一、白血病抑制因子受体gp190细胞内区与HL-60细胞内Cdc25B激活的关系（论文文献综述）
程凯[1]（2020）在《人白血病细胞中c-myb的远距离表达调控机制研究》文中指出c-Myb作为血细胞分化成熟过程中的重要转录因子,与髓系细胞的的分化、增殖和凋亡有关。在多种恶性肿瘤中如白血病、结直肠癌和乳腺癌等,都发现了c-Myb的异常表达。尽管对人和鼠的白血病细胞中的c-myb调控机制已经有一定深度的研究,人白血病细胞中c-myb调控的机制还不清楚。c-myb在人体和小鼠及一些哺乳动物中参与血细胞生成与成熟,对血细胞分化也起重要作用。而c-myb精细的表达调控作用还不清楚。与c-myb表达相关的调控机制及调控相关的信号通路有需要更进一步的探索研究。c-Myb的过表达与人类T细胞急性淋巴细胞白血病相关。在降低c-Myb表达的小鼠中发现了造血干细胞数量明显增加的现象。虽然在敲除c-myb后的小鼠血液中发现髓系细胞如红细胞和巨核细胞的占有比例有增长现象,但是按照绝对数值比较其数量还是呈现显着下降趋势。基于c-myb在血细胞分化成熟及白血病生成过程中的重要作用,对于人白血病细胞中c-myb调控机制的研究具有重要意义。本实验以人白血病细胞作为研究主体,探究人红白血病K562细胞、人急性髓系白血病U937细胞、人早幼粒急性白血病HL60细胞中转录因子GATA1、GATA2、CTCF、TAL1、PU.1、C/EBPβ、Rad21、c-Jun对c-myb的表达调控。首先我们用100μg/L TPA（12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯）诱导U937细胞72 h,用40μmol/L Hemin（氯高铁血红素）诱导K562细胞24 h,用2μmol/L ATR A（全反式维甲酸）诱导HL60细胞72 h。诱导后检测这些转录因子及c-myb的表达变化,发现GATA1、c-Jun、TAL1、C/EBPβ的表达与c-myb表达同时发生改变,意味着GATA1、c-Jun、TAL1、C/EBPβ可能与c-myb的表达有所关联。并用Ch I P-q PCR实验检测到K562细胞分化前后c-Jun在-34K、-88K的富集发生了明显的变化,说明转录因子c-Jun对c-myb的作用与-34K、-88K这两个c-myb上游远端增强子有关。我们克隆出GATA1基因并成功构建了p LVX-IRES-GATA1慢病毒表达质粒;同时设计了GATA1、TAL1、c-Jun、GATA2、CTCF、PU.1、Rad21转录因子的sh RNA敲降质粒并构建到p LKO.1质粒上形成p LKO.1-GATA1 sh RNA、p LKO.1-TAL1 sh RNA、p LKO.1-c-Jun sh RNA、p LKO.1-GATA2 sh RNA、p LKO.1-CTCF sh RN A、p LKO.1-Rad21 sh RNA、p LKO.1-PU.1 sh RNA质粒。我们用双荧光素酶报告系统检测了GATA1转录因子在-34Ka（我们将-34K区段划分为a、b、c三个片段形成-34Ka、-34Kb、-34Kc）及-88K区对c-myb promoter表达的影响。用293T细胞包装生产具有感染效率的慢病毒,感染K562和U937细胞,并用Western blo t和RT-q PCR检测c-myb和转录因子的表达情况。实验得出:（1）Western blo t结果显示K562细胞经过Hemin诱导后c-Jun、TAL1、C/EBPβ表达明显上升,G ATA1的表达明显下降,c-Myb表达明显下降;Ch IP-q PCR显示诱导分化后K562细胞中c-Jun结合在c-myb promoter、-34kb、-88kb区域均下降;（2）Wester n blot结果显示U937细胞经过TPA诱导后,c-Jun表达明显上升,GATA1表达明显下降,c-Myb表达明显下降;（3）Western blot结果显示HL60细胞经过AT RA诱导后C/EBPβ表达明显上升,GATA1表达明显下降,c-Myb表达明显下降;（4）RT-q PCR和Western blot结果显示成功过表达GATA1的K562细胞中,c-M yb表达也同时提高;RT-q PCR结果显示成功敲降GATA2、CTCF、PU.1、Rad21、T AL1、c-Jun的K562细胞中,c-myb表达随之下降。（5）RT-q PCR和Western bl ot结果显示成功过表达及敲降GATA1的U937细胞中,c-Myb表达也同时升高和降低;（6）双荧光素酶报告系统检测显示GATA1能促进c-myb promoter的表达。综上所述,本实验通过用诱导剂对白血病细胞K562、U937、HL60诱导分化检测c-myb与转录因子GATA1、GATA2、CTCF、PU.1、Rad21、TAL1、c-Jun的表达变化,设计转录因子的表达质粒和敲降质粒,利用慢病毒包装感染技术在白血病细胞中敲降或过表达转录因子来进一步探索转录因子对c-myb的调控作用,用双荧光素酶报告系统进一步确认GATA1对c-myb的调控作用,和用Ch IP-q PCR技术探究了c-Jun在c-myb上游远端调控位点的结合情况。以上结果表明GATA1在K562和U937细胞中对c-myb的表达具有促进作用,GATA1在HL60细胞中可能有促进c-myb表达的作用。在K562细胞被诱导分化后的c-Jun、TAL1、C/EBPβ表达明显上升c-myb表达下降,而在K562细胞中敲降这些转录因子后c-myb随之下降的现象,目前只能说明c-Jun、TAL1、C/EBPβ在K562细胞中与c-myb的表达是有关联的,具体的关联机制还有待更深入的研究。GATA2、CTCF、PU.1、Rad21则可能在K562细胞中能够促进c-myb的表达。基于c-myb基因在白血病和其他癌症当中重要的作用和这些转录因子对c-myb的表达调控机制,本研究可为白血病研究方案和治疗提供新的思路。
桑春艳[2]（2019）在《激酶抑制剂C0129和C0198的抗肿瘤活性及作用机制研究》文中进行了进一步梳理癌症严重影响人类的健康,是人类主要的死亡病因之一。根据国际癌症研究机构（IARC）的报告,预计到2030年全球癌症患者病例将达到2220万。目前治疗癌症的手段主要有手术治疗、放射治疗和化学治疗等,其中传统的化学治疗虽然取得一定的治疗效果,但仍存在疗效差、预后不良、毒副作用严重且易产生耐药性等缺点。癌症的突出特征是癌细胞的生长不受控制,进而破坏正常的组织及器官,使之功能紊乱、结构受损,最终影响机体的正常运转。近年来,药学工作者针对癌症发生发展中特异性表达的激酶、受体和细胞因子等研发新型靶向药物,以提高药物对癌细胞的选择性、安全性和耐受性,降低毒性,保证临床疗效。Aurora激酶和血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）是两类重要的癌症靶标分子。Aurora是一类丝/苏氨酸激酶,在中心体复制、纺锤体形成和染色体分配等有丝分裂过程关系密切,并参与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路。VEGFR2作为重要的酪氨酸激酶受体,可诱导肿瘤血管生成,促进肿瘤侵袭和转移,参与调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路。目前,还没有Aurora激酶抑制剂用于临床治疗。虽然VEGFR2抑制剂索拉非尼、吉非替尼等在临床上有较好的应用,但仍存在抗肿瘤谱较窄、易产生耐药和毒副作用大等缺点。本课题组前期研究发现,化合物C0129和C0198具有较好的Aurora激酶抑制活性和抗肿瘤活性。同时发现,化合物C0129对VEGFR2也有显着的抑制活性。因此,本论文将对这两个化合物的体内外抗肿瘤活性及作用机制进行较为系统的研究。化合物C0129是一种稳定氮氧自由基标记的嘧啶类化合物,抑制Aurora A和VEGFR2的IC50分别为0.061 nM和1.469 nM。CCK-8法测得化合物C0129对结肠癌细胞HT-29、肝癌细胞HepG2、非小细胞肺癌细胞A549、宫颈癌细胞HeLa和前列腺癌细胞PC-3等都有较强的增殖抑制活性,IC50值分别为2.9?0.5μM、3.2?0.7μM、4.5?0.6μM、0.9?0.3μM和2.8?0.5μM,其中对HeLa细胞的抑制作用最强,对正常肾小球系膜细胞HRMC抑制不明显。此外,EdU实验表明在HeLa细胞中C0129可明显抑制细胞的DNA复制。在HeLa细胞中,一方面,通过免疫荧光实验发现C0129使纺锤体的形成受阻,影响细胞有丝分裂进程;细胞流式术和蛋白印迹分析发现C0129能够调控周期蛋白cdc2和cyclinB1的活性,使HeLa细胞周期阻滞在G2/M期;C0129还能够诱导细胞凋亡,使BAD、Bax、caspase-3以及caspase-9促凋亡蛋白上调,Bcl-2抑凋亡蛋白下调,调节PI3K/Akt/mTOR信号通路的传导。另一方面,C0129通过调控TGF-β、MMP2、MMP9和nm23-H1的表达,抑制HeLa细胞的迁移;C0129还通过调控FAK、VE-cadherin、YB-1以及p38MAPK蛋白的表达,减弱了HeLa细胞的侵袭能力。这些作用与C0129调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路有关。药代动力学研究表明C0129单次口服给药后其半衰期为4.12 h,达峰时间为4 h,而急性毒性实验显示其LD50大于1000 mg/kg;体内实验发现C0129在50 mg/kg时,体内对HeLa细胞移植瘤的抑瘤率为70%,高于VX680的50%;器官组织HE结果显示C0129在体内的毒性不明显,和急性毒性实验结果一致。综合上述结果,证明化合物C0129是一种Aurora A激酶和VEGFR2激酶受体双靶点抑制剂,体内外均具有较好的抗肿瘤活性,且有较好的成药性,具有进一步开发研究的价值。化合物C0198是一种酞嗪酮类Aurora激酶抑制剂,体外抑制Aurora A和Aurora B的IC50分别为118 nM和80 nM;在细胞水平能明显抑制结肠癌细胞HCT-116和LoVo、前列腺癌细胞PC-3、宫颈癌细胞HeLa和非小细胞肺癌细胞A549的活性,CCK-8法测得IC50值分别为0.83?0.2μM和2.2?0.7μM、1.75?0.6μM、3.2?0.5μM以及2.8?0.5μM;C0198对Aurora激酶高表达的HCT-116和PC-3肿瘤细胞的抗增殖活性最显着,而在正常肾小球系膜细胞HRMC中的毒性较小。在HCT-116细胞和PC-3细胞中,C0198通过阻滞细胞有丝分裂停滞在G2/M期,最终抑制了肿瘤细胞的增殖。C0198对肿瘤细胞周期的调控与它抑制Aurora A和Aurora B的活性直接相关。一方面,C0198通过抑制Aurora A在Thr288位的磷酸化,使Aurora A对CDC25B在Ser353位的磷酸化激活减弱,降低了CDC25B对cdc2/CyclinB1的调控作用;C0198通过抑制Aurora A的活性,使中心体的功能异常,导致纺锤体形成受阻,而微管蛋白是纺锤体的基本构成。另一方面,C0198通过抑制Aurora B在Thr232位的磷酸化,影响着丝粒的功能,引起染色体缺失和损坏,使染色体正常复制和分配紊乱,从而使纺锤丝连接并牵拉姐妹染色体的分离异常,最终染色体不能有序分配到子细胞中去,使细胞有丝分裂停滞在G2/M期。因此,C0198阻滞肿瘤细胞周期在G2/M期诱导细胞的死亡是抑制Aurora A和Aurora B激酶活性的结果。此外,体内急性毒性实验和药代动力学实验表明,C0198的LD50大于1000 mg/kg,半衰期为21 h,达峰时间为1.6 h,说明机体对C0198的吸收较快。裸鼠移植瘤实验发现C0198抑瘤作用显着,在HCT-116细胞移植瘤模型中,90 mg/kg C0198的抑制率为75%,高于VX680的60%;在PC-3细胞移植瘤模型中,90 mg/kg C0198的抑制率为66%,高于VX680的55%。组织器官HE结果显示,C0198对机体的器官损伤不明显,该结果和急性毒性结果一致。综上所述,C0198作为Aurora激酶泛抑制剂,在细胞水平和体内移植瘤水平均有显着的抗肿瘤活性,并且毒性较低,成药性较强,有进一步研究开发的价值。总之,本论文对本课题组发现的两种激酶抑制剂的抗肿瘤活性及其作用机制进行了较为详细的研究,为进一步研究开发奠定了较好的基础。
