选择性高、细胞毒性小的优点。本论文第三章针对第二代NNRTIs依曲韦林存在的耐药性、水溶性差以及不良反应严重等问题,靶向于NNIBP的可容纳区域I,引入富含sp3碳原子的亲水性基团,在增强靶标结合力的同时,通过增加Fsp3值以改善水溶性等成药性参数,设计、合成了 24个新型的 NNRTIs。细胞水平的活性测试表明所有的目标化合物对HIV-1野生株具有良好的抑制活性,EC50在0.16～0.0021 μM之间。其中化合物II-7c对野生型、K103N和E138K突变型HIV-1的抗病毒活性较阳性对照依曲韦林有显着提高,细胞毒性相对较低。逆转录酶抑制实验表明该系列化合物作用靶点为HIV-1逆转录酶,且化合物细胞水平的抗病毒活性与抑酶活性有着良好的相关性。此外,我们采用分子（动力学）模拟研究了化合物II-7c与HIV-1 RT的相互作用。总之,由于富含sp3碳原子的亲水性基团的引入,该系列化合物的水溶性等理化性质与依曲韦林相比明显改善,这将有助于提高DAPY类化合物的药代动力学性质。（3）新型HIV-1衣壳蛋白抑制剂的设计、合成以及生物活性评价HIV衣壳蛋白（Capsid Protein,CA）是组成病毒衣壳的结构蛋白,在病毒生命周期的多个环节均发挥重要作用,已成为抗HIV-1药物研究领域十分有前景的新靶标。本文第四章以作用机制独特的HIV-1衣壳蛋白小分子抑制剂PF-74为先导化合物,鉴于其抑制HIV-1复制活性较低、体内代谢稳定性差的缺点,基于PF-74与衣壳蛋白的作用模式以及课题组前期研究成果,采用电子等排、骨架跃迁的药物设计策略,设计合成了 32个PF-74类苯丙氨酸衍生物。细胞水平的抗病毒活性筛选表明PF-74类化合物的“连接链”区域及靶向于CTD的取代基对抗病毒活性影响较大,其中III-b和III-e系列的大部分化合物表现出了中等程度的抗HIV-1活性。两个系列中活性最好的化合物分别是III-b3（EC50=5.14±1.62μM）和 III-e10（EC50=2.57±0.79 μM）,但是活性稍弱于PF-74（EC50=0.42±0.11μM）。靶标亲和力实验显示该系列化合物更倾向于与CA六聚体结合。进一步的分子动力学模拟表明相比于III-b3,III-e10与CA六聚体的结合构像更加稳定。这一结果与细胞水平的抗病毒活性结果以及靶标亲和力测试结果相一致,并且对该类化合物进一步结构优化具有重要的指导意义。总之,本研究丰富了 PF-74类衣壳蛋白抑制剂的活性-构效关系,为发现抗病毒活性高、代谢稳定性高的新型HIV-1衣壳蛋白抑制剂奠定了基础。综上所述,本论文针对严重威胁人类生命健康的HIV-1和HBV,聚焦于病毒生命周期的重要靶标衣壳蛋白与逆转录酶,采用药物设计新策略、成药性优化新理念,通过细胞水平的抗病毒活性筛选与机制研究,发现了具有开发价值的HBV衣壳蛋白抑制剂NVR3-778琥珀酸单酯前药I-4、抗病毒活性与成药性俱佳的NNRTI Ⅱ-7c、结构新颖的PF-74类HIV-1 CA抑制剂III-b3和III-e10,为研发高效低毒且成药性良好的抗病毒创新药物奠定了基础。
徐盟[8]（2021）在《ATA通过抑制HBV RNase H活性抑制耐药型HBV复制的机制研究》文中提出目的:乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）是全球引起肝脏疾病的最主要发病原因,是肝硬化和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的患病高危因素,HBV感染已成为严重危害全世界数亿人的社会和公共卫生问题。HBV慢性感染的成因非常复杂,尚未完全清楚,一些患者由于HBV长期感染甚至进展为肝硬化或HCC,偶尔甚至发生急性恶化。研究虽证实,目前应用广泛地针对乙肝表面抗原（HBsAg）的疫苗能够有效保护人体免受HBV感染,但全球每年仍有数千万人感染HBV。HBV感染人体后,首先在肝细胞核内形成共价、闭合、环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）,进而持续地转录生成病毒RNA,其中包括一种复制RNA中间体,前基因组RNA（pgRNA）,它会编码两种病毒蛋白,分别为:HBV 核心蛋白（HBV core protein,HBc）和 HBV 聚合酶（polymerase,Pol）。目前公认的抗HBV药物可分为两大类,主要包括:第一类是干扰素,这类药物能实现病毒的血清学清除,但主要缺陷是只对部分HBV有抗病毒作用,总体应答率小于40%。长期服用易出现不良反应和引起耐药。第二类是以拉米夫定（LAM）、恩替卡韦为主的核苷（酸）类似物,这类药物能够快速高效地抑制HBVDNA复制,抗感染效果优于干扰素,已成为目前乙肝治疗的首选,但存在缺点是一旦停用,病毒容易反弹、易发生耐药,还会出现基因型突变和易感性缺失。研究发现核苷类似物发生的耐药可能与HBV P基因变异有关。cccDNA可以在肝脏细胞内持续地静息存在且难以彻底清除,这是慢性乙肝至今难以治愈的最主要障碍。寻找彻底清除cccDNA的有效策略是全世界研究者们一直以来的研究重点。同时,找到解决核苷类似物耐药问题的新策略,也是目前乙肝领域的研究重点和难点。研究发现,人体感染HBV导致慢性活动性炎症,会促使炎症因子激活载脂蛋白 B mRNA 编辑酶催化多肽 3（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 3,APOBEC3s）类胞苷脱氨酶,这是一类在正常肝组织中表达微量,然而在感染HBV后,表达水平发生显着升高的酶类。研究发现,APOBEC3s类胞苷脱氨酶的编辑作用能够抑制HBV的复制。炎症组织能够通过诱导此酶的表达,促进HBV和宿主细胞的基因组发生变异,进而造成HBV基因变异/缺失频展的标志性分子事件。我们在前期研究还发现,APOBEC3s类胞苷脱氨酶表达异常与肝细胞癌的预后不良相关。干扰素作为常用的乙肝治疗药物,目前已知它能够广泛引如入病毒各个基因的突变,核苷类药物一样也有引发基因突变的耐药性风险,所以,非核苷类药物的研发需要积极纳入日程,这也是将来对抗慢性乙肝的必须方案。本研究中首次阐明了干扰素-α和细胞因子TGF-β1对APOBECs类胞苷脱氨酶所引发HBV基因组变异的影响机制,并解释了干扰素与核苷类似物联用引发耐药性产生的可能原因。本研究首次筛选和验证出一种新型抗HBV复制的化合物,金精三羧酸（Aurintricarboxylic acid,ATA）,它对野生型HBV毒株和拉米夫定耐药型HBV突变株的复制具有较强的抑制作用。同时,ATA不会影响HBV的转录或病毒衣壳内RNA-DNA杂合分子的形成。这一研究结果为探寻和研发新型抗HBV药物提供了新的思路和理论依据,同时也为乙肝实现治愈提供了可能。研究方法:1.研究对象本研究对多种肝细胞和肝癌细胞系进行扩增培养和转染并展开后续研究,具体包括:人肝脏祖细胞系HepaRG、人肝癌细胞株HepG2、人肝癌细胞株HepG2衍生细胞HepG2.2.15。2.细胞传代培养使用含10%灭活FBS、2mML-谷氨酰胺、200U/ml青霉素、200 μg/ml链霉素的William’s E培养基对HepaRG和HepG2细胞分别进行培养,辅以5 μ g/ml胰岛素、20ng/ml表皮生长因子、50 μ M氢化可的松和2%DMSO对细胞进行诱导分化。置于37℃,5%CO2浓度的细胞培养箱中静置培养。每2天传代一次。使用含10%灭活FBS、10mMHEPES、200U/ml青霉素、200μg/ml链霉素的DMEM培养基对HepG2.2.15细胞进行培养。置于37℃,5%CO2浓度的细胞培养箱中静置培养。