陈文波[3]（2019）在《2,3-二氧代吲哚啉-1-N-苯基乙酰胺合成及CDC25B抑制活性研究》文中研究表明靛红（Isatin,ISA）,又名2,3-吲哚二醌,是一种广泛分布于动植物及人体内的重要的天然产物,其在脑内海马等部位有较高的分布,也是龙虾等海洋动物生存所需的内源性活性因子。目前已报道靛红及其衍生物具有抗肿瘤、抗病毒、神经保护、抗氧化等诸多生物活性,且具有较低的毒性。此外,磷酸酶CDC25B和PTP1B作为肿瘤药物研究的新靶点,其生物学机制也逐渐被揭示。为了寻找生物活性强,毒副作用低的具有抗肿瘤活性的新型Isatin衍生物,本文以取代苯胺为起始原料,设计、合成2个系列共27个Isatin衍生物,对所合成的目标化合物对CDC25B和PTP1B的抑制活性进行了研究,并对其构效关系进行了分析。本研究所合成的化合物分为两个系列:第一系列以取代苯胺为起始原料,经过Sandmeyer合成法得到Isatin结构,再通过与N-氯乙酰基苯胺发生亲核取代反应,经薄层色谱技术（TLC）跟踪检测反应,利用重结晶纯化化合物方法得到了15个Isatin衍生物（4a-4o）,并进行了其对CDC25B和PTP1B抑制活性的评价;第二系列以我们先前研究的生物活性较好的先导结构6-溴代靛红为目标结构,通过与不同取代的N-氯乙酰基苯胺发生亲核取代反应,经薄层色谱技术（TLC）跟踪检测反应,利用柱色谱以及重结晶纯化化合物方法得到了12个6-溴代靛红衍生物（5a-5p）,并进行了其对CDC25B和PTP1B抑制活性的评价。结果显示:在化合物4a-4o中,绝大多数衍生物对CDC25B(IC50=3.2-23.2μg/mL)和PTP1B(IC50=2.7-21.4μg/mL)均有抑制作用。其中化合物4h对磷酸酶CDC25B和PTP1B具有最好的抑制活性,IC50值分别为3.2μg/mL和2.7μg/mL。在细胞毒性活性测试中,化合物4h对Hela、A549和HCT116癌细胞株有较强的细胞毒性。此外,化合物4h在体内的colo205异种移植瘤模型中显示出显着的肿瘤抑制活性。在系列二中,大部分化合物对CDC25B和PTP1B具有一定的抑制活性,其中化合物5k对CDC25B和PTP1B的抑制活性最强,IC50值分别为3.87μmol/L和2.9μmol/L。化合物5k对三种癌细胞株（Hela、A549和HCT116）也表现出较高的细胞毒性活性。此外,化合物5k在体内colo205异种移植瘤模型中显示了有效的肿瘤抑制活性。主要结论:本文在先导化合物靛红的基础上,对靛红母核及其1位N原子上引入了各种取代基团,合成了两个系列的Isatin衍生物,对其对CDC25B和PTP1B的抑制活性做了相关试验,初步评价了其抗肿瘤活性,并探讨了其构效关系;并对活性较好的化合物4h与5k进行了体外和体内抗肿瘤活性评价,为进一步研究新一类的生物活性高、副作用少的抗肿瘤药提供实验理论依据。
徐莎[4]（2013）在《多肽CT3依赖STAT3抑制microRNA-155的表达促进HL-60细胞分化》文中提出白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor, LIF）是IL-6细胞因子家族中的一员，它具有多种生物学效应。有报道称在体外LIF对U937、HL-60、小鼠M1细胞具有抑制生长的能力，并且诱导细胞像成熟血细胞方向分化的作用。可白血病细胞由于增殖失控，因此对LIF的敏感度较低，导致体内有限的LIF对白血病细胞的恶性增殖无法抑制，同时非生理剂量、外源性的LIF也会对正常组织以及正常细胞产生较大的毒副作用，并会干扰细胞因子间的调控网络，所以它不能直接应用于临床治疗。LIF发挥其生物学作用是借助与靶细胞膜上的LIF受体发生结合而得以实现的。LIF受体包括LIFRα和gp130这两个亚基。LIFRα由胞内区，跨膜区和胞外区三部分组成。其中胞内区含重要作用结构为YXXQ的功能域，分别为Box1、Box2和Box3。YXXQ中的氨基酸分别为：Y代表酪氨酸，X代表任意氨基酸，Q代表谷氨酰胺，该结构是活化胞内信号分子的必要序列。我们以往的研究已表明，通过基因转染的方式，将LIFRα亚基中胞内区含Box3功能域的C末端序列（LIFRα-CT3）过表达于HL-60细胞胞质中，可促进细胞朝成熟粒细胞方向分化，并抑制其增殖能力。然而，脂质体或是病毒等基因转染方式只能应用于体外试验，在临床治疗上存在一定的安全风险和技术限制。因此，我们借助蛋白转导结构域（Protein Transduction Domain, PTD）能将蛋白跨膜携带进入细胞内的特性，采用CHO（中国仓鼠卵巢细胞）真核表达体系制备了LIFRα-CT3融合多肽，即TAT-CT3-cMyc（cMyc为蛋白纯化标签）。实验结果表明该融合多肽确实能抑制HL-60细胞增殖，并向粒系分化。由于该表达体系获得的融合多肽存在表达量少、浓度低、成本高的缺点，不利于今后对该蛋白与白血病细胞间的机制研究，所以要获得大量的、高浓度的融合蛋白TAT-CT3显得非常有必要。信号转导和转录激活子STAT3参与细胞增殖、分化、恶性转化及凋亡机制。现有研究发现在多种肿瘤中均存在STAT3蛋白的持续性磷酸化的高表达，参与肿瘤的发生。因此，阻断JAK/STAT3通路已作为肿瘤治疗的一个治疗新靶点。而近几年的研究已证实STAT3异常持续性的激活与白血病的发生、发展有着密切关系，因此我们推测HL-60细胞分化可能与STAT3磷酸化的降低存在着某种联系。MicroRNAs（miR）是一类由内源性基因编码的，序列长度为18～25个核苷酸的非编码单链RNA，它通过调控其下游靶基因，参与细胞的生长和分化过程，与肿瘤的发生也有着密切联系。一些microRNAs已被证实为致癌性小RNA，与急性髓系白血病（acutemyelocytic leukemia，AML）的发生密不可分。在这些致癌性小RNA中，miR-155在血液系统的恶性肿瘤中呈高表达趋势，同样也高表达于某些分型的AML白血病细胞。miR-155位于B-cell Integration Cluster（bic）基因的第三个外显子内，其表达水平受到BIC基因的转录和miRNA加工等调控。虽然STAT3和miR-155分别被视作癌基因和致癌性小RNA，两者又都在白血病中存在高表达的现象，但是在对白血病的研究中，两者之间的联系鲜有相关的文献报道。同时，C/EBPβ作为miR-155的下游靶基因，在粒系分化中有着重要的作用。因此，探索STAT3与miR-155之间的关系对研究TAT-CT3对HL-60细胞分化的作用机制是十分有必要的，并且也对靶向STAT3的肿瘤治疗有更多维的认识。本实验的目的是想通过技术上已成熟的原核表达系统制备大量有活性的TAT-CT3融合多肽，观察其是否具备像真核表达的多肽一样，对HL-60细胞的生长和分化有相似的作用，并研究在HL-60细胞分化过程中STAT3磷酸化水平以及miR-155表达的变化，并探讨两者在HL-60细胞分化中的作用及其相互关系。在本实验中，我们应用原核表达系统获得高表达的带有SUMO标签的TAT-CT3多肽,用FITC加以标记，以50μg/ml的浓度、作用HL-60细胞1h后，通过免疫荧光检测证实了TAT-CT3能够进入HL-60细胞内。接着，多肽以10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml的浓度处理HL-60细胞4天后，经流式细胞仪分析发现，经50μg/ml的终浓度暴露的细胞，其细胞分化表面标志物CD11b表达增加最多，以此确定后续实验所需的最佳多肽剂量。之后以50μg/ml的终浓度作用24h,48h,72h,98h，分别检测细胞增殖以及CD11b/14的表达变化。实验结果表明原核表达的TAT-CT3多肽具有真核表达蛋白的生物活性，可以诱导HL-60细胞向粒系方向分化，同时能抑制该细胞的增殖。为了进一步研究TAT-CT3多肽在其抑制细胞增殖诱导分化的过程中，是否能降低STAT3持续性磷酸化水平以及miR-155的表达水平，以50μg/ml的TAT-CT3对HL-60细胞进行为期4天的暴露。通过Western Blotting以及qRT-PCR的方法检测，结果表明STAT3磷酸化水平在24h,48h,72h,98h后有所下降，miR-155及其前体BIC同样表达有所下降。miR-155其下游的靶基因有SOCS-1、C/EBPβ，SOCS-1是JAK/STAT通路的负调控因子，C/EBPβ在粒系细胞分化过程中有重要的诱导作用，因此我们在mRNA以及蛋白水平分别检测了它们的表达情况，结果表明，随着多肽暴露时间的延长，SOCS-1以及C/EBPβ表达都有所上升。在本教研室的前期实验中已证实了HL-60细胞的分化是通过激活和强化STAT3的磷酸化来实现的，这一结果与本课题中STAT3磷酸化的降低存在矛盾性。有研究表明IL-6通过激活STAT3的磷酸化从而诱导SOCS-1的表达，一旦SOCS-1表达上升，它作为JAK/STAT3通路的负调控因子又抑制STAT3的磷酸化。我们通过qRT-PCR以及WesternBlotting检测发现，当加入TAT-CT3后，在0-2小时之间，STAT3磷酸化增加的同时伴有SOCS-1表达的上升，而在2小时后，STAT3磷酸化被SOCS-1抑制而降低，并低于未经TAT-CT3暴露前的磷酸化水平。这一结果说明TAT-CT3通过强化STAT3磷酸化水平促进了SOCS-1的表达，SOCS-1表达的升高反作用于STAT3，使其磷酸化降低。SOCS-1表达增加伴随着STAT3磷酸化的增强，而SOCS-1是miR-155的下游靶基因，以此推测STAT3是作用于miR-155来调控SOCS-1的表达。并且STAT3作为信号转导和转录活化因子，当被激活后会形成二聚体入核，可以调控基因的表达。因此对野生组以及TAT-CT3组HL-60细胞进行4天的连续暴露（50μg/ml，每日换液）后分别检测pSTAT3在转录因子启动子区的水平变化。CnIP实验结果表明，STAT3能够结合至BIC启动子区域。我们可以推断在多肽TAT-CT3加入至HL-60细胞培养基后，STAT3磷酸化一过性的增强促进其二聚体的形成并入核，结合至BIC启动子区抑制了miR-155的表达，从而促进SOCS-1的表达。总之，本研究制备了有活性的原核表达的TAT-CT3融合多肽，它能够抑制HL-60细胞增殖并促进其向粒系分化。首次证明了STAT3能直接结合到BIC的启动子区，调节miR-155的表达，这也为靶向miR的肿瘤治疗提供一定的借鉴意义。
杨玲[5]（2012）在《190CT3通过调节STAT3α和β的活性诱导HL-60细胞分化的机制研究》文中指出白血病是血液系统最常见的恶性肿瘤之一。其发病机制目前尚不十分清楚。该病的主要特点是大量失去正常定向分化功能的非成熟的白血病细胞在体内堆积而产生造血异常。因此，诱导白血病细胞从未分化状态重新进入分化轨道，是白血病治疗的一个新思路。白血病抑制因子（LIF）是体内一种天然的、多功能细胞因子，对白血病细胞，如：HL-60、U937、M1等有诱导分化和增殖抑制作用。然而，白血病细胞增长快速且对LIF的感应能力差，使得机体内有限的LIF无法抑制白血病细胞的恶性繁殖。而外援性非生理剂量的LIF对脂肪细胞、内分泌细胞和生殖细胞等有细胞毒性，同时还干扰了细胞因子间的协调作用，所以它的药用价值不能得到体现。LIF的生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体完成的。LIF受体包括一个α亚基（gp190）和一个β亚基（gp130）。Tomida等研究发现，在没有gp130亚基存在的情况下，LIF受体gp190亚基胞内区也能形成同源二聚体，激活细胞内的STAT3。进一步研究证实，在gp190亚基的胞内区含有3个重要功能域，即：BOX1、BOX2和BOX3。其中，BOX3及其羧基末端（C-末端）含有3个YXXQ官能体（Y-酪氨酸，Q-谷氨酰胺，X-任意氨基酸），YXXQ可以识别STAT3的SH2位点，并与SH2位点特异性结合，是STAT3磷酸化的必须结构。而Porter等人研究发现，IL-7受体α亚基的游离T片段可以激活STAT5和PI3K等激酶，加快成T细胞分裂，并延长其成活时间，促进T细胞发育。这一研究表明，单一亚基的单一信号启动位点在游离状态下能够在细胞内启动相应的信号传导途径。综上所述，为了充分发挥LIF抗白血病的作用，又规避它的细胞毒性。我们按照LIFRgp190亚基胞内区C-末端设计了一个小分子即：190CT3（包含BOX3功能域及其羧基末端）。我们期望研究，在没有LIF刺激的情况下，过表达外源性的190CT3是否能替代LIF，激活胞内的信号通路，对细胞的增殖分化情况产生影响。在前期的研究中我们已经观察到：过表达190CT3的HL-60细胞株出现了增殖抑制的现象，然而其中的相关分子机制还不甚明了。在本研究中，我们将进一步深入研究190CT3对HL-60细胞的作用并探讨其相关分子机制。为白血病的治疗提供相关理论依据。首先，我们将190CT3目的基因片段装载到带有GFP绿色荧光蛋白标记的去内毒素穿梭质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP上。分别用制备的pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-190CT3和空载体慢病毒颗粒感染HL-60细胞，获得稳定表达190CT3-GFP及GFP空载体的HL-60细胞株，并设野生型HL-60细胞为空白对照，通过细胞周期检测、台盼蓝染色细胞活力检测、绘制生长曲线等比较各组细胞的增殖情况，通过流式细胞术观察各组细胞表面成熟粒细胞相关抗原CD15、CD11b的变化，透射电镜检测、细胞化学检测（瑞氏染色、α-NAE染色、NBT实验），比较细胞的形态、吞噬能力、还原能力，分析细胞的分化状态。结果显示：190CT3转染组HL-60细胞发生G0/G1期阻滞，增殖受到抑制。其粒细胞表面标志CD15、CD11b的表达增高，与对照组相比，核质比减小、细胞器增多，溶酶体增多，出现杆状和分叶状；α-NAE染色出现少量弱阳性细胞且阳性不被NaF抑制、NBT实验中阳性细胞明显增加，表明细胞的吞噬能力、还原能力增强。以上结果说明190CT3转染组HL-60细胞增殖受到抑制，且向有功能的成熟粒细胞分化。在上述工作的基础上，190CT3促进HL-60细胞分化和生长抑制的相关分子机制是我们下一步研究的重点内容。白血病细胞与残存的正常造血细胞存在于同样的骨髓微环境中却表现出截然不同的生物学特性，正常的造血细胞在细胞因子的作用下不断的分化成熟，而白血病细胞则表现为无限增殖、分化受阻。提示：细胞内信号通路异常在白血病的形成中起着重要的作用。越来越多的证据表明JAK/STAT通路异常激活在白血病的病理机制中有着重要的地位。STAT3是JAK/STAT信号途径中的一个重要的信号分子。最近的研究发现，STAT3的激活对细胞的生长、凋亡、细胞周期调控都有着重要影响。而STAT3自身又受细胞内多种信号转导途径的调控。在许多实体肿瘤和血液肿瘤中均发现STAT3被持续活化。所以，STAT3的激活可能与肿瘤发生发展的机制相关，已成为JAK/STAT的研究重点。在多数急性髓性白血病病人中STAT3的Tyr705和Ser727位点被组成性激活。其中，705位的酪氨酸发生磷酸化是STAT3发挥功能所必需的，而727位丝氨酸磷酸化有助于STAT3发挥最大转录活性。针对STAT3蛋白的肿瘤靶向治疗在白血病的治疗中有着良好的应用前景。STAT3存在有两个亚型，一个是全长的STAT3α（即我们通常所说的STAT3），一个是被截短的STAT3β。STAT3β与STAT3α相比在C末端缺失55个氨基酸残基，而被7个新的氨基酸残基所替代。STAT3β虽然缺乏Ser727位点，但是包含有Tyr705位点。该位点的磷酸化促使STAT3β发生二聚化， STAT3β二聚体具有比STAT3α二聚体更强烈的DNA结合活性。所以，STAT3β不仅仅是STAT3α的显性负性突变，它还可以调控基因的表达，STAT3β的过表达可以抑制STAT3α的功能。这两种类型在细胞中的动态平衡会影响细胞基因活化的形式，从而使STAT3表现出多效性。那么，是否190CT3的过表达改变了HL-60细胞中STAT3α和β的表达及磷酸化状态，从而影响了细胞的增殖和分化？为此，我们通过RT-PCR、免疫印记和免疫荧光技术检测了各组细胞中STAT3α和β的mRNA水平、蛋白表达水平以及跟信号转导密切相关的Tyr705、 Ser727的磷酸化水平及其细胞内分布情况。结果发现，实验组细胞中STAT3β的表达及其Tyr705磷酸化水平明显升高且表现为核内聚集，而STAT3α的表达及其Tyr705磷酸化水平没有明显变化，但Ser727的磷酸化水平降低，且主要被滞留在胞质中；而三组细胞中STAT3α和β的mRNA水平没有明显改变。同时，我们还通过免疫印记研究发现三组细胞中JAK1蛋白和磷酸化水平没有明显变化，但190CT3诱导的HL-60细胞中ERK1/2的磷酸化水平下降。以上结果提示①外源性过表达的190CT3对HL-60细胞中STAT3α和β的影响主要来自于翻译水平及翻译后蛋白的磷酸化状态的调控，190CT3促进了STAT3β的表达及其Try705位点的磷酸化水平升高。STAT3β二聚化后入核，能产生比STAT3α二聚体更强烈的DNA结合活性，抑制STAT3α的功能。但190CT3对STAT3α和β的转录水平没有影响。②Ser727残基是MAPK的磷酸化位点，外源性过表达的190CT3能够使ERK1/2的磷酸化水平下降，从而降低STAT3α Ser727位点磷酸化水平，进而降低STAT3α本身与DNA的结合能力。以上两个方面协同作用，抑制了STAT3α下游基因的表达。而该过程没有JAK1蛋白的参与。为了进一步证实190CT3与STAT3的相互关系，本研究通过免疫共沉淀，在提取的蛋白样品中相继加入LIFR（190CT3）抗体和Protein A Agarose后形成沉淀物，经SDS-PAGE电泳和转膜后，分别用LIFR（190CT3）抗体、STAT3抗体（检测总STAT3含量，包括磷酸化及非磷酸化的STAT3α和STAT3β）进行免疫识别，在重组190CT3慢病毒感染的HL-60细胞中分别检测到相对分子量约17KD和分子量约79KD、86KD（STAT3α和STAT3β）的蛋白条带。LIFR（190CT3）抗体可以将190CT3和STAT3α、STAT3β同时沉淀下来，证明190CT3与STAT3α、STAT3β之间存在相互作用。用同样的方法检测190CT3与p-STAT3之间的相互关系，在提取的蛋白样品中相继加入LIFR（190CT3）抗体和Protein A Agarose后形成沉淀物，经SDS-PAGE电泳和转膜后，分别用LIFR（190CT3）抗体和p-STAT3（即p705-STAT3）抗体（检测总p-STAT3，包括p-STAT3α和p-STAT3β）进行免疫识别。结果显示，在重组190CT3慢病毒感染的HL-60细胞中分别检测到相对分子量约17KD和分子量约79KD、86KD（p-STAT3α和p-STAT3β）的蛋白条带，LIFR（190CT3）抗体可以将190CT3、p-STAT3α、p-STAT3β同时沉淀下来。以上结果提示190CT3与STAT3之间存在相互作用，190CT3可以和STAT3结合，从而使STAT3β蛋白的表达及磷酸化水平升高，过表达的STAT3β二聚化后与STAT3α竞争性入核与DNA结合，而P-STAT3α被滞留在胞质，从而抑制了STAT3α的功能，表现为抑制HL-60细胞的增殖促进其分化。STAT3β蛋白的表达及磷酸化水平的升高，推测是由于190CT3与STAT3α的结合促进了STAT3α的剪切而引起的。这一部分内容还有待进一步研究证实。为了进一步探讨STAT3α和β的表达及活化状态对其下游增殖分化相关基因的影响，我们通过流式细胞术分析了粒系分化的关键调节蛋白PU.1、 C/EBPε，细胞从G1期进入S期的关键激酶cyclinE、CDK2的mRNA水平，结果显示实验组细胞中PU.1、C/EBPε的mRNA水平升高， cyclinE、CDK2的mRNA水平降低。免疫印记检测发现癌基因c-myc的表达下降。提示cyclinE、CDK2的表达降低使细胞周期阻滞于G0/G1期，HL-60细胞增殖受到抑制。癌基因c-myc的表达降低，有利于细胞的分化，而PU.1、C/EBPε在190CT3诱导的粒系分化过程中发挥重要作用。总之，本研究发现，一个新型的小分子——190CT3可以抑制HL-60细胞增殖，促进其向粒系分化。其可能机制有两个方面：（1）190CT3促进了STAT3β的表达及磷酸化。二聚化的STAT3β可以竞争性结合STAT3α的DNA结合位点，抑制STAT3α促进细胞增殖的作用，促进HL-60细胞向粒系分化。（2）在此过程中，ERK1/2的磷酸化水平降低，引起STAT3α Ser727位点磷酸化水平下降，从而降低STAT3α本身与DNA的结合能力。降低其下游癌基因的表达。