每2天传代一次。3.细胞转染转染前将细胞按照0.8×106/mL密度接种于6孔板中（细胞融合度约60%-80%）;采用 jetPRIME 转染试剂（Polyplus-transfection）转染 HBV 病毒质粒,分别加入200μLjetPRIME buffer和4μLjetPRIME,涡旋混匀,短暂离心,室温静置孵育10min;将200μL配置好的转染试剂逐滴缓慢滴入细胞培养液中,轻轻摇晃孔板使试剂均匀分布;培养箱中继续培养;4至6小时后换50%新鲜的细胞培养液;24或48小时后对转染效果进行检测并收集培养上清待用。4.病毒提纯与感染首先按照上述转染方法制备病毒颗粒,用0.45 μ m滤器过滤所得培养上清。加入6%聚乙二醇8000（PEG8k）沉淀病毒颗粒,用含25%FBS的PBS重悬。按照MOI=1.0,1200×g离心力离心2小时,得到纯化的病毒沉淀;1×107个HBV基因组等效拷贝对应1 × 105个肝细胞被接种的比例对细胞进行感染,感染3小时后,用嘌呤霉素筛选,终浓度为1 μ g/mL。5.基因组 DNA（genome DNA,gDNA）提取和差异 DNA 变性PCR（Differential DNADenaturation PCR,3D-PCR）按照QIAamp mini kit说明书进行操作,完成gDNA提取,得到gDNA样品,然后按照3D-PCR扩增试剂盒说明书,设置扩增条件,完成两轮PCR扩增。6.天然琼脂糖凝胶电泳（NAGE）将采用聚乙二醇沉淀法纯化得到的病毒颗粒,直接用琼脂糖电泳分析。首先,配制缓冲液然后制胶;在适量的样品溶液中加入适量上样缓冲液,混匀,上样;控制电压保持在110 V,电流在40 mA以上电泳约40 min;紫外下拍照并观察。将凝胶依次用如下试剂处理进行碱变性,室温下轻轻摇动确保溶液覆盖凝胶:0.25MNaOH 15min;蒸馏水摇洗5min;变性液40 min;蒸馏水摇洗5min;中和液15min,2次,在凝胶碱变性的同时,制备转印装置。在转印迹槽中倒入20xSSC溶液,槽中置一固相支持物,在固相支持物上从下向上依次置入:滤纸,凝胶,滤膜,滤纸,吸水纸,400-800g重物。转膜后,分别用HBVDNA探针和anti-HBc抗体检测病毒RC-DNA和HBc的表达情况。7.酶联免疫吸附试验（ELISA）首先准备25mL 1×WashBuffer,将96孔板平衡至室温;然后用培养液5000倍稀释收取的细胞培养液样品;将标准品按试剂盒使用说明书进行倍比稀释,得到标准品的浓度依次为 100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12.5pg/mL、6.3pg/mL、3.1pg/mL,上样,孵育;然后每孔加入100μL Stop Solution,在20分钟内用酶标仪读取检测数值和标准曲线;根据稀释倍数计算样品浓度。8.实时荧光定量反转录PCR（RT-qPCR）首先配制PCR反应液,然后按照试剂盒完成两步法PCR扩增程序。接下来,使用 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒去除RNA中夹杂的DNA并将RNA逆转录为cDNA,然后使用TB Green Premix Ex Taq（Tli RNase H Plus）试剂盒进行实时荧光定量PCR。以GAPDH为内参,2-ΔΔCT法计算待测基因相对于GAPDH内参基因的表达量作为结果进行分析。9.蛋白提取和蛋白免疫印迹（Western Blot）分析利用 RIPA Lysis and Extraction Buffer 重悬细胞,超声破碎。4℃,12000rpm/min 离心 15min,转移上清至新管并加入 4×SDS PAGE Loading Buffer,反复吹打混匀。将样品99℃煮沸5分钟使蛋白变性,然后置于-20摄氏度冰箱冷冻保存待测。按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书配制凝胶,恒压电泳1小时左右;按照（+）滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸（-）的顺序依次叠放,恒流转膜2小时;PBST洗膜一次后采用5%BSA室温封闭1小时;一抗室温孵育1小时后PBST洗膜;二抗室温孵育30分钟后PBST洗膜;ECL发光成像,以GAPDH蛋白为内参进行结果分析。10.统计学分析采用SPSS19.0和GraphPad 8.0对数据进行统计学分析并作图。计量资料以x±S表示,两组间数据采用Students’t-test方法进行差异比较,以P<0.05代表差异具有统计学意义。结果:1.APOBECs诱导HBV基因突变分析首先,我们用HBV表达质粒pHBV1.5转染HepG2细胞并连续培养3天,分别对不同组别的细胞用IFN-α或TGF-β1处理。然后回收病毒基因组总RNA及病毒颗粒,检测病毒基因组DNA和HBV衣壳蛋白的表达情况,发现两者表达均明显被抑制,说明IFN-α和TGF-β1均能特异性抑制HBV的复制。对病毒基因组DNA进行扩增和测序发现,IFN-α和TGF-β1均能诱发大量G-to-A和C-to-T碱基突变,这种碱基突变类型符合APOBECs脱氨酶家族的生理特性。因此,我们还过表达了 APOBECs家族来进一步验证HBV的复制和突变情况。通过回收细胞总RNA定量病毒转录物,并未发现APOBECs有对HBV病毒转录过程的影响。然后通过富集病毒颗粒并提取病毒基因组DNA,用3D-PCR法检测其突变水平发现,除了 A3B外,APOBECs家族其它成员均能引发HBV基因组的超突变,而在相似的蛋白表达水平下,A3G和A3F引发的突变更多。尿嘧啶-N-糖基化酶（uracil-N-glycosylase,UNG）是一种主要功能是移除单链DNA分子上的dU的蛋白。由于IFN-α和TGF-β1可以诱导肝脏细胞上调表达APOBECs,我们推测:IFN-α和TGF-β1诱导HBV的超突变被UNG部分修复,这可能是病毒在利用宿主而修复自身一些突变来维持生命,从而避免因过多突变而死亡。通过对病毒DNA测序后发现,与IFN-α和TGF-β1单独处理相比,加入了能特异性抑制肝脏UNG表达的UGI蛋白后,G-to-A和C-to-T基因突变数量明显增加,这个结果揭示了 IFN-α和TGF-β1引发的病毒基因超突变能被UNG部分修复。2.干扰素和拉米夫定联用诱导HBV产生耐药性的机制研究在本部分研究中首先对前一部分的研究结果在诱导分化的人肝脏细胞HepRG细胞中进行了验证。首先将HepRG细胞用DMSO诱导分化,并将细胞裂解并回收总RNA以及HBV病毒颗粒后发现,所有的RNA片段均显着被IFN-α下调,HBV的DNA和病毒衣壳的表达也都被显着下调,更说明了 IFN-α对HBV转录的抑制作用及对HBV复制的抑制。接下来,我们通过检测病毒基因组DNA的突变发现,IFN-α能显着地诱导HBV引起基因组DNA超突变,其突变类型也是G-to-A和C-to-C突变,另外测序结果可见,HBV的X基因和P基因均发生了突变。有研究指出,P基因的突变可能是导致HBV耐药发生的主要原因。我们还用同样的方法对拉米夫定（LAM）对HBV复制的影响进行了研究,发现LAM能显着抑制HBV DNA的合成,但不会导致病毒DNA的任何突变。由于HBVLAM耐药（YIDD）突变株是可以通过在P基因处的G-to-A点突变引入的。前期研究也表明,A3G能够诱发P基因的超突变,因此接下来,我们用A3G过表达质粒和HBV真核表达质粒pHBV1.5共转染HepG2细胞,将不同组别细胞加或不加LAM（30 μ M）处理后,分离回收细胞内的病毒颗粒。