尹肖雯[6]（2011）在《γ分泌酶对LIF受体α亚基gp190的切割作用及机制探讨》文中指出白血病是严重危害人类健康的疾病,且由于环境等恶化,白血病的发病呈上升趋势。越来越多的研究者都开始关注白血病的发生机制,试图通过探索白血病的发病机制找到白血病治疗的有效途径。最新的有关白血病的研究表明:γ分泌酶抑制剂可以通过调节Notch1信号通路抑制白血病细胞的增殖,有望成为白血病治疗的新途径。γ分泌酶是膜内切割蛋白酶家族（intramembrane- cleaving-proteases, I-Clips）的成员,该家族的酶都可以在脂质双分子层内部催化肽键水解。γ分泌酶广泛存在于体内的组织细胞中,可以切割多种I型跨膜蛋白,如γ-淀粉样多肽的前体蛋白（APP）, Notch受体, CD44, E-钙黏蛋白等。生物化学及基因方面的证据表明:γ分泌酶由4个亚基组成,它们分别为PS1（presenilin）, NCT（nicastrin）, APH1（anterior-pharynx-defective-1）, PEN2(presenilin enhancer-2,4个亚基按照1:1:1:1的比例组合,空间排列紧密有序。γ分泌酶四个亚基功能各异,PS1是催化亚基,有切割底物的功能,在生物体中,PS1首先以无活性的全蛋白形式分泌,再经生理性分子内部水解,裂解为由20Kda的PS1-C端（PS1-CTF）和30Kda的PS1-N端（PS1-NTF）构成的异源二聚体,有催化活性的PS1都是以异源二聚体的形式存在的,PS1发生突变是阿尔茨海默病（AD）发病的重要原因;APH1和PEN2是2个较小的亚基,APH1是γ分泌酶复合体组装过程中的支架,能够稳定有活性的PS1;NCT是γ分泌酶的重要亚基,发挥着底物受体的作用,即γ分泌酶的底物被PS切割之前,要先被NCT特异识别并结合,NCT广泛存在于人体和大鼠的所有细胞系,与γ分泌酶的组装和成熟密切相关,研究者证明:NCT的高表达可以通过提高γ分泌酶的活性进而促进对其底物Aγ的切割,因此是阿尔茨海默病治疗的潜在靶点。Notch基因广泛存在于多种物种中,其家族成员在进化上高度保守,介导的信号通路更是参与了胚胎发育、血细胞发育和肿瘤形成等多个病理生理过程。在白血病细胞的增殖分化决定中,Notch发挥着重要的作用。Notch是γ分泌酶的底物,迄今为止,在哺乳动物体内发现了4种基因,他们编码4种跨膜受体蛋白,分别为Notch1-4。目前对Notch1的了解较为深入,Notch1在体内依次经过ADAM金属蛋白酶、γ分泌酶切割后在细胞膜上释放活性胞内片段ICN1（Intracellular domain Notch1）入核,在核内,ICN1通与转录调节因子CSL结合,同时招募MAML,形成CSL-ICN1-MAML三元复合物,该复合物可作为转录活化因子,激活HES（hairy enhancer of split）、HRP（HES—related repressor protein）等Notchl靶基因的转录,进而对细胞增殖和分化起始的过程进行精确调控。NCT在此生理过程中发挥重要的作用,NCT突变可以导致在生长发育各个阶段的细胞命运决定缺陷。因此本实验最初旨在通过高表达NCT提高γ分泌酶对Notch1的切割,进而观察对白血病细胞增殖和分化的影响。因此在第一部分实验中,我们构建了pcDNA3.0-NCT重组质粒,在HL-60细胞中表达并且获得稳定高表达NCT的细胞株,通过绘制生长曲线和流式细胞仪检测细胞的生长和分化情况,检测结果与预期相反:NCT高表达抑制白血病细胞的增值,促进白血病细胞的分化。因此我们假设,γ分泌酶可以通过影响其他信号通路调节白血病细胞的生长和分化。LIF,白血病抑制因子,是一种多效性细胞因子,可作用于多种组织细胞发挥不同的生物学作用,比如刺激血小板生成,造血细胞增殖;促进神经原形成,肌肉卫星细胞的增殖,参与神经肌肉修复。这些生物学效应的发生依赖于LIF和细胞膜上LIF受体（LIFR）结合启动下游信号通路,靶细胞膜上的LIFRγ亚基（gp190）,可与LIFRγ亚基（gp130）形成异源性二聚体,进而激活下游信号转导通路。人们已证明,生理状态下存在可溶性和完整性gp190两种形式。可溶性LIFR游离于胞外,无跨膜区和细胞内区,可以拮抗LIF发挥的正常生理效应。gp190是LIF的特异性受体,完整性gp190包括胞外区、跨膜区和胞内区,其胞内区含有三个功能域,由近膜端至远膜端依次为BOX1、BOX2和BOX3,以往的研究工作表明,在无LIF诱导的情况下,高表达LIFR亚基gp190也可以激活白血病细胞下游的信号转导通路。设计包含BOX3的小分子-190CT3,并在白血病细胞中高表达,通过检测JAK/STAT3以及P44/P42MAPK信号转导通路下游信号分子以及磷酸化水平,发现其确实具有LIF受体的信号启动效应从而抑制白血病细胞的生长。gp190是I型跨膜蛋白,γ分泌酶能够切割I型跨膜蛋白进而影响下游信号通路,因此我们大胆提出γ分泌酶能够切割gp190产生gp190-CTF的假设,本实验第二部分别通过抑制和提高γ分泌酶的活性来探索γ分泌酶和gp190的关系,我们首先通过γ分泌酶抑制剂干扰实现酶活性的下降,再通过NCT的过表达实现γ分泌酶对底物切割作用的提高,从正反两个方面验证我们的假设。目前对于NCT的研究重点主要集中在NCT与阿尔茨海默病的关系上,更多的研究者企图通过γ分泌酶抑制剂的应用来抑制γ分泌酶的活性,进而阻止Aγ的产生,起到对阿尔茨海默病的治疗作用,关于γ分泌酶和其他I型跨膜蛋白的关系则研究很少。本实验分两个部分创新的探讨了高表达NCT对白血病细胞增殖和分化的影响,对进一步研究γ分泌酶在造血系统中的作用奠定了基础,为白血病的治疗提供了新的可能性。第一部分、Nicastrin重组质粒的构建以及其在HL-60细胞中的表达及鉴定方法: （1）重组质粒pcDNA3.0-NCT的获得及鉴定:设计引物5 -CGGGGTACCAGAGGCAAGATGGCTACGGCAG-3, 5 -TTTGCGGCCGCCCC AGGGAGGTTCCAGTGACAA-3 ,以MSCcDNA为模板,PCR获得包含NCT蛋白编码区的目的片段,共2.174kb。PCT产物经KpnI、NotI酶切、T4连接酶连接、转化、挑选克隆后成功构建载体pcDNA3.0-NCT,且测序正确。（2）重组质粒pcDNA3.0-NCT转染HL-60 ,同时设置pcDNA3.0空质粒转染组、野生组HL-60作对照组。G418筛选转染pcDNA3.0-NCT及pcDNA3.0组HL-60细胞15d,挑选生长旺盛的克隆扩增,离心收集细胞,通过RT-PCR和蛋白印迹（Western blot）进行蛋白半定量检测,获得稳定高表达NCT的HL-60细胞株,保存以备后面实验使用。结果:（1）PCR产物电泳后与紫外灯下观察可见大小相符合的片段,约2.2kb;重组质粒依次经KpnI、NotI酶切后、电泳紫外灯下观察可见大小约5.2kb和2.2kb左右的片段,质粒测序结果与Genbank核酸序列数据库中NCT序列比对,匹配率100%,成功获得重组pcDNA3.0-NCT的真核表达质粒。（2）G418筛选后获得稳定转染pcDNA3.0-NCT的HL-60细胞株,RT-PCR、Western blot半定量检测NCT mRNA及蛋白表达,结果显示:和对照组细胞NCT表达水平相比,pcDNA3.0-NCT转染组NCT的表达量明显升高,我们获得稳定高表达NCT的细胞株,保存以备下一步实验。（3）绘制生长曲线,与对照组细胞相比,pcDNA3.0-NCT转染组细胞生长受到抑制。流式细胞仪显示pcDNA3.0-NCT转染组细胞表面CD15/CD11b表达最高。结论:（1）KpnI、NotI双酶切鉴定、测序均证明我们成功构建了重组质粒pcDNA3.0-NCT;（2）G418筛选生长旺盛的阳性克隆,经半定量RT-PCR检测、Western blot检测获得稳定高表达NCT的HL-60细胞株;（3）相比pcDNA3.0转染组以及野生组细胞,转染NCT的HL-60细胞增殖受到明显抑制,CD15及CD11b的表达量增高,细胞向成熟方向分化。第二部分、LIF受体α亚基gp190以及与γ-secretase关系的研究方法:（1）γ分泌酶抑制实验:将NCT高表达组、空质粒转染组、野生组细胞培养在12孔板中,每组细胞4孔,每孔细胞生长至1×107,加入γ分泌酶抑制剂,抑制剂浓度分别为:0nM（DMSO）,25 nM,50 nM,和100 nM,抑制时间均为8小时,抑制剂浓度和时间通过预实验确定,8小时后,裂解细胞,western blot检测gp190全长（gp190-FL）及gp190-CTF,PS1-NTF、PS1全长（PS1-FL）、NCT的表达情况;（2）pcDNA3.0,wild type ,pcDNA3.0-NCT转染组细胞生长至1×107离心收集细胞,western blot检测gp190-FL,gp190-CTF,NCT的表达水平。（3）LIF刺激试验:pcDNA3.0-NCT组、pcDNA3.0组、野生组细胞生长至1×107后加,入浓度为60ng/ml的LIF,LIF刺激时间分别为12h、24h、48h之后,分别离心收集三组细胞,western blot检测gp190-FL,gp190-CTF,PS1-FL,PS1-NTF的表达;LIF刺激浓度通过预实验确定。（4）检测pcDNA3.0-NCT、pcDNA3.0、野生组HL-60细胞下游信号分子STAT3磷酸化水平,细胞生长至1×107,离心收集细胞,western blot检测三组细胞STAT3的磷酸化水平。（5）免疫共沉淀检测gp190和NCT的相互作用情况,LIFR抗体做沉淀,NCT抗体做western blot。结果:（1）γ分泌酶抑制剂干扰实验结果示:加入γ分泌酶抑制剂后,随着抑制剂浓度的逐渐增加,PS1-NTF表达逐渐减弱,PS1-FL蛋白的表达增高,这标注着γ分泌酶活性逐渐下降;gp190-CTF的表达逐渐减弱,NCT和gp190-FL的表达未见明显变化;（2）和pcDNA3.0转染组以及野生型HL-60相比,pcDNA3.0-NCT转染组细胞,PS1-NTF表达逐渐增加,PS1-FL蛋白表达减少,这标志着γ-secretase分泌酶活性升高;gp190-CTF表达逐渐增加,gp190-FL表达各组细胞间未见明显区别;结论:（1）γ分泌酶抑制实验,酶活性受到抑制后,gp190-CTF表达减弱,且gp190-CTF的表达量和γ分泌酶抑制剂浓度呈反比,随着γ分泌酶抑制剂浓度的逐渐增加,gp190-CTF表达逐渐减弱;（2）NCT高表达组HL-60细胞,western blot检测可见更多的gp190-CTF表达;（3）对每组细胞而言,随着LIF刺激时间的增加,gp190-CTF的表达逐渐增加。（4）STAT3磷酸化表达水平的检测示:STAT3的磷酸化水平为pcDNA3.0-NCT〉pcDNA3.0〉野生组HL-60。（5）加入gp190抗体免疫共沉淀检测可以检测到NCT的表达。综上所述,第二部分实验表明,γ-secretase可能有切割gp190,产生游离C末端的作用,且通过影响下游信号分子STAT3磷酸化水平-调节HL-60细胞的增殖和分化。小结本实验的两个部分围绕γ分泌酶和gp190相互关系以及对白血病细胞生长和分化的研究展开。通过构建及转染pcDNA3.0-NCT获得稳定高表达NCT的HL-60细胞,并观察到NCT高表达可以抑制白血病细胞的增殖、促进白血病细胞的分化。研究γ分泌酶和gp190关系的实验表明:随着γ分泌酶抑制剂浓度的增加,gp190-CTF表达逐渐减弱;NCT高表达导致gp190-CTF表达明显升高。pcDNA3.0,pcDNA3.0-NCT,野生组细胞均随着LIF刺激时间增长,gp190-CTF的表达逐渐增加,且NCT高表达可以促进细胞内信号分子STAT3的磷酸化水平;免疫共沉淀的结果揭示了gp190和NCT的相互作用。实验总结:生理状态下,γ-secretase可能切割gp190产生细胞内的游离功能域,参与信号传递过程,进而抑制白血病细胞的增值、促进白血病细胞分化。本实验创新的研究了γ分泌酶与LIFR亚基gp190的关系,为研究γ分泌酶在造血系统的关系奠定了基础,为白血病治疗寻找新的靶点提供了可能性。