结果可见,A3G和LAM分别抑制了 HBV基因组DNA的合成,而且两者联用的抑制能力较单用更明显。通过HBVDNA扩增测序进一步发现,LAM本身不能促发HBVDNA超突变,只有A3G可以促发其超突变,而在LAM和A3G同时存在下,LAM促发了较多的YIDD突变。由此可见,A3G脱氨酶的酶活性能够通过产生G-to-A基因突变而诱导野生型病毒基因的YIDD突变,并且在LAM的选择作用下,其酶活性能定向诱导YIDD突变的不断累积,进而形成了对LAM耐药性的定向突变。3.ATA抑制HBV复制的机制研究为了找寻解决抗HBV治疗引发耐药的临床实际问题,我们在前期研究中经过药筛试验已首次发现了一种具有广泛的抗病毒活性,可对抗多种RNA/DNA病毒的化合物——金精三羧酸（ATA）。本部分研究中,首先证实了 ATA对HBV病毒复制具有较明显的抑制作用。首先,通过用不同浓度的ATA处理经HBV感染的HepaRG细胞并测定病毒HBeAg的释放量可见,ATA能够持续抑制HBV的侵染和复制,还能持续抑制HBeAg的表达,并且抑制作用随着ATA药物浓度的增加而增强,证实了 ATA对HBV病毒复制的抑制作用是依赖其药物浓度的。接下来,用HBV稳转肝细胞系HepG2.2.15进一步探究其分子机制。首先,不同浓度ATA处理HepG2.2.15细胞,并采用NAGE法分别测定NC-DNA和HBcAg水平,结果显示,ATA对NC-DNA合成有其药物剂量依赖性抑制作用,但对HBcAg表达无明显影响,HBV转录本表达也未见差异,这一结果提示了ATA能引起对HBV复制的抑制作用,且不影响HBV转录。根据以往其它研究的发现,ATA被认为是一种广谱核酸酶抑制剂,因此我们假设ATA可能通过阻断其Pol RNase H活性来抑制HBV的复制。基于以上假说,我们构建了一个含有D737V点突变位点的突变型HBV质粒,检测HBV病毒颗粒的DNA的表达水平。结果可见,突变型HBV病毒颗粒的DNA表达不受ATA抑制,HBcAg的表达也无明显变化,野生型HBV病毒颗粒的DNA表达水平显着下降。证实了 ATA能够通过抑制DNA聚合酶的RNase H活性发挥对HBV的抑制作用。提取HBV总RNA检测其转录水平可知,ATA对突变病毒转录本的表达没有作用。说明ATA通过干扰病毒Pol RNase H活性和暂停HBV RNA/DNA杂交过程的来抑制HBV复制,不抑制病毒转录。最后,为了明确ATA对YIDD,YVDD突变的耐药型HBV复制的影响,采用YIDD、YVDD和YMDD三种不同基因型HBV表达质粒转染细胞,经LAM或ATA处理后检测细胞内HBV基因组DNA以及HBcAg的表达情况。结果发现,ATA和LAM均能显着抑制野生型HBV DNA的表达,而ATA还可显着降低YIDD和YVDD突变的病毒DNA的表达。而HBcAg的表达在各组未见差异。由此可见,ATA对LAM耐药的HBV突变体的复制也具有一定抑制作用。因此,本研究成果为治疗乙型肝炎的新型抗病毒分子的研发提供了全新的研究思路和新策略,ATA有望作为一种对抗耐药性HBV的新型化合物药物在未来应用于乙肝的临床治疗。结论:1.IFN-α和TGF-β1能够抑制HBV复制并诱发HBV基因组超突变,上调肝脏细胞APOBECs的表达,从而诱导HBV基因组发生超突变。这种由IFN-α和TGF-β1诱导的HBV基因突变能被UNG部分修复。2.APOBEC3G能够引发野生型HBV产生YIDD基因突变,而IFN-α和LAM联合使用会诱发LAM耐药型HBV突变的不断累积。3.本研究首次发现ATA能通过抑制HBV Pol RNase H活性来抑制HBV复制,并且不影响HBV的转录。ATA对LAM耐药型HBV的复制具有抑制作用。
付志鹏,康东伟,刘新泳,展鹏[9]（2020）在《基于靶标的抗艾滋病药物研究新进展》文中指出如何克服药物的耐药性和降低不良反应一直是抗艾滋病药物研究的重要任务。随着结构生物学和药物筛选技术的快速发展,抗艾滋病的新靶标及其抑制剂被不断发现,增加了治愈艾滋病的希望。通过综述近几年的相关研究,从新药研发的角度总结基于靶标的抗艾滋病药物最新研究进展,以期为抗艾滋病药物研发提供参考。
孙崧凯[10]（2020）在《基于前药策略的2-巯基苯甲酰胺硫酯类HIV-1 NCp7抑制剂的设计、合成及活性评价》文中研究指明艾滋病（AIDS）是主要由1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）引起的恶性传染性疾病。目前,联合抗逆转录病毒疗法（cART）是治疗艾滋病的最有效方法。然而,HIV-1基因组具有高度的变异性,耐药突变株的出现限制了 cART的功效。因此,研发具有新结构、新机制的HIV-1抑制剂非常必要。HIV-1核衣壳蛋白7（NCp7）是由55个氨基酸残基组成的短肽,并具有2个锌指中心结构域。NCp7在HIV-1逆转录和整合的过程中发挥至关重要的作用,NCp7的结构发生改变或因药物作用发生交联,HIV-1复制周期就会受到影响,致使不完整的病毒出芽,释放出低感染力或无感染力的病毒。通过对NCp7的核苷酸序列进行突变试验,结果证明NCp7具有高度的保守性,任意氨基酸的改变都将使其失活。因此,针对NCp7的抑制剂不易由于HIV-1的基因突变而产生耐药性。所以NCp7成为近年来抗艾滋病药物研究备受关注的新靶点之一。基于NCp7在HIV-1生命周期中的作用机制以及其空间结构特征,目前已有大量针对该靶点抑制剂被报道。根据作用机制的不同主要分两种:（1）基于干扰NCp7与核酸结合的抑制剂;（2）基于锌离子“逐出”机制的抑制剂。其中基于锌离子“逐出”机制的抑制剂S-酰基-2-巯基苯甲酰胺硫酯（SAMT）可以通过亲核作用使NCp7的锌指结构发生改变并逐出锌离子,使NCp7失活。在发挥作用之后,SAMT转化得到2-巯基苯甲酰胺硫酯（MT）,MT在细胞内乙酰辅酶A的作用下,乙酰化得到SAMT再次发挥作用。通过循环往复利用,提高了药物的半衰期,减少了使用量,因此SAMT与MT是具有良好前景的先导化合物。然而,与大多数用于治疗HIV-1感染的药物相比,SAMT和MT的抗HIV-1活性相对较弱。同时SAMT中的硫酯键极易水解,很难配制成治疗产品,因此,通常针对抑制剂MT进行修饰。但由于MT结构中存在巯基,使其具有极性较大、跨膜性差、容易被氧化、毒性较大等缺陷,因此使用前药修饰策略来改善其存在的缺陷、提高其抗病毒活性是当前研究的热点。前药修饰策略在抗病毒药物研究领域有着广泛的应用,通过前药修饰可以克服先导化合物在吸收、分布、代谢、排泄以及毒性（ADMET）上的不足,提高成药性。除此之外,双靶点前药还可以使所得化合物兼具两种母体药物的优势,发挥“1+1=2,甚至>2”的功效,是发现抗耐药性抗病毒药物的重要策略。本论文围绕改善NCp7抑制剂MT抗HIV-1活性不佳、存在巯基使其成药性较差的科学问题,利用前药策略对其进行修饰,主要分为以下两部分:第一部分:MT与逆转录酶抑制剂双靶点前药的设计、合成及活性评价HIV-1逆转录酶（RT）在病毒生命周期中起着至关重要的作用,且人体内没有其同源酶,因此成为抗艾滋病药物研究的重要靶点之一。目前,美国FDA共批准14个逆转录酶抑制剂（化学实体）上市用于艾滋病的治疗,根据作用机理的不同分为核苷（酸）类逆转录酶抑制剂（NRTIs/NtRTIs）和非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）。逆转录酶抑制剂具有高效、低毒可与其他药物联用的特性,在cART疗法中占据十分重要的地位。但由于HIV-1具有高度变异性,在逆转录酶抑制剂药物选择压力下,极容易产生基因突变而产生（交叉）耐药性。因此,研发具有高效抗耐药性的HIV-1抑制剂依然十分必要。与之相反,NCp7具有高度的保守性,针对NCp7的抑制剂不易由于HIV-1基因突变产生耐药性。又因为NCp7在发挥生物学功能时常与逆转录酶形成蛋白复合物,因此本部分研究基于双靶点前药的修饰策略,选取具有高选择性和耐药性的NCp7抑制剂——2-巯基苯甲酰胺硫酯（MT）,通过在体内可以自发水解的酯键与逆转录酶抑制剂相连,设计合成两类双靶点前药。期望所设计的目标化合物能兼具两种母体药物的优势,既具有优秀的抗HIV-1野生株活性也具有优秀的抗耐药性。根据已上市的逆转录酶抑制剂的种类,本部分设计合成了两大类MT双前药化合物,即:与NRTI的双靶点前药（5个）、与NNRTI的双靶点前药（6个）。并且对目标化合物进行了不同细胞系中不同HIV病毒株的细胞水平活性测试,进而选取代表化合物进行了血浆稳定性代谢测试。结果表明:通过双靶点前药修饰,MT与NRTI的双靶点前药所有目标化合物的抗HIV活性相对于母体药物MT均有大幅度提高,并且linker长度越长或分支数越少的化合物表现出更强的抗病毒活性。该系列化合物中SSK1-3在MT4细胞系和TZM-b1细胞系中均表现出最佳的抗HIV活性,其抑制HIV-1不同毒株的 EC50值分别为 0.042μM（ⅢB）、1.329 μM（RES056）和 0.308 μM（NL4-3）,分别是母体药物MT的125倍、6倍和8倍。SSK1-3血浆稳定性测试结果表明:其在血浆中代谢比较充分,母药MT的释放成良好的线性,具有前药特性。但是其在血浆中代谢速度过快,10分钟之内几乎完全降解,可能会影响其到达靶细胞发挥作用,还需要针对其血浆稳定性进行进一步的修饰。MT与NNRTI双靶点前药的活性测试正在进行中。第二部分:基于智能化降解的MT二硫键前药的设计、合成及活性评价二硫键（S-S键）是一种重要的化学官能团,主要存在于各类天然小分子化合物和生物体蛋白质结构中。二硫键在体内可以被广泛存在于体液和细胞质中的谷胱甘肽（GSH）还原断裂,且细胞内GSH的浓度是血浆中的2000-4000倍,因此含有二硫键的药物通常在血浆中较为稳定,而进入细胞后在较高GSH浓度下发生还原裂解。针对MT酯键前药存在的血浆稳定性不佳的问题,我们基于二硫键独特的氧化还原特性,设计合成了一系列MT二硫键前药,期望该系列化合物能在血浆中稳定存在,而进入细胞后裂解释放出母体药物发挥抗病毒作用。同时对于MT的巯基进行修饰,改善因其存在巯基而使化合物具有成药性不佳的缺陷。本部分研究,我们共设计合成了 7个MT二硫键前药并对其进行了细胞水平的抗病毒活性测试,同时选取代表化合物进行了血浆稳定性和GSH代谢稳定性测试。实验结果表明:通过二硫键前药修饰,新合成的大部分目标化合物对HIV-1野生（ⅢB）毒株、HIV-2（ROD）毒株的抑制活性均高于母体药物MT。其中SSK 2-3抑制HIV-1野生株的活性最佳（EC50=2.38 μM）,优于先导化合物MT（EC50=5.52μM）2.3倍,SSK2-2对于HIV-2毒株表现出最佳的抑制活性（EC50=1.27μM）,是先导化合物MT（EC50=5.37μM）4.2倍。但是,二硫键前药系列化合物的细胞毒性和选择性指数与母体药物MT相比结果较差,仍需进一步修饰改善。我们选取该系列代表化合物SSK 2-3研究其血浆稳定性及GSH稳定性。结果表明:SSK2-3在血浆中稳定存在,120分钟内几乎不分解;而在人体细胞GSH浓度下（5 mM）,SSK2-3能快速发生代谢降解,降解的半衰期为19.2分钟,且在60分钟内几乎分解释放出原药发挥作用,体现出二硫键前药智能化降解的优势。总之,本文以2-巯基苯甲酰胺硫酯（MT）为先导化合物,基于前药设计策略,先后设计合成了两个系列共计18个MT前药。生物学评价结果显示,多种化合物具有较高的HIV抑制活性,明显优于MT,可作为先导化合物供进一步研究。同时,本论文获得的初步构效关系及成药性数据为下一步结构优化提供了有价值的信息。
二、逆转录病毒产生耐药性的新机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、逆转录病毒产生耐药性的新机制（论文提纲范文）
（3）海洋候选药物PA/GPA抗肾癌机制和早期ADMET研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 PA类抗肾癌活性候选药物筛选及肾癌靶点挖掘 |
| 第一章 PA类抗肾癌活性候选药物筛选 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 溶液配制 |
| 2 PAs化合物的结构 |
| 3 PAs化合物的肾癌细胞增殖抑制活性 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 细胞给药 |
| 3.3 PA/GPA抗肾癌增殖活性优于索拉菲尼 |
| 4 PA和GPA的理化性质分析 |
| 5 小结与讨论 |
| 第二章 多组学挖掘PA/GPA抗肾癌作用新靶点 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 转录组学挖掘PA抗肾癌靶点 |
| 2.1 样品准备 |
| 2.2 转录组文库构建、质检和上机测序 |
| 2.3 差异表达基因显着性分析 |
| 3 定性蛋白质组学筛选PA相互作用新靶标 |
| 3.1 实验路线及操作方案 |
| 3.2 液-质连用(HPLC-MS/MS)分析与小分子PA结合的蛋白质成分 |
| 4 WGCNA分析发现PRDX1/4与PA所影响基因处于同一表达模式 |
| 5 RT-qPCR验证PA/GPA对PRDX1的影响 |
| 5.1 样品制备 |
| 5.2 数据处理及显着性标准 |
| 5.3 RT-qPCR结果分析 |
| 6 临床人肾透明细胞癌组织与癌旁组织PRDX1表达情况 |
| 6.1 样品准备 |
| 6.2 临床人肾透明细胞癌组织中PRDX1低表达 |
| 7 MTT法检测PA/GPA对shPRDX1敲低ACHN细胞增殖抑制率 |
| 7.1 慢病毒转染 |
| 7.2 MTT法检测PA/GPA对shPRDX1敲低ACHN细胞的增殖抑制率 |
| 8 小结与讨论 |
| 第三章 PA/GPA直接结合PRDX1诱导肾癌细胞凋亡 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 激光全息细胞成像系统检测PA诱导ACHN细胞凋亡 |
| 2.1 样品准备 |
| 2.2 结果 |
| 3 PA/GPA降低ACHN细胞ROS水平 |
| 3.1 PA降低ACHN肾癌细胞ROS水平 |
| 3.2 PRDX1敲低后PA/GPA降ROS作用消失 |
| 4 PA/GPA通过抑制PRDX1的Tyr194磷酸化增加过氧化物酶活性 |
| 5 PA/GPA促使PRDX1入核增加 |
| 5.1 样品准备 |
| 5.2 结果 |
| 6 表面等离子共振实验证明PA/GPA与PRDX1蛋白结合 |
| 6.1 配体预富集、蛋白偶联及样品进样 |
| 6.2 结果 |
| 7 PA/GPA作用于PRDX1二聚体结合界面 |
| 8 小结与讨论 |
| 第四章 PA/GPA对ACHN荷瘤裸鼠成瘤能力的影响 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 人肾癌裸鼠移植瘤模型建立及给药方案设计 |
| 2.1 人肾癌裸鼠移植瘤模型的建立 |
| 2.2 实验设计与分组 |
| 2.3 数据处理及显着性标准 |
| 3 荷瘤小鼠体重、肿瘤体积、重量及免疫组化检测 |