孙擎[7]（2011）在《分泌型多肽TAT-CT3-cMyc对白血病HL-60细胞的生长调节》文中研究说明白血病是造血系统的恶性疾病。近几年,研究人员提出,应该从分子角度重新认识白血病,开展针对信号分子激活/抑制的研究,为白血病的防治提供新的思路和方法。白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor, LIF）是一种多功能的、作用广泛的细胞因子,为IL– 6细胞因子家族的一员,能够在体外抑制粒系白血病细胞（如人HL-60、U937、小鼠M1系等）的增殖。然而,由于白血病细胞增长快速并对LIF感应能力很差,机体内有限的LIF无法有效抑制白血病细胞的生长[1]。而外源性、非生理剂量的LIF对脂肪细胞、生殖细胞和内分泌细胞等正常细胞具有显着的细胞毒性,同时干扰了细胞因子间的正常协调作用,所以LIF目前还无法直接用于疾病治疗。进一步研究显示,LIF的生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体（LIFR）来实现的。LIFR包括两个亚基--LIFRα（gp190）和LIFRβ（gp130）。其中,LIFRα含有1239个氨基酸,胞外区由789个氨基酸构成,跨膜区由26个疏水氨基酸组成,胞内区由238个氨基酸构成。LIFRα的胞内区共有三个功能域（Box1、Box2和Box3）,其主要作用结构为YXXQ（Y为酪氨酸,X为任意氨基酸,Q为谷氨酰胺）,是激活细胞内信号分子的必须序列[2]。本教研室前期工作中已证实,通过脂质体转染的方式,将LIFRα细胞内区全长序列（LIFRα-CT）和含Box3功能域的C末端序列（LIFRα-CT3）分别富集于人类急性早幼粒白血病细胞HL-60胞质中,可促进该系白血病细胞的粒细胞方向分化,并有效抑制其增殖潜力[4-9]。但无论是脂质体还是病毒等转染方式,均只能应用于体外试验,因此,研发可用于体内将LIFRα-CT3安全、高效地导入白血病细胞的方法显得非常有意义。近年研究发现,蛋白质转导结构域（Protein Transduction Domain, PTD）可将全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40 nm磁珠和200 nm脂质体等[10]携带入细胞/核。目前最常用的PTD是人类免疫缺陷I型病毒（HIV-1）来源的TAT蛋白片段（TAT-PTD）,它具有短小、高效、无毒、快速、不影响下游分子生理功能的优良特性,但常用的原核表达体系得到的融合蛋白因缺乏转录后的剪切、翻译修饰,存在低/无生物活性的可能性[11-14]。因此,要获得有活性的TAT-PTD融合蛋白需用真核表达系统。本课题的目的就是利用真核表达系统制备有活性的LIFRα-CT3融合蛋白,并通过蛋白质转导结构域（PTD）将LIFRα-CT3携带入白血病胞内/核内,观察其对白血病细胞系HL-60的作用,并探讨其机制。为此,我们采用基因重组的方法,将LIFRα-CT3、TAT-PTD、出胞信号肽（Signal Sequence,ss）和融合标签cMyc克隆入真核表达载体pcDNA3.0中,成功构建了pcDNA3.0-ss-TAT-CT3-cMyc重组表达载体和对照载体pcDNA3.0-ss-CT3-cMyc;通过FuGENE 6非脂质体转染法将两种载体分别转染入中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中,RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光检测显示,TAT-CT3-cMyc可在CHO细胞中转录和表达,表明TAT-CT3-cMyc的真核表达系统已建立成功;进一步利用Realtime-PCR筛选获得了高表达的CHO-TAT-CT3-cMyc细胞系。接着,我们将构建好的CHO-CT3-cMyc和CHO-TAT-CT3-cMyc两个细胞系大量扩增后,更换为无血清培养液,72h后,回收培养液和超声粉碎CHO细胞后的上清, 0.45μm滤器过滤后,利用抗cMyc标签凝胶包被的蛋白层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳检测显示,纯化获得的目的蛋白正确,且纯度高（大于95%）,BCA定量检测得知,共获得732μg的TAT-CT3-cMyc多肽和569μg的CT3-cMyc多肽。最后,将获得的TAT-CT3-cMyc多肽和CT3-cMyc多肽分别按终浓度10μg/ml、30μg/ml和50μg/ml加入到人早幼粒白血病细胞系HL-60的培养基中,观察其对细胞生长和分化的影响,并探索可能涉及的信号转导通路。免疫荧光检测显示,作用时间1h时,TAT-CT3-cMyc多肽组HL-60细胞内可见明显阳性反应,但10μg/ml组荧光强度较弱,30μg/ml组和50μg/ml组可见强阳性反应。灰度分析提示,30μg/ml组和50μg/ml组的荧光强度无明显差别,这表明TAT-CT3-cMyc确可将融合蛋白片段带入HL-60细胞内,并富集于胞核,且作用时间1h,剂量30μg/ml是较理想的条件。免疫荧光检测还证实,TAT融合多肽进行转导时,其阳性率在80%以上,荧光强度在30min1h内即可达到峰值,此后随时间延长而下降,至8h左右时,荧光强度已非常弱,但仍可检测到。流式细胞术检测显示,30μg/ml TAT-CT3-cMyc多肽作用8h的HL-60细胞,CD14和CD11b的表达在72h时明显增高,表明TAT-CT3-cMyc多肽确有促进HL-60细胞朝成熟粒细胞方向分化的功能。CCK-8细胞增殖检测显示,与野生型和添加了CT3-cMyc多肽的HL-60细胞相比,添加了TAT-CT3-cMyc多肽（30μg/ml,连续暴露4天,每天8h）的HL-60细胞增殖明显下降,表明TAT-CT3-cMyc多肽的连续应用对HL-60细胞的增殖有明显抑制作用。免疫印迹检测显示,在不添加Jak2抑制剂（AG-490）的情况下,TAT-CT3-cMyc多肽组的HL-60细胞中,pSTAT3的水平最高;添加了Jak2抑制剂后,TAT-CT3-cMyc多肽组的HL-60细胞中,pSTAT3分子仍有较清晰的表达,表明TAT-CT3-cMyc组的pSTAT3是由TAT融合多肽在不依赖于Jak2分子的情况下独立激活的。为了证实TAT-CT3-cMyc组HL-60细胞的分化确实是由STAT3分子激活引起的,我们在各组添加了STAT3抑制剂,并再次在蛋白水平检测了CD14/CD11b的表达。结果显示,3组细胞的CD14/CD11b表达量均有一定程度的减低但TAT无差别,表明pSTAT3的表达量与HL-60细胞的分化程度呈正相关。激光共聚焦显微镜观察发现,与野生型和CT3-cMyc多肽组HL-60细胞相比,TAT-CT3-cMyc多肽组HL-60细胞中tSTAT3和荧光pSTAT3的表达明显增强,表明TAT-CT3-cMyc多肽可以促进HL-60细胞内信号分子STAT3的聚集和激活,启动STATs相应的信号转导通路。总之,本研究构建了pcDNA3.0-ss-TAT-CT3-cMyc真核表达载体,首次建立了TAT-CT3-cMyc融合蛋白真核表达系统,纯化获得了高纯度且有生物学活性的TAT-CT3-cMyc融合蛋白,并首次发现,TAT-CT3-cMyc融合蛋白可以在短时间内（<1h）高效进入白血病细胞HL-60内,并通过不依赖Jak2的途径激活STAT3磷酸化,促进急性髓系白血病细胞向成熟细胞方向分化并抑制其增殖。这为进一步利用TAT-CT3-cMyc融合蛋白靶向治疗白血病提供了技术支持和理论依据。关键词:白血病抑制因子,信号转导,STAT3,中国仓鼠卵巢细胞,cMyc标签蛋白,TAT蛋白转导结构功能域小结1、TAT-CT3-cMyc融合蛋白可以高效进入白血病细胞HL-60内,促进急性髓系白血病细胞向成熟细胞方向分化。2、TAT-CT3-cMyc融合蛋白在白血病细胞HL-60内游离存在时,可以以独立于Jak2分子的情况下,激活STAT3磷酸化信号通路,影响其增殖与分化进程。3、通常情况下只能用原核表达系统制备的TAT融合蛋白在本试验中采用真核表达体系CHO也能大量制备,且在额外添加了信号肽序列后可以分泌出胞,纯化后仍有生物学活性。