| 4 PA/GPA下调PRDX1抑制荷瘤小鼠肿瘤生长 |
| 5 PA/GPA诱发荷瘤裸鼠肝毒性 |
| 6 小结与讨论 |
| 第二部分 PA/GPA肝毒性机制研究 |
| 第五章 PA/GPA毒性机制挖掘 |
| 1 试剂和仪器 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 TMT标记定量蛋白质组学差异表达蛋白鉴定 |
| 2.1 样品准备 |
| 2.2 差异表达蛋白鉴定与KEGG通路富集 |
| 3 转录组学与定量蛋白质组学关联研究PA/GPA肝毒性靶点 |
| 3.1 差异靶基因的挖掘 |
| 3.2 差异靶基因的肝肾组织分布 |
| 3.3 PA/GPA对HepG2细胞胆固醇代谢靶基因表达的影响 |
| 4 PA/GPA的线粒体毒性 |
| 4.1 样品准备 |
| 4.2 PA/GPA对HepG2细胞线粒体膜电位的影响 |
| 5 PA/GPA增加HepG2细胞对低密度脂蛋白的摄取 |
| 5.1 样品准备 |
| 5.2 PA/GPA对HepG2细胞摄取LDL能力的影响 |
| 6 PA/GPA加剧高胆固醇诱导的小鼠肝损伤 |
| 6.1 实验动物 |
| 6.2 总体实验设计与分组 |
| 6.3 数据处理与显着性标准 |
| 6.4 小鼠肝脏形态学和生化指标 |
| 7 LXRα的激活是PA/GPA产生肝毒性的必要条件 |
| 8 PA/GPA延缓肝脏胆固醇代谢 |
| 9 PA/GPA对胆汁酸代谢信号通路Cyp7a1基因具有抑制作用 |
| 10 PA/GPA通过抑制LXRα调控CYP7A1的表达 |
| 10.1 siLXRα敲低HepG2细胞株的构建 |
| 10.2 PA/GPA通过抑制LXRα下调CYP7A1的表达 |
| 11 小结与讨论 |
| 第六章 PA/GPA与LXRα蛋白体外结合能力探讨 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 薛定谔Maestro v11.1对PA/GPA-LXRα进行计算机模拟分子对接 |
| 3 SPR实验证明PA与LXRα蛋白直接结合 |
| 3.1 配体预富集、蛋白偶联及样品进样 |
| 3.2 PA能在体外与LXRα蛋白直接结合 |
| 4 粉蝶霉素类化合物与LXRα毒效关系探讨 |
| 5 小结与讨论 |
| 第七章 PA/GPA早期ADME研究 |
| 1 材料与仪器 |
| 1.1 主要材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 2 PA/GPA的吸收与分布 |
| 2.1 动物准备 |
| 2.2 总体实验设计与分组 |
| 2.3 高分辨质谱、UPLC、UPLC-MS/MS鉴定方法 |
| 2.4 样品的处理和进样 |
| 2.5 PA/GPA在小鼠体内的药时曲线和肝组织含量 |
| 3 PA的代谢 |
| 3.1 PA在人肝微粒体中的CYP代谢 |
| 3.2 PA在人肝微粒体中的UGT代谢 |
| 4 小结与讨论 |
| 第八章总结与展望 |
| 1 总结 |
| 2 本论文的创新之处 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间的成果 |
| 致谢 |
（4）槲皮素通过靶向人抗原蛋白R抑制肝癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 中药单体槲皮素抑制肝癌细胞增殖转移的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 实验细胞系 |
| 2. 实验动物 |
| 3. 实验试剂及实验仪器 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. 细胞药物处理 |
| 3. 细胞增殖实验 |
| 4. 细胞迁移和侵袭实验 |
| 5. 细胞凋亡实验 |
| 6. 裸鼠荷瘤及给药模型的构建 |
| 7. 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1. 槲皮素可以抑制HCC细胞的增殖 |
| 2. 槲皮素可以诱导HCC细胞的凋亡 |
| 3. 槲皮素可以抑制HCC细胞的侵袭及转移 |
| 4. 槲皮素可以抑制体内HCC的生长 |
| 三、分析与讨论 |
| (一)中药治疗HCC的认识及发展 |
| 1. 中医对肝癌的认识 |
| 2. 肝癌的中医病因学研究 |
| 3. 肝癌的中医治疗思想 |
| 4. 肝癌常用的治疗方剂与中药 |
| 5. 中药可改善HCC患者症状及预后 |
| 6. 中药可改善化疗药物的副反应 |
| 7. 中药治疗HCC的分子机制 |
| 8. 中医治疗HCC的挑战 |
| (二) 槲皮素的肝脏保护作用和抗肿瘤机制研究 |
| 1. 槲皮素广泛存在于抗肿瘤中药且安全低毒 |
| 2. 槲皮素对肝脏具有多重保护作用 |
| 3. 槲皮素治疗HCC的机制 |
| 四、小结 |
| 第二部分 槲皮素靶向人抗原蛋白HuR调控LINC01123治疗肝癌的机制研究 |
| 第一章 长链非编码RNA LINC01123通过调节miR-34a-5p/TUFT1轴促进肝癌细胞的增殖和侵袭 |
| 一、材料与方法 |
| (一)实验材料 |
| (二)实验方法 |
| 1. 临床样本的收集分析 |
| 2. 细胞转染 |
| 3. 组织或细胞的RNA提取 |
| 4. 荧光定量PCR |
| 5. 细胞增殖实验 |
| 6. 细胞迁移和侵袭实验 |
| 7. 蛋白样品制备及免疫印迹实验 |
| 8. 双荧光素酶报告基因检测系统实验 |
| 9. RNA免疫共沉淀分析 |
| 10. 裸鼠荷瘤模型的构建 |
| 11. 生物信息学分析 |
| 12. 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1. LINC01123在HCC组织中表达上调,与患者的预后不良相关 |
| 2. LINC01123促进HCC细胞增殖和侵袭 |
| 3. LINC01123沉默抑制了体内HCC的生长 |
| 4. LINC01123通过海绵吸附作用,靶向结合miR-34a-5p |
| 5. LINC01123可通过miR-34a-5p/TUFT1轴促进HCC进展 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 第二章 HuR可增加LINC01123的稳定性并促进其表达 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 生物信息学分析 |
| 2. 细胞转染 |
| 3. HuR敲低的细胞系中LINC01123半衰期的测定 |
| 4. RNA免疫共沉淀分析 |
| 5. 细胞RNA的提取 |
| 6. 荧光定量PCR |
| 7. 蛋白样品制备及免疫印迹实验 |
| 8. 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1. HuR在HCC组织中高表达,与LINC01123的表达量呈正相关关系 |
| 2. LINC01123与HuR存在潜在的结合可能 |
| 3. HuR能增加LINC01123的稳定性,并单向促进LINC01123的表达 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 第三章 槲皮素靶向HuR作用于LINC01123抑制HCC的增殖与转移 |
| 一、材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 生物信息学分析 |
| 2. 细胞药物处理 |
| 3. 细胞RNA的提取 |
| 4. 荧光定量PCR |
| 5. 细胞增殖实验 |
| 6. 细胞迁移及侵袭实验 |
| 7. 细胞凋亡实验 |
| 8. 蛋白样品制备及免疫印迹实验 |
| 9. 统计分析 |
| 二、结果 |
| 1. HuR是槲皮素的潜在作用靶点 |
| 2. 槲皮素通过靶向HuR下调LINC01123的表达并抑制HCC的进展 |
| 三、分析与讨论 |
| 四、小结 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 学术成果 |
| 致谢 |
| 文献综述 人抗原蛋白R与肿瘤耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）新型HIV-1衣壳蛋白抑制剂和RNase H抑制剂的设计、合成与生物活性评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 艾滋病与HIV病毒 |
| 一、艾滋病及其流行现状 |
| 二、HIV-1病毒结构 |
| 三、HIV-1生命周期 |
| 四、抗艾滋病化学治疗 |
| 第二节 HIV-1衣壳蛋白:抗病毒药物研究新靶标 |
| 一、HIV-1衣壳蛋白的结构和功能 |
| 二、HIV-1衣壳蛋白抑制剂研究进展 |
| 三、HIV-1 CA六聚体相邻亚基NTD-CTD界面:作为药物设计新靶标的优势 |
| 第三节 HIV-1 RNase H:抗病毒药物研究新靶标 |
| 一、HIV-1 RNase H的结构和功能 |
| 二、HIV-1 RNase H抑制剂研究进展 |
| 第四节 抗病毒先导化合物的发现和结构优化策略 |
| 一、先导化合物发现策略 |
| 二、先导化合物优化策略 |
| 第五节 本章小结 |
| 第二章 含三氮唑的苯丙氨酸类HIV-1衣壳蛋白抑制剂的设计、合成与活性评价 |
| 第一节 目标化合物的设计 |
| 第二节 目标化合物的合成 |
| 一、仪器与试剂 |
| 二、目标化合物的合成路线 |
| 三、目标化合物的合成步骤 |
| 四、合成实验讨论 |
| 第三节 目标化合物的活性评价 |
| 一、体外抗HIV-1活性实验 |
| 二、化合物与HIV-1衣壳蛋白相互作用研究 |
| 三、化合物抗HIV-1作用阶段确证实验 |
| 四、衣壳蛋白(p24)含量测定实验 |
| 五、体外衣壳蛋白装配实验 |
| 第四节 化合物在体外人肝微粒体和人血浆代谢稳定性评价 |
| 一、化合物在人肝微粒体中的代谢稳定性研究 |
| 二、化合物在人血浆中的代谢稳定性研究 |
| 第五节 分子动力学模拟研究 |
| 第六节 本章小结 |
| 第三章 含苯磺酰胺的苯丙氨酸类HIV-1衣壳蛋白抑制剂的设计、合成与活性评价 |
| 第一节 目标化合物的设计 |
| 第二节 目标化合物的合成 |
| 一、仪器与试剂 |
| 二、目标化合物的合成路线 |
| 三、目标化合物的合成步骤 |
| 四、合成实验讨论 |
| 第三节 目标化合物的活性评价 |
| 一、体外抗HIV活性实验 |
| 二、化合物与HIV-1衣壳蛋白相互作用研究 |
| 三、化合物抗HIV-1作用阶段确证实验 |
| 四、衣壳蛋白(p24)含量测定实验 |
| 五、体外衣壳蛋白装配实验 |
| 六、体外逆转录酶抑制实验 |
| 第四节 分子动力学模拟与蛋白共晶结构研究 |
| 一、IIA-3k和IIB-2a的分子动力学研究 |
| 二、IIC-31与HIV-1 CA初步的共晶结构研究 |
| 第五节 IIC-31的初步成药性评价 |
| 一、体外人肝微粒体和人血浆稳定性实验 |
| 二、急性毒性实验 |
| 三、临床前药代动力学实验 |
| 第六节 本章小结 |
| 第四章 香豆素酰胺类抗HIV-1 RNase H先导化合物的发现 |
| 第一节 表型筛选发现香豆素酰胺类HIV-1 RNase H抑制剂 |
| 一、抗HIV活性筛选 |
| 二、初步作用机制研究 |
| 第二节 新型香豆素酰胺类HIV-1 RNase H抑制剂的设计 |
| 第三节 目标化合物的合成 |
| 一、仪器与试剂 |
| 二、目标化合物的合成路线 |
| 三、目标化合物的合成步骤 |
| 第四节 目标化合物的生物活性评价 |
| 一、体外抗HIV活性实验 |
| 二、RNaseH抑制实验 |
| 第五节 分子模拟研究 |
| 第六节 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 第一节 总结 |
| 一、基于结构的新型HIV-1衣壳蛋白抑制剂的设计、合成与活性评价 |
| 二、表型筛选发现香豆素酰胺类HIV-1 RNase H苗头化合物及其结构优化 |
| 三、本论文创新点 |
| 四、本论文不足之处 |
| 第二节 展望 |
| 一、对本课题的进一步研究思路 |
| 二、新一代抗艾滋病药物的研究趋势 |
| 参考文献 |
| 附录-部分代表性化合物谱图 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间科研及奖励情况 |
| 附件 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）基于优势骨架的新型HIV-1/HBV RNase H抑制剂的设计、合成及活性评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 第一节 艾滋病及其治疗现状 |
| 1. 艾滋病流行现状 |
| 2. HIV-1结构及其生命周期 |
| 3. HIV-1抑制剂研究进展 |
| 第二节 乙肝及其治疗现状 |
| 1. 乙肝流行现状 |
| 2. HBV结构及其生命周期 |
| 3. HBV抑制剂研究进展 |
| 第三节 HIV-1/HBV RNase H及其抑制剂 |
| 1. RNase H的结构和功能 |
| 1.1 HIV/HBV RNase H功能 |
| 1.2 RNase H催化部位及作用机理 |
| 2. HIV-1 RNase H抑制剂研究进展 |
| 3. HBV RNase H抑制剂研究进展 |
| 第二章 新型多酚类及羟基喹唑啉类HIV-1 RNase H抑制剂的设计、合成与活性评价 |
| 第一节 新型多酚类“Y”型HIV-1 RNase H抑制剂的设计、合成与活性评价 |
| 1. 目标化合物的设计 |
| 2. 目标化合物的合成及讨论 |
| 2.1 仪器和试剂 |
| 2.2 目标化合物的合成路线 |
| 2.3 目标化合物的合成步骤 |
| 2.4 合成实验讨论 |
| 3. 目标化合物的活性评价及结果讨论 |
| 3.1 HIV-1 RNase H活性测试 |
| 3.1.1 测试原理 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 结果与讨论 |
| 3.2 体外细胞活性测试 |
| 3.2.1 测试原理 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.4 结果与讨论 |
| 3.3 代表化合物细胞单向渗透性实验 |
| 4. 分子模拟研究 |
| 第二节 新型羟基喹唑啉类HIV-1 RNase H抑制剂的设计、合成与活性评价 |
| 1. 目标化合物的设计 |
| 2. 目标化合物的合成 |
| 2.1 仪器和试剂 |