王静[8]（2009）在《游离的gp190胞内功能片段对白血病细胞的生长调节》文中研究说明白血病抑制因子（LIF）是一种多效性细胞因子,作用于多种组织细胞发挥不同的生物学作用,广泛调节细胞的生长、增殖和分化。如LIF抑制胚胎干细胞的体外分化;刺激血小板生成,造血细胞增殖;促进成骨细胞增殖;促进神经原形成,肌肉卫星细胞的增殖,参与神经肌肉修复;参与肝的急性期反应,参与炎症的生理病理过程等。这些生物学效应有赖于LIF结合于靶细胞膜上的LIF受体α亚基（gp190）,并与LIF受体β亚基（gp130）形成异源性二聚体,激活下游信号转导通路。gp190是LIF的特异性受体,人们已证明,在生理状态下存在可溶性和完整性gp190两种状态。可溶性受体游离于胞外,无跨膜区和细胞内区,对LIF发挥的正常生理效应有拮抗作用。完整性的gp190含有胞外区、跨膜区和胞内区,其中胞内区含有三个功能域,由近膜端至远膜端依次为BOX1、BOX2和BOX3。研究表明,BOX1、2和3各自在细胞增殖分化过程中发挥着不同的作用。gp190胞内区含有3个YXXQ官能体（其中2个位于BOX3中,另一个位于gp190C-末端）,它可以与STAT的SH2位点特异性识别,启动信号传递。LIF可以激活信号通路JAK-STAT和Ras-MAPK,人们研究证实单一亚基的单一信号启动位点在离膜状态下完全能够在细胞内启动相应的信号转导通路,LIF的生物多效性可能与受体不同功能域的作用有关。为了明确受体不同功能域在细胞内游离状态时对细胞的生长调节,我们根据gp190细胞内区的不同功能域分别设计了两种小分子——190CT2+3（C-末端199个氨基酸,含有BOX2和BOX3）和190CT3（C-末端119个氨基酸,含有BOX3）,初步证明了gp190细胞内区成为游离多肽在细胞内存在时,可以诱导白血病细胞分化。为了进一步验证前期工作,深入探讨它的发生机制,在本课题的实验研究中,我们首先鉴定已构建的190CT2+3和190CT3重组质粒,并进一步对190CT3的YXXQ官能体定点突变,继而研究相关信号转导通路。实验结果证明稳定表达目的基因（190CT2+3和190CT3）的白血病细胞,增殖均受到抑制,细胞向成熟方向分化,信号分子STAT3被激活。当YXXQ突变或PIAS3作用后,190CT3的以上作用被削弱。通过对gp190细胞内区和γ-secretase的研究,说明在生理状态下γ-secretase可能发挥着切割gp190产生游离C-末端的作用。最后我们进行了动物实验,成功建立了白血病裸鼠动物模型。通过对外周血、骨髓和脏器的检测,说明190CT3移植组在裸鼠体内仍然呈现了分化趋势,侵袭转移的恶性程度降低。因此,通过本课题的研究,我们明确了gp190 C-末端不同功能域190CT2+3、190CT3在细胞内游离存在时,促进白血病细胞分化,激活信号分子STAT3;这种游离多肽在生理状态下也可能存在。本研究旨在探索受体细胞内区单一功能域的应用价值,诱导白血病细胞成熟分化。第一部分、重组人gp190胞内功能片段的白血病细胞株的获得与鉴定方法:（1）酶切初步鉴定已构建的重组质粒pcDNA3.0-190CT2+3、pcDNA3.0-190CT3,进一步测序;构建重组质粒pcDNA3.0- MUT:通过引物重叠PCR法设计定点突变,在引物中置换突变碱基,将190CT3蛋白序列中三处YXXQ基团的酪氨酸（Y）位点突变为苯丙氨酸（F）,将突变后的基因序列插入载体pcDNA3.0。（2）将重组质粒用FuGENE-6脂质体转染人白血病细胞株HL-60和K562,G-418梯度筛选阳性克隆15d,挑选生长旺盛的克隆扩增,设转染pcDNA3.0空质粒载体和野生型HL-60和K562细胞为对照组。鉴定转染后细胞内gp190羧基末端（C-terminal）的表达:用免疫细胞化学,蛋白印迹和RT-PCR的方法进行蛋白水平的半定量检测,确定稳定表达目的基因的细胞株,以备后面实验使用。（3）苏木精染色,显微镜下观察各组细胞形态;细胞计数绘制生长曲线;金黄色葡萄球菌实验检测细胞吞噬功能;流式细胞术检测细胞表面成熟粒单核细胞相关抗原的表达。结果:（1）BamHⅠ、XbaⅠ双酶切重组质粒pcDNA3.0- 190CT2+3、pcDNA3.0- 190CT3,电泳紫外灯下观察可见大小相符的目的片段,测序结果与Genbank核酸序列数据库中LIFR序列（X61615）比对,完全一致。190CT2+3全长597个碱基,190CT3全长357个碱基。对190CT3定点突变,获得339bpDNA片段,经BamHⅠ、XbaⅠ双酶切连接重组入质粒pcDNA3.0,双向测序后与Genbank数据库中LIFR序列（X61615）比对,原190CT3片段的三处编码酪氨酸的cDNA序列TAT正确置换为编码苯丙氨酸的TTC,成功获得重组pcDNA3.0-MUT的真核表达质粒。（2）经G-418筛选得到重组190CT2+3、190CT3、MUT的HL-60和K562细胞和空质粒转染细胞。用免疫印迹法检测LIFR,于20KD、15KD处见目的蛋白条带,选取稳定表达的细胞株进行下一步实验。苏木精染色,光镜下观察细胞形态,结果显示190CT2+3和190CT3诱导后,细胞的杆状核与分叶核增加。统计学分析分叶核比例:190CT3>190CT2+3组,P<0.01,组间差别有意义。（3）细胞计数,绘制生长曲线,190CT2+3和190CT3诱导后,细胞生长速度减慢:190CT3< 190CT2+3< MUT< pcDNA3.0< WT HL-60/K562。流式细胞术检测CD15、CD11b和CD14,结果显示转染190CT2+3和190CT3后标志分子表达增加:190CT3> 190CT2+3> MUT> pcDNA3.0> WT HL-60/K562。结论:（1）将190CT2+3、190CT3和MUT重组质粒转染HL-60/K562细胞,经检测说明重组白血病细胞株已经稳定表达目的基因。（2）190CT2+3、190CT3组分叶核的比例增加,增殖减慢,CD15/CD11b/CD14表达增高,对金葡菌的吞噬功能增强,证明gp190 C-末端功能域对白血病细胞有促进分化,抑制增殖的作用。第二部分、gp190胞内功能片段信号通路以及与γ-Secretase关系的研究方法:（1）免疫印迹法检测各组白血病细胞株（HL-60/K562）中磷酸化STAT3和磷酸化MAPK的蛋白表达;免疫荧光双标法检测各组HL-60细胞中STAT3和磷酸化STAT3。（2）构建PIAS3-pEGFP重组质粒:抽提HL-60细胞的总RNA,逆转录得到cDNA,设计四对引物,通过引物重叠延伸PCR法,扩增得到PIAS3编码区全长序列;经XhoⅠ、SacⅡ双酶切连接重组入真核表达载体pEGFP-N1,双向测序后与Genbank数据库中PIAS3序列（NM006099）比对。通过脂质体瞬时转染190CT3-HL60细胞,通过免疫荧光和免疫印迹法检测转染后不同时间点PIAS3的表达,通过免疫印迹法检测PIAS3作用后,不同时间点STAT3二聚体的表达。细胞计数,绘制转染后的细胞生长曲线。（3）人LIF因子和γ-secretase抑制剂分别作用于HL-60细胞,免疫印迹法检测gp190（全长和C-末端）和PS1（全长和N-末端）的表达。结果:（1）免疫印迹法检测信号分子的蛋白表达,结果显示190CT2+3、190CT3组白血病细胞中（HL-60/K562）磷酸化STAT3明显较对照组增高;磷酸化MAPK的表达情况相反,190CT组表达量较对照组明显降低。激光共聚焦检测的结果显示190CT3组细胞磷酸化STAT3表达增强,STAT3核聚集增多。（2）免疫荧光和免疫印迹法检测证实PIAS3随转染时间的延长,表达增加;在PIAS3的作用下,STAT3二聚体的表达下降,细胞增殖转而加快。（3）LIF作用后,gp190的C-末端约26KD的片段,蛋白表达增加;同时伴随PS1的N-末端（PS1-NTF）蛋白表达逐渐增加,说明gp190胞内区游离多肽增加,γ-secretase分泌酶活性增加。γ-secretase抑制剂的作用下,gp190的C-末端约26KD的片段,蛋白表达减少;同时伴随PS1的N-末端（PS1-NTF）蛋白表达逐渐减少,说明gp190胞内区游离多肽减少,γ-secretase分泌酶活性降低。γ-secretase分泌酶可能切割了gp190产生游离功能域。结论:（1）目的片段190CT2+3与190CT3,即gp190胞内区C-末端功能域在白血病细胞内游离存在时,可以激活信号分子STAT3,同时抑制了信号分子MAPK;C-末端的YXXQ官能体发挥重要作用。（2）PIAS3瞬时作用于190CT3-HL60细胞后,STAT3二聚体减少,细胞增殖加快,说明STAT3在190CT3抑制白血病细胞的增殖过程中发挥关键作用。（3）hLIF刺激引起gp190 C-端片段和PS1 N-端片段表达增加,γ-secretase抑制剂作用使gp190 C-端片段和PS1 N-端片段表达减少,说明生理状态下,γ-secretase可能有切割gp190,产生游离C末端的作用。第三部分、动物实验方法:（1）4-5周龄雄性裸鼠由轻到重排列,按照随即配对的分组方法,分成5组（PBS、野生型HL-60、pcDNA3.0-HL60、MUT-HL60和190CT3-HL60）,每组7只,尾静脉注射。第一次接种量为2×105个细胞,设立空白对照（注射200μlPBS）。记录接种日期,每天观察小鼠状态及行为表现。30天后第二次接种2×106个细胞。（2）7、14、21、28天分别断尾采集外周血制作血涂片,瑞氏染色,计数外周血中淋巴样细胞和粒细胞百分率;28天取骨髓细胞,流式细胞术检测骨髓细胞中标志分子CD15和HLA-1的表达。第二次接种60天后取出脏器（肝、肾、脾、肺和胃肠）做H-E染色,检测脏器有无病理结构的改变。结果:（1）外周血:CT3组裸鼠粒细胞比例较高,淋巴样细胞比例较低;骨髓:在第28天的检测结果显示,CT3组CD15和HLA-1的表达均升高。（2）组织切片的H-E染色。肝脏:均可见肉芽组织。肺部:野生型HL-60细胞移植组,部分肺泡结构消失,其内有边界不清的肉芽肿,有浆细胞、组织细胞,淋巴样细胞浸润,有出血坏死;pcDNA3.0-HL60移植组,部分肺泡正常结构被破坏,有肉芽肿样结构,部分坏死;MUT-HL60移植组,部分肺泡正常结构被破坏伴坏死、出血;190CT3-HL60移植组,肺部结构正常,肺泡间隔增厚,少量淋巴样细胞聚集,无出血坏死结构。结论:（1）移植后,CT3组细胞在裸鼠体内仍然表现为较成熟的粒细胞形态,维持了较分化的状态。（2）190CT3组HL-60细胞在裸鼠体内恶性程度降低。小结1、gp190胞内C-末端功能域在细胞内游离存在时,促进急性髓系白血病细胞向成熟细胞方向分化。2、gp190胞C-末端功能域在白血病细胞内游离存在时,可以激活STAT3信号通路,同时抑制了信号分子MAPK;C-末端的YXXQ突变或PIAS3转染后,STAT3通路被抑制,细胞增殖加快;γ-secretase可能切割gp190产生细胞内的游离功能域,参与信号传递过程。3、gp190胞内C-末端功能域作用后的白血病细胞在裸鼠体内恶性程度降低。
王静[9]（2006）在《游离的LIFα胞内功能片段对HL-60细胞的生长调节》文中认为白血病抑制因子（LIF）是一种多效性细胞因子,作用于多种细胞组织发挥不同的生物学作用,广泛调节细胞的生长、增殖和分化。如抑制胚胎干细胞的体外分化;刺激血小板生成,造血细胞增殖;促进成骨细胞增殖;促进神经原形成,肌肉卫星细胞的增殖,参与神经肌肉修复;参与肝的急性期反应,参与炎症的生理病理过程等。这些生物学效应有赖于其结合靶细胞膜上的LIF受体α亚基（gp190）,与另一亚基（gp130）形成异源性二聚体,激活下游信号转导通路。gp190（LIFRα亚基）是低亲和力的LIF特异性受体,属于造血细胞素受体超家族,缺乏内生激酶的活性。生理状态下存在可溶性LIFR和跨膜LIFR。可溶性受体,游离于胞外,无跨膜区和细胞内区,对LIF发挥的正常生理效应有拮抗效应。跨膜LIFR（gp190）胞内区含三个功能域——BOX1、2、3。YXXQ序列位于远膜端（Y酪氨酸,X任意氨基酸,Q谷氨酰胺）,与STAT3的SH2位点特异性识别结合。细胞内是否存在胞内区游离受体,胞内区受体游离后如何影响信号传递,发挥其生物学效应?有关膜受体信号启动位点的游离多肽对细胞增殖分化的影响已有报道,提示我们,单一亚基的单一信号启动位点在离膜状态下完全能够在细胞内启动相应的信号转导通路。LIF信号传导激活JAK-STAT途径和RAS-MAPK途径,我们前期研究根据gp190细胞内区的不同功能域分别设计了两种小分子——190CT2+3（含BOX2+3）和190CT3（含BOX3）,发现gp190细胞内区的多个功能域成为游离多肽在细胞内存在时,对细胞分化有不同的影响,激活不同的信号分子。为进一步验证前期工作,研究发生机制,本研究成功获得了重组190CT2+3和190CT3两种白血病HL-60细胞株,并进一步对190CT3的YXXQ基团定点突变研究相关信号转导通路,发现稳定表达重组目的基因（190CT2+3和190CT3）的肿瘤细胞,增殖均受到抑制,促进细胞成熟分化,JAK/STAT3通路激活;通过该研究,我们明确了gp190不同的功能域190CT2+3、190CT3在胞内游离存在时,对急性早幼粒白血病细胞HL-60增殖分化的功能效应和相