| 2.2 目标化合物的合成路线 |
| 2.3 目标化合物的合成步骤 |
| 2.4 合成实验讨论及代表化合物波谱解析 |
| 3. 目标化合物的活性评价及结果讨论 |
| 第三章 新型吡啶骈嘧啶酮类HBV RNase H抑制剂的设计、合成及活性评价 |
| 第一节 目标化合物的设计 |
| 第二节 目标化合物的合成及讨论 |
| 1. 仪器和试剂 |
| 2. 目标化合物合成路线 |
| 3. 目标化合物的合成步骤 |
| 4. 合成实验讨论 |
| 第三节 目标化合物体外HBV活性评价 |
| 1. 测试原理 |
| 2. 实验材料 |
| 3. 测试方法 |
| 4. 结果与讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 第一节 总结 |
| 第二节 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间科研及奖励情况 |
| 附录一: 部分化合物的MS、~1H NM和~(13)C NMR图谱 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）靶向于病毒衣壳蛋白以及逆转录酶的抗病毒先导化合物的发现（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 第一节 HIV-1及其抑制剂 |
| 一、HIV-1的结构 |
| 二、HIV-1的生命周期 |
| 三、临床应用的抗艾滋病药物 |
| 第二节 HBV及其抑制剂 |
| 一、HBV的结构 |
| 二、HBV的生命周期 |
| 三、临床应用的抗HBV药物 |
| 第三节 前药策略 |
| 一、前药的基本概念 |
| 二、前药设计的原则和方法 |
| 三、前药策略的应用 |
| 第四节 本章小结 |
| 第二章 HBV衣壳蛋白抑制剂NVR 3-778前药的设计、合成以及初步成药性评价 |
| 第一节 HBV衣壳蛋白及其抑制剂 |
| 一、HBV衣壳蛋白的结构和功能 |
| 二、HBV衣壳蛋白抑制剂的研究进展 |
| 第二节 NVR 3-778前药的设计 |
| 第三节、目标化合物的合成 |
| 一、仪器与试剂 |
| 二、目标化合物的合成路线与实验步骤 |
| 第三节 NVR 3-778前药的体外抗HBV活性评价 |
| 一、抗HBV活性测试原理和方法 |
| 二、活性结果与讨论 |
| 第五节 NVR 3-778前药的水溶性测试 |
| 一、水溶性测试方法 |
| 二、实验结果与讨论 |
| 第六节 NVR 3-778前药的血浆及全血稳定性测试 |
| 一、血浆及全血稳定性测试方法 |
| 二、实验结果与讨论 |
| 第七节 NVR 3-778前药的药代动力学实验 |
| 一、大鼠药代动力学实验方法 |
| 二、实验结果与讨论 |
| 第八节 本章小结 |
| 第三章 靶向可容纳区域I的新型HIV-1 NNRTIs的发现 |
| 第一节 HIV-1逆转录酶及NNRTIs |
| 一、HIV-1逆转录酶的结构和功能 |
| 二、NNRTIs的研究进展 |
| 第二节 目标化合物的设计 |
| 第三节 目标化合物的合成 |
| 一、仪器与试剂 |
| 二、目标化合物的合成路线与实验步骤 |
| 第四节 目标化合物抗HIV-1活性评价(细胞水平) |
| 一、抗HIV-1活性测试原理和方法 |
| 二、活性结果与讨论 |
| 第五节 HIV-1逆转录酶活性抑制测试 |
| 一、酶活测试原理及方法 |
| 二、活性结果与讨论 |
| 第六节 代表性化合物的分子动力学模拟研究 |
| 第七节 代表性化合物的初步成药性评价 |
| 第八节 本章小结 |
| 第四章 新型HIV-1衣壳蛋白抑制剂的设计、合成以及生物活性评价 |
| 第一节 HIV-1衣壳蛋白及其抑制剂 |
| 一、HIV-1衣壳蛋白结构和功能 |
| 二、HIV-1衣壳蛋白抑制剂研究现状 |
| 第二节 目标化合物的设计 |
| 第三节 目标化合物的合成 |
| 一、仪器与试剂 |
| 二、目标化合物的合成路线与实验步骤 |
| 第四节 目标化合物抗HIV-1活性评价(细胞水平) |
| 一、抗HIV-1活性测试原理和方法 |
| 二、活性结果与讨论 |
| 第五节 代表性化合物与衣壳蛋白的相互作用研究 |
| 一、测试原理与实验步骤 |
| 二、实验结果与讨论 |
| 第六节 代表性化合物的分子动力学模拟研究 |
| 第七节 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 第一节 总结 |
| 一、靶向于病毒衣壳蛋白以及逆转录酶的抗病毒先导化合物的发现 |
| 二、本论文的不足之处 |
| 第二节 展望 |
| 附录 |
| 附录一、分子动力学模拟实验方法 |
| 附录二、代表性化合物的ESI-MS、~1H-NMR及~(13)C-NMR谱图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文及获奖情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）ATA通过抑制HBV RNase H活性抑制耐药型HBV复制的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 APOBECs诱导HBV基因突变分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 Differential DNA Denaturation PCR(3D-PCR)试验 |
| 2.2.3 细胞转染 |
| 2.2.4 病毒基因组 DNA(genome DNA,gDNA)提取 |
| 2.2.5 蛋白提取 |
| 2.2.6 天然琼脂糖凝胶电泳(Native Agarose Gel Electrophoresis Assay,NAGE)试验 |
| 2.2.7 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.8 实时荧光定量 PCR(Realtime-Quantitative PCR,RT-qPCR)和逆转录 PCR试验 |
| 2.2.9 蛋白免疫印迹(Western Blot)分析 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 探究3D-PCR技术在富集的HBV基因突变中的作用 |
| 3.2 干扰素α和细胞因子TGF-β1 通过诱发HBV DNA超突变抑制HBV复制 |
| 3.3 IFN-α和TGF-β1诱导肝细胞中APOBECs家族的表达 |
| 3.4 APOBECs家族抑制HBV复制 |
| 3.5 UNG抑制APOBECs对 HBV超突变 |
| 3.6 UNG修复 IFN-α和细胞因子 TGF-β1 诱导的 HBV 超突变 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 干扰素和拉米夫定联用诱导HBV产生耐药性基因突变的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 细胞培养和转染 |
| 2.2.2 HBV病毒感染 |
| 2.2.3 Differential DNA Denaturation PCR(3D-PCR)试验 |
| 2.2.4 病毒基因组DNA(genome DNA,gDNA)提取 |
| 2.2.5 天然琼脂糖凝胶电泳(Native Agarose Gel Electrophoresis Assay,NAGE)试验 |
| 2.2.6 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.7 蛋白免疫印迹(Western Blot)分析 |
| 2.2.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 IFN-α诱导侵染性HBV的超突变 |
| 3.2 拉米夫定药物不诱导HBV超突变 |
| 3.3 APOBEC3G可诱导HBV产生YIDD突变 |
| 3.4 联用 IFN-α和 LAM 也能够定向诱导并累计 YIDD 突变 |
| 3.5 联用 IFN-α和 LAM 能够定向诱导 YIDD 突变模式 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 ATA抑制HBV复制的机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 细胞转染 |
| 2.2.3 HBV病毒感染 |
| 2.2.4 天然琼脂糖凝胶电泳(Native Agarose Gel Electrophoresis,NAGE)试验 |
| 2.2.5 荧光素酶活性的检测 |
| 2.2.6 Total RNA提取 |
| 2.2.7 病毒基因组 DNA(genome DNA,gDNA)提取 |
| 2.2.8 实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)和逆转录 PCR |
| 2.2.9 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.2.10 蛋白免疫印迹(Western Blot)分析 |
| 2.2.11 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ATA抑制HBV的复制 |
| 3.2 ATA抑制HBV聚合酶的RNase H活性 |
| 3.3 ATA抑制耐药突变型HBV的复制 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究的创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 抗乙型肝炎病毒药物及耐药机制概述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）基于靶标的抗艾滋病药物研究新进展（论文提纲范文）
| 1 HIV-1侵入抑制剂 |
| 2 HIV-1逆转录酶抑制剂 |
| 2.1 核苷（酸）类HIV-1逆转录酶抑制剂 |
| 2.2 非核苷（酸）类HIV-1逆转录酶抑制剂 |
| 2.2.1 二芳基嘧啶类衍生物NNRTIs |
| 2.2.2 吲哚芳基砜类衍生物NNRTIs |
| 2.2.3 二氢烷氧基苯基氧代嘧啶类NNRTIs 2019年， |
| 2.3 靶向核糖核酸酶H的逆转录酶抑制剂 |
| 3 HIV-1整合酶抑制剂 |
| 4 蛋白酶抑制剂 |
| 4.1 拟肽类HIV-1蛋白酶抑制剂 |
| 4.1.1 Darunavir类似物 |
| 4.1.2 其他多肽类似物 |
| 4.2 Atazanavir的药物设计 |
| 5 针对其他靶点的HIV抑制剂 |
| 5.1 HIV-1核衣壳蛋白抑制剂 |
| 5.2 HIV衣壳蛋白抑制剂 |
| 6 HIV潜伏激活剂 |
| 7 老靶标，新机制 |
| 8 结语与展望 |
（10）基于前药策略的2-巯基苯甲酰胺硫酯类HIV-1 NCp7抑制剂的设计、合成及活性评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 第一节 HIV-1及其抑制剂 |
| 1. HIV-1的结构 |
| 2. HIV-1的生命周期 |
| 3. HIV-1抑制剂研究进展 |
| 第二节 HIV-1 NCp7及其抑制剂 |
| 1. HIV-1 NCp7的结构 |
| 2. HIV-1 NCp7的功能 |
| 3. HIV-1 NCp7抑制剂的研究进展 |
| 第三节 前药及其在抗病毒领域的应用 |
| 1. 前药的概念 |
| 2. 前药在抗病毒领域的应用 |
| 第二章 HIV-1 NCp7抑制剂2-巯基苯甲酰胺硫酯与逆转录酶抑制剂双靶点前药的设计、合成及活性评价 |
| 第一节 目标化合物的设计 |
| 1. HIV-1逆转录酶及其抑制剂 |
| 2. MT与NRTI的双靶点前药的设计 |
| 3. MT与NNRTI的双靶点前药的设计 |
| 第二节 目标化合物的合成 |
| 1. 仪器和试剂 |
| 2. 目标化合物的合成路线 |
| 3. 目标化合物的合成步骤 |
| 第三节 目标化合物抗HIV活性测试 |
| 1. 活性测试方法 |
| 2. 活性结果与分析 |
| 第四节 代表化合物的血浆稳定性测试 |
| 1. 人体血浆中代谢稳定性的测试方法 |
| 2. 实验结果与分析 |
| 第五节 本章小结 |
| 第三章 基于二硫键降解机制的2-巯基苯甲酰胺硫酯前药的设计、合成及活性评价 |
| 第一节 目标化合物的设计 |
| 第二节 目标化合物的合成 |
| 1. 仪器和试剂 |
| 2. 目标化合物的合成路线 |
| 3. 目标化合物的合成步骤 |
| 第三节 目标化合物抗HIV活性测试 |
| 1. 活性测试方法 |
| 2. 活性结果与分析 |
| 第四节 代表化合物血浆及GSH代谢稳定性测试 |
| 1. 人体血浆中代谢稳定性的测试方法 |
| 2. GSH代谢稳定性的测试方法 |
| 3. 实验结果与分析 |
| 第五节 本章小结 |
| 第四章 总结与展望 |
| 1. 总结 |
| 2. 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士研究生期间科研及奖励情况 |
| 附录 部分化合物MS、~1H-NMR、~(13)C-NMR图谱 |
| 附件 |
四、逆转录病毒产生耐药性的新机制（论文参考文献）
- [1]以金属离子依赖性蛋白为靶标的抗病毒药物研究进展[J]. 张丽娜,徐淑静,刘新泳,展鹏. 中国药物化学杂志, 2021(09)
- [2]以聚合酶为靶标的抗病毒药物研究进展[J]. 张莹,侯凌欣,鞠翰,刘新泳,展鹏. 中国药物化学杂志, 2021(09)
- [3]海洋候选药物PA/GPA抗肾癌机制和早期ADMET研究[D]. 梁至. 南方医科大学, 2021
- [4]槲皮素通过靶向人抗原蛋白R抑制肝癌进展的机制研究[D]. 肖遵强. 浙江中医药大学, 2021(02)
- [5]新型HIV-1衣壳蛋白抑制剂和RNase H抑制剂的设计、合成与生物活性评价[D]. 孙林. 山东大学, 2021(11)
- [6]基于优势骨架的新型HIV-1/HBV RNase H抑制剂的设计、合成及活性评价[D]. 魏粉菊. 山东大学, 2021(12)
- [7]靶向于病毒衣壳蛋白以及逆转录酶的抗病毒先导化合物的发现[D]. 姜向毅. 山东大学, 2021(12)
- [8]ATA通过抑制HBV RNase H活性抑制耐药型HBV复制的机制研究[D]. 徐盟. 中国医科大学, 2021(02)
- [9]基于靶标的抗艾滋病药物研究新进展[J]. 付志鹏,康东伟,刘新泳,展鹏. 药学进展, 2020(09)
- [10]基于前药策略的2-巯基苯甲酰胺硫酯类HIV-1 NCp7抑制剂的设计、合成及活性评价[D]. 孙崧凯. 山东大学, 2020(02)