冀凯宏,汤淑萍,刘善荣,陆海英,刘厚奇[10]（2004）在《白血病抑制因子受体细胞内区对HL-60细胞表达CD14和CD15的影响》文中研究指明观察白血病抑制因子 （LIF）受体gp190亚基完整的细胞内区和gp190胞内区C末端片段（190CT）对人白血病系HL 6 0表达CD14、CD15的影响 ,进一步了解LIF引发白血病细胞增殖抑制和分化的关系 .用基因重组技术将LIF另一亚基gp130的细胞内区换成gp190的细胞内区 ,用PCR技术扩增gp190细胞内区C末端的一个多肽的编码序列 ,构成嵌合体受体基因 130 /190及 190CT片段 ,并分别在HL 6 0细胞表达 .用免疫组化和流式细胞术检测分析在LIF的诱导下 ,HL 6 0细胞表达CD14、CD15的水平 .转染pcDNA130 /190的HL 6 0细胞 ,CD15表达量明显增高 ;转染pcDNA190CT的细胞 ,CD15的表达量降低 ;但 2组细胞的CD14表达量均较低且水平接近 .LIF可能诱导HL 6 0细胞向粒细胞而不向单核细胞分化 ,该效应是由gp190亚基细胞内区介导的 ,而gp190C末端片段可干扰LIFα受体介导的信号传导效应 .
二、白血病抑制因子受体gp190细胞内区与HL-60细胞内Cdc25B激活的关系（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、白血病抑制因子受体gp190细胞内区与HL-60细胞内Cdc25B激活的关系（论文提纲范文）
（1）人白血病细胞中c-myb的远距离表达调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 c-myb表达异常与癌症 |
| 1.1.1 c-myb与结直肠癌 |
| 1.1.2 c-myb与乳腺癌 |
| 1.1.3 c-myb与子宫内膜癌 |
| 1.2 c-myb在造血系统中的作用 |
| 1.2.1 适当表达水平的c-myb维持造血干细胞的正常造血 |
| 1.2.2 低水平的c-myb表达促进造血干细胞分化 |
| 1.2.3 血细胞在成熟与分化过程中c-myb的表达量不同 |
| 1.3 c-myb与白血病的关系 |
| 1.4 与c-myb调控相关的分子机制 |
| 1.4.1 转录因子对c-myb的调控及对细胞造血影响 |
| 1.4.2 表观修饰对c-myb的调控 |
| 1.5 研究背景 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验细胞及培养 |
| 2.2 细胞的诱导分化 |
| 2.3 慢病毒表达质粒构建 |
| 2.3.1 RNA的提取 |
| 2.3.2 载体与目的片段的连接 |
| 2.3.3 转化 |
| 2.4 转录因子shRNA敲降质粒构建 |
| 2.5 质粒提取 |
| 2.6 慢病毒包装与感染 |
| 2.6.1 293T包装慢病毒 |
| 2.6.2 感染U937、K562细胞 |
| 2.7 蛋白质提取 |
| 2.8 Bradford法测定蛋白浓度 |
| 2.9 蛋白质印迹法(Western Blot) |
| 2.10 RT-qPCR |
| 2.11 ChIP实验 |
| 2.11.1 细胞处理 |
| 2.11.2 纯化DNA |
| 2.12 双荧光素酶报告系统 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 重组质粒构建结果 |
| 3.1.1 p LKO.1-shRNA重组质粒构建 |
| 3.1.2 p LVX-IRES-GATA1质粒构建 |
| 3.2 双荧光素酶报告系统检测GATA1对c-myb表达的作用 |
| 3.3 K562细胞中转录因子与c-myb的表达 |
| 3.3.1 Hemin诱导K562细胞分化后c-myb及转录因子变化 |
| 3.3.2 K562细胞中过表达及敲降转录因子后c-myb的表达变化 |
| 3.4 U937细胞中转录因子与c-myb的表达 |
| 3.4.1 TPA诱导U937细胞分化后c-myb及转录因子变化 |
| 3.4.2 U937 细胞中过表达及敲降GATA1后c-myb的表达变化 |
| 3.5 HL60细胞中转录因子与c-Myb的表达 |
| 3.5.1 ATRA诱导HL60细胞分化后c-Myb及转录因子变化 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（2）激酶抑制剂C0129和C0198的抗肿瘤活性及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 Aurora激酶和VEGFR2 激酶受体抑制剂研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 Aurora蛋白激酶 |
| 1.2.1 Aurora蛋白激酶结构 |
| 1.2.2 Aurora蛋白激酶分子功能 |
| 1.2.3 Aurora蛋白激酶与肿瘤 |
| 1.2.4 Aurora蛋白激酶抑制剂 |
| 1.3 血管内皮生长因子(VEGF)及其受体蛋白激酶 |
| 1.3.1 血管内皮生长因子(VEGF) |
| 1.3.2 血管内皮生长因子受体2(VEGFR2) |
| 1.3.3 VEGFR2 分子功能 |
| 1.3.4 VEGFR2 与肿瘤 |
| 1.3.5 VEGFR2 抑制剂 |
| 1.4 展望 |
| 第二章 实验材料和方法 |
| 2.1 实验仪器 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.3 主要实验方法 |
| 2.3.1 体外酶抑制筛选实验 |
| 2.3.2 分子对接 |
| 2.3.3 细胞培养 |
| 2.3.4 细胞增殖抑制实验 |
| 2.3.5 细胞EDU检测实验 |
| 2.3.6 细胞Aurora A/B siRNA转染实验 |
| 2.3.7 细胞免疫荧光实验 |
| 2.3.8 细胞蛋白印迹实验 |
| 2.3.9 细胞染色体稳定性实验 |
| 2.3.10 细胞周期检测实验 |
| 2.3.11 细胞凋亡诱导实验 |
| 2.3.12 细胞AnnexinV-FITC/PI染色实验 |
| 2.3.13 细胞迁移实验 |
| 2.3.14 细胞侵袭实验 |
| 2.3.15 小鼠体内急性毒性实验 |
| 2.3.16 化合物药代动力学实验 |
| 2.3.17 血管形成抑制实验 |
| 2.3.18 裸鼠移植瘤实验 |
| 2.3.19 免疫组化实验 |
| 2.3.20 数据统计分析 |
| 第三章 嘧啶类Aurora A/VEGFR2抑制剂C0129 抗肿瘤活性研究. |
| 3.1 引言 |
| 3.2 C0129 的化学合成 |
| 3.3 C0129 抑制蛋白激酶活性 |
| 3.4 C0129 的体外抗肿瘤活性 |
| 3.4.1 C0129 抑制肿瘤细胞增殖 |
| 3.4.2 C0129 抑制HeLa细胞DNA复制 |
| 3.5 C0129抑制Aurora A蛋白激酶活性 |
| 3.5.1 C0129抑制Aurora A影响He La细胞增殖 |
| 3.5.2 C0129抑制He La细胞Aurora A蛋白激酶活性 |
| 3.5.3 C0129影响He La细胞纺锤体形成 |
| 3.5.4 C0129阻滞He La细胞周期 |
| 3.5.5 C0129诱导He La细胞凋亡 |
| 3.5.6 C0129调控He La细胞PI3K/Akt/m TOR通路 |
| 3.6 C0129抑制VEGFR2活性 |
| 3.6.1 C0129与VEGFR2分子对接 |
| 3.6.2 C0129抑制He La细胞VEGFR2活性 |
| 3.6.3 C0129抑制He La细胞迁移 |
| 3.6.4 C0129抑制He La细胞侵袭 |
| 3.6.5 C0129抑制HUVECs血管形成 |
| 3.6.6 C0129调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路 |
| 3.7 C0129体内急性毒性 |
| 3.8 C0129药物代谢动力学研究 |
| 3.8.1 方法 |
| 3.8.2 色谱条件 |
| 3.8.3 血浆预处理 |
| 3.8.4 标准曲线 |
| 3.8.5 药代动力学参数 |
| 3.9 C0129抑制He La细胞裸鼠移植瘤 |
| 3.10 讨论 |
| 第四章 酞嗪类Aurora A/B抑制剂C0198抗肿瘤活性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 C0198的化学合成 |
| 4.3 C0198抑制肿瘤细胞增殖 |
| 4.4 C0198抑制HCT-116 和PC-3 细胞机制研究 |
| 4.4.1 C0198抑制HCT-116 和PC-3 细胞Aurora激酶活性 |
| 4.4.2 C0198调控HCT-116 和PC-3 细胞Aurora激酶底物活性 |
| 4.4.3 C0198阻滞HCT-116 和PC-3 细胞周期 |
| 4.4.4 C0198调控HCT-116 和PC-3 细胞周期蛋白激酶活性 |
| 4.4.5 C0198影响HCT-116 和PC-3 细胞纺锤体的形成 |
| 4.4.6 C0198诱导HCT-116 和PC-3 细胞染色体紊乱 |
| 4.5 C0198体内急性毒性 |
| 4.6 C0198药物代谢动力学研究 |
| 4.6.1 方法 |
| 4.6.2 色谱条件 |
| 4.6.3 血浆预处理 |
| 4.6.4 标准曲线 |
| 4.6.5 药代动力学参数 |
| 4.7 C0198抑制裸鼠体内移植瘤 |
| 4.7.1 C0198抑制裸鼠HCT-116 细胞移植瘤 |
| 4.7.2 C0198抑制裸鼠PC-3 细胞移植瘤 |
| 4.8 结论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 在学期间研究成果 |
| 致谢 |
（3）2,3-二氧代吲哚啉-1-N-苯基乙酰胺合成及CDC25B抑制活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 癌症的研究进展 |
| 1.2.1 癌症的定义、临床表现及其危害 |
| 1.2.2 癌症的治疗研究现状 |
| 1.2.3 CDC25B与肿瘤细胞相关研究进展 |
| 1.2.4 PTP1B与肿瘤细胞相关研究进展 |
| 1.3 靛红及其衍生物的活性研究进展 |
| 1.3.1 靛红及其衍生物在中枢神经系统中的作用 |
| 1.3.2 靛红及其衍生物在心脑血管疾病的作用 |
| 1.3.3 靛红及其衍生物的抗菌、抗病毒活性 |
| 1.3.4 靛红及其衍生物的抗肿瘤活性 |
| 第二章 合成实验部分 |
| 2.1 实验设计与选题依据 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验药品与试剂 |
| 2.3 Isatin衍生物的合成 |
| 2.3.1 2-(取代-2,3-二氧代吲哚啉-1-)-N-苯基乙酰胺的合成路线与方法 |
| 2.3.2 2-(取代-2,3-二氧代吲哚啉-1-)-N-苯基乙酰胺的光谱数据 |
| 2.3.3 6-溴-2,3-二氧代吲哚啉-1-N-取代苯基乙酰胺的合成路线与方法 |
| 2.3.4 6-溴代-2,3-二氧代吲哚啉-1-N-取代苯基乙酰胺的光谱数据 |
| 第三章 药理实验部分 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂与药品 |
| 3.1.2 实验细胞株与实验动物 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 其他实验材料 |
| 3.2 磷酸酶抑制活性的测定 |
| 3.2.1 CDC25B的生物活性测定方法 |
| 3.2.2 PTP1B的生物活性测定方法 |
| 3.2.3 化合物的抑制活性及酶动力学分析 |
| 3.3 体外抗肿瘤活性的测定 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 MTT法测定体外抗肿瘤活性 |
| 3.4 体内抗肿瘤活性的测定 |
| 第四章 结果与讨论 |
| 4.1 合成实验部分讨论 |
| 4.1.1 异亚硝基苯乙酰胺(1a-1o)衍生物的合成 |
| 4.1.2 靛红与取代靛红(2a-2o)的合成 |
| 4.1.3 N-氯乙酰基苯胺衍生物(3a-3p)的合成 |
| 4.1.4 2,3-二氧代吲哚啉-1-N-苯基乙酰胺及其衍生物的合成 |
| 4.2 靛红衍生物的相关图谱解析 |
| 4.2.1 红外光谱(IR)图谱解析 |
| 4.2.2 核磁共振氢谱(1H-NMR)图谱解析 |
| 4.2.3 核磁共振碳谱(13C-NMR)图谱解析 |
| 4.3 药理实验部分 |
| 4.3.1 靛红衍生物对磷酸酶CDC25B及 PTP1B的抑制活性实验结果 |
| 4.3.2 靛红衍生物4h的酶动力学分析 |
| 4.3.3 靛红衍生物的体外抗肿瘤活性实验结果 |
| 4.3.4 靛红衍生物的体内抗肿瘤活性实验结果 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（4）多肽CT3依赖STAT3抑制microRNA-155的表达促进HL-60细胞分化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 多肽 CT3 的制备与鉴定 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 多肽 CT3 对 HL-60 细胞增殖分化的影响 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 多肽 CT3 对 HL-60 细胞分化影响的机制研究 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 全文小结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表和科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（5）190CT3通过调节STAT3α和β的活性诱导HL-60细胞分化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 定表达 190CT3 基因的 HL-60 细胞株的筛选和建立 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第二部分 190CT3 对 HL-60 细胞增殖分化的影响 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 第三部分 190CT3 对 HL-60 细胞增殖分化影响的机制研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 全文小结 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 STAT3 及 JAK/STAT 信号转导途径与白血病 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）γ分泌酶对LIF受体α亚基gp190的切割作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分、Nicastrin 重组质粒的构建以及其在HL-60 细胞中的表达及鉴定 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分、γ 分泌酶对LIF 受体亚基gp190 作用机制的探讨 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述：γ 分泌酶结构和功能的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录：研究生期间以发论文和参加会议 |
| 一、攻读学位期间发表的学术论文 |
| 二、攻读学位期间参加学术会议 |
| 致谢 |
（7）分泌型多肽TAT-CT3-cMyc对白血病HL-60细胞的生长调节（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 重组人TAT-CT3-cMyc 及对照片段的CHO 细胞株的获得与鉴定 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 分泌型多肽TAT-CT3-cMyc 及对照片段的纯化与鉴定 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 分泌型多肽TAT -CT3-cMyc 对HL-60 细胞的生长调节作用 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 创新点 |
| 综述一 蛋白转导穿膜域的现状与未来 |
| 参考文献 |
| 综述二 精原干细胞研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间论文发表和科研工作情况说明 |
| 一、攻读学位期间发表的学术论文 |
| 二、攻读学位期间参加科研工作情况 |
| 三、博士研究生期间参加学术会议及培训情况 |
| 致谢 |
（8）游离的gp190胞内功能片段对白血病细胞的生长调节（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 外文缩写索引 |
| 第一部分、重组人gp190 胞内功能片段的白血病细胞株的获得与鉴定 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分、gp190胞内功能片段信号通路以 及与γ-Secretase关系的研究 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分、重组人gp190胞内功能片段 在动物体内抑制白血病细胞的功能效应 |
| 前言 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 附录 |
| 致谢 |
（9）游离的LIFα胞内功能片段对HL-60细胞的生长调节（论文提纲范文）
| 外文缩写索引 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 |
| 第二部分 |
| 综述 |
| 全文小结 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、白血病抑制因子受体gp190细胞内区与HL-60细胞内Cdc25B激活的关系（论文参考文献）
- [1]人白血病细胞中c-myb的远距离表达调控机制研究[D]. 程凯. 上海海洋大学, 2020(03)
- [2]激酶抑制剂C0129和C0198的抗肿瘤活性及作用机制研究[D]. 桑春艳. 兰州大学, 2019(02)
- [3]2,3-二氧代吲哚啉-1-N-苯基乙酰胺合成及CDC25B抑制活性研究[D]. 陈文波. 浙江海洋大学, 2019(02)
- [4]多肽CT3依赖STAT3抑制microRNA-155的表达促进HL-60细胞分化[D]. 徐莎. 第二军医大学, 2013(05)
- [5]190CT3通过调节STAT3α和β的活性诱导HL-60细胞分化的机制研究[D]. 杨玲. 第二军医大学, 2012(09)
- [6]γ分泌酶对LIF受体α亚基gp190的切割作用及机制探讨[D]. 尹肖雯. 第二军医大学, 2011(09)
- [7]分泌型多肽TAT-CT3-cMyc对白血病HL-60细胞的生长调节[D]. 孙擎. 第二军医大学, 2011(09)
- [8]游离的gp190胞内功能片段对白血病细胞的生长调节[D]. 王静. 第二军医大学, 2009(10)
- [9]游离的LIFα胞内功能片段对HL-60细胞的生长调节[D]. 王静. 第二军医大学, 2006(09)
- [10]白血病抑制因子受体细胞内区对HL-60细胞表达CD14和CD15的影响[J]. 冀凯宏,汤淑萍,刘善荣,陆海英,刘厚奇. 中国生物化学与分子生物学报, 2004(05)
标签：白血病论文; 急性髓性白血病论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 细胞分化论文; 细胞增殖